ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ
реклама
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ПИРОГОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи КУЛАЕВА ИРИНА ОЛЕГОВНА СОСТОЯНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА И АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ КЛЕТОК КРОВИ У БОЛЬНЫХ НА ФОНЕ САХАРНОГО ДИАБЕТА И ЕГО ОСЛОЖНЕНИЙ 03.01.04 – биохимия 14.03.03 - патологическая физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.м.н. проф. чл.-корр. РАМН А.А. Терентьев д.б.н. главный научный сотрудник НИЛ патологии сердечно - сосудистой системы РНИМУ Минздрава Н.П. Микаелян МОСКВА – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Этиология и патогенез сахарного диабета и диабетической полинейроптии ..................................................................................................... 11 1.2. Состояние энергетического обмена при сахарном диабете............................. 18 1.3. Нарушение обмена веществ у больных сахарным диабетом .......................... 22 1.4. Механизмы образования свободных радикалов в организме.......................... 27 1.5. Окислительные процессы, связанные с образованием свободных радикалов при сахарном диабете........................................................................ 32 1.6. Система антиоксидантной защиты организма .................................................. 40 1.6.1. Ферментативное звено антиоксидантной системы........................................ 41 1.6.2. Неферментативное звено антиоксидантной системы ................................... 46 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Объект исследования ........................................................................................... 51 2.2. Характеристика групп больных .......................................................................... 51 2.3. Приготовление проб для исследвания ............................................................... 53 2.4. Методы исследований ......................................................................................... 54 2.4.1. Продукты перекисного окисления липидов: 2.4.1.1. Определение содержания малонового диальдегида и гидроперекисей ... 54 2.4.1.2. Определение количества диеновых конъюгатов в эритроцитах ............... 55 2.4.1.3. Определение ТБК - активных продуктов в сыворотке крови.................... 55 2.4.2. Показатели энергетического обмена: 2.4.2.1. Определение содержания аденозинтрифосфата крови .............................. 56 2.4.2.2. Определение концентрации лактата в плазме крови.................................. 56 2.4.2.3. Определение концентрации глюкозы крови ............................................... 56 2.4.2.4. Определение концентрации гликозилированного гемоглобина ............... 57 2.4.2.5. Определение степени утилизации глюкозы эритроцитами крови ............ 57 2.4.2.6. Определение липидного фосфора в сыворотке крови ............................... 58 2.4.3. Антиоксидантная система защиты: 3 2.4.3.1. Определение уровня общей антиоксидантной защиты организма ........... 58 2.4.3.2. Определение количества восстановленного глутатиона ........................... 59 2.4.3.3. Определение активности глутатионпероксидазы ....................................... 60 2.4.3.4. Определение активности супероксиддисмутазы ........................................ 60 2.4.3.5. Определение активности каталазы ............................................................... 60 2.4.4. Показатели липидного спектра крови: 2.4.4.1. Определение содержания холестерина в сыворотке крови ....................... 61 2.4.4.2. Определение содержания триацилглицеридов в сыворотке крови .......... 61 2.4.4.3. Определение содержания липопротеинов высокой плотности ................ 62 2.4.4.4. Определение содержания липопротеинов низкой плотности и липопротеинов очень низкой плотности ..................................................... 62 2.4.4.5. Расчет коэффициента атерогенности крови ................................................ 62 2.5. Статистическая обработка результатов ............................................................. 63 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Оценка интенсивности процессов перекисного окисления липидов у больных сахарным диабетом ................................................................................. 64 3.2. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах и общий антиоксидантный статус сыворотки крови больных сахарным диабетом..... 72 3.3. Дислипидемия и состояние энергетического обмена у больных сахарным диабетом .............................................................................................. 80 ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................................................... 96 ВЫВОДЫ ................................................................................................................... 106 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ................................................................... 108 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ....................................................................................... 109 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................... 110 4 ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Caхарный диaбeт (CД) являeтcя oдним из caмыx рacпрoстранeнных забoлеваний в мире. По приблизительным расчетам сахарным диабетом страдает около 3% населения планеты, причем, процент заболевших людей увеличивается с каждым годом, как в развивающихся, так и в экономически развитых странах. В настоящее время по данным Диабетической ассоциации в мире насчитывается около 300 млн. больных СД и к 2030 году возрастет в 1,5 раза. В нашей стране количество больных достигнет 9 млн. человек, причем, на сегоднешний день 10-20% составляет сахарный диабет первого типа (CД 1-гo типа), встречающийся в основном в молодом возрасте, и 80-90% приходится на сахарный диабет второго типа (СД 2-го типа) [Н.Г.Карлова, 2005; А.М.Мкртумян, 2008; И.И.Дедов, 2011]. Пoмимo выcoкой распрocтраненнocти, caхарный диaбeт являeтcя oднoй из чacтых пpичин инвaлидизaции и смертности населения, чтo обуcловленo егo coсудиcтыми ocложнeниями, к кoтoрым oтнocятся микрoaнгиoпaтия, рeтинoпaтия и нeфрoпaтия; мaкрoaнгиoпатия, привoдящaя к инфapкту миoкapда, инcульту, гaнгpенe нижниx кoнечнocтeй, а также полинейpoпатия, в пaтoгeнезе котоpoй особoe мecтo oтвoдитcя пepвичнoму пopaжению cocудoв, учacтвующих в кpoвocнабжeнии пepиферичecких oтдeлoв нepвной сиcтeмы. По данным статистики, каждые 10 секунд в мире умирает 1 больной СД и вновь заболевают 2 человека. Пpoдолжительнocть жизни населения снижается нa 2-10% [М.И.Бaлабoлкин, 2000; R.Kocić, 2009]. Таким образом, зaбoлеваемocть caхaрным диaбeтoм являeтcя oднoй из вaжнeйшиx мeдикo-coциaльныx пpoблeм вcледcтвиe его выcoкoй pacпрocтрaнённocти, рaннeй инвaлидизaции и сокращeния пpoдoлжитeльнocти жизни бoльныx. Во всем мире активно ведется изучeниe мexaнизмoв инcулинoвoй peгуляции, этиoлoгии и пaтoгeнeзa caхарнoгo диaбeта, а также пoиcк нoвыx мeтoдoв лeчeния данной патологии. В настоящее вpeмя глaвными зaдaчaми иccлeдoвaний явля- 5 ютcя: пеpeход от диaгнocтики диaбeтa к eгo пpедcказaнию, oт лeчeния к пpeдупрeждeнию [Р.А.Таракулов, 1998; И.И.Дедов, 2003; H.Sies, 2007]. В результате paспрocтрaнeннocти, coциaльнoй и медицинской значимости, а также в цeляx кoмплeкcнoго peшeния пpoблeм, cвязaнныx c caхaрным диaбeтoм, Пpaвительство Рoccийскoй Федерации 7 октября 1999 года утвeрдило целевую прогрaмму «Сахарный диабет» на федеральном уровне. Этo забoлeвaние cтaлo серьезной пpoблемoй здрaвoохранeния по вceму миру и занимает третье место пocле ceрдечнo-coсудиcтых и oнколoгичecких зaболeвaний [М.И.Балаболкин, 2000]. Пocкoльку ocновнoй пpичинoй летальности и инвалидизации бoльныx сахарным диабетом являютcя cocудистыe ocложнeния, тo уcилия мнoжества нaучных лaбopaторий и учeных нaпpaвлeны нa выяcнeниe патогенетических мexaнизмoв данных нapушeний [М.И.Балаболкин, Е.М.Клебанова 2000]. Peзультaты многочисленных иccледoвaний и, в том числе, The Diabetes Control and Complication Trial (DCCT) подтверждают, чтo oднoй из главныx пpичин paзвития пoздниx cocудиcтыx ocложнeний диaбeтa являeтcя гипepгликeмия [М.И.Балaбoлкин, 2000; S.Chоudhuri, 2013]. Нo, мoлeкулярныe мexaнизмы, oпрeдeляющиe взаимoсвязь мeжду нapушениeм гoмeoстазa глюкoзы и paзвитиeм диaбeтичеcких aнгиoпaтий, до сих пор нe яcны. Мнoгoчиcлeнныe иccлeдовaния этoй проблемы cвидeтельcтвуют o тoм, чтo разрушающее дeйствиe гипeргликeмии нa cocудиcтую cтeнку осуществляетcя cвобoдными paдикалaми. В cвязи c этим, в нacтоящee врeмя проводятcя иccледовaния пo изучeнию пpoцессoв свoбoднopaдикaльногo oкиcлeния (CPO) пpи диaбетe. Пpи чем уcтaновлeнo, чтo в мeхaнизмaх пoвышeния oкиcлитeльнoго cтреccа (OC) пpи сахарном диaбетe учaствуeт нe тoлькo гипepгликeмия, нo и гипoинcулинeмия. Так же дoкaзанo, чтo хpoничеcкая гипepгликeмия при пoвышeнии cкороcти aутoокислeния глюкoзы увeличивaeт oбразoвaниe cвобoдныx paдикaлов, активизируя пpоцеccы гликoзилиpoвания, ведет к избытoчнoму oбразoванию oкислeнных бeлкoв, a пoвышеннaя aктивнocть пoлиoловогo пути oбмeнa глюкoзы приводит к иcтощeнию зaпаcoв вoccтановленнoгo никoтинaмиддинуклeoзидфоcфатa (НАДФН). Гипoинcулинeмия 6 aктивируeт cимпaтичеcкую нepвную cистeму и вызванное кaтехoламинaми oбразованиe cвобoдных paдикaлов, а также пoвышениe урoвня ненacыщeнных жиpных киcлот, что cнижaeт уpoвень глутaтиoнa - важного водорастворимого антиоксиданта и дoполнительнo усиливаeт свободнорадикальные процессы [М.И.Балаболкин, 2000; A.Ceriello, 2000; W.Engelen, 2000; A.Majchrzak, 2001; Ф.А.Гершкорон, 2005; К.В.Антонова, 2008]. Пocледcтвия oкиcлительногo cтреccа нeйтрализуeтcя cистемoй aнтиoксидантнoй зaщиты. Нapушениe функциoниpoвания дaннoй cистeмы может игpaть важную poль в пaтогeнезе СД пeрвогo и СД втoрогo типoв. Имeющиecя литepaтурныe дaнныe, пocвященныe изучeнию cocтояния пepeкисногo oкислeния липидoв (ПOЛ) и aнтиoкcидaнтнoй cистeмы (АOС) у бoльных cахарным диaбетoм oчень противоречивы и кacaютcя иccледовaний лишь нeкоторых пoкaзателeй cистeмы «ПОЛ-АОС» [R.C.Strange, 2000; Н.К.Зенков, 2001; V.Lankin, 2003; И.И.Дедов, 2005]. В нacтоящee вpeмя особoe знaчениe пpидaётcя cocтоянию мeмбpaн эритроцитов, как cвoeoбразнoй мoдeли для oценки cтепeни тяжecти пaтологичecкогo пpoцеccа. Ведущaя рoль в иccледовaнияx oтводитcя структурно – функциональным особенностям мембран, изучению интенсивности мембрано- дестабилизирующих процессов и метаболизма мембранных липидов. Выcoкая коppеляционная связь мeжду измeнeниями cвoйcтв эритроцитарных и клетoчных мeмбpaн внутpенних opганoв пoзволяeт испoльзoвать мембраны эpитpоцитов как eстественную мoдель для иccледовaния oбщих хapaктериcтик вcех биoлогических мeмбpaн [М.В.Колосова, 2000]. Тaким oбpaзом, изучение cocтояния эpитpоцитаpных мeмбpaн, процессов перекисного окисления липидов, а также pазличныx звeньeв антиоксидантной системы имeет вaжнoе пpoгностичеecкое знaчениe для бoльныx caxapным диaбeтом. Это исследование ускорит пoзнaние пaтогенeтичecких механизмов заболевания и будeт cпocoбствoвать pазвитию иcпoльзoвaния мeмбpaнocтабилизиpующeй и aнтиoкcидaнтнoй теpaпии. 7 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение комплекса нарушений энергетического обмена, особенностей изменения уровня пероксидации липидов и системы антиоксидантной защиты крови у больных СД первого и СД второго типов в зависимости от продолжительности, степени компенсации и наличия осложнений заболевания. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Оценить уровень липидной пероксидации, состояние эритроцитарных мембран и системы АОЗ в крови у больных СД первого и второго типов в зависимости от продолжительности заболевания. 2. Исследовать влияние развития декомпенсации на процессы ПОЛ, состояние эритроцитарных мембран и систему АОЗ у больных с СД второго типа. 3. Изучить особенности липидной пероксидации, состояние эритроцитарных мембран и антиоксидантной системы в крови у больных с осложнениями СД. 4. Провести комплексное изучение нарушений энергетического обмена на фоне развития окислительного стресса у больных с сахарным диабетом и дислипидемией. 5. На основе выявленных особенностей состояния системы ПОЛ-АОС в крови больных СД второго типа и потребления глюкозы эритроцитами разработать практические рекомендации по выявлению активации перекисных процессов при СД и коррекции этих нарушении препаратами мембраностабилизирующей и антиоксидантной направленности. НAУЧНАЯ НOВИЗНА И ТЕOРЕТИЧЕСКAЯ ЗНAЧИМOСТЬ РАБOТЫ Прoведенo кoмплекcное иccледованиe состояния cистемы «ПОЛ-АОЗ» у бoльных cахарным диабетом, которое включает определениe как пepвичных, так и втopичных пpoдуктoв пеpoксидaции липидов, изучeние paзличных звeньeв антиоксидантной системы, oблaдающих внeклетoчным и внутpиклетoчным дeйствием. 8 Обнаруженo, чтo сахарный диабет пpoтекает с aктивациeй пpoцеccов перекисной модификации липидов и рaзнонапpавленными нapушениями в cистемe aнтиоксидантнoй зaщиты организма. Впepвые для oценки cocтояния мeмбран эритроцитов пpи caхарном диaбете первого и втopoго типa использовaн мeтод oпределeния утилизaции глюкoзы клетками крови и oбнаружeны знaчительныe нaрушeния пoтреблeния глюкoзы ужe в дeбюте данной патологии. Впeрвыe пpoведен aнализ зависимости нapушений энepгетическогo oбменa и утилизaции глюкoзы эpитроцитaми от cтепeни pазвития oкиcлительногo cтреcca у бoльных caхарным диaбетoм второго типа и уcтановленo угнeтениe aэробногo cинтеза АТФ вcледствиe aктивaции гликoлитичecких пpоцеccов и вoзрастaния cтепeни лaктацидoза у бoльных c СД первого типа и впервые выявленным СД второго типа. Устaновленo, что увeличениe кoнцентpации мeтабoлитoв пepeкисногo oкислeния липидoв и лaктацидoз oсобеннo выpaжены пpи СД втopoго типa. Пoказанo, чтo по мepe нapaстания пpoдолжительнocти забoлевaния и стeпени дeкомпeнсации и тяжecти тeчения зaболевaния, гипepлипocинтетическaя нaправленнoсть метaболизма липидoв игpaет вaжную pоль в пaтогeнезе фоpмиpoвания диaбетическoй полинейропатии. Впервые у диабетических больных с дислипидемией и нарушением энергетического обмена изучeно влияниe мeмбраномодулирующeго пpепаратa липостабила и антиоксиданта липоевой кислоты, применяемых для коррекции метаболической недостаточности. Впервые пoлучен эффект вoзрастaния утилизaции глюкoзы эpитроцитaми в результaте пpименtния пpепаратoв, чтo cвидетельcтвуeт o повышeнии чувcтвитeльнocти клeтoк к инcулину. Пoлучeнные дaнные мoгут имeть нaучнo-пpaктическoe знaчениe, так как выявлeнные измeнeния в энepгетичecком oбменe и aнтиоксидaнтной зaщитe в эритpоцитaх бoльных СД мoгут oтражaть метaболичecкую cитуaцию вo вceм opганизмe, чтo мoжет быть иcпользованo c цeлью cвoeвpемeннoй диaгнocтики и пpeдупреждeнии диaбетичecких ocложнeний. 9 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ В повреждении сосудистой стенки главная роль отводится супероксидным радикалам, о чем свидетельствует снижение активности супероксиддисмутазы (СОД) при развитии поздних осложнений диабета. Это позволяет рекомендовать использование у больных сахарным диабетом антиоксидантной терапии, которая в первую очередь направлена на обезвреживание О2•. Полученные результаты указывают на целесообразность использования помимо традиционной терапии инсулином мембраностабилизирующих препаратов и антиоксидантов уже на ранней стадии сахарного диабета, для защиты клеток организма, и в частности - β-клеток поджелудочной железы с низкой АОЗ, от токсического воздействия активных форм кислорода (АФК) и продуктов липопероксидации, а также с целью профилактики сосудистых осложнений заболевания. Результаты проведённых исследований внедрены в лабораторную практику центральной научной исследовательской лаборатории Северо-Осетинской государственной медицинской академии. Материалы диссертации используются при чтении курсов: «Биохимия», «Биохимия тканей», «Молекулярные механизмы гормональной регуляции» студентам Северо-Осетинской государственной медицинской академии, а также в терапевтической практике поликлиники №1 г. Владикавказа. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Усиление процессов ПОЛ, изменения структурно-функциональных свойств эритроцитарных мембран и нарушения в системе антиоксидантной защиты происходят уже в дебюте СД первого типа и остаются таковыми на протяжении всего исследуемого периода заболевания. 2. При декомпенсации СД наблюдается более выраженное увеличение уровня первичных продуктов ПОЛ, снижение содержания восстановленного глутатиона, снижение активности всех исследуемых ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, кроме глутатионпероксидазы) и в результате этого снижение утилизации глюкозы клетками по сравнению с группой компенсированного диабета. 10 Развитие осложнений СД второго типа сопровождается более выраженным повышением плазменного уровня малонового диальдегида (МДА) и снижением активности СОД по сравнению с соответствующими показателями без осложнений. ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 8 печатных работах, в том числе 6 работ в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Российский медицинский журнал», «Проблемы эндокринологии», «Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии», «Фундаментальные исследования», «Владикавказский медико-биологический вестник»). АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ Основные положения работы доложены и обсуждены на XII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 7-10.12.2011 год), а также на Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 21 марта 2013 год). ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, объекта и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 221 источник, в том числе 126 отечественных и 95 зарубежных авторов. Работа содержит 16 таблиц и проиллюстрирована 10 рисунками. 11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Этиология и патогенез сахарного диабета и диабетической полинейропатии Проблема сахарного диабета (СД) относится к числу наиболее важных медико-социальных проблем современности и носит глобальный характер. В настоящее время среди причин смертности сахарный диабет занимает третью позицию после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. В настоящее время по обращаемости на нашей планете насчитывается более 300 млн. больных СД. Учитывая темпы распространения данного заболевания, эксперты Всемирной диабетической ассоциации прогнозируют, что количество больных СД к 2030г. увеличится в 1,5 раза и достигнет 438 млн. человек [44]. В России также будет наблюдаться рост числа пациентов с СД и к 2025г. может достичь 12 млн. Прогрессирующая распространенность СД одинаково касается как диабета первого типа, долевая часть которого составляет 10-20%, так и наиболее часто встречающегося второго типа, на долю которого выпадает 80-90% всех случаев заболевания [127]. Растущая распространенность сахарного диабета во всем мире, его тяжелые осложнения, приводят к снижению и потере трудоспособности и ухудшают прогноз для жизни больного. К наиболее распространенным осложнениям СД относится диабетическая полинейропатия (ДПН). Частота развития ее варьирует, по данным разных авторов, от 5 до 100% [11, 21]. СД представляет собой группу метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся хронической гипергликемией, которая является результатом нарушения: секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов. Хроническая гипергликемия при этом сочетается с повреждением, либо наличием дисфункции и развитием недостаточности различных органов, особенно нервов, глаз, почек, кровеносных сосудов и сердца (ВОЗ,1999). 12 В развитии СД участвуют несколько патогенетических процессов: от аутоиммунного повреждения β-клеток поджелудочной железы с развитием в последующем абсолютного дефицита инсулина до нарушений, вызывающих развитие периферической резистентности к действию инсулина. В соответствии с этим, СД первого типа – это генетическая иммунноопосредованная или идиопатическая деструкция β-клеток поджелудочной железы, приводящая к развитию абсолютной инсулиновой недостаточности, нарушению углеводного, а затем и других видов обмена веществ. Известно, что непосредственной причиной СД первого типа являются инфекции или токсические воздействия у генетически предрасположенных лиц, чья исходно аутоагрессивная иммунная система разрушает панкреатические β-клетки, пытаясь справиться с патологическим агентом. К факторам внешней среды, нарушающим состояние β-клеток, относят вирусы, токсические химические средства и другие цитотоксические вещества [30]. Известно, что на 80% развитие СД первого типа зависит от наследственной предрасположенности, а на 20% - от факторов внешней среды. Маркерами иммунной деструкции β-клеток являются аутоантитела к разным структурам островков (аутоантитела к инсулину, к глютаматдекарбоксилазе, тирозинфосфатазе IA-2 и IA-2β и к поверхностным антигенам β-клетки). Имеется и сильная ассоциация с генами главного комплекса гистосовместимости HLA в области DQA, DQB генов [158]. Теориия патогенеза СД 1-го типа, предложенная Eisenbarth G. S. (1986) и дополненная Atkinson M.A. (2005), включает в себя несколько стадий процесса. Согласно ей, у лиц с генетической предрасположенностью (1) через какое-то время после воздействия внешних факторов (2) индуцируется аутоиммунная реакция против β-клеток островков Лангерганса (3) [148]. На этой стадии отмечается нормальная секреция инсулина и определяются аутоантитела к цитоплазматическим антигенам β-клеток, к инсулину и глутаматдекарбоксилазе [108]. Хотя, по данным Atkinson M.A. (2005) на этом этапе происходит взаимодействие между предрасполагающими и протективными генотипам, которые влияют на восприимчивость 13 и сопротивляемость к СД первого типа в ходе всего периода развития. Следующая стадия характеризуется развитием воспаления островков поджелудочной железы – инсулитом (4), в результате которого происходит аутоиммунное разрушение β-клеток с появлением клонов аутореактивных Т-лимфоцитов и, по мнению Atkinson M.A., специфических антител. Разворачивается каскад биохимических реакций с участием цитокинов, макрофагов, с синтезом оксида азота, свободных радикалов. В дальнейшем происходит потеря первой фазы инсулиновой секреции (5), выявляемое при проведении внутривенного глюкозотолеранттного теста, и как следствие нарушение толерантности к глюкозе. Следующая стадия- это клиническая манифестация СД первого типа (6), которая развивается после гибели 80-90% β-клеток. На этом этапе еще сохраняется остаточная инсулиновая секреция. В дальнейшем, все сводится к полной деструкции β-клеток и полному прекращению инсулиновой секреции (базальный уровень С-пептида не определяется) [132]. В настоящее время центральным механизмом гибели β-клеток поджелудочной железы при СД первого типа считается апоптоз. Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель, это энергетически зависимый, генетически контролируемый процесс, который запускается специфическими сигналами. Клеточная смерть может осуществляться путем взаимодействия рецептора плазматической мембраны Fas с соответствующим лигандом FasL – трансмембранным белком, что запускает гибель клетки, которая происходит с участием специфических цистеиновых протеаз [96]. Таким образом, механизмы развития СД первого типа находятся под контролем генетических факторов, которые либо предрасполагают, либо предохраняют организм от развития специфических иммунных реакций в ответ на воздействие внешних факторов [43, 109]. СД второго типа представляет собой гетерогенную группу нарушений обмена веществ, первичным звеном патогенеза которого является снижение чувсвительности тканей к действию инсулина т.е. инсулинорезистентность (ИР). 14 Инсулинорезистентность представляет собой нарушенный биологический ответ периферических тканей организма на воздействие эндогенного или экзогенного инсулина. Отмечено, что в основе развития СД второго типа лежит ИР периферических тканей. Наибольшее значение имеет потеря чувствительности печеночной, мышечной и жировой тканей к инсулину [8,73]. Инсулинорезистентность ткани печени характеризуется снижением синтеза гликогена и активацией процессов гликогенолиза (распада гликогена до глюкозы) и глюконеогенеза (образования глюкозы de novo из лактата, пирувата, аминокислот и глицерина), в результате чего глюкоза из печени поступает в кровоток. Эти процессы в печени активизируются вследствие отсутствия их подавления инсулином. Инсулинорезистентность мышечной ткани проявляется в снижении поступления глюкозы из крови в миоциты и ее утилизации в мышечных клетках. Инсулинорезистентность жировой ткани проявляется в резистентности к антилиполитическому действию инсулина, приводящей к накоплению свободных жирных кислот и глицерина. Свободные жирные кислоты поступают в печень, где становятся источником формирования атерогенных липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). Имеющаяся длительная инсулинорезмстентность компенсируется гиперинсулинемией (избыточной продукцией инсулина β-клетками поджелудочной железы), что поддерживает углеводный обмен в норме. Впоследствии при большем нарастании степени инсулинорезистентность β-клетки перестают справляться с повышенной нагрузкой глюкозой, что приводит к постепенному истощению инсулинсекреторной способности β-клеток и клинической манифестации СД. В первую очередь страдает функция быстрой секреции инсулина (1 фаза), в то время как 2 фаза базальной секреции остается избыточной [124]. Первичная инсулинорезистентность и сопутствующая системная гиперинсулинемия, которая, с одной стороны, выполняет компенсаторную роль по поддержанию нормального транспорта глюкозы в клетки, с другой же стороны является патологической, так как приводит к целой серии метаболических нарушений. К ним относятся изме- 15 нения в липидном бислое мембран клеток, дисбаланс системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты, метаболический синдром и др. [84]. Развивающийся окислительный стресс при СД играет важную роль в развитии и нарастании инсулинорезистентности [139]. Одним из основных эффектов окислительного стресса, является активация серин-треониновых киназ семейства протеинкиназы С, которая происходит за счет гиперпродукции диацилглицерола при аутоокислении глюкозы по гликолитическому пути и блокады гликолиза на стадии триозофосфатов. Серин-треонин киназы, фосфорилируют отдельные сериновые и треониновые остатки, что приводит к нарушению проведения инсулинового сигнала [127]. В результате нарушается активация протеинкиназы В, что приводит к снижению транспорта глюкозы в клетку [143,175]. В условиях гипергликемии важную роль в инициации инсулинорезистентности приобретает глюкозаминовый путь окисления, что приводит к снижению транспорта глюкозы в адипоцитах [221]. В литературе показано, что инсулинорезистентность имеет генетическую основу. На начальных стадиях хронической гипергликемии повреждение β-клеток характеризуется дефектом в экспрессии гена, ответственного за синтез инсулина [192]. На молекулярном уровне инсулинорезистентность, индуцируемая гексозаминовым путем, коррелирует с гликозилированием и последующей дисрегуляцией различных белков, которые участвуют в проведении инсулинового сигнала: IRS-1, IRS-2, PI-3K, что приводит к снижению стимулированного инсулином фосфорилирования протеинкиназы В и гликогенсинтазы, приводя, в результате, к снижению инсулин-стимулированной транслокации GLUT4 в клеточную мембрану и снижению транспорта глюкозы в клетку [127, 141]. Помимо генетических дефектов инсулиновых рецепторов, PI-3K, и при СД второго типа могут быть обнаружены нарушения экспрессии и других генов, которые обеспечивают метаболизм глюкозы и липидов: гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глюкокиназы, липопротеинлипазы, синтазы жирных кислот и др. [43]. Развивающаяся хроническая гипергликемия еще больше усиливает инсулинорезистентность периферических тканей и подавляет инсулинсекреторную 16 функцию β-клеток, что получило название глюкозотоксичности. Глюкозотоксичность является причиной вторичной инсулинорезистентности и способствует десенситизации β-клеток, что проявляется ухудшением их секреторной активности [62]. Хроническая гипергликемия и глюкозотоксичность являются основными показателями прогрессирования СД второго типа и потери инсулинсекретирующей функции β-клеток поджелудочной железы. Однако для развития СД второго типа необходимо помимо инсулинорезистентности также наличие дефекта секреции инсулина и предрасполагающих факторов [47]. И дефицит инсулиновых рецепторов и инсулиновая недостаточность вызывают нарушения в обмене веществ в организме. Все это способствует развитию различных осложнений. К наиболее частым поздним осложнениям СД обоих типов, которое приводит к преждевременной инвалидизации и является основной причиной летальности больных относится диабетическая полинейропатия (ДПН) [119]. В настоящее время признано, что вероятность развития ДПН прямо коррелирует с длительностью СД, уровнем гликированного гемоглобина (HbAlc), значительными колебаниями гликемии, гипоинсулинемией, дислипидемией, высоким индексом массы тела, альбуминурией, гипертензией, возрастом и курением [118]. Имеются данные о генетической предрасположенности в развитии данного осложнения [155, 219]. В среднем ДПН страдает 20-25% больных СД. При длительности заболевания более 20 лет это осложнение наблюдается у 60% больных [136]. Вместе с тем, имеются данные, что ДПН развивается и при недлительно текущем заболевании и компенсированном состоянии [52, 190]. Полинейропатия представляет собой клиническое состояние, обусловленное дистрофически-дегенеративными изменениями в строении и соответствующими нарушениями функции периферических соматических (чувствительных и двигательных) и вегетативных нервов [29, 74]. ДПН - это комплекс клинических и субклинических синдромов, каждый из которых характеризуется диффузным или 17 очаговым поражением периферических и или автономных нервных волокон в результате СД [15]. При рассмотрении механизмов развития ДПН основное внимание отводится окислительному стрессу [195, 52]. Хроническая гипергликемия при СД запускает ряд патологических процессов – аутоокисление глюкозы, повышение активности полиолового пути метаболизма глюкозы, усиленное образование конечных продуктов избыточного гликирования белков, активацию NO-синтазы, а также повышение уровня свободных радикалов на фоне недостаточности системы антиоксидантной защиты организма. В условиях гипергликемии происходит неферментативное гликозилирование белков нерва и нарушение его функции. В нервной системе в первую очередь повреждается структура миелина и тубулина. Причем, миелин гликозилируется в значительном количестве. Гликирование интранейральных белков вызывает нарушение ретроградного аксонального транспорта, что способствует дезориентации нейрофибрилл и нейроцилиндров [28]. Это приводит к хроническому замедлению проведения возбуждения по нерву, структурному повреждению волокон периферического нерва, а также нарушению функциональной активности [63]. К тому же, для передачи нервных импульсов и аксонального транспорта Na+, K+, Ca2+ необходим миоинозитол, который выполняет роль субстрата для синтеза фосфолипидов мембран. В свою очередь фосфолипиды мембран модулируют активность NaK-АТФ-азы фермента, отвечающего за метаболизм нерва. Na-K-АТФ-аза осуществляет транспорт Na+ и K+ через мембрану клетки и участвует в гидролизе АТФ. Этот транспорт не только поддерживает концентрацию ионного градиента между внутренними и внешними средами, но и контролирует генерацию мембранного потенциала и нервную проводимость [62, 160]. На фоне окислительного стресса угнетается синтез оксида азота – основного регулятора расслабления сосудистой стенки, и активируется ядерный транскрипционный фактор (NF-kB), способствующий выделению субстанций, которые ухудшают микроциркуляцию, например, эндотелина-1 и ведут к развитию эндоневральной гипоксии [76, 176]. К тому же активирование транскрипционного фак- 18 тора Nf-kB непосредственно изменяет функцию многих генов, ответственных за синтез белков, являющихся компонентами клеток сосудистой стенки и других тканей организма [40]. Активация сорбитолового пути обмена глюкозы при сахарном диабете приводит к накоплению сорбитола в периферическом нерве. При активации полиолового пути повышается активность альдозоредуктазы, что влечет за собой истощение НАДФ-Н+ и ухудшение образования глутатиона – основного кофермента антиоксидантной защиты. НАДФ-Н+ является необходимым компонентом NO-синтазы, а недостаточное образование NО ухудшает кровоснабжение нерва. Так как мембраны шванновских клеток образованы в основном липидами, активация процессов перекисного окисления липидов способствует также их дестабилизации и разрушению [110]. 1.2. Состояние энергетического обмена при сахарном диабете В аэробных условиях большинство клеток организма получают энергию за счет окислительных процессов или полного расщепления биополимеров. В присутствии кислорода аденозинтрифосфат (АТФ) образуется почти исключительно за счет окислительного фосфолирирования. В анаэробных условиях клетка может синтезировать энергию в виде АТФ только за счет гликолитического разрушения глюкозы [68]. Таким образом, распад глюкозы является основным поставщиком энергии в организме. В процессе аэробного гликолиза из глюкозы образуются две молекулы пировиноградной кислоты. Пируват, через образование ацетил-КоА, поступает в цикл Кребса. В результате, в ходе аэробного распада глюкоза расщепляется до Н2О и СО2. Следовательно, аэробный гликолиз представляет собой процесс окисления глюкозы до пировиноградной кислоты в присутствии кислорода с образованием энергии в виде АТФ. Аэробный распад глюкозы происходит во многих органах и тканях и служит основным источником энергии для жизнедея- 19 тельности. Энергобаланс аэробного гликолиза если учитывать окисление 1 моля глюкозы составляет около 30 моль АТФ согласно современным представлениям [68]. То есть, биологическое значение аэробного расщепления глюкозы заключается в высвобождении и запасании энергии. В условиях недостатка кислорода включается анаэробный гликолиз, в результате которого пировиноградная кислота претерпевает дальнейшие превращения, обеспечивая при этом регенерацию НАД +, и образуется молочная кислота. В этих условиях гликолиз является единственным способом получения энергии для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Анаэробный распад глюкозы, в основном, наблюдается в мышцах, в эритроцитах, а также в других органах при ограниченном снабжении кислородом. Таким образом, за счет анаэробного распада глюкозы клетки обеспечиваются энергией при недостатке кислорода. Уровень лактата в крови является результатом равновесия между процессами его утилизации и образования. Кратковременный лактоацидоз встречается и у здоровых людей. Увеличение концентрации лактата в сыворотке крови может развиваться из-за нарушений метаболизма пирувата [44]. Так, при СД, сопровождающимся развитием гипоксии, снижается окислительное декарбоксилирование пирувата. Образование ацетил-КоА из пирувата нарушается, вследствие повышенного накопления лактата. Следовательно, снижается синтез АТФ и синтез глюкозы de novo, в том числе из лактата. Накопление лактата со сдвигом рН внутри клетки оказывает отрицательное влияние на активность всех ферментов: как следствие снижается активность пируваткарбоксилазы, которая катализирует глюконеогенез (синтез глюкозы из пирувата). Таким образом, одной из причин накопления молочной кислоты при СД может быть активация анаэробного гликолиза на фоне гипоксии тканей [187]. При этом нарушения в работе пируватдекарбоксилазного комплекса, могут приводить к ее накоплению [57]. В исследованиях Arbeláez A.M. установленно повышение количества лактата в своротке крови у больных СД второго типа, и нормализация показателей на фоне 20 компенсации СД, причем характер сахароснижающей терапии не влияет на уровень молочной кислоты [130, 196]. Снижение синтеза АТФ в тканях, по-видимому, связано со снижением синтеза, концентрации и активности ключевых ферментов гликолиза, пентозофосфатного цикла, некоторых энзимов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) и разобщением или снижением сопряженности тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования. Уменьшение содержания адениловых нуклеотидов может быть результатом интенсификации процессов, участвующих в утилизации макроэргических соединений, в частности, активности аденозинтрифосфатаз [120]. Уровень АТФ может варьировать в зависимости от тяжести и длительности течения СД. По данным литературы при СД второго типа наблюдается постепенное понижение АТФ в крови, что прямо пропорционально тяжести течения. По мере улучшения общих клинико-лабораторных показателей АТФ повышается, но не достигает нормальных значений. При давности диабета свыше 10 лет отмечается наибольшее снижение количества АТФ в крови [114]. У больных СД первого типа при декомпенсации отмечается тенденция к снижению содержания АТФ, причем после введения экзогенного инсулина полностью показатель не нормализуется [22, 65]. Авторами также показана обратная зависимость между повышенным уровнем лактата и сниженным уровнем АТФ. А в работах Laudahn G. не отмечено достоверных изменений обмена адениннуклеотидов при сахарном диабете [171]. Синтез АТФ в клетках находится в тесном взаимодействии с использованием ими кислорода. Основным показателем усредненного уровня глюкозы крови в течение двух месяцев является гликозилированный гемолобин, который образуется при неэнзиматическом присоединении глюкозы к α-аминогруппе N-терминального остатка валина β-цепи. Также глюкоза соединяется с α-аминогруппой N- терминального конца валина α-цепи и с ε-аминогруппами конечных лизиновых остатков α- и β-цепей. Увеличенное гликозилирование гемоглобина вызывает изменение его свойств. При блокировании NH2-терминальной группы β-цепи гексозой заметно уменьшается его связывание с 2,3-дифосфоглицератом и изменяется 21 связывание кислорода с гемоглобином. Поэтому высокие уровни HbA1c могут способствовать развитию гипоксии [184]. Известно, что тканевая гипоксия развивается также и вследствие нарушения использования, потребления кислорода тканями, то есть при нарушении окислительно-восстановительных процессов. Они могут быть связаны: а) либо с повреждением ферментов цитохромоксидазы, которая активирует молекулярный кислород, поступающий из крови в тканевую жидкость; б) либо с повреждением активности дегидрогеназных ферментов, осуществляющих отрыв атома водорода от окисляемых органических веществ. При повреждении любого звена окислительно-восстановительной системы потребление кислорода тканью замедляется, уровень окислительно- восстановительных процессов снижается [47]. У больных СД гипоксия тканей связана с замедлением процессов окисления и потерей способности клеток утилизировать кислород вследствие паралича тканевых дыхательных ферментов. Известно, что важную роль в окислительно-восстановительных процессах играет глутатион (GSH), который легко окисляется, восстанавливается и активизирует некоторые ферменты в клетках. Уровень восстановленного и окисленного глутатиона косвенно характеризует тканевое дыхание [191]. В литературе имеются неоднозначные данные о внутриклеточном содержании глутатионзависимых ферментов. В исследованиях обнаружено повышение активности глутатионпероксидазы (ГПО) в эритроцитах при СД второго типа [185], у других авторов опубликованы данные об отсутствии изменений [133, 200] или о понижении данного показателя относительно группы контроля [167]. У больных диабетом первого типа так же по данным одних авторов активность ГПО уменьшалась [180, 186], по данным других авторов она не изменялась [200] или повышалась [173] по сравнению со здоровой группой. В связи с этим, можно думать, что при СД обоих типов клетки страдают от дефицита GSH, поставщика восстановительных эквивалентов в катализируемх ГПО реакциях [120, 173, 200], а также, в целом, от падения уровня тиоловых групп в восстановленном состоя- 22 нии [80, 180]. Таким образом, тщательное изучение глутатионзависимых систем поможет объяснить этапы развития и прогрессирования осложнений при сахарном диабете. Литературные данные свидетельствуют о том, что по мере развития диабета фосфорилирование в тканях значительно затормаживается и, следовательно, коэффициент сопряжения фосфорилирования и дыхания резко снижается. Гипоксия, по мнению одних исследователей, при СД является следствием артериальной гипоксемии, обусловленной нарушением оксигенации крови в легких. Другие связывают ее со снижением сосудистой проницаемости, обусловленной диабетической капилляропатией. Третьи полагают, что в генезе тканевой гипоксии главное значение имеет первичное нарушение метаболических и ферментативных процессов, которое приводит к пониженной способности утилизировать кислород [201, 163]. Таким образом, при активации анаэробного гликолиза на фоне сахарного диабета изучение процессов окислительного фосфорилирования и накопления молочной кислоты могут помочь в уточнении некоторых звеньев патогенеза данного заболевания. 1.3. Нарушение обмена веществ у больных сахарным диабетом Инсулин - самый мощный сахароснижающий анаболический гормон, принимающий участие в процессе обмена веществ и обеспечивающий жизнедеятельность организма. Это гормон немедленного действия, который быстро синтезируется и секретируется. Общее количество накопленного в островках поджелудочной железы инсулина составляет приблизительно 200 ЕД, а скорость синтеза в сутки - 30 ЕД у взрослого человека. Инсулин и С-пептид выделяются в систему воротной вены и поступают в печень, которая задерживает около 50-60% гормона. Инсулин активно участвует в процессах регуляции обмена веществ. Стимуляция инсулином приводит к увеличению скорости утилизации глюкозы клетками в 2040 раз. Происходит это за счет 5-10-кратного увеличения содержания белков- 23 транспортеров глюкозы на поверхности мембраны, при одновременном снижении их содержания внутри клетки на 50-60% [86, 108, 125]. Биологическое действие инсулина заключается в регуляции реакций метаболизма: обмена углеводов, липидов и белков, и в том числе митогенных процессов роста, дифференцировки тканей, транскрипции генов и синтеза ДНК. [124]. Инсулин стимулирует белоксинтезирующую активность клеток путем увеличения образования всех типов РНК и активирования связывания аминокислот с т-РНК. Клинические проявления СД обусловлены нарушениями различных видов метаболизма: углеводного, липидного, белкового и водно-солевого, что связано с функциональными изменениями в геноме и белоксинтезирующем аппарате клеток [125]. Основная причина большинства проявлений СД – абсолютный дефицит инсулина в случае СД первого типа или недостаточное его действие и/или неадекватная секреция, а также недостаточное действие гормона на периферии при СД второго типа. При диабете главным звеном нарушений метаболизма углеводов, жиров белков является недостаточность функционирования инсулина в тканяхмишенях [43]. Возникающая гипергликемия, блокирует углеводный обмен. В жировой ткани, скелетных мышцах, миокарде затрудняется активный транспорт глюкозы из крови и внеклеточной жидкости внутрь клеток. Замедление поглощения глюкозы этими тканями, депонирующими ее в нормальных условиях жизнедеятельности в мышцах в форме гликогена, а в жировой ткани в виде липидов, существенно отражается на энергетическом обеспечении всего организма [78]. В норме клетки печени свободно проницаемы для глюкозы, а скорость ее поступления в клетку зависит от скорости ее внутриклеточного фосфорилирования, которое осуществляется высокоспецифичной глюкокиназой. При недостатке инсулина в первую очередь тормозится глюкокиназная реакция (гексокиназа) и тем самым затрудняется начальный этап усвоения молекулы глюкозы - её фосфорилирование. Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ. Глюкокиназа обеспечивает утилизацию глюкозы при более высоких концентрациях в клетках. Тормо- 24 жение биосинтеза этих ферментов, вовлекающих глюкозу в энергетический обмен клеток, приводит к нарушению дальнейших этапов метаболизма [86]. Инсулиновая недостаточность приводит к нарушению всех видов обмена веществ. Недостаток инсулина проявляется в нарушении транспорта глюкозы из периферического сосудистого русла в клетки инсулинзависимых тканей. В результате в организме развивается состояние недостатка энергии, в силу чего активируются все катаболические процессы. Это приводит к существенному повышению содержания в крови антагониста инсулина - глюкагона. Так как инсулин больше не сдерживает процессы, которые глюкагон стимулирует в печени, продукция глюкозы в результате распада гликогена и глюконеогенеза резко возрастает. В то же время потребление глюкозы печенью, мышцами и жировой тканью снижается. Также гипергликемия нарастает и из-за повышения концентраций других контринсулярных гормонов – адреналина, кортизола и гормона роста. Повышение уровня глюкозы в крови выше почечного порога (7-9 ммоль/л) вызывает глюкозурию, которая сопровождается полиурией, так как избыток глюкозы, вследствие ее высокой осмотической активности, увлекает за собой большое количество жидкости при выведении с мочой. Дефицит глюкозы в клетках приводит к более активному использованию в качестве источника энергии жиров. Всё количество образующегося при этом ацетил-КоА не способно сгорать в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), к тому же скорость потребления ацетил-КоА в нем падает в связи с уменьшением количества промежуточных продуктов обмена углеводов, которые в норме активируют начальные процессы ЦТК. При этом часть ацетил-КоА расходуется на синтез кетоновых тел, где окисляется до ацетоацетата и β-гидроксимасляной кислоты. Накопление кетоновых тел в организме вызывает развитие метаболического кетоацидоза. Компенсаторно организм пытается снизить содержание в крови продуктов, вызвавших закисление внутренней среды, и выводит их с мочой (кетонурия) и выдыхаемым воздухом. Поскольку органические анионы ацетоуксусной и β-гидроксимасляной кислот связаны с ионами Na+ и К+, происходит их выведение с мочой, а почечные канальца пытаются заменить утраченные ионы катионами и реабсорбируют Н+ и ионы NH4+. Нарастающий 25 ацидоз компенсируется за счет буферных систем, в частности гидрокарбоната натрия. По мере нарастания ацидоза и истощения емкости буферных систем развивается некомпенсированный метаболический ацидоз, приводящий к компенсаторной гипервентиляции легких, что способствует дополнительной потери жидкости через легкие [30, 77]. Недостаток инсулина усиливает также катаболизм белков организма. Образовавшиеся при этом аминокислоты включаются в процесс глюконеогенеза, что ведёт, в первую очередь, к усугублению гипергликемии, во вторую, к потере аминокислот и нарушению синтеза белка и, в третью, к росту синтеза мочевины и, как следствие,- к отрицательному азотистому балансу. Наиболее опасным последствием вышеперичисленных нарушений является наступление диабетической комы. Развитие её связано с появлением гиперосмотической дегидратации в связи с выделением с мочой большого количества растворимых веществ - глюкозы, кетоновых тел, азотсодержащих соединений и ионов натрия. Дегидратация клеток с поражением функций мозга ведёт к возникновению диабетической комы [78, 86]. При сахарном диабете активируются процессы неферментативного гликозилирования, представляющие собой распространенный вид посттрансляционной модификации белков Они могут протекать в тканях здоровых людей, но с большей скоростью происходят у лиц с гипергликемией. При этом глюкоза и другие моносахариды ковалентно связывается с NH2-группами некоторых аминокислот. Такая модификация отмечается для многих белков, включая гемоглобин (Нb), белки эритроцитарных мембран, белки хрусталика глаза, альбумин, фибриноген, инсулин, коллаген, трансферрин, глобулины, миелины, а также все классы липопротеинов. Важно отметить, что гликозилированный гемоглобин связывает необратимо кислород, ухудшая его доставку тканям. Неферментативное гликозилирование может изменять некоторые физико-химические и функциональные свойства белков и таким образом играть существенную роль в развитии диабетических осложнений [41, 58]. Вследствие недостатка инсулина происходит недостаточное использование глюкозы инсулинозависимыми тканями, в первую очередь печенью, мышечной и 26 жировой. А в инсулиннезависимых тканях (эндотелии сосудов глаз и почек, нервной ткани) усиливается превращение глюкозы по полиоловому пути утилизации глюкозы или сорбитоловому, в котором глюкоза восстанавливается до многоатомного спирта сорбитола с последующим его окислением во фруктозу. Ферменты, регулирующие эти реакции, не чувствительны к инсулину и поэтому их активность полностью определяется доступностью субстратов. Следовательно, при повышении концентрации глюкозы увеличивается и скорость образования сорбитола и фруктозы. Ферментом, лимитирующим скорость этих двух последовательных реакций, служит сорбитолдегидрогеназа, в связи с этим в тканях накапливается в больших количествах сорбитол, чем фруктоза. В физиологических условиях скорость функционирования сорбитолового пути незначительна (до 1%), но при диабете интенсивность ее значительно возрастает (до 10%). Сорбитол накапливается в инсулиннезависимых тканях в нефизиологических количествах, вызывая деформацию клеток, их перерастяжение, которое сопровождается нарушением их функциональной активности. Так как сорбитол является активным осмотическим веществом, то развивается выраженный гиперосмолярный отек. В результате происходит гидратация клеток с накоплением ионов Na+ и одновременной потерей ионов К+. Накопление сорбитола в клетках сопровождается уменьшением в них уровня миоинозитола - важнейшего предшественника фосфолипидных компонентов клеточных мембран. Активность гликозилирования белков и сорбитолового пути не регулируется гормонами и зависит только от уровня глюкозы в крови. Литературные данные свидетельствуют о накоплении высоких концентраций сорбитола и фруктозы при сахарном диабете в эритроцитах, хрусталике, спинномозговой жидкости, нервах больных, именно в тех тканях, в которых развиваются диабетические осложнения. Эти соединения не способны диффундировать через клеточную мембрану, что является биохимической основой развития таких осложнений сахарного диабета как ретинопатии, полинейропатии и нефропатии [43, 198]. Таким образом, при СД нарушаются все виды обмена веществ. Особенно страдает углеводный обмен, что характеризуется гипергликемией за счет усиле- 27 ния гликогенолиза и глюконеогенеза, торможения пентозофосфатного пути. Изменение жирового метаболизма проявляется стимуляцией липолиза, усилением ßокисления жирных кислот и повышенным образованием ацетил-КоА, активацией биосинтеза кетоновых тел и холестерина. Изменения в белковом обмене проявляются увеличением распада белков, увеличением синтеза мочевины и нарушением биосинтеза гликопротеинов. 1.4. Механизмы образования свободных радикалов в организме Кислород необходим для поддержания жизни любого организма и нормального обмена веществ. Однако именно он может быть источником свободных радикалов - молекул с нечетным количеством электронов, что придает таким молекулам высокую реакционную способность. Свободные радикалы могут возникать в организме в избыточном количестве вследствие курения, под воздействием различных внешних химических веществ, гипероксии, избыточного потребления углеводов и липидов, а также при недостаточном их расходовании, при гиподинамии на фоне низкого уровня биологического ферментативного окисления и сопровождаться снижением восстановления пиридиннуклеотидов и тд. [17]. В организме в прцессе с участием клеточных оксидазных систем, ксантиноксидазы и НАД/НАДФ оксидазы метаболизма образуются и генерируются свободные радикалы или супероксиды. Окислительные процессы в организме связаны с использованием кислорода по двум путям: оксидазному и оксигеназному. Основной путь – это оксидазный, который сопряжен с синтезом и ресинтезом АТФ - главного источника энергии в организме. При этом не происходит включение кислорода в молекулу окисляемого субстрата, а присоединение к молекулярному кислороду (О2) 4-х электронов приводит к образованию воды. Окисление энергетических субстратов реализуется конечным звеном дыхательной цепи - цитохромоксидазой. 28 Оксигеназный путь характеризуется включением одного или двух атомов кислорода в молекулу окисляемого субстрата, что происходит, в основном, в системе микросомального окисления, содержащей цитохром Р-450 [103]. Образование активных форм кислорода может отмечается в митохондриях, где при транспорте электронов к цитохромоксидазе может происходить «сброс» одного электрона на кислород. При окислении различных субстратов в оксигеназном пути не происходит полного восстановления кислорода до воды, что вызывает образование активных формы кислорода, такие как супероксидный анион, перекись водорода и гидроксильный радикал, обладающий значительной разрушительной способностью [208]. Активные кислородные метаболиты реагируют с фосфолипидами клеточных мембран, и прежде всего с арахидоновой и докозогексеновой кислотами с образованием продуктов перекисной модификации липидов. Таким образом, генерация свободнорадикальных частиц в биологических системах играет существенную роль в ходе важных физиологических и патологических процессов [63]. Свободно-радикальное окисление липидов является неотъемлемой частью многих жизненно важных физиологических процессов, которые протекают в организме на всех уровнях: от регуляции активности внутриклеточных ферментов до регуляции сердечно-сосудистой системы, нервной регуляции сократительной функции желудка, капилляров, внешнего дыхания, скорости апоптоза, участия в экспрессии различных генов, ответственных за синтез белков, которые необходимы для обеспечения нормальных физиологических процессов и участия в развитии патологических структур различных тканей организма. Свободные радикалы участвуют в переносе электронов флавиновыми элементами, окислительном фосфорилировании в митохондриях, обновлении состава липидов биологических мембран, делении клеток, проведении нервного импульса, в метаболизме лейкотриенов и простаноидов, а также защищают организм от бактерий, регу- 29 лируют метаболизм кальция и выполняют другие не менее важные функции [48, 156, 183]. Многие свободные радикалы цитотоксичны, так как стремятся получить дополнительный второй электрон от других молекул, нарушая и, тем самым, повреждая их структурную организацию [62]. В каждой клетке, осуществляющей аэробный метаболизм, имеются необходимые условия для протекания реакций перекисной модификации биомолекул, в частности липидов. Это обусловлено тем, что субстратами перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются фосфолипиды, которые входят в состав плазматических и внутриклеточных мембран. В патологический процесс, в первую очередь, вовлекаются фосфолипиды мембран клеток, богатые полиненасыщенными жирными кислотами [24, 174, 177]. Таким образом, мембраны клеток богатые полиненасыщенными жирными кислотами и являются основными субстратами для перекисного окисления липидов [162, 197]. Процессы липопероксидации активно контролируют регуляцию транспорта веществ через мембраны клеток и является одним из основных механизмов нарушения их функциональной способности [24, 95, 181, 209]. Клеточным мембранам принадлежит ведущая роль в обеспечении жизнедеятельности клеток, а также при выполнении клетками специфических функций, важных для всего организма в целом. Главную роль в ингибировании перекисной модификации биомолекул может играть структурная организация их клеточных стенок [81]. На основании экспериментальных и клинических работ было установлено, что при сахарном диабете изменяется состояние клеточных мембран за счет активно протекающих процессов пероксидации липидов [52, 69, 70, 88, 102, 168, 205]. Процессы ПОЛ представляют собой окисление молекулярным кислородом полиненасыщенных жирнокислотных остатков фосфолипидов биологических мембран [24] и включают следующие стадии: инициирование, удлинение, разветвление, обрыв цепей окисления. Главная роль в инициировании перекисных 30 реакций принадлежит активным формам кислорода, таким как супероксидрадикал, синглетный кислород, гидроксил-радикал. Инициирование цепи: Радикал гидроксила, будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом в липидном слое мембран образуются липидные радикалы: НО•+ LH → Н2О + L • Липидный радикал (L•) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом, являющимся бирадикалом; при этом образуется новый свободный радикал - радикал липоперекиси (LOO•): L• + •O•2 → LOO• Продолжение цепи: Радикал LOO• атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L•: LOO• + LH → LOOH + L• Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов. Разветвление цепи: Существенное усиление пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. При этом происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe2+ c гидроперекисями липидов: Fe2+ + LOOH →Fe3+ + HO- + LO• Образующиеся радикалы LO инициируют новые цепи окисления липидов: LO• + LH → LOH + L•; L• + •O•2 → LOO• → и т. д. Обрыв цепей: В клеточных мембранах цепи могут состоять из десятка и даже более звеньев. В итоге цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с 31 антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe2+) [34] или друг с другом: LOO• + Fe2+ + H+→ LOOH + Fe3+ LOO• + InH → In• + LOOH LOO• + LOO•→ молекулярные продукты + фотон Диеновые конъюгаты (ДК), являющиеся первичными продуктами ПОЛ, относятся к токсическим метаболитам, которые оказывают деструктивное действие на липопротеиды, ферменты, белки и нуклеиновые кислоты. Следующимиими продуктами перекисной модификации липидов являются альдегиды и кетоны (малоновый диальдегид и др.), которым принадлежит важная роль в синтезе простагландинов, прогестерона и других стероидов. При взаимодействии диальдегидов со свободными группами мембранных соединений образуются конечные продукты перекисного окисления липидов (основание Шиффа и др.), непрерывное накопление которых дестабилизирует биомембраны и способствует деструкции клеток [39, 59, 207]. Липоперекиси представляют собой неустойчивые соединения, которые легко подвергаются дальнейшим превращениям с образованием более устойчивых, но токсичных, вторичных продуктов окисления, в том числе малонового диальдегида (МДА) [53, 150, 203, 214]. Это химически очень активное вещество, своими альдегидными группами взаимодействует с NН2-группами белков, вызывая их необратимую денатурацию [194]. По концентрации данного вещества судят об интенсивности перекисного окисления в биологических жидкостях. Избыточное образование продуктов перекисного окисления липидов проявляется повреждением мембран эритроцитов, лизосом. При этом изменяется структура мембран клеток, вплоть до их разрыва, ингибируется активность цитохромоксидазы. Наряду с повреждением липидного слоя при активации ПОЛ происходит модификация мембранных белков. В первую очередь поражаются сульфгидрильные группы, что способствует появлению катионной и анионной проницаемости мембран митохондрий и их набуханию, появлению катионной проницаемости у мембран эритроцитов, что приводит к их коллойдно- 32 осмотическому гемолизу, выходу Ca2+ из саркоплазматического ретикулума. Рост концентрации Ca2+ в клетке вызывает активацию мембранных фосфолипаз и интенсификацию ПОЛ, что обусловливает изменения деформируемости мембран, структуры белкового цитоскелета и белок-липидных взаимодействий. При этом может происходить трансформация эритроцитов, которая и будет сопровождаться всплеском H+ и выбросом K+. В эритроцитах в условиях длительной гипергликемии при СД установлено изменение активности ключевых эритроцитарных энзимов пентозного цикла и гликолиза [34, 67, 103]. Происходит постоянное образование алкильных липидных радикалов, которые инициируют окисление новых молекул субстрата, в результате чего циклы свободнорадикального окисления постоянно возобновляются, процесс носит цепной характер и может продолжаться бесконечно [97]. Таким образом, свободнорадикальное окисление протекает в норме, но с низкой интенсивностью. Постоянно протекающие в клеточных стенках реакции перокисной модификации, способствуют обновлению их липидного состава и поддержанию определенной активности всех липидзависимых мембранносвязанных ферментов, к которым относятся практически все ферментные системы организма. Следовательно, ПОЛ является необходимым участником поддержания структурного гомеостаза организма. Реакции, в которых принимает участие избыток активных форм кислорода, повреждают и оказывают деструктивное действие на клетки [23, 50, 89, 182]. Они способствуют развитию многих заболеваний: атеросклероза, катаракты, артритов, рака, инсульта [32], инфаркта, воспалительных, инфекционных и аутоиммунных процессов [37, 115, 121, 123], а также и сахарного диабета [53, 56, 93]. 1.5. Окислительные процессы, связанные с образованием свободных радикалов при сахарном диабете Процессы окисления постоянно происходят в организме человека, являясь одним из компонентов метаболизма [7]. Образующиеся при этом активные соеди- 33 нения кислорода (перекись водорода, супероксид анион, гидроксил радикал) в норме подвергаются воздействию антиоксидантной системы, которое ведет к их дезактивации. Непрерывное образование и разрушение свободных радикалов поддерживает баланс между перекисным окислением липидов и антиоксидантной системой [35]. Нарушение этого равновесия приводит к дисбалансу в системе оксиданты-антиоксиданты, который, по данным литературы, сопровождает ряд патологических процессов и заболеваний, в том числе и сахарный диабет [87]. Любая стрессорная реакция организма сопровождается кратковременным повышением интенсивности свободно-радикальных процессов и развитием окислительного стресса. В ответ на это происходит активация антиоксидантной системы клетки (АОС), своевременное и скоординированное действие которой важно для понижения уровня реакционноспособных соединений и предотвращения их токсического действия на ткани организма. Таким образом, окислительный стресс можно охарактеризовать как реакцию адаптации организма к экстремальным воздействиям. Конечный результат адаптации - приспособление к новым условиям окружающей среды или срыв адаптивных механизмов, следствием которого является развитие патологического процесса [48]. Срыв адаптации сопровождается переходом физиологического окислительного стресса в патологический, т.е. неуправляемый, проявляющийся свободнорадикальными повреждениями биополимеров: углеводов, липидов, белков и нуклеиновых кислот [53]. Патологический окислительный стресс является единой патогенетической основой целого ряда состояний таких как воспалительные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания [212], заболевания печени [72], стрессовые состояния, ожоговая болезнь, атеросклероз и др., в том числе и сахарного диабета. Патологический окислительный стресс сопровождается резкой интенсификацией свободно-радикальных процессов, истощением и дисбалансом ферментативных и неферментативных компонентов антиоксидантной защиты [206]. Можно сказать, что окислительный стресс - это состояние напряжения антиоксидантной системы [202]. Показано, что по мере прогрессирования патологических процессов отмечается напряженность в функционировании системы антиоксидантной защиты. 34 Идет истощение в первую очередь ферментативной антиоксидантной системы, активность ферментов-антиоксидантов ингибируется активными формами кислорода. Деструктивному воздействию подвергаются и компоненты биологической АОС [82]. Развитию окислительного стресса при СД способствуют различные нарушения обменных процессов: изменения секреции инсулина, гипергликемия, дислипидемия и истощение антиоксидантных резервов организма. Кроме этого, повышенный уровень глюкозы способствует развитию дисбаланса окислительного фосфорилирования и повышению концентраций супероксидного анион-радикала, перекиси водорода и гидроксильных радикалов [114]. Окислительный стресс при СД может быть следствием следующих механизмов: а) повышенного образования реактивных оксидантов при окислении, как самих углеводов, так и углеводов, комплексирующихся с различными белками, а также в результате аутоокисления жирных кислот в триглицеридах, фосфолипидах и эфирах холестерина б) снижения активности антиоксидантной системы в организме, которая представлена глютатионом, глютатионпероксидазой, каталазой, супероксиддисмутазой, витаминами А, Е и С и другими антиоксидантами (таурин, каротин, мочевая кислота и убихинон); в) нарушения митохондриального окисления, ферментов полиолового обмена глюкозы, обмена простагландинов и лейкотриенов [14, 40]. Пусковым механизмом окислительного стресса при СД первого и второго типов и их осложнениях считается нарушение обмена глюкозы. Гипергликемия при обоих типах диабета реализуется как патогенетический аспект окислительного стресса, за счет нескольких механизмов, опосредованно индуцируя стресс-чувствительные внутриклеточные сигнальные пути и приводя к развитию диабетических осложнений, инсулинорезистентности или нарушению секреции инсулина [49]. Гипергликемия активирует многочисленные сигнальные механизмы в клетке: усиление полиолового пути обмена глюкозы, что истощает цитозольный уровень НАДФН и впоследствии GSH, повышение аутоокисления глюкозы с об- 35 разованием конечных продуктов гликирования, повреждающих белки и активирующих рецепторы конечных продуктов гликирования, использующие АФК в качестве вторичных мессенджеров, что приводит к активации протеинкиназы С с последующим усилением гипергликемии, а также тканевой гипоксии [140]. А гипергликемия будет усиливать интенсивность образования свободных радикалов [210]. В свою очередь, свободные радикалы сами могут способствовать развитию гипергликемии [213]. Неферментативное гликирование вследствие аутоокисления глюкозы также способствует развитию оксидативного стресса, т.к. гликированные белки являются источником радикалов [188]. В свою очередь, повышение внеклеточной или внутриклеточной концентрации глюко зы через аутоокисление глюкозы, гликирование белков с образованием конечных продуктов гликирования и полиоловый путь обмена, лежат в основе развития оксидативного стресса [134]. Гипергликемия развивается вместе с гиперлипидемией. Цитозольные отложения триглицеридов в нежировой ткани усиливают утечку АФК из работающих митохондрий за счет подавления активности аденозиннуклеотидтранслоказы, приводя к снижению АДФ. Уменьшение концентрации АДФ замедляет движение электронов по электрон-транспортной цепи, и возрастает вероятность неполного восстановления кислорода с образованием супероксидных радикалов [154]. Активация протеинкиназы С супероксидными анионами индуцирует синтез НАД(Ф)Н-оксидазы, что значительно увеличивает продукцию супероксида [49]. Полиоловый (сорбитоловый) путь также запускается гипергликемией. Глюкоза восстанавливается в сорбитол альдозоредуктазой при окислении никотинамидных коферментов. Затем сорбитол окисляется сорбитолдегидрогеназой до фруктозы с восстановлением никотинамидных коферментов. Этот путь является единственным источником непарных нестабильных электронов за счет процесса восстановления и создает восстановительный стресс [85]. Избыточный уровень глюкозы может быть источником свободных радикалов, углеводы подвергаются аутоокислению с образованием перекиси водорода и гидроксильных радикалов [147]. При аутоиммунном процессе ак- 36 тивированные макрофаги и β-клетки поджелудочной железы могут синтезировать свободные радикалы [41]. β-клетки островков Лангерганса поджелудочной железы высокочувствительны к повреждающему действию оксидантов [179]. АФК способствуют развитию β-клеточной дисфункции и приводят к их гибели. Свободные радикалы повреждают такие макромолекулы их внеклеточного матрикса, как липопротеиды и ДНК [134]. При СД первого типа осуществляется гибель клеток поджелудочной железы аутоиммунной атакой и действием цитокинов. АФК также нарушают функции β-клеток при сахарном диабете второго типа [146]. Накопление свободных радикалов инактивирует ферменты, содержащие ионы металлов. Оксидативный стресс приводит к снижению внутриклеточного содержания Zn с индуцируемой цитокинами активацией аутоиммунного процесса, разрушающего островковые клетки. В настоящее время активно изучается участие свободнорадикальных процессов в патогенезе сахарного диабета и его осложнений [6, 12, 51, 144, 145, 180, 211]. Результаты многочисленных исследований указывают на активацию свободнорадикального перекисного окисления липидов на разных стадиях и при разных клинических вариантах сахарного диабета. Так обнаруживается усиление генерации прооксидантов и связанное с этим накопление продуктов окислительной модификации липидов, белков, нуклеиновых кислот. В исследованиях Хоробрых О.Ю. выявлено, что у длительно болеющих СД второго типа интенсивность хемилюминесценции увеличивается в 2 раза, а у больных с впервые выявленным СД второго типа в 4 раза по сравнению с эритроцитами здоровых людей. При СД первого типа интенсивность хемилюминесценции повышается в 3,2 раза. Интенсификация хемилюминесценции свидетельствует об усилении перекисного окисления в эритроцитах [117]. При СД первого типа уровень малонового диальдегида в сыворотке крови увеличивается в 1,9 раза [20], по данным Martin-Gallan P. в 1,5 раза [180], по сравнению с группой контроля. При этом имеются данные и о том, что уровень 37 вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида в фазах компенсации и декомпенсации соответствует в группе больных СД первого типа контрольному [31], что может свидетельствовать о высоком уровне функционирования АОС. На фоне нормального содержания МДА происходило снижение содержания первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) у больных в субкомпенсированном состоянии. В условиях декомпенсации уровень ДК повышался до контрольного [31]. Имеются неоднозначные данные о содержании ДК в крови больных инсулинзависимым СД: достоверное повышение концентрации первичных продуктов ПОЛ в 1,3 раза относительно контрольных значений, уровень ДК не отличался от нормы и был ниже контроля в 1,4 раза [97]. Исследование маркера активности ПОЛ-МДА у больных СД второго типа, выявило достоверный рост его в сыворотке крови на 27,3% относительно уровня в контрольной группе, что также свидетельствует об усилении процессов липидной пероксидации [85]. В исследованиях Komosinska-Vassev et al. обнаружено увеличение концентрации МДА, ГП и ДК в плазме крови при хорошем гликемическом контроле. А неудовлетворительный контроль значительно усугубляет активацию процессов ПОЛ [167]. В то же время имеются данные, которые показали, что в эритроцитах количества ТБК-активных продуктов увеличено на 61% с плохой компенсацией у лиц с СД первого и второго типов, и не было изменено у пациентов с нормальным уровнем гликемии [183]. Это согласуется с данными исследований, в которых показано снижение выраженности окислительного стресса в результате проведения адекватной сахароснижающей и инсулиновой терапии, сопровождающейся улучшением гликометаболического статуса, у пациентов с СД первого [218] и СД второго типов [133, 218]. Высокое содержание ДК и МДА у больных сахарным диабетом могут свидетельствовать о быстром образовании и накоплении высокореакционных радикалов, обладающих способностью вступать в реакцию цепного окисления липидов мембранных структур и способствующих накоплению продуктов пероксидации [60]. 38 Как известно, повреждение белков в результате гликозилирования может служить фактором риска развития неблагоприятных последствий при сахарном диабете. Неферментативное гликирование белковых аминогрупп приводит вначале к образованию легко обратимых шиффовых оснований в ходе реакции Мэйларда с последующим их превращением в более стабильные продукты Амадори. Затем они могут диссоциировать с высвобождением свободной глюкозы и молекулы протеина или через стадию 3-дезоксиглюкозона, медленно превращаются в стабильные и неподдающиеся расщеплению конечные продукты неферментативного гликирования (пентозидин, пирралин, карбоксиметиллизин, имидазоллон и др.) [137]. Они являются и активными интермедиатами в межбелковых соединениях и генерации активных форм кислорода. Доказано, что в результате гликирования в белках образуются ферментоподобные активные центры, которые представляют собой перекрестно связанные катион-радикалы шиффовых оснований протеинов и имитируют характеристики металлсодержащих окислительных систем, катализирующих генерацию АКМ [220]. Процессы неферментативного гликирования и ПОЛ включают аналогичные реакции и промежуточные продукты и ведут к идентичным модификациям лизиновых остатков. Таким образом, оба процесса усиливают друг друга [80]. В нормальных условиях у человека гликозилировано 1,3-2% лизиновых остатков в липопротеинах низкой плотности (ЛПНП), а при диабете их число возрастает в 2-3 раза. В первую очередь гликированию подвергаются апо В и фосфолипидные компоненты ЛПНП, что повышает их подверженность к окислительной модификации [160]. На фоне активации процессов липидной пероксидации с накоплением высокотоксичных продуктов перекисной модификации биомолекул и нарушениями в системе АОЗ, у больных СД наблюдается выраженный дисбаланс в липопротеиновом спектре крови. Диабетическая дислипидемия имеет свои особенности и представляет особый вариант атерогенной дислипопротеинемии. Атерогенные дислипидемии - это преобладание фракций липопротеинов, трансформирующих холестерин в пери- 39 ферические клетки над липопротеинами, акцептирующими холестерин с клеточных мембран и транспортирующими его в печень, где происходит катаболизм холестерина [75]. Диабетическая дислипидемия характеризуется гипертриглицеридемией (ТГ), увеличением содержания липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), снижением концентрации липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Гипертриглицеридемия способствует увеличению ЛПОНП, снижению ЛПВП, постпрандиальной гиперлипидемии, нарушению свертываемости крови и увеличению малых, плотных ЛПНП [40]. При сахарном диабете преобладают мелкие и плотные гранулы ЛПВП, поскольку они легче проникают через стенки сосудов, кроме того, они более чувствительны к окисляющим соединениям, а сродство их связывания с рецепторами ЛПВП ниже чем у промежуточных или легких форм ЛПВП [98]. Коррекция гиперлипопротеидемий при СД уже давно привлекает внимание исследователей и клиницистов. Из немногихх препаратов, оказывающих гиполипидемическое действие, изучению подверглись препараты эссенциальных фосфолипидов (ЭФЛ) (эссенциале, липостабил) у больных СД и первого и второго типов, осложненными ангиопатией [45]. Между тем исследования, касающиеся применения ЭФЛ у больных СД с полинейропатией отсутствуют. Эссенциальные фосфолипиды по своей химической структуре соответствуют естественным фосфолипидам организма, однако в функциональном отношении превосходят их благодаря высокому содержанию в 1-м и 2-м положениях молекулы полиненасыщенных жирных кислот, особенно линоленовой кислоты [111]. Имеются данные, что под влиянием ЭФЛ происходит улучшение показателей липидного спектра плазмы крови и как следствие уменьшение резистентности к инсулину периферических тканей [45]. ЭФЛ оказались эффективными также в отношении уменьшения клинических симптомов, снижения гликированного гемоглобина, увеличения ХС ЛПВП, снижения ригидности клеточных мембран, причиной которого является повышенное проникновение в них холестерина и улучшение функции инсулиновых рецепторов в эритроцитах. Эссенциальные фосфолипиды могут стать важным дополнительным фактором в лечении больных диабетом, когда углеводный и липидный 40 обмен не могут в достаточной степени контролироваться диетой, инсулином или антидиабетическими препаратами, чтобы избежать или свести до минимума диабетические осложнения [83]. 1.6. Система антиоксидантной защиты организма Беспредельное увеличение количества свободных радикалов и гидроперекисей липидов должно было бы привести к быстрой деструкции клеточных структур, но в естественных условиях этого не происходит благодаря наличию в организме многокомпонентной системы биологических антиокислителей и естественных антиоксидантов, которые способны ингибировать свободнорадикальную модификацию биомолекул при химическом воздействии [10, 42]. Главные действие антиоксидантов связывают с наличием в их молекуле подвижного атома водорода с ослабленной связью, в результате чего он восстанавливает высокореактивные радикалы, заменяя их малоактивными радикалами антиоксидантов, которые не способны к продолжению цепи, и которые превращаются в стабильные молекулы за счет рекомбинаций [53]. В здоровой клетке работают хорошо сбалансированные механизмы системы ПОЛ-антиоксиданты по принципу обратной связи. Увеличение уровня антиоксидантов приводит к торможению перекисной модификации биомолекул, что, в свою очередь, вызывает изменение самих липидов. В липидах появляются легко окисляемые фракции, что ускоряет процессы их перекисного окисления. На фоне этого активируется ферментативное звено антиоксидантов, а также повышается расход неферментативных антиоксидантов, что способствует сбалансированности процессов [57]. В нормальных физиологических условиях наличие сложной многоуровневой системы защиты приводит к минимуму опасность бесконтрольного протекания свободнорадикальных процессов в клетке. Про- и антиоксидантная системы у человека, находясь в состоянии динамического равновесия, поддерживаются определенной организацией плазменных и клеточных липидов, динамической си- 41 стемой обмена мембранных фосфолипидов и холестерина, которые определяют начальный уровень жесткости и окисляемости клеточных мембран. Соотношение антиоксидантной и прооксидантной систем в тканях может меняться в зависимости от состояния организма, влияния различных факторов внешней среды [79]. Вредному воздействию активных форм кислорода на клетки и организм в целом препятствуют ферментативные и неферментативные компоненты антиоксидантной системы. 1.6.1. Ферментативное звено антиоксидантной системы В процессе эволюции в клетках для защиты от АКМ выработались специализированные системы ферментных антиоксидантов. Они характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенных форм АКМ; специфичностью клеточной и органной локализации; специфичностью использования металлов в качестве катализаторов, к которым относится медь, цинк, марганец, гемовое железо и селен [85]. Антиоксидантные ферменты играют важную роль в регуляции свободнорадикальных процессов, включают супероксиддисмутазу (СОД), каталазу (КТ), глутатионпероксидазу (ГПО), глутатионтрансферазу (ГТ) [92, 169, 204]. К ним также относятся глутатион, аскорбатзависимые ферментные системы, НАДH и НАДФH [93]. СОД и КТ не нуждаются в кофакторах, что делает их работу автономной, не зависящей от функционирования других клеточных структур. В то же время для работы глутатионзависимых ферментов необходим восстановленный глутатион, который синтезируется глутатионсинтетазой или восстанавливается в реакции с глутатионредуктазой [55]. Первый уровень защиты предусматривает возможность детоксикации потенциально опасных АФК с участием супероксиддисмутазы и каталазы, что позволяет предотвратить образование гидроксильного радикала при протекании реакций Фентон и Хабера - Вайса. 42 СОД представляет первое звено антиоксидантной защиты. Она катализирует реакцию дисмутации двух супероксидионрадикалов с образованием свободного кислорода и перекиси водорода (Н2О2). Супероксидный радикал и Н2О2 крайне реакционноспособны и могут быстро окислять любые биологические молекулы. Перекись водорода выводится благодаря активности каталазы и пероксидаз, а именно ГПО и ГТ. Каталаза является металлоферментом, локализуется в пероксисомах клетки и выполняет детоксикационную функцию, разлагая образующуюся в процессе биологического окисления перекись водорода на воду и молекулярный кислород (2H2O2 → 2H2O + O2). Участвуя в инактивации активных форм кислорода, супероксиддисмутаза и каталаза выполняют антиоксидантную роль [50]. В норме СОД эффективно утилизирует супероксидные радикалы. Снижение активности СОД более чем на 50% приводит к неконтролируемому развитию свободнорадикальных реакций и гибели клетки [66]. Дальнейшему прерыванию цепи свободнорадикального окисления способствуют глутатионзависимые ферменты – глутатионпероксидаза и глутатионтрансфераза, а также ферментные системы биорегенерации окисленного глутатиона. Глутатионпероксидаза катализирует реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов в стабильные соединения. Биорегенерация окисленного глутатиона, образующегося в глютатионпероксидазной реакции, осуществляется с участием глютатионредуктазы и систем восстановления никотинамиддинуклеозидфосфат (НАДФ+) [55, 166]. Таким образом, ключевым внутриклеточным антиоксидантом является глутатион. Глутатион (γ-глутамилцистеинилглицин) представляет собой трипептид, который состоит из остатков глутаминовой кислоты, цистеина и глицина и составляет около 90-95% всех небелковых тиолов [1]. К антиоксидантам непрямого действия можно отнести и предшественников глютатиона (глютаминовая кислота, цистеин, метионин), пиридиннуклеотиды (никотиновая кислота), индукторы протеаз (селенит натрия) [214]. Выделяют две основные формы глутатиона: восстановленная (GSH) и окисленная (GSSG) [122]. GSH выполняет огромную роль в защите от ксено- 43 биотиков и их метаболитов, участвует в обезвреживании органические соединения почти всех химических классов. GSH способствует транспорту глюкозы в кишечнике, а высокое соотношение GSH/GSSG повышает сродство Na+- зависимого переносчика глюкозы [1]. Глутатион содержится во всех клетках и тканях высших живых организмов и имеет важное значение для окислительно - восстановительных реакций в связи со способностью сульфгидрильной группы (SH-) цистеина вступать в обратимую связь [1]. Имеются литературные данные о том, что в условиях гипоксии глутатион может выступать в роли естественного акцептора электронов, а его защитное действие связано с восстановлением способности дыхательной цепи образовывать АТФ в первом пункте окислительного фосфорилирования [193]. Некоторые естественные соединения, такие как липоевая кислота и Nацетилцистеин увеличивают содержание клеточного глютатиона и участвуют в активности детоксифицирующих систем, снижая количество реактивных карбониловых промежуточных продуктов и, тем самым, уменьшая количество конечных продуктов гликозилирования. Глутатион является бифункциональным коэнзимом, обладающим как антиоксидантными, так и детоксифицирующими свойствами, т.е. защищает клетки от окислительного и карбонилового стресса [61]. Таким образом, глутатион в организме выполняет очень важные функции: защищает клетки от активных кислородных метаболитов, обеспечивает функциональную активность белков, в том числе и ферментов, сохраняет активность мембран, участвует в обмене эйкозаноидов. Он также является резервом цистеина, участвует в метаболизме ксенобиотиков, влияет на синтез нуклеиновых кислот, повышает резистентность к вредным факторам, влияет на пролиферативные процессы в тканях[122]. При сахарном диабете наряду с избыточным образованием активных форм кислорода, имеют место различные нарушения антиоксидантной системы. Есть данные о снижении активности каталазы и СОД [41, 151], а также глутатионпероксидазы, [193, 199], истощении внутриклеточного [132] и плазменно- 44 го глутатиона [99]. Механизм этого неоднозначен. С одной стороны, антиоксидантные ферменты могут повреждаться в результате гликирования или окисления, а с другой стороны, согласованное функционирование антиоксидантов может нарушаться при истощении одного из них [128]. Расходование НАДФН в полиоловом пути оборачивается ограничением перехода GSSG в GSH. Это лишает глутатионпероксидазу субстрата для связывания пероксида, который активно генерируется в реакции дисмутации с участием СОД. На уровень антиоксидантов может также влиять также отсутствие регулирующего действия инсулина. Данные многочисленных работ, в которых изучалось состояние антиоксидантной системы, довольно неоднозначны и зачастую противоречивы. Так при СД первого типа в эритроцитах содержание СОД может быть снижено [142], либо не изменено [157], другие авторы отмечают увеличение активности СОД при сахарном диабете первого типа [170, 180, 200]. Такая же неоднозначность изменений ферментативного звена антиоксидантной системы наблюдается и при СД второго типа. Kaji et al., обследуя 60 женщин с СД второго типа не обнаружили изменений в СОД-активности в эритроцитах по сравнению с 71 здоровыми женщинами из контрольной группы [164]. В то же время в другом исследовании показано, что даже при хорошем гликемическом контроле и при отсутствии диабетических осложнений при СД второго типа активность СОД повышена на 60% [167]. Это может говорить о способности систем компенсации противостоять свободнорадикальному окислению, но с другой стороны может привести к повышению концентрации перекиси водорода и, учитывая у этих пациентов снижение концентрации каталазы, спровоцировать дальнейшую деструкцию. СД осложняется многими метаболическими расстройствами, что усугубляет процесс свободнорадикального повреждения. У больных СД второго типа с гиперлипидемией выявлено значительное уменьшение содержания СОД, КТ и ГПО в эритроцитах [165]. При ангиопатиях наблюдалось двукратное увеличение активности СОД, а концентрация КТ у них снижалась [167]. В работе Bono et al. обнаружено повышение активности ГПО при СД второго типа [135], хотя в других исследованиях 45 обращают на себя внимание данные об отсутствии изменений [200], или о понижении данного показателя относительно контрольной группы [167]. При сахарном диабете первого типа наблюдается снижение активности каталазы [47, 60, 142]. В одних работах показано снижение активности глутатионпероксидазы в клетках красной крови при СД первого типа [180], по результатам же других исследований она не изменена [157, 200], либо повышена [173]. Аналогичные данные имеются и в отношении концентрации глутатионредуктазы в эритроцитах: она может возрастать, причем, как в стадию субкомпенсации, так и в условиях декомпенсации [31, 142], не изменяться [157] или уменьшаться [218]. При этом можно утверждать, что при диабете обоих типов клетки страдают от дефицита GSH, поставщика восстановительных эквивалентов в катализируемых ГПО реакциях и продукта глутатионредуктазной реакции [180, 218], а также в целом от падения количества тиоловых групп белков [180]. В исследованиях Хоробрых О.Ю. активность каталазы и пероксидазы в эритроцитах больных сахарным диабетом достоверно увеличивалась примерно в 1,5 раза. Активность глутатионредуктазы снижалась в 3 раза по сравнению с контролем. Активность СОД в эритроцитах у больных СД первого и второго типов снижалась в 1,4 раза, лишь у больных с впервые выявленным СД второго типа активность фермента в эритроцитах практически не отличалась от группы контроля. Степень изменения активности фермента зависит от степени тяжести заболевания. Падение активности ГР, СОД при СД свидетельствует о снижение антиоксидантной защиты в организме. Повышение активности КТ, ГПО, вероятно, является компенсаторным в ответ на повышение свободнорадикального окисления при сахарном диабете [117]. В литературе клинических наблюдений описано формирование окислительного стресса при СД [80, 152, 167]. Однако остаются малоизученными процессы свободнорадикального окисления и состояние антиоксидантной защиты в мембранах эритроцитов. 46 1.6.2. Неферментативное звено антиоксидантной системы Какова бы ни была причина усиления перекисной модификации биомолекул, изменение скорости окисления липидов находится в тесной взаимосвязи со снижением концентрации биоантиоксидантов. Такая ситуация приводит к изменению состава липидов клеточных мембран, в частности повышению процента насыщенных жирных кислот, увеличению содержания холестерина и снижению фосфолипидов, а следовательно, уменьшению текучести липидной фазы мембраны, которая становится более жесткой [79]. В результате снижения активности мембранных ферментов (в том числе аденилатциклазы), эффекторами которых являются легко окисляющиеся липиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит), изменяется чувствительность клетки к гормональной и нервной регуляции. Антиоксиданты могут быть природного (биоантиоксиданты) и синтетического происхождения. Выделяют жирорастворимые биоантиоксиданты (токоферолы, витамин А, каротиноиды, витамины группы К, фосфолипиды, убихинон, стероидные гормоны), которые осуществляют свою защитную функцию в биологических мембранах, и водорастворимые (аскорбиновая, липоевая, никотиновая, лимонная кислоты, серосодержащие соединения - цистеин, гомоцистеин, фенольные соединения полифенолы, флавоноиды, церулоплазмин, трансферрин, лактоферрин, альбумин, мочевая кислота мочевина,) - в плазме крови, лимфе, цитозоле клеток и межклеточной жидкости [17]. Хорошо изученными компонентами неферментативной АОС являются низкомолекулярные, жирорастворимые, природные антиоксиданты, к которым относятся альфа-токоферол (витамин Е), β - каротин (провитамин А) и убихинон Q [54,178]. Убихиноны, витамины А, С, Е, РР являются мощными антиоксидантами, защищающими мембраны клеток от разрушения. Биофлавоноиды (витамин Р, квер- 47 цетин, катехины) улучшают микроциркуляцию за счет подключения сети капилляров, ранее не участвовавших в кровоснабжении [36]. Защита от повреждающего действия АФК, свободнорадикальное окисление осуществляется на всех уровнях организации: от клеточных мембран до организма в целом и направлена против всех видов радикалов. К основным природным антиоксидантам относятся аскорбиновая кислота (витамин С) и α-токоферол (витамин Е). Аскорбиновая кислота, будучи хорошо растворимой в воде, способна защитить от АФК компоненты цитозоля, а гидрофобный токоферол - мембранные липиды от пероксидного окисления [71]. Витамин С обладает чрезвычайно широким спектром антиоксидантных свойств: обезвреживает О2-, НО2•, RO2•, HO•; восстанавливает α-токоферильный радикал, тем самым возвращая α-токоферолу антиоксидантные свойства [112]. Витамин Е является природным антиоксидантом и неферментным компонентом антиоксидантной защиты. Как известно, активный гидроксильный радикал индуцирует окисление полиеновых липидов. Альфа-токоферол является обязательным компонентом всех плазматических мембран, обеспечивает образование малоактивных радикалов, неспособных поддерживать цепные реакции ПОЛ, и увеличивает плотность упаковки мембранных фосфолипидов, делая их менее доступными переокислению [149, 159,172]. Установлено, что витамины Е и С обеспечивают снижение концентраций первичных продуктов ПОЛ и повышение активности антиатерогенного фермента параоксоназы в сыворотке крови [33]. Антигипергликемический эффект этих витаминов реализуется путем снижения интенсивности свободнорадикального окисления, что приводит к улучшению действия инсулина и повышает в панкреатических β-клетках соотношение восстановленного и окисленного глутатиона, которое играет важную роль в секреции инсулина [36]. Антиоксидантным действием обладают ряд других природных веществ: каротин, мочевая кислота, трипептид-глутатион, дипептид карнозин, таурин и т.д. Накопленные к настоящему времени данные позволяют рассматривать ан- 48 тиоксиданты как весьма перспективные препараты, способные оказывать протективное действие как на функцию β-клеток и секрецию инсулина, так и на механизмы развития ангио-, нейропатий и других осложнений диабета [19]. В последние годы внимание исследователей привлечено к α-липоевой (тиоктовой) кислоте - физиологическому антиоксиданту с высокой метаболической активностью. α-липоевая кислота является коэнзимом мультиферментных комплексов митохондрий, осуществляющих окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты и α-кетокислот, и играет важную роль в процессе образования энергии АТФ. Необычным свойством тиоктовой кислоты является ее способность повышать утилизацию глюкозы тканями и предотвращать образование конечных продуктов гликирования. В клинических исследованиях лечение тиоктовой кислотой способствует коррекции показателей свободнорадикального окисления липидов, белков и сывороточной активности лизосомальных ферментов у больных СД первого типа с полинейропатией [101, 189]. Известно, что αлипоевая кислота в окисленной форме способна оказывать инсулинпотенцирующее действие и препятствовать зависимому от оксидативного стресса развитию инсулинрезистентности в своей восстановленной форме [26]. Никотинамид является одним из часто используемых препаратов с антиоксидантными своиствами. Его действие основано на снижении уровня НАД+ в βклетках, что важно для синтеза инсулина и контроля аутоиммунных процессов. Применения никотинамида в начальной стадии СД первого типа способствует сохранению остаточной функции β-клеток и замедлению их апоптоза [46]. В лечении диабетической нейропатии в настоящее время широко используются различные формы витаминов группы В. Жирорастворимые формы тиамина, особенно бенфотиамин, отличаются высокой биодоступностью и потенциальным нейротропным действием. В последнее время накоплены данные, свидетельствующие о способности бенфотиамина подавлять образование конечных продуктов гликирования, что может иметь определенное значение как в развитии диабетической нейропатии, так и в его лечении [118]. 49 Скорость окислительных реакций в липидах мембран связана с изменением состава липидов, структуры мембраны, ее чувствительности к действию сигнальных веществ и повреждающих воздействий и, наконец, ее функциональной активности. Использование антиоксидантов при интенсификации перекисной модификации биомолекул приводит к нормализации ПОЛ, а также состава, структуры и функции биомембран. Антиоксиданты являются универсальными мембранотропными препаратами, защищающими мембраны от действия повреждающих факторов [25]. По современным представлениям, важная роль в патогенезе СД принадлежит активации процессов свободнорадикального окисления: дисбалансу между прооксидантами и антиокислителями, приводящему к избытку свободных радикалов и накоплению высокотоксичных продуктов свободнорадикального окисления («окислительный стресс»). Однако, даже учитывая высокую значимость участия свободнорадикальных процессов в патогенезе сахарного диабета, до настоящего времени не было проведено комплексной оценки состояния системы «ПОЛАОС», которая в норме сбалансирована и функционирует по принципу обратной связи. Имеющиеся экспериментальные и клинические исследования в области терапии СД разноречивы и не имеют комплексного подхода к лечению данной патологии. Существуют данные об использовании ЭФЛ в качестве корректора липидного состава плазмы крови, однако данных о влиянии этих препаратов на показатели энергетического обмена и АОС клеток, имеющих важное значение в патогенезе СД и его осложнений в литературе мы не встретили. Данные в области применения α-липоевой кислоты касаются исследований лишь нескольких показателей системы «ПОЛ-АОЗ» и не обнаружено их влияния на состояние энергетического обмена у больных СД с полинейропатией. В связи с этим, исследование уровня ПОЛ, различных звеньев АОС, а также состояния эритроцитарных мембран, может иметь важное прогностическое значение для больных СД и способствовать познанию патогенетических процессов заболевания. Это расширит возможности использования антиоксидантов и мем- 50 браностабилизирующих препаратов с целью защиты клеток организма, и, в частности, β-клеток (имеющих низкую АОС), от токсического воздействия продуктов липопероксидации и самих АФК. Такого рода вспомогательная терапия может существенно увеличить эффективность гипогликемического лечения и способствовать профилактики сосудистых осложнений и ДПН при СД первого и второго типов. 51 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Объект исследований В условиях эндокринологических отделений Городских Клинических больниц № 52 и № 68 г. Москвы было обследовано 108 больных обоего пола, страдающих сахарным диабетом. Больные поступили в стационар в связи с ухудшением общего состояния, а также для коррекции доз применяемых препаратов. Все пациенты в течение 12 дней находились на диете № 9, получали пероральные гипогликемические препараты групп бигуанидов и сульфонилмочевины, человеческий инсулин длительной, короткой и средней продолжительности действия для подкожного введения, антиоксидантную инфузионную терапию тиоктовой (α-липоевой) кислотой и пероральные ЭФЛ. Материалом для исследования послужила кровь больных СД. Забор материала для исследования проводили дважды в условиях стационара при поступлении больного в отделение и перед выпиской после соответствующей терапии спустя 12 дней. Кровь для исследования брали из локтевой вены натощак. В соответствии с методиками в качестве антикоагулянта использовали этилендиаминтетрауксусную кислоту и гепарин. 2.2. Характеристика групп больных Все пациенты были разделены на 3 группы, согласно диагнозу. 1-ю группу больных составили 28 человек с диагнозом «сахарный диабет второго типа, впервые выявленный». Средний возраст пациентов составил 52 года. Больные поступили в стационар в декомпенсированном состоянии, течение заболевания было осложнено ДПН. 52 2-я группа включала в себя 25 человек в возрасте 23-35 лет с сахарным диабетом первого типа. 15 больных находились в компенсированном состоянии, 20 - в фазе декомпенсации. Декомпенсированных пациентов разделили на 2 подгруппы: с кетозом и без него. 3-я группа больных сахарным диабетом второго типа с полинейропатией. Средний возраст больных 53 года. В группу вошли 55 пациентов, которые подразделялись на подгруппы с компенсированным течением заболевания (29 человек) и декомпенсированным (26 человек), а также по продолжительности заболевания до 8 лет и более 8 лет. Группу контроля составили 30 человек без эндокринной патологии. Причем, контрольная группа для сравнения с СД первого типа состояла из 15 человек того же возраста, для СД второго типа – 15 человек 40-65 лет, средний возраст 52 года. Степень компенсации сахарного диабета оценивали по уровню гликемии натощак и концентрации гликированного гемоглобина (HbA1с). Декомпенсацию углеводного обмена у больных считали при показателе глюкозы крови натощак свыше 7,5 ммоль/л и HbA1с более 6,5 %. HbA1с имеет прямую корреляцию с уровнем глюкозы в крови и является интегрированным показателем компенсации углеводного обмена на протяжении последних 60-90 дней. Скорость образования НbА1с зависит от величины гипергликемии, а нормализация его уровня в крови происходит через 4-6 недель после достижения эугликемии [13]. Ценность определения гликированного гемоглобина заключается в том, что уровень его не зависит от времени суток, физических нагрузок, приёма пищи, назначенных лекарств и эмоционального состояния больного [101]. В группу компенсированного сахарного диабета второго типа вошли 29 больных (средний уровень HbA1c - 6,41 %, суточная гликемия - 9,23 ммоль/л, принимали препараты сульфонилмочевины (диабетон МВ) в суточной дозе 30 мг, бигуаниды (глюкофаж) 1000 мг, средняя доза инсулина составила 0,27 Ед/кг.). В группу декомпенсированного сахарного диабета второго типа вошли 26 больных (средний уровень HbA1c - 9,65 %, суточная гликемия - 14,72 ммоль/л, диабетон 53 МВ в суточной дозе 60 мг, глюкофаж 2000 мг, доза инсулина 0,56-1 Ед/кг). Сахарный диабет второго типа в обеих группах был осложнен диабетической нейропатией. Всем обследуемым брали кровь из локтевой вены после 10-12 часов голодания в 8-9 часов утра для определения уровней глюкозы, и показателей липидного спектра крови, параметров ПОЛ, энергетического обмена и антиоксидантной защиты. Вторично брали кровь через 2 недели (перед выпиской) после проведения терапии: сахароснижающими препаратами групп сульфонилмочевины в суточной дозе 30-60 мг, бигуанидов 1000 - 2000 мг, препаратами человеческого инсулина короткой продолжительности действия 12-40 Ед/сут., средней продолжительности в суточной дозе 6-42 Ед, и длительного действия 12-40 Ед/сут, а также антиоксидантом липоевой кислотой 300 мг/сут. и эссенциальными фосфолипидами - липостабилом 500 мг/сут. 2.3. Приготовление проб для исследования Для проведения лабораторных исследований использовали цельную кровь больных. Забор материала производили в две биохимические пробирки: с этилендиаминтетрауксусной кислотой для цельной крови и плазмы, а также с разделительным гелем для сыворотки. В соответствии с методиками определения материалом для исследования служила сыворотка и плазма крови, а также лизат эритроцитов. Для подготовки пробы к исследованию цельную кровь центрифугировали при 3 000об/мин в течение 10 мин., после чего отделяли плазму. Затем эритроциты отмывали троекратным центрифугированием с использованием изотонического раствора хлорида натрия 0,9 % при 3 000 об/мин в течение 15 минут. Полученную эритроцитарную массу доводили до исходного объема 0,9 %-м раствором хлорида натрия, соблюдая гематокрит. Затем в соотношении 1:10 разводили кровь холодной дистиллированной водой, лизируя эритроциты, и замораживали приготовленый лизат. 54 2.4. Методы исследований 2.4.1. Продукты перекисного окисления липидов 2.4.1.1. Определение содержания малонового диальдегида и гидроперекисей В липидных системах в результате процессов перекисного окисления липидов образуется малоновый диальдегид (МДА), взаимодействие которого с 2тиобарбитуровой кислотой (ТБК) приводит к образованию хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм. Количественное содержание МДА определяли по методу Yagi Y. et al. [216]. В плазме крови и в гемолизате эритроцитов МДА определяли спектрофотометрически по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в условиях инициации перекисного окисления двухвалентным железом Fe2+. На спектрофотометре Specoll 400 регистрировали спектр поглощения образцов при 532 нм или 515 нм. Расчёт содержания МДА производили с учётом коэффициента молярной экстинкции образовавшегося хромогена и выражали в ммоль на 1 мл эритроцитов (плазмы) (ммоль/мл). Для определения концентрации малонового диальдегида в экстрактах эритроцитов использовали заранее приготовленный лизат, который разливали в количестве 1,5 мл в 2 конические пробирки. К нему в пробирку А добавляли 0,5 мл дистиллированной воды, в пробирку В - Fe2+, через 4 минуты в каждую добавляли 20% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), центрифугировали в течение 10 минут при 3 000 об/мин. Затем отбирали 2 мл супернатанта из каждой пробирки и проводили реакцию с 0,5% раствором ТБК, перемешивали и инкубировали 15 минут на кипящей бане. После охлаждения на спектрофотометре Specoll 400 при длине волны 532 нм в кюветах с толщиной слоя 1,0 см регистрировали спектр поглощения. По пробе А определяли количество малонового диальдегида в эритроцитах, а проба В содержала суммарное количество МДА и гидроперекисей (ГП), 55 где разница между А и В пропорциональна количеству гидроперекисей. Полученные результаты в единицах оптической плотности переводили в ммоль/ мл (умножив полученные значения на коэффициент экстинкции для МДА, равный 6,41 и на 3 (так как в процессе приготовления образца происходит его разбавление в 3 раза)). 2.4.1.2. Определение количества диеновых конъюгатов в эритроцитах Количество ДК определали спектрофотометрически по методу В.Б. Гаврилова [27]. Методика определения основана на экстракции ДК гептанизопропаноловой смесью. Для разделения гептановой и водно-изопропанольной фаз использовали раствор соляной кислоты pH 2,0. В гептановом экстракте измеряли на спектрофотометре Biochrom Ltd., Cambridge, England при длине волны 233 нм. содержание сопряженных диенов в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против гептана. Расчёт количества ДК производили, используя молярный коэффициент экстинкции при длине волны 233 нм, равный 27000 М"'хсм"' [94] и выражали в ммолях на мл клеток (эритроцитов). 2.4.1.3. Определение ТБК - активных продуктов в сыворотке крови Продукты перекисного окисления липидов образуют с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом. В побирку вносят реактивы: 3 мл ортофосфорной кислоты, 0,25 мл сыворотки крови, 1 мл раствора ТБК и 4 мл бутанола. Пробу интенсивно встряхивают до образования однородной белой суспензии и центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин. Затем отбирают 3 мл супернатанта и измеряют оптическую плотность при двух длинах волн: 535 и 570 нм. Расчет производят по формуле, количество ТБК-активных продуктов измеряют в нмоль/мг белка. 56 2.4.2. Показатели энергетического обмена 2.4.2.1. Определение содержания аденозинтрифосфата крови Концентрацию аденозинтрифосфата (АТФ) определяли в лизатах эритроцитов больных с помощью стандартных наборов фирмы BioVision, USA на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 3200. Данный метод основан на количественном определении продукта реакции фосфорилирования глицерола колориметрическим методом при длине волны 570 нм. Концентрацию АТФ рассчитывают в нмоль/мкл с помощью формулы с использованием стандартных кривых. 2.4.2.2. Определение концентрации лактата в плазме крови Для количественного определения in vitro концентрации L-лактата в плазме крови использовали стандартный набор реактивов фирмы RANDOX с использованием биохимического анализатора SAPPHIRE 400. Концентрацию лактата измеряли в ммоль/л. 2.4.2.3. Определение концентрации глюкозы крови Глюкозу крови определяли с помощью наборов фирмы Analyti- con℗Biotechnologies AG/ Germani. Принцип метода заключается в ферментативном колориметрическом тесте на основе глюкозооксидазной реакции Триндера: Глюкоза+ О2+Н2О2→глюконат + Н2О2 и пероксидазной: Н2О2+ фенол→Красный Хинонимин+4-аминоантипирин +4Н2О. Концентрацию глюкозы в плазме измеряли в ммоль/л. 57 2.4.2.4. Определение концентрации гликозилированного гемоглобина Для определения количества гликозилированного гемоглобина HbA1c в эритроцитах колориметрическим методом (Данилова Л. А., 1986) [38] использовали лизат эритроцитов. Забор крови производили в биохимическую пробирку с гепарином. Эритроциты подвергали кислотному гидролизу с образованием 5оксиметилфурфурола, который определяли спектрофотометрически по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Экстинцию раствора измеряли при длине волны 443 нм в кювете 1см. Концетрацию HbA1c рассчитывали исходя из того, что 1% гемоглобина равен оптической плотности 0,029. % HbA1c = (экстинция раствора / 0,029). 2.4.2.5. Определение степени утилизации глюкозы эритроцитами крови Для определения утилизации глюкозы эритроцитами использовали цельную кровь с этилендиаминтетрауксусной кислотой. Для подготовки пробы к исследованию цельную кровь центрифугировали при 3 000об/мин в течение 10 мин., после чего удаляли плазму. Затем эритроциты отмывали троекратным центрифугированием с использованием изотонического раствора хлорида натрия 0,9 % при 3 000 об/мин в течение 15 минут. Полученную эритроцитарную массу доводили до исходного объема 0,9%-м раствором хлорида натрия, соблюдая гематокрит. Количество эритроцитов определяли на эритрогеммометре, предварительно смешав 0,02 мл полученной пробы с 10 мл 3,5%-ым раствором NaCl и хорошо перемешав. Затем в 2 пробирки разливали по 0,1 мл полученной пробы, добавляли к ней такое же количество раствора глюкозы (5,7,10г. растворенного в 100 мл воды вещества) 1-ю пробу доводили до объема 0,2 мл 0,9%-м растворомром NaCl, во 2-ю 58 добавляли 0,1 мл генно-инженерного человеческого инсулина (актропид НМ 100МЕ/мл). Опытные пробы помещали в вибротерм на 1 час при 37°С. Далее использовали набор реагентов ГЛЮКОЗА АГАТ для определения концентрации глюкозы глюкозооксидазным методом с использованием рабочего раствора (разбавленный буфер с фенолом и субстратно-ферментная смесь). Параллельно ставили контрольную и калибровочную пробы. После окончания инкубации при t=37°С в течение 15 мин измеряли величину оптической плотности калибровочной и опытных проб против контрольной при длине волны 510 нм. Концентрацию глюкозы рассчитывали по формуле и измеряли в ммоль/л. Затем производили перерасчет количества глюкозы в мкмоль/кл.час. 2.4.2.6. Определение липидного фосфора в сыворотке крови Проводили с помощью набора «Фосфор-АГАТ». Фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно – молибденовую кислоту, которая реагирует с малахитовым зеленым с образованием комплекса зеленого цвета, стабилизированного в растворе наличием детергента. К 20 мкл сыворотки приливают 2 мл рабочего раствора детергента, затем 2 мл красителя, тщательно перемешивают и через 10 мин определяют оптическую плотность против холостой пробы. Оптическая плотность комплекса при 630 нм пропорциональна концентрации фосфора в образце. Расчет проводили по калибровочному графику. 2.4.3. Антиоксидантная система защиты 2.4.3.1. Определение общей антиоксидантной защиты организма Для количественного определения in vitro концентации общих антиоксидантов в плазме крови на биохимическом анализаторе SAPPHIRE 400 использовали стандартный набор фирмы RANDOX. Принцип метода заключается в следующем: 2,2-азидо-ди-[3-этилбензтиазолин сульфонат] инкубировали с пероксидазой (мет- 59 миоглобином) и H2O2 с образованием одноименного радикала. Полученный раствор имел относительно стабильный зелено-голубой цвет, который измеряли при 600 нм. Антиоксиданты, содержащиеся в тестируемой пробе, подавляли развитие окраски пропорционально их концентрации в образце. Полученую концентрацию общих антиоксидантов измеряли в ед.акт., что эвивалентно ммоль/л. 2.4.3.2. Определение количества восстановленного глутатиона Определение основано на взаимодействии GSH с ДТНБК (5,5'-дитио-бис-2нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм. [129]. Гемолизат готовили путем добавления 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дистилированной Н20, охлаждённой до 0°С. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл осаждающего раствора (1,67 г ледяной ортофосфорной кислоты, 0,2 г этилендиаминтетрауксусной кислоты и 30 г хлористого натрия растворяли в дистилированной Н2О и доводили до метки 100 мл). Пробы тщательно перемешивали и после 20 минутного стояния при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. 2 мл фильтрата помещали в спектрофотометрическую кювету объёмом 10 мл, добавляли 8мл фосфатного буфера (0,3 М Na2HP04). Затем в пробу вносили 1 мл раствора ДТНБК (5,5'-дитио-бис-2нитробензойной кислоты) (0,02%-ный раствор, приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия). Сразу же после перемешивания появляется жёлтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой. Пробу фотометрировали при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Поскольку раствор 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислоты имеет слабожелтую окраску, параллельно с опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий раствор, разведёный дистилированной Н20 в отношении 2:5. 60 Содержание восстановленного глутатиона рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (13600 М'хсм"1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой и выражали в мкмоль на грамм НЬ. 2.4.3.3. Определение активности глутатионпероксидазы Концентрацию глутатионпероксидазы (ГПО) определяли в лизатах эритроцитов больных с помощью стандартных наборов фирмы BioVision, USA на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 3200. Принцип метода основан на способности ГПО превращать восстановленный глутатион (GSH) в окисленный глутатион (GSSG). При этом снижение концентрации НАДФН+ прямо пропорционально активности ГПО, концентрацию которой определяют спектрофотометрически при 340 нм и выражают в ЕД/мл. 2.4.3.4. Определение активности супероксиддисмутазы Количественное определение in vitro супероксиддисмутазы (СОД) в цельной крови проводили с помощью стандартного набора фирмы RANDOX на биохимическом анализаторе SAPPHIRE 400. Метод основан на использовании ксантина и ксантиноксидазы для генерирования кислородных радикалов, которые, вступая в реакцию с 2-(4-иодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5- фенилтетразолиумхлорид, образуют окрашенное в красный цвет соединение формазан. Активность СОД определялась как величина ингибирования этой реакции и измерялась в Ед/мл. 2.4.3.5. Определение активности каталазы Концентрацию КТ определяли в лизатах эритроцитов больных с помощью стандартных наборов фирмы BioVision, USA на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 3200. 61 Принцип колориметрического метода данного набора основан на способности КТ разлагать перекись водорода до воды и кислорода в необходимых условиях при температуре 25°С и pH среды 4,5. Измерение оптической плотности конечного продукта в пробе производят при длине волны равной 570 нм. Активность КТ определяют по формуле в мЕД/мл. 2.4.4. Показатели липидного спектра крови 2.4.4.1. Определение содержания холестерина в сыворотке крови Концентрацию холестерина (ХС) в сыворотке крови определяли с помощью набора реактивов фирмы Analyticon℗Biotechnologies AG/ Germani. Метод определения представляет собой ферментативный колориметричесий тест. Холестерин определяется ферментативно с применением холестеринэстеразы и холестериноксидазы. Эфир холестерина расщепляется под влиянием холинэстеразы, образуя свободный холестерин и жирные кислоты. Холестерин превращается в ∆ 4холестенон и перекись водорода под влиянием кислорода в присутствии холестериноксидазы. Образовавшаяся перекись водорода даёт красное окрашивание в реакции с 4 –аминоантипирином и фенолом в результате каталитического воздействия пероксидазы. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации холестерина и может быть измерена в ммоль/л. Значения нормы для ХС 35,4 ммоль/л. 2.4.4.2. Определение содержания триацилглицеридов в сыворотке крови Определение содержания триацилглицеридов проводили с помощью стандартных наборов реактивов фирмы BioSystems S.A. Costa Brava 30, Barselona (Spain). В результате сопряжённых реакций под действием ряда ферментов: липа- 62 зы, глицеролкиназы, оксидазы и пероксидазы образуется цветной комплекс. Концентацию триглицеридов определяли спектрометрически и выражали в ммоль/л. Норма ТГ колеблется в пределах 0,8-1,8 ммоль/л. 2.4.4.3. Определение конценрации липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови Определение конценрации липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови (ЛПВП) прводили стандартным набором реагентов фирмы BioSystems S.A. Costa Brava 30, Barselona (Spain). Принцип данного метода основан на том, что специфичный детергент гидролизует холестерин из липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и хиломикрона. Холестерин окисляется холестеролоксидазой с образованием неокрашенных продуктов реакции. Второй детергент переводит холестерин образца из липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в растворимую форму. ЛПВП измеряют спектрофотометрически и концентрацию выражают в ммоль/л. Референтные значения ЛПВП составляют 0,7-1,9 ммоль/л. 2.4.4.4. Определение липопротеинов низкой плотности и липопротеинов очень низкой плотности Определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) в сыворотке крови оценивали по расчетной формуле У.Т. Фридевальда (1972) [151]. Значения нормы для ЛПНП составляют 2,6-3,6 ммоль/л. Концентрация ЛПОНП не должна превышать 0,9 ммоль/л. 2.4.4.5. Коэффициент атерогенности крови Коэффициент атерогенности (КА) крови определяли по формуле А.Н.Климова (1980) [64]. В норме значение КА не должно превышать 3,0. 63 2.5. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку материала осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Excel (2007). Достоверность различий оценивали по критерию t Стьюдента. При изучении характера взаимоотношений исследуемых параметров использовали коэффициент корреляции Спирмена. Различия считались достоверными при р<0,05. Все средние значения в таблицах представлены в виде М ± m. 64 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Оценка интенсивности процессов перекисного окисления липидов у больных сахарным диабетом Процессы перекисной модификации биомолекул представляют собой нормальный биохимический процесс. Через стадию образования перекисей липидов в клетках осуществляется синтез простагландинов, стероидных гормонов, образование желчных кислот из холестерина. Процессы ПОЛ необходимы для нормальной работы цепи переноса электронов в реукциях микросомального окисления. [4, 34, 105, 123]. Нарушения структуры и функций клеточных мембран, происходящие при пероксидации, сопровождаются вымыванием из мембран окисленных липидов и заменой их новыми, более насыщенными липидами. Это облегчает процесс самообновления мембранных структур и за счёт изменения гидрофобности слоя влияет на проницаемость мембран, активность мембраносвязанных ферментов и ионный транспорт. Таким образом, свободнорадикальное окисление - физиологический процесс, который обеспечивает регуляцию клеточной активности. Однако, при избыточном появлении свободнорадикальных форм сомоускоряющийся процесс ПОЛ приводит к полному разрушению ненасыщенных липидов, нарушению структуры и функции белков, нуклеиновых кислот и других молекул и, в конечном счёте, к гибели клетки [9, 179]. Для оценки процессов ПОЛ у больных СД второго типа были определены следующие показатели: содержание МДА в эритроцитах и плазме крови, а также содержание ДК в эритроцитах. При исследовании уровня продуктов ПОЛ в зависимости от степени компенсации СД второго типа, осложненного ДПН, показано повышение концентрации всех продуктов пероксидации липидов относительно контрольной группы в обеих группах: при компенсированном и декомпенсированном течении заболевания. При этом более выраженное достоверное увеличение концентраций первичных и вторичных продуктов наблюдается в фазе декомпенсации (таблица 3.1.1). 65 Таблица 3.1.1 Концентрация продуктов перекисного окисления липидов в крови у больных сахарным диабетом второго типа с полинейропатией (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза компенсации Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации При поступлении в стационар При выписке из стационара При поступлении в стационар При выписке из стационара Малоновый диальдегид в плазме, мкмоль/л 3,09 ±0,19 n=7 3,24±0,34 n=15 3,68±0,21* n=10 3,87±0,36* n=16 3,88±0,27* n=8 Малоновый диальдегид в эритроцитах, мкмоль/л 1,41 ±0,12 n=7 2,34±0,22* n=15 1,66±0,25** n=10 2,29±0,17* n=16 1,58±0,18** n=8 Гидроперекиси, ммоль/мл 0,53± 0,11 n=7 0,79±0,15 n=15 0,96±0,18* n=10 1,09±0,17* n=16 0,6±0,23** n=8 Диеновые конъюгаты, ммоль/мл 2,46±0,7 n=7 3,81±0,6* n=14 3,35±0,87 n=10 5,54±1,02* n=15 4,14±0,76* n=7 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар Установлено, что концентрация МДА в эритроцитах и в плазме крови больных в фазе декомпенсации СД второго типа с полинейропатией увеличена в 1,62 раза и в 1,25 раза соответственно (р<0,05 в обоих случаях), по сравнению с группой контроля (рисунок 3.1.1). Содержание ДК в эритроцитах больных также увеличено по сравнению с референтными значениями с 2,46 ммоль/мл до 5,54 ммоль/мл (р<0,05), а концентрация ГП повышена в 2 раза (рисунок 3.1.2). мкмоль/л 66 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 * * ** Показатель в контрольной группе Показатель при поступлении больного в стационар Концентрация МДА в плазме Показатель при выписке больного из стационара Концентрация МДА в эритроцитах Рисунок 3.1.1 - Концентрация малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах крови у больных сахарным диабетом второго типа с полинейропатией, фаза декомпенсации ммоль/мл Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * ** Концентрация ГП в контрольной группе Концентрация ГП при поступлении больного в стационар Концентрация ГП при выписке больного из стационара Рисунок 3.1.2 - Концентрация гидроперекисей (ГП) у больных сахарным диабетом второго типа с полинейропатией, фаза декомпенсации Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар 67 Таким образом, состояние декомпенсации СД второго типа сопровождается более выраженным образованием продуктов ПОЛ. Содержание ДК в группе с декомпенсацией повышено по сравнению с группой компенсированного диабета, то есть можно отметить, что достижение компенсации (нормализация углеводного обмена) сопровождается снижением уровня ДК в эритроцитах больных СД. Подобное изменение содержания ДК, вероятно, можно объяснить более выраженным недостатком инсулина при декомпенсированном состоянии. Инсулин является ингибитором чувствительной к гормонам липазы и при снижении его концентрации липолиз активируется. В результате этого свободные жирные кислоты, образующиеся при гидролизе триацилглицеридов, поступают одновременно с глицеролом в кровь и, таким образом, происходит увеличение их концентрации. А поскольку свободные жирные кислоты являются основным субстратом окисления, то при увеличении их содержания можно ожидать усиления в целом интенсивности свободнорадикальное окисление и в первую очередь - увеличения содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК. К тому же в группе больных СД второго типа с ДПН между содержанием ДК и уровнем НbА1с имеется прямая корреляционная зависимость (r=0,67), что подтверждает влияние углеводного обмена на уровень продуктов ПОЛ. У больных СД второго типа c полинейропатией даже в компенсированной фазе концентрация НbА1с составляла в среднем (6,41±0,31) %, что достоверно превышает нормальные значения 4-5,9 %. В фазе декомпенсации количество гликированного гемоглобина почти в 2 раза выше нормальных величин и составляет 9,65±0,41 %. После лечения больных СД второго типа с ДПН препаратами сульфонилмочевины (диабетон МВ-20мг), бигуанидов (глюкофаж - 2000 мг), инсулина короткого действия (актропид 6-10 Ед) ), инсулина средней продолжительности действия (протофан НМ 2-20 ЕД), инсулина длительного действия (лантус 16-40 ЕД) и антиоксидантами (берлитион 300мг) концентрация изученных нами продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах снижалась (таблица 3.1.1), достоверное уменьшение выявлено в группе с декомпенсацией СД второго типа. Несмотря на то, что концентрация МДА в сыворотке 68 крови в декомпенсированной группе больных не изменилась после терапии, в компенсированной группе больных даже увеличилась на 13 % от уровня данного показателя при поступлении. Количество ГП при компенсации сахарного диабета повысилось на 22 % после лечения. Следовательно, усиление процессов пероксидации происходит, как у больных в фазе компенсации, так и декомпенсации диабета, причем, после двух недельного лечения наблюдается снижение уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ у декомпенсированных больных, не достигающее контрольных значений. Изучение уровня липидной пероксидации у больных СД второго типа с ДПН в зависимости от длительности заболевания показало более выраженное повышение всех изучаемых параметров перекисного окисления липидов при декомпенсированном течении СД свыше 8 лет (таблица 3.1.2). При этом было отмечено достоверное повышение МДА в плазме крови с длительностью заболевания более 8 лет на 12 % по сравнению с группой менее длительного течения сахарного диабета. У 28 больных в возрасте 40-65 лет был впервые выявлен сахарный диабет второго типа. Показатели метаболизма глюкозы у них указывали на декомпенсированное течение заболевания (средний уровень HbA1с - 14,6%, суточная гликемия - 16,26 ммоль/л, доза инсулина 0,95 Ед/кг). Результаты исследования в данной подгруппе мы сравнивали с полученными данными у больных СД первого типа. Для этого проводили обследование 25 больных СД первого типа, которые получали человеческий рекомбинантный инсулин в индивидуальной дозе по интенсифицированной схеме (от 0,35 до 1,66 Ед/кг). Данные исследований, представленные в таблице 3.1.3, свидетельствуют о том, что у больных СД первого типа и впервые выявленным СД второго типа усилен синтез активных кислородных метаболитов в мембранах эритроцитов, о чем свидетельствует высокая концентрация переокисленных продуктов. При этом общая антиокислительная активность сыворотки (ОАА) крови повышается по сравнению с контрольной группой. 69 Анализ процессов свободнорадикального окисления липидов у больных с впервые выявленым СД второго типа обнаружил достоверное повышение широкого спектра продуктов липопероксидации: ДК в 2,9 раза (р<0,05), ГП в 1,8 раза (p<0,05) и МДА в эритроцитах в 1,06 раза (р<0,05) по сравнению с контрольной группой. Таблица 3.1.2 Концентрация продуктов перекисного окисления липидов в крови у больных сахарным диабетом второго типа с полинейропатией с разной длительностью заболевания (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации, длительность заболевания менее 8 лет Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации, длительность заболевания более 8 лет При поступлении в стационар При выписке из стационара При поступлении в стационар При выписке из стационара Малоновый диальдегид в плазме, мкмоль/л 3,09 ±0,19 n=7 3,49±0,18* n=7 3,26±0,21 n=7 3,9±0,21*,** n=12 3,71±0,19* n=9 Малоновый диальдегид в эритроцитах, мкмоль/л 1,41 ±0,12 n=7 2,18±0,26* n=7 1,85±0,36* n=7 2,30±0,23* n=12 1,52±0,22 n=8 Гидроперекиси, ммоль/мл 0,53± 0,11 n=7 0,84±0,21 n=7 0,70±0,21 n=7 0,98±0,19* n=12 0,58±0,22 n=8 Диеновые конъюгаты, ммоль/мл 2,46±0,70 n=7 3,66±0,36* n=6 3,17±0,41 n=6 4,21±0,57* n=10 3,88±0,64* n=8 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при длительности СД менее 8 лет 70 Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее выраженная активация процессов ПОЛ с повышением концентрации ГП, ДК и МДА наблюдается у больных с впервые выявленым СД второго типа, по сравнению как с больными СД первого типа, так и с контрольной группой. Таблица 3.1.3 Изменение метаболических показателей крови у больных сахарным диабетом первого типа и впервые выявленым сахарным диабетом второго типа (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом первого типа Группа больных впервые выявленным сахарным диабетом второго типа Общая антиокислительная активность, ммоль/л. 1,72 ± 0,13 n=7 1,72 ± 0,13 n=10 2,38 ± 0,09* n=10 Малоновый диальдегид в плазме, мкмоль/л 3,09 ±0,19 n=7 3,09±0,23 n=10 4,83±0,24* n=24 Малоновый диальдегид в эритроцитах, мкмоль/л 1,41 ±0,12 n=7 2,31±0,27* n=10 2,45±0,19* n=24 Гидроперекиси, ммоль/мл 0,53± 0,11 n=7 0,39±0,06 n=20 0,95±0,14* n=10 3,91±0,05* n=15 4,37±0,14* n=19 Диеновые конъюгаты, ммоль/мл 2,46±0,70 n=7 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой Результаты исследования показателей ПОЛ в крови больных с сахарным диабетом первого типа с осложнением в виде кетоацидоза и без него представлены в таблице 3.1.4. В обеих группах уровень эритроцитарного и плазменного МДА, а также содержание ДК достоверно повышены по сравнению с контрольными величинами. Выявлено повышение уровня плазменного МДА (р<0,05) у больных с кетоацидо- 71 зом по сравнению с группой больных без кетоза. По содержанию эритроцитарного МДА и ДК значительных различий между группами не найдено. Таблица 3.1.4 Содержание малонового диальдегода и диеновых конъюгатов в эритроцитах и плазме крови у больных сахарным диабетом первого типа с кетозом и без кетоза (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом первого типа без кетоза Группа больных сахарным диабетом первого типа с кетозом Малоновый диальдегид в плазме, мкмоль/л 0,75 ±0,03 n=18 1,16±0,09* n=15 1,21±0,02*,** n=17 Малоновый диальдегид в эритроцитах, мкмоль/л 0,53 ±0,02 n=18 0,92±0,07* n=15 0,95±0,02* n=17 Диеновые конъюгаты, ммоль/мл 0,57±0,03 n=18 0,97±0,05* n=8 0,96±0,07* n=8 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой без осложнений В результате проведенного исследования установлено, что наиболее выраженная активация ПОЛ наблюдается в группах больных с впервые выявленым СД второго типа и с длительностью СД второго типа более 8 лет. 72 3.2. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах и общий антиоксидантный статус сыворотки крови больных сахарным диабетом Постоянство антирадикального и антиперекисного потенциалов клеток в организме обеспечивает антиоксидантная система защиты. У больных СД второго типа в фазе компенсации активация процессов ПОЛ сопровождается достоверным снижением концентрации СОД и повышением активности КТ и ГПО по сравнению с контрольной группой. Общия антиокислительная активность сыворотки крови повышена в 0,5 раза (рисунок 3.2.1), повидимому, за счет КТ и ГПО. 3 * ед.акт. 2,5 * 2 1,5 1 0,5 0 Контрольная группа Группа больных СД 2-го типа, фаза компенсации Группа больных СД 2-го типа, фаза декомпенсации Показатель в контрольной группе Показатель при поступлении больного в стационар Показатель при выписке больного из стационара Рисунок 3.2.1 - Общая антиоксидантная активность сыворотки крови у больных сахарным диабетом второго типа Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой У больных при компенсации СД второго типа в эритроцитах регистрировался достоверный рост активности КТ в 2,4 раза, ГПО в 3 раза и общей антиоксидантной активности сыворотки крови в 1,5 раза относительно контрольных величин (таблица 3.2.1). 73 Таблица 3.2.1 Показатели антиоксидантной системы в сыворотке и эритроцитах крови у больных сахарным диабетом второго типа (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза компенсации При поступлении в стационар Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации При При выписке При выписке поступлении в из стационара из стационара стационар Общая антиоксидантная активность, ед.акт. 1,72 ± 0,19 n=7 2,58±0,15* n=9 2,45±0,14* n=9 2,31±0,11* n=15 2,39±0,13* n=15 Супероксиддисмутаза, ЕД/мл 210±11,4 n=7 89,8±13,8* n=7 102±16,8* n=7 110±22,1* n=12 126±16,3* n=11 Каталаза, мЕД/мл 0,28 ±0,04 n=7 0,68±0,18* n=7 0,55±0,15* n=7 0,46±0,13* n=10 0,27±0,05** n=10 Глутатионпероксидаза, ЕД/мл 0,12±0,05 n=7 0,36±0,04* n=7 0,43±0,06* n=7 0,23±0,06 n=10 0,19±0,04 n=9 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар Это может свидетельствовать о способности систем компенсации противостоять свободнорадикальной атаке и связанному с ней окислительному повреждению, но с другой стороны может привести к увеличению концентрации перекиси водорода, и провоцировать дальнейшую деструкцию клеток. В многочисленных клинических работах выявляется разнонаправленность изменений ферментов антиоксидантной защиты при СД второго типа [165, 167, 200]. В то же время в других исследованиях показано, что даже при хорошем гли- 74 кемическом контроле и при отсутствии диабетических осложнений активность СОД в эритроцитах больных СД второго типа повышена [80, 152, 167]. В нашем исследовании фаза декомпенсации сахарного диабета второго типа характеризуется повышением общей антиокислительной активности сыворотки крови (p<0,05). При этом активность супероксиддисмутазы не претерпевает значительных изменений (p<0,05), а концентрация КТ и ГПО повышены в 1,8 мЕД/мл (p<0,05) (рисунок 3.2.2) и в 2 раза соответственно (таблица 3.2.1). 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 * * ** Контрольная группа Группа больных СД 2-го типа, фаза компенсации Группа больных СД 2-го типа, фаза декомпенсации Показатель в контрольной группе Показатель при поступлении больного в стационар Показатель при выписке больного из стационара Рисунок 3.2.2 - Концентрация каталазы в эритроцитах у больных сахарным диабетом второго типа Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар На фоне инсулиновой терапии, применения пероральных сахароснижающх препаратов и антиоксидантного лечения (тиоктовой или ά-липоевой кислотой) в группе больных в декомпенсированном состоянии общий антиоксидантный статус повышался за счет СОД (таблица 3.2.1), при этом наблюдалась тенденция к понижению КТ и незначительному снижению ГПО. В другой группе больных, поступивших в стационар в компенсированном состоянии, лечение сопровождалось повышением активности СОД на 14 %, а также незначительным увеличени- 75 ем активности ГПО. На фоне терапии тиоктовой кислоты было отмечено снижение активности КТ (p<0,05). Таким образом, на фоне десятидневного применения выше приведенной терапии, мы отметили снижение выраженности окислительного стресса, что сопровождалось улучшением гликометаболического контроля у больных сахарным диабетом второго типа. При диабете второго типа у больных отмечалась активация ПОЛ и снижение редокс состояния системы глутатиона в плазме крови (таблица 3.2.2). Таблица 3.2.2 Содержание гидроперекисей липидов, восстановленного и окисленного глутатиона в плазме крови у больных сахарным диабетом второго типа Группы исследования Исследуемый показатель Гидроперекиси липидов, мкмоль/л Общий глутатион, нмоль/ мг белка Восстановленный глутатион, нмоль/мг белка Окисленный глутатион, нмоль/ мг белка Соотношение концентрации восстановленного и окисленного глутатиона 6, 90 Группа больных сахарным диабетом второго типа при поступлении в стационар n = 12 17,4 * Группа больных сахарным диабетом второго типа при выписке из стационара n = 12 12,5 (4,32 – 7,19) (12,4 -21,12) (8,91 – 15, 22) 0,135 0,049* 0,095*,** (0,113 – 0,126) (0,037 – 0,065) (0,072 – 0,098) 0,123 0,035* 0,084** (0,011 – 0,026) (0,029 – 0,059) (0,011 -0,021) 0,015 0,008 * 0,009 (0,009 -0,019) (0,007 – 0,013) (0,008 – 0,014) 8,200 4,375* 9,330* (6,8 – 17,5) (2,9 – 5,7) (4,015 – 8,26) Контрольная группа n = 10 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар 76 Это выражалось в снижении общей концентрации трипептида и соотношения восстановленной и окисленной форм глутатиона. Деградация первичных метаболитов перекисного окисления липидов приводит к накоплению вторичных и конечных продуктов свободнорадикального процесса. Установлено повышение содержания ТБК - активных продуктов в плазме крови, а также в эритроцитах в 1,65 раза (p<0,05) (таблица 3.2.3). Таблица 3.2.3 Содержание общего, восстановленного и окисленного глутатиона, активность глутатионпероксидазы в эритроцитах у больных сахарным диабетом второго типа (M±m) Группы исследования Контрольная группа n = 10 Группа больных сахарным диабетом второго типа при поступлении в стационар n = 12 Группа больных сахарным диабетом второго типа при выписке из стационара n = 12 Общий глутатион, нмоль/ мг белка 5,23 (4,11 – 6,26) 2,93* (1,79 – 6,06) 4,09 (4,072 – 4,098) Восстановленный глутатион, нмоль/мг белка 3,74 (3,51 – 4,46) 1,95* (1,29 – 2,59) 2,08 (1,95 – 3,21) Окисленный глутатион, нмоль/ мг белка 1,49 (0,49 – 0,61) 0,98 * (1,47 – 3,35) 2,86 (1,01 – 4,84) Соотношение концентрации восстановленного и окисленного глутатиона 1,15 (1,8 – 7,5) 2,00* (2,1 – 5,7) 1,03* (2,015 – 4,26) Глутатионпероксидаза, нмоль НАДФ/ (мин х мг белка) 20,1 (18,3 –21,9) 44,4 * (42,2 – 46,8) 32,5*,** (29,4 – 33,0) Исследуемый показатель Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар 77 Повышение содержания ТБК-активных продуктов может быть следствием окисления ненасыщенных фосфолипидов в мембране эритроцитов. Активация ПОЛ в эритроцитах приводит к снижению концентрации общего глутатиона в плазме крови в 2,75 раза, в эритроцитах – в 1,77 раза, восстановленной формы трипептида - в 3,51 раза в плазме крови и в 1,9 - в эритроцитах, окисленной формы глутатиона в 1,87 раза в плазме крови и 1,5 в эритроцитах по сравнению с контрольными величинами (p<0,05) (таблица 3.2.2 и таблица 3.2.3). При этом в плазме крови значительно снижалась величина соотношения содержания восстановленного глутатиона к содержанию окисленного, что свидетельствует о сокращении ёмкости редокс - потенциала глутатион зависимой системы в эритроцитах у больных с диабетом второго типа. У больных в эритроцитах при поступлении в стационар одновременно регистрировался рост активности глутатионпероксидазы в 2,2 раза (p<0,05) относительно контрольных величин (таблица 3.2.3). Высокая активность ГПО, которая использует восстановительный потенциал глутатиона, может способствовать снижению содержания глуатиона при чрезмерной продукции липопротеидов в условиях диабета. При активации липолиза при сахарном диабете второго типа, по-видимому, происходит накопление свободных жирных кислот, окисление которых может способствовать значительному увеличению продукции супероксидного аниона радикала в дыхательной цепи митохондрий [167], что может послужить причиной к активации ПОЛ и снижению редокс - потенциала системы глутатиона в эритроцитах. Активация ПОЛ и нарушение тиолдисульфидного обмена, сопровождающиеся снижением антиоксидантного потенциала системы глутатиона в эритроцитах при СД второго типа может приводить к стимуляции спонтанного липолиза и к возникновению инсулинорезистенции. Полученные нами данные, свидетельствуют о мобилизации защитных механизмов в условиях свободно-радикальной атаки при сахарном диабете. Этот факт наиболее ярко подтверждается и у группы больных с впервые выявленным СД второго типа при поступлении в стационар, у которых установлено достовер- 78 ное повышение всех изученных нами показателей АОС относительно контрольной группы (таблица 3.2.4). Таблица 3.2.4 Показатели антиоксидантной системы в сыворотке и эритроцитах крови у больных с впервые выявленным сахарным диабетом второго типа (M±m) Группы исследования Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации, при поступлении в стационар Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации, при выписке из стационара Общая антиоксидантная активность, Ед.акт. 1,72 ± 0,13 n=7 2,37±0,06* n=10 2,49±0,06* n=8 Супероксиддисмутаза, ЕД/мл 209,73±11,42 n=7 323±14,47* n=9 381±30,44*,** n=6 Каталаза, мЕД/мл 0,28 ±0,04 n=7 0,62±0,11* n=5 1,48±0,09*,** n=5 Глутатионпероксидаза, ЕД/мл 0,12±0,05 n=7 0,29±0,03* n=8 0,45±0,07*,** n=8 Исследуемый показатель Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар В группе больных с впервые выявленным СД второго типа в фазе декомпенсации включение в терапию наряду с сахароснижающими препаратами также и антиоксиданта липоевой кислоты отмечает повышение активности изучаемых нами ферментов антиоксидантной защиты (p<0,05). Десятидневное внутривенное введение тиоктовой кислоты в дозе 300 мг привело к повышению активности СОД на 18 %, КТ – 140 %, ГПО – 55% (таблца 3.2.4). У декомпенсированных больных СД первого типа при поступлении в стационар обнаружено повышение всех изученных ферментов АОС (таблица 3.2.5). При выписке отмечено снижение концентрации общей антиокислительной активности за счет снижения активности ГПО в 0,6 раза. 79 Таблица 3.2.5 Показатели антиоксидантной системы в сыворотке и эритроцитах крови у больных сахарным диабетом первого типа (M±m) Группы исследования Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом первого типа, фаза декомпенсации, при поступлении в стационар Группа больных сахарным диабетом первого типа, фаза декомпенсации, при выписке из стационара Общая антиокислительная активность, Ед.акт. 1,72 ± 0,13 n=7 2,38±0,09* n=9 2,23±0,05*,** n=9 Супероксиддисмутаза, ЕД/мл 210±11,4 n=7 215±21,6 n=10 217±13,8 n=10 Каталаза, мЕД/мл 0,28 ±0,04 n=7 0,52±0,11* n=10 0,75±0,17* n=10 Глутатионпероксидаза, ЕД/мл 0,12±0,05 n=7 0,58±0,17* n=8 0,32±0,09* n=8 Исследуемый показатель Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар Можно предположить, что полученные данные отражают общеприспособительные механизмы в развитии заболевания, которые способствуют адаптации к отрицательному влиянию активных форм кислорода. Следовательно, у диабетических больных по сравнению с контрольной группой наблюдается гиперактивация ПОЛ с включением механизмов ферментативной антиоксидантной защиты. 80 3.3. Дислипидемия и состояние энергетического обмена у больных сахарным диабетом Токсическое действие гипергликемии при сахарном диабете обусловлено накоплением в тканях продуктов неферментного гликолизирования и образованием крайне реакционноспособных свободных радикалов, ослаблением антиоксидантной защиты и развитием окислительного стресса. Эти процессы еще больше усугубляются вследствие гиперосмолярности стенок сосудов, накопления воды и ионов натрия с одновременной потерей ионов калия и развития отека сосудистой стенки, что может вызвать гипоксию тканей [90]. Основным показателем усиления процессов гликозилирования в организме является увеличение уровня гликозилированного гемоглобина HbA1c, что может, в свою очередь, вести к некоторой гипоксии и усиливать возникший порочный круг метаболических нарушений. Таким образом, важную роль в развитии осложнений при СД играет активация процессов свободнорадикального окисления, в частности, образование окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в плазме крови, индуцируемое неферментным гликозилированием [16]. Имеющиеся исследования свидетельствуют о роли дислипидемии, особенно дислипопротеинемии, в патогенезе сахарного диабета. Развитие дислипопротеинемии связывают с нарушением гормональной регуляции метаболических процессов и считают одним из факторов развития сосудистых осложнений (микро - и макроангиопатии), определяя тяжесть течения заболевания [98]. Развитие патологического процесса в сосудистой стенке во многом определяется особенностями сосудистого эндотелия, которые в свою очередь, зависят от физико-химических свойств клеточных мембран. Общность условий функционирования эритроцитов и клеток эндотелия позволяют экстраполировать изменения мембран эритроцитов на клетки сосудистого эндотелия. В научных работах последних лет имеются данные о том, что в основе механизмов атеросклеротического поражения сосудистой стенки лежит активация процессов ПОЛ [51]. 81 Результаты наших исследований свидетельствуют, что у больных СД второго типа отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольными значениями как в фазе компенсации, так и в декомпенсированном состоянии (таблица 3.3.1). Таблица 3.3.1 Показатели липопротеинового спектра крови у больных сахарным диабетом второго типа (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза компенсации Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации При При При выписке из При выписке поступлении поступлении в стационара из стационара в стационар стационар n=11 n=10 n=28 n=30 Общий холестерин, ммоль/л 4,38±0,19 5,46±0,25* 5,85±0,28* 6,19±0,31* 5,53±0,28*,** Триацилглицериды, ммоль/л 0,87±0,12 2,40±0,26* 2,56±0,36* 4,24±0,72* 3,21±0,47* Холестерин липопротеинов высокой плотности, ммоль/л 1,53±0,06 0,96±0,06* 0,81±0,03*,** 1,05±0,08* 0,70±0,06*,** Холестерин липопротеинов низкой плотности, ммоль/л 2,79±0,13 3,38±0,26* 3,87±0,23* 3,87±0,44* 3,32±0,29* Холестерин липопротеинов очень низкой плотности, ммоль/л 0,48±0,07 1,15±0,14* 1,17±0,16* 1,73±0,25* 1,46±0,21* Коэффициент атерогенности, усл.ед. 1,97±0,08 5,7±0,42* 6,42±0,58* 5,99±0,53* 7,37±0,91* Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар 82 При этом фаза декомпенсации СД характеризуется более выраженными изменениями количественного состава липопротеинов крови. КА повышался в 3 раза (p<0,05) по сравнению с контролем на фоне увеличения концентраций ХС, ТГ, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП (рисунок 3.3.1). 7 6 * * 5 ммоль/л ** * 4 3 2 * 1 * ** 0 ХС ТГ ХС ЛПВП ХС ЛПНП ХС ЛПОНП Показатель в контрольной группе Показатель при поступлении больного в стационар Показатель при выписке больного из стационара Рисунок 3.3.1- Показатели липидного спектра крови больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар Эти данные подчеркивают тезис о том, что повышение ХС ЛПНП и ТГ является одним из наиболее характерных признаков диабетической дислипидемии. Между тем количество ХС ЛПВП достоверно ниже контрольной величины данного показателя. Достижение фазы клинико-метаболической компенсации не сопровождалось нормализацией изучаемых параметров (по-видимому, из-за короткого времени наблюдения). Данные исследований, представленные в таблице 3.3.1, свидетельствуют и о том, что в группе больных в фазе компенсации и уровень ХС и ХС ЛПНП повышен в 1,2 раза, ТГ в 2,8 раз, ХС ЛПОНП в 2,4 раза, КА в 2,9 раза (p<0,001), а ХС ЛПВП достоверно снижен в 0,6 раз в сравнении с кон- 83 трольными величинами. После проведения комплексной терапии: сахароснижающими препаратами групп сульфонилмочевины в суточной дозе 30-60 мг, бигуанидов 1000 - 2000 мг, препаратами человеческого инсулина короткой продолжительности действия 12-40 Ед/сут., средней продолжительности в суточной дозе 642 Ед, и длительного действия 12-40 Ед/сут, а также антиоксидантом липоевой кислотой 300 мг/сут., отмечалось еще большее снижение уровня ХС ЛПВП на 16% (p<0,05). В остальных параметрах достоверных изменений мы не выявили, по-видимому, из-за короткого времени наблюдения. Нарушение энергетического обмена у больных СД второго типа как компенсированного, так и декомпенсированного проявлялось снижением синтеза АТФ (рисунок 3.3.2) по сравнению с контрольной группой на фоне повышения уровня лактата в сыворотке (рисунок 3.3.3). 0,16 ** нмоль/мкл 0,14 * * 0,12 0,1 * 0,08 0,06 0,04 0,02 0 Контрольная группа СД 2-го типа, фаза компенсации СД 2-го типа, фаза декомпенсации Показатель в контрольной группе Показатель при поступлении больного в стационар Показатель при выписке больного из стационара Рисунок 3.3.2 - Изменение концентрации АТФ у больных сахарным диабетом второго типа Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар Причем в группе больных в декомпенсированном состоянии, где уровень гипергликемии достигал 14,72±0,28 ммоль/л (p<0,001), а содержание HbA1с со- 84 ставляло 9,65±0,41 % (p<0,001), наблюдалось значительное увеличение концентрации молочной кислоты (рисунок 3.3.3). 6 * моль/л 5 * 4 ** 3 2 1 0 Контрольная группа СД 2-го типа, фаза компенсации СД 2-го типа, фаза декомпенсации Показатель в контрольной группе Показатель при поступлении больного в стационар Показатель при выписке больного из стационара Рисунок 3.3.3 - Концентрация лактата в сыворотке крови у больных сахарным диабетом второго типа Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар После проведенной терапии (актропид в дозе 6-10 ЕД, протофан 6-20 ЕД, манинил 3,5 мг, диабетон МВ 20-60 мг, глюкофаж 1000мг 1-2 раза в день, берлитион 300мг) показатели АТФ у пациентов в стадии компенсации повысились. При этом в фазе компенсации концентрация лактата снизилась на 1 моль/л, а в декомпенсированной фазе на 1,2 моль/л (таблица 3.3.2). При этом после двухнедельного лечения в стационаре концентрация глюкозы в периферической крови снизилась в компенсированной группе больных на 20% (p<0,05), в декомпенсированной - на 30% (p<0,05). В потреблении глюкозы эритроцитами в стадии декомпенсации отмечалось достоверное повышению этого показателя на 23 % относительно его значений при поступлении больного в стационар. 85 Таблица 3.3.2 Показатели энергетического обмена при сахарном диабете второго типа (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза компенсации Группа больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации При При При выписке из При выписке поступлении поступлении в стационара из стационара в стационар стационар Лактат, ммоль/л 1,10±0,30 n=7 3,51±0,46* n=9 2,52±0,38* n=8 4,90±0,60* n=16 3,70±0,37*,** n=15 АТФ, нмоль/мкл 0,14±0,01 n=7 0,1±0,006* n=8 0,13±0,01* n=8 0,11±0,005* n=16 0,1±0,009* n=10 Глик. Hb., % 4,80±0,30 n=7 6,71±0,31* n=9 - 9,65±0,41* n=11 - Глюкоза, ммоль/л 4,50±0,40 n=7 8,10±0,53* n=25 6,49±0,27*,** n=11 14,7±0,28* n=30 10,4±0,77*,** n=16 Утилизация глюкозы мкмоль/ (2*109кл/ч) 2,11±0,03 n=7 1,92±0,05* n=9 1,74±0,06** n=8 1,57±0,07* n=9 1,93±0,11** n=9 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар Таким образом, выявленное нами снижение концентрации АТФ в сыворотке крови можно объяснить недостаточным его синтезом, по-видимому, вследствие снижения активности ключевых ферментов гликолиза, пентозофосфатного цикла, а также некоторых энзимов цикла Кребса и разобщением или снижением сопряженности тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования у больных СД второго типа на фоне гипергликемии. Повышение уровня лактата у больных, вероятно, обусловлено усилением анаэробного гликолиза, что в свою очередь про- 86 воцируется снижением концентрации аденозинтрифосфата и еще в большей степени усугубляет гипоксию тканей и ДПН. Нами выявленна корреляционная связь между уровнем ТБК - активных продуктов и уровнем общего ХС (r=0,57), ХС ЛПНП (r=0,45), ТГ (r=0,38), КА (r=0,47), глюкозы (r=0,47), инсулина (r=0,41), что свидетельствует о взаимосвязи процессов ПОЛ с СД второго типа в фазе декомпенсации. Значительное увеличение содержания МДА в эритроцитах у больных с СД второго типа в стадии декомпенсации при поступлении в стационар, по сравнению с фазой компенсации подтверждает полученные данные. Таким образом, на фоне выраженного оксидативного стресса при СД второго типа развивается дислипидемия, характеризующаяся повышением уровней ХС, ТГ, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП и КА в плазме крови, при этом количество ХС ЛПВП снижается. На фоне данных метаболических нарушений происходит активация гликолитических процессов и угнетение аэробного синтеза АТФ в клетках, что сопровождается гиперлактацидемией и прогрессированием гипоксии, что может являться одной из причин развития осложнений у пациентов. На фоне кратковременной инсулиновой терапии, применения пероральных сахароснижающих препаратов и антиоксидантного лечения (тиоктовой или α-липоевой кислотой) отмечается лишь тенденция к улучшению изучаемых показателей при декомпенсации СД второго типа. Результаты наших исследований, представленные в таблице 3.3.3, свидетельствуют о том, что концентрация ХС ЛПВП в сыворотке крови у больных СД первого типа, в зависимости от степени компенсации заболевания, достоверно уменьшается (p<0,01), при этом возрастал уровень ХС ЛПНП (p<0,01) и КА, особенно значительно при декомпенсации с кетозом до 7,1 усл. ед. (при норме 1,97±0,08). У больных с гипертриглицеридемией отмечался пониженный уровень ХС ЛПВП, по-видимому, вследствие усиленного катаболизма апо - липопротеинов. 87 Таблица 3.3.3 Содержание липидов, холестерина в липопротеинах сыворотки крови у больных сахарного диабета первого типа (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Группа больных сахарным Контрольная диабетом первого группа типа, фаза n=12 компенсации n=15 Группа больных сахарным диабетом первого типа, фаза декомпенсации без кетоза n=12 Группа больных сахарным диабетом первого типа, фаза декомпенсации с кетозом n=8 Свободный холестерин, ммоль/л 1,98±0,12 2,45±0,16 2,31±0,14 2,73±0,19 Этерифицированный холестерин, ммоль/л 4,15±0,17 7,21±0,34* 7,62±0,38* 6,83±0,31* Общий холестерин, ммоль/л 4,38±0,19 5,89±0,26* 6,16±0,14* 6,43±0,21* Триацилглицериды, ммоль/л 0,87±0,12 0,91±0,03 1,03±0,21 1,5±0,26* Холестерин липопротеинов высокой плотности, ммоль/л 1,53±0,06 1,39±0,05 0,95±0,04* 0,69±0,11* Холестерин липопротеинов низкой плотности, ммоль/л 2,79±0,13 4,09±0,13* 4,75±0,26* 4,75±0,49* Холестерин липопротеинов очень низкой плотности, ммоль/л 0,48±0,07 0,41±0,02 0,41±0,03 0,71±0,13 Коэффициент атерогенности, усл.ед. 1,97±0,08 3,25±0,16 5,51±0,7* 7,1±1,2* Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой 88 Наши данные свидетельствуют о том, что по мере нарастания степени декомпенсации и тяжести течения заболевания гиперлипосинтетическая направленность метаболизма липидов играет важную роль в патогенезе формирования диабетической полинейропатии. По нашим данным, дислипопротеинемия у больных СД первого типа выражена в меньшей степени, чем при СД второго типа. Как и содержание глюкозы, уровень ЛП в плазме зависит от концентрации и действия инсулина [30]. Менее агрессивная атерогенная модификация ЛП у больных СД первого типа, возможно, связана с количеством инсулина и чувствительности к нему тканей. Так при СД второго типа чувствительность к инсулину снижена за счет инсулинрезистентности и как следствие появление гиперинсулинемии, которая стимулирует превращение углеводов в ТГ и повышает окислительную модификацию ЛПНП [106]. У больных СД первого типа в фазе компенсации наблюдается повышение эндогенного уровня общих липидов сыворотки крови за счет увеличения концентрации ХС (в основном его этерифицированной формы, тенденции к увеличению содержания ТГ). Нестабильность фракции неэстерифицированные жирные кислоты и триацилглицериды проявляется увеличением их соотношения в сторону первых, что свидетельствует о дисбалансе в системе «липолиз - липогенез» [98]. Как видно из таблицы 3.3.4, показатели энергетического обмена у больных СД первого типа в стадии декомпенсации не претерпевают значительных изменений на фоне инсулинотерапии, несмотря на то, что уровень гликемии снижается в более чем 1,5 раза (p<0,05). Концентрация АТФ при СД первого типа снижена относительно контрольной группы (p>0,05), но превышает значения данного показателя в группах больных СД 2-го типа и впервые выявленным СД 2-го типа в 1,2 раза (p<0,05) (рисунок 3.3.4). 89 Таблица 3.3.4 Показатели энергетического обмена при сахарного диабета первого типа (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом первого типа, фаза декомпенсации При поступлении в стационар При выписке из стационара Лактат, ммоль/л 1,10±0,32 n=7 3,94±0,71* n=9 4,47±0,52 * n=9 АТФ, нмоль/мкл 0,14±0,01 n=7 0,128±0,02 n=9 0,096±0,004** n=7 HbA1c, % 4,8±0,3 n=7 9,1±0,73* n=8 - 16,75±1,81* n=25 10,91±1,58** n=11 Глюкоза, ммоль/л 4,5±0,41 n=7 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар 0,16 0,14 нмоль/мкл 0,12 * 0,1 ** * ** ** 0,08 0,06 0,04 0,02 0 Контрольная группа Группа больных СД 2-го типа Группа больных СД 2-го типа впервые выявленным Группа больных СД 1-го типа Концентрация АТФ в контрольной группе Концентрация АТФ при поступлении больного в стационар Концентрация АТФ при выписке больного из стационара Рисунок 3.3.4 - Концентрация АТФ у больных разных типов сахарного диабета в фазе декомпенсации 90 У больных с впервые выявленным декомпенсированным СД второго типа при снижении ХС ЛПВП отмечается достоверное повышение ХС, ТГ, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП и КА. После терапии улучшения показателей не выявлено. Это свидетельствует о том, что двухнедельное лечение сахароснижающими препаратами положительного эффекта не дало (таблица 3.3.5). Таблица 3.3.5 Концентрация холестерина, триацилглицеридов и показатели липопротеинового спектра крови у больных с впервые выявленным сахарным диабетом второго типа (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа n=7 Группа больных с впервые выявленным сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации При поступлении в стационар n=13 При выписке из стационара n=8 Общий холестерин, ммоль/л 4,38±0,19 6,01±0,72* 5,24±0,29* Триацилглицериды, ммоль/л 0,87±0,12 2,89±0,49* 3,01±0,14* Холестерин липопротеинов высокой плотности, ммоль/л 1,53±0,06 0,93±0,14* 0,61±0,02*,** Холестерин липопротеинов низкой плотности, ммоль/л 2,79±0,13 3,81±0,8* 3,26±0,23 Холестерин липопротеинов очень низкой плотности, ммоль/л 0,48±0,07 1,34±0,25* 1,37±0,06* Коэффициент атерогенности, усл.ед. 1,97±0,08 5,61±0,59* 7,56±0,45*,** Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар 91 Однако, с впервые выявленным СД второго типа на уровне гиперлипопротеинемии, гиперлактоцидемии, гипергликемии, при значениях HbA1c = 13,94 % после двухнедельного лечения больных в условиях стационара сахароснижающими препаратами (протофан 8-14 Ед, актропид 6-8 Ед, диабетон-2000мг/сут) отмечается снижение уровня гликемии в 2,32 раза и повышение как базального, так и стимулируемого потребления глюкозы эритроцитами (таблица 3.3.6). Таблица 3.3.6 Показатели энергетического обмена при впервые выявленном сахарном диабете второго типа (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных с впервые выявленным сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации При поступлении в стационар При выписке из стационара Лактат, ммоль/л 1,10±0,32 n=7 2,47±0,11* n=10 2,92±0,20* n=8 АТФ, нмоль/мкл 0,14±0,01 n=7 0,11±0,01* n7 0,08±0,002* n=5 HbA1c, % 4,80±0,30 n=7 13,9±0,81* n=11 - Глюкоза, ммоль/л 4,50±0,41 n=7 13,9±0,62* n=18 6,0±0,39* n=8 Утилизация глюкозы 10г.с инс., мкмоль(2*109кл/ч) 2,11±0,03 n=7 1,49±0,09* n=25 1,49±0,11* n=14 Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар Таким образом, течение СД на фоне повышенного ПОЛ характеризуется количественными изменениями липопротеинов в плазме крови. Проведение терапии не сопровождается нормализацией всех изученных параметров, несмотря на 92 то, что снижается уровень гликемии и, следовательно, может явиться одной из причин формирования и прогрессирования осложнений у пациентов. У больных сахарным диабетом накопление продуктов липидной пероксидации снижает содержание ненасыщенных жирных кислот в клеточных мембранах, в следствие чего увеличивается их жесткость, уменьшается связывание инсулина со своими рецепторами, что ведет к ухудшению потребления глюкозы клетками. Подтверждением этому являются полученные нами данные по определению утилизации глюкозы эритроцитами. У больных СД снижается и базальное и стимулируемое инсулином потребление глюкозы клетками крови in vitro, особенно значительно при декомпенсированном СД второго типа (рисунок 3.3.5) и при длительности течения заболевания мкмоль(2*10^6кл.)/час более 8 лет (рисунок 3.3.6). 3 2,5 ** * 2 * ** 1,5 1 0,5 0 Контрольная группа Группа больных СД 2-го типа при поступлении в стационар Группа больных СД 2-го типа при выписке из стационара Базальное потребление глюкозы, концентрация глюкозы 7г. Стимулируемое потребление глюкозы, концентрация глюкозы 7г. Базальное потребление глюкозы, концентрация глюкозы 10г. Стимулируемое потребление глюкозы, концентрация глюкозы 10г. Рисунок 3.3.5 - Утилизация глюкозы эритроцитами in vitro у больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар 93 У больных СД второго типа с продолжительностью диабета менее 8 лет также снижается базальное потребление глюкозы эритроцитами, но в меньшей степени. Так как стимулируемая инсулином утилизация глюкозы в данных группах больных угнетается в большей степени, то можно предполагать, что имеется мкмоль(2*10^9кл.)/час инсулинорезистентность. 3 2,5 2 * * * * 1,5 1 0,5 0 Контрольная группа Группа при поступлении в стационар Группа при выписке из стационара Базальное потребление глюкозы Стимулируемое потребление глюкозы Рисунок 3.3.6 - Утилизация глюкозы эритроцитами in vitro у больных сахарным диабетом второго типа длительностью более 8 лет Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар Как видно из диаграмм при добавлении разных концентраций глюкозы и инсулина к отмытым эритроцитам выраженных изменений в реакции клеток к инсулину не отмечается, что свидетельствует о снижении чувствительности эритроцитов к инсулину. После проведенного лечения в группе с декомпенсированным течением диабета второго типа потребление глюкозы эритроцитми достоверно повышается: базальное на 26%, стимулируемое на 23%, но не достигает контрольных величин. В группе больных с длительностью сахарного диабета второго типа более 8 лет наблюдуется незначительное повышение данных показателей. 94 Проведение экспериментов с эритроцитами, взятыми у больных СД первого типа показало, что на фоне значительного повышения уровня ТБК- активных продуктов при сниженной антиоксидантной защите, значительно снижается, как базальное, так и стимулируемое потребление глюкозы клетками. Результаты исследований зависимости между дозой инсулина и характером изменений одного из метаболических показателей свидетельствуют, что при физиологической инсулинемии у больных СД первого типа утилизация глюкозы эритроцитами in vitro снижена по сравнению с контролем, при гиперинсулинемии этот процесс приближается к норме (таблица 3.3.7) Таблица 3.3.7 Исследование метаболических показателей у больных сахарным диабетом первого типа в фазе декомпенсации на фоне лечения инсулином и эссенциальными фосфолипидами (M±m) Группы исследования Исследуемый показатель Контрольная группа Группа больных сахарным диабетом первого типа, фаза декомпенсации Терапия инсулином Терапия инсулином и эссенциальными фосфолипидами Малоновый диальдегид, нмоль/109кл. 3,15±0,40 8,03±0,90* 3,79±0,20*,** Гидроперекиси, отн.ед./ 109кл 1,34±0,06 3,81±0,40* 1,96±0,03*,** Общая антиоксидантная активность, % 61,3±2,10 49,9±2,20* 56,3±2,20*,** Липидный фосфор, ммоль/ 109кл 11,5±0,20 3,82±0,19* 4,30±0,37* Утилизация глюкозы, мкмоль (2*109кл/ч) 2,75±0,15 1,78±0,03* 1,89±0,04*,** Примечание: * - p<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - p<0,05 по сравнению с группой при лечении инсулином 95 Следовательно, у больных СД первого типа снижается чувствительностиь клеток к пороговым физиологическим дозам инсулина. Большие дозы инсулина активируют ПОЛ, истончают мембраны, что регистрируется по снижению содержания липидного фосфора (11,5±0,2 в контрольной группе и 3,82±0,19 ммоль/109 клеток при СД первого типа), о чём и свидетельствует сниженная чувствительность клеток к инсулину. При достижении метаболической компенсации с использованием эссенциальных фосфолипидов возрастает утилизация глюкозы клетками, достоверно снижается концентрация МДА, ГП в эритроцитах и повышается общая антиокислительная активность сыворотки крови (p<0,05) (таблица 3.3.7). При применении эссенциальных фосфолипидов (липостабила) (в суточной дозе 500 мг в течение 10 дней пребывания в стационаре) на фоне гипогликемической терапии диабета (актропид 4-14 Ед- 3 раза, новорапид 8-10 Ед – 3 раза, хумалог 14 Ед – 3 раза, левемир 10-14 Ед -1-2 раза, протофан 8-14 Ед – 2 раза, лантус 16-48 Ед - 1 раз), наступает фаза достижения компенсации (нормализация углеводного обмена). Снижается концентрация ТБК - активных продуктов в эритроцитах на фоне повышения антиокислительной активности сыворотки крови. Улучшается усвояемость глюкозы эритроцитами при снижении ее концентрации в периферической крови с 16,75±1,81 до 8,14±0,67 ммоль/л. При исследовании уровня продуктов ПОЛ при декомпенсации сахарного диабета первого типа показано, что в обеих группах: при лечении инсулином вместе с эссенциальными фосфолипидами (ЭФЛ) и только инсулином, имеются достоверные отличия по содержанию МДА и ГП в сравнению с контролем (таблица 3.3.7). Таким образом, применение тиоктовой кислоты и ЭФЛ не фоне сахароснижающей терапии следует считать важным дополнительным фактором в лечении больных диабетом, когда углеводный и липидный обмен не могут в достаточной степени контролироваться диетой, инсулином или гипогликемическими преператами, чтобы избежать или свести до минимума диабетические осложнения. 96 ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время проблема заболеваемости сахарным диабетом является наиболее актуальной в современной эндокринологии. Её особая значимость определяется угрозой ранней инвалидизации и снижением общей продолжительности жизни пациентов в связи с развитием тяжелых сосудистых осложнений. В нашей стране ежегодно регистрируется от 5 до 10 новых случаев сахарного диабета на 100 тысяч населения, заболеваемость беспрерывно растет в среднем на 5%. [3, 100]. Несмотря на увеличение заболеваемости СД возрастает интерес к изучению развития и течения данного заболевания. Этиологические факторы и патогенетические механизмы развития этого процесса остаются до конца невыясненными. Многие исследователи считают, что важная роль в патогенезе СД принадлежит активации процессов свободнорадикального окисления, нарушению баланса между прооксидантами и антиоксидантами, что приводит к избытку свободных радикалов и накоплению высокотоксичных продуктов свободнорадикального окисления, способствуя развитию окислительного стресса. Но, учитывая даже высокую значимость участия свободнорадикального окисления в патогенезе СД, до настоящего времени не было проведено комплексной оценки состояния системы «ПОЛ-АОС», которая в норме сбалансирована и функционирует по принципу обратной связи. В работах, где представленна характеристика уровня свободнорадикального окисления и состояния антиоксидантной защиты у пациентов с СД, изучены только отдельные компоненты данной системы. К тому же имеющиеся в литературе данные о характере изменения активности и содержания исследуемых показателей у больных с диабетом очень противоречивы [33, 49, 81, 88, 134, 150]. В ходе работы обследовано 138 человек в возрасте от 23 до 65 лет, из них с диагнозом СД первого типа - 25 человек, с впервые выявленным СД второго типа - 28 и 55 человек с раннее поставленным диагнозом СД второго типа. Исследования проводились в период ремиссии сопутствующих заболеваний. В качестве контрольной группы обследовано 30 человек того же возраста. Результаты иссле- 97 дования представлены в зависимости от длительности течения, уровня компенсации и наличия осложнений основного заболевания. Изучение активности липидной пероксидации в общей группе больных диабетом показало увеличение концентрации и первичных, и вторичных продуктов ПОЛ по сравнению с контрольной группой. Накопление продуктов перекисной модификации может привести к появлению в мембранах своеобразных пор за счёт увеличения содержания гидрофильномодифицированных углеводородных хвостов. Это, по-видимому, ведет к повышению жёсткости мембраны в результате снижения содержания ненасыщенных жирных кислот и, таким образом, оказывает влияние на состояние инсулиновых рецепторов, снижает их гормонсвязывающую активность и приводит к снижению потребления глюкозы клетками [82]. Подтверждением этому являются полученные нами данные по определению утилизации глюкозы эритроцитами, которые свидетельствуют о том, что в эритроцитах у больных СД снижается как базальное, так и стимулируемое потребление глюкозы клетками, особенно значительно при СД второго типа осложнённого полинейропатией в стадии декомпенсации. У больных СД второго типа с продолжительностью болезни до 8 лет в фазе компенсации также снижается базальное потребление глюкозы эритроцитами, но в меньшей степени. Поскольку, стимулируемое инсулином потребление глюкозы у этих больных угнетается в более выражено, то можно предполагать, что имеется тенденция к развитию инсулинрезистентности. Концентрация АТФ при СД первого типа снижена относительно контрольной группы (p<0,05), но превышает значения данного показателя равных по величине концентраций АТФ при СД второго типа и впервые выявленным СД второго типа в 1,2 раза (p<0,05). Таким образом, полученные нами результаты по снижению степени потребления глюкозы эритроцитами позволяют считать, что клеточные мембраны при СД претерпевают значительные структурные и функциональные изменения, сопровождающимся снижением энергообеспечением клеток. У больных СД первого типа в фазе компенсации наблюдается повышение эндогенного уровня общих липидов сыворотки крови за счет увеличения концен- 98 трации холестерина (в основном его этерифицированной формы) и тенденции к увеличению содержания триацилглицеридов. Кроме того, концентрация ХС ЛПВП в сыворотке крови у больных СД первого типа в зависимости от степени компенсации заболевания достоверно уменьшается (p<0,01), при этом возрастает уровень ХС ЛПНП (p<0,01) и коэффициента атерогенности крови, в особенности в группе больных сахарным диабетом первого типа с кетозом в фазе декомпенсации до 7,1 усл.ед. (при норме 1,97±0,08). У больных с гипертриглицеридемией отмеченный пониженный уровень ХС ЛПВП, по-видимому, можно объяснить усиленным катаболизмом апо - липопротеинов. Установлено наличие количественных и качественных изменений липопротеинового спектра крови особенно значимых при СД второго типа и их зависимости от тяжести и длительности заболевания. В целом, средние показатели ХС ЛПВП были ниже таковых по сравнению с контролем (p<0,05), уровень ХС ЛПНП повышен (p<0,05), коэффициент ХС ЛПВП/ ХС ЛПНП понижен (p<0,01). В результате проведенного исследования получены новые данные фундаментального характера о состоянии мембран эритроцитов при дислипопротеинемиях у больных сахарным диабетом первого и второго типов. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных СД второго типа, как в фазе компенсации, так и на стадии декомпенсации, на фоне дислипидемии, усилен синтез активных кислородных метаболитов в мембранах эритроцитов, о чем свидетельствует высокая концентрация продуктов перекисного окисления липидов, таких как ГП, ДК и МДА относительно контрольной группы. При этом более выраженное увеличение концентрации вторичных продуктов свободнорадикального окисления - МДА отмечается при декомпенсированной форме СД второго типа, что свидетельствует о развитии более выраженного системного окислительного стресса. Выявленная нами корреляционная связь между уровнем МДА, ГП, ДК и уровнем общего ХС (r=0,57), ХСЛПНП (r=0,45), ТГ (r=0,38), КА (r=0,47), глюкозы (r=0,47), инсулина (r=0,41) свидетельствует о взаимосвязи процессов перекисной модификации биомолекул с СД второго типа в фазе декомпенсации. Значительное увеличение содержания МДА в эритроцитах у больных с СД 99 второго типа в стадии декомпенсации, по сравнению с фазой компенсации подтверждает полученные данные. У больных независимо от стадии компенсации, концентрация всех, изученных нами, продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах достоверно снижалась, на фоне уменьшения гликемии натощак до 6,54 ммоль/л при этом улучшалось и усвоение глюкозы эритроцитами (r=0,57). Таким образом, основной причиной нарушения структуры и функциональных способностей клеточных мембран при СД второго типа служат изменения её липидного состава, которые являются результатом активации процессов перекисного окисления липидов. А также, в результате пероксидации липидов образуются цитотоксичные соединения, среди которых наибольшую опасность представляют карбонильные продукты, которые легко образуют соединения с белками (ферментами антиоксидантной защиты, ингибируя их активацию) и нуклеиновыми кислотами [116]. Вследствие этого, при активации процессов ПОЛ можно ожидать нарушения взаимодействия гормона - инсулина с его рецепторами. Это может привести к изменению инсулиновых рецепторов, уменьшению количества инсулинсвязывающих участков и недостаточному действию гормона на клетки-мишени, и таким образом, стать одной из причин развития и прогрессирования инсулинрезистентности. В ходе работы обнаружено повышение концентрации малонового диальдегида в плазме крови. Это свидетельствует об усилении перекисной модификации в липопротеиновых комплексах и может стать дополнительным этиологическим фактором нарушения сродства липопротеинов к их рецепторам и, таким образом, способствовать образованию холестериновых бляшек на стенках сосудов [138]. На фоне увеличения активности процессов свободнорадикального окисления липидов и нарушением структуры и свойств мембраны эритроцитов при СД первого типа и СД второго типа наблюдаются изменения в системе антиоксидантной защиты, причем разнонаправленного характера. Показано, что у больных СД первого типа имеет место снижение содержания восстановленного глутатиона и активности ГПО, СОД и повышение активности КТ в крови. 100 Снижение активности ферментов глутатионового обмена и СОД может быть связано с действием активных форм кислорода, которые способны оказывать непосредственное модифицирующее воздействие на белки-ферменты, а также через их первичное взаимодействие с другими биомолекулами. При этом, наличие в структуре активных центров ферментов наиболее чувствительных к действию АФК аминокислотных остатков, дисульфидных мостиков и свободных SH-групп усугубляет процесс повреждающего воздействия активных кислородных радикалов на молекулы энзимов [53]. Влияние активных кислородных метаболитов на активность каталазы, повидимому, также имеет место, но оно незначительно нивелируется за счёт того, что общая ёмкость КТ в эритроцитах во много раз превышает потребности организма, необходимые для защиты липидов и других биомолекул от негативного действия кислородных радикалов [103]. К тому же каталаза относится к ферментам антиоксидантной защиты, которые почти не требуют энергии активации, наиболее долго сохраняют свою высокую активность. Скорость каталазной реакции лимитирует лишь скорость диффузии субстрата к активному центру фермента. Тогда, повышение концентрации КТ в эритроцитах больных сахарным диабетом можно назвать компенсаторной реакцией на увеличение интенсивности свободнорадикального окисления при диабете, в то время когда другие компоненты антиоксидантной системы оказываются значительно чувствительнее к усилению окислительных процессов в клетке, что проявляется снижением их ферментативной активности. Введение инсулина, который обладает способностью повышать активность каталазы, становиться дополнительным фактором, способным повлиять на работу данного фермента [53]. При изучении антиоксидантных ферментов в условиях in vivo кроме модифицирующего действия кислородных радикалов на структуру молекул можно ожидать дополнительного влияния нарастающей концентрации активных форм кислорода на активность супероксоддисмутазы и каталазы, так как данные белки являются ферментами специфической защиты в организме, субстратами для которых служат непосредственно активные формы кислорода. Увеличение содержа- 101 ния перекиси водорода, которая является ингибитором СОД и субстратом для КТ, в частности, может являться причиной снижения активности СОД и повышения активности КТ [25]. Наличие отрицательной корреляционной взаимосвязи между активностью ГПО и активностью КТ, также обладающей пероксидазной активностью, даёт возможность предполагать, что нарастание концентрации Н2О2 в клетке и как следствие - повышение активности каталазы, может повлиять на уменьшение уровня и понижение активности глутатионпероксидазы, так как ГПО эффективна только при низких концентрациях перекиси водорода [11]. Усиление процессов гликозилирования ферментов, играет важную роль в изменении их активности. На фоне усиления гликозилирования можно ожидать не только изменения химической структуры, но и снижения их каталитической активности антиоксидантных энзимов. А это подтверждается исследованиями, в которых отмечено, что гликозилирование супероксиддисмутазы и каталазы сопровождается уменьшением их активности [5, 217]. Обнаруженное в ходе работы снижение концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах больных сахарным диабетом может быть обусловлено следующими причинами: снижением его биосинтеза, вследствие нарушения транспорта необходимых для этого аминокислот в условиях нехватки АТФ при дефиците инсулина; увеличением расхода GSH на метаболические процессы (защиту клетки от действия активных кислородных метаболитов, процессов липопероксидации и окислительной модификации белков) и нарушением восстановления трипептида, обусловленного снижением глутатионредуктазы, глюкозо-6фосфатдегидрогеназы и дефицитом впоследствии НАДФН. Вследствие уменьшения внутриклеточного содержания GSH, изменяется активность глутатионзависимых ферментов. Между уровнем GSH и активностью GSSG обнаружена прямая корреляционная зависимость, тогда как между содержанием восстановленного глутатиона и активностью ГПО найдена отрицательная корреляционная связь. 102 Недостаток инсулина у всех больных СД первого и СД второго типов также может влиять на изменение активности ферментов глутатионового метаболизма in vivo. При этом происходит снижение скорости использования глюкозы по пентозофосфатному пути, что ведёт к дефициту НАДФН, который в свою очередь является основным поставщиком восстановительных эквивалентов в эритроцитах крови. Изменение содержания GSH, в свою очередь, также может влиять на скорость глюкозо-6-фосфат дегидрогеназной реакции, так как основное количество окисленной формы НАДФ+ - субстрата глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы регенерируется глутатионредуктазой в эритроците. И при снижении активности данного фермента, имеющего место при СД, особенно при диабете первого типа, возникает недостаток НАДФ+, что значительно ограничивает скорость начальной реакции пентозофосфатного пути [5]. Особое значение имеет показанное в нашей работе снижение GSH в эритроцитах при СД второго типа. Высокая значимость GSSG по сравнению с другими компонентами глутатионового метаболизма может быть связана с тем, что основной функцией окисленного глутатиона является защита клеток от продуктов перекисной модификации липидов посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы GSH или нуклеофильного замещения гидрофобных групп. Вероятно, это обусловлено тем, что в отличие от GSSG, для которого лучшими субстратами служат гидрофобные гидропероксиды с большим объёмом молекулы, ГПО активно восстанавливает гидрофильные гидропероксиды с малым размером молекулы. А именно с увеличением таких гидрофильных углеводородных участков и связано появление в клеточной стенке своеобразных пор и следовательно - изменение проницаемости биомембраны. В процессе исследования обнаружено, что такие клинические характеристики, как уровень компенсации и наличие осложнений СД второго типа, а также длительность течения патологического процесса, оказывают влияние на уровень изучаемых показателей. Содержание ДК, МДА, GSH, и активность GSSG, ГПО в крови больных изменяются в зависимости от длительности заболевания и остают- 103 ся на том же уровне на протяжении всего периода пребывания пациентов в стационаре (10 дней). При увеличении срока заболевания наблюдается повышение как плазменного, так и эритроцитарного уровня малонового диальдегида. При повышении срока заболевания выявляются некоторые изменения концентрации GSH. Так, если в эритроцитах у больных с СД второго типа с начальным диабетом (длительностью заболевания до 8 лет) уровень GSH резко снижен по сравнению с контрольной группой, то у больных с продолжительностью СД более 8 лет содержание данного показателя достоверно повышается в сравнении с группой больных с течением заболевания до 8 лет, но при этом остаётся значительно ниже контрольной величины. При значительном увеличении срока заболевания (свыше 8 лет) содержание GSH достоверно снижается по сравнению с предыдущей группой. Развитие декомпенсированного течения заболевания усугубляет возникшие изменения исследуемых показателей. В группе больных с декомпенсацией наблюдается более выраженное увеличение уровня первичных продуктов перекисного окисления липидов, снижение активности всех исследуемых антиоксидантных ферментов (кроме ГПО), уменьшение концентрации восстановленного глутатиона по сравнению с группой компенсированного СД второго типа. Увеличение количества ДК, по-видимому, связано со снижением концентрации инсулина при декомпенсации сахарного диабета. Инсулин является ингибитором чувствительной к гормонам липазы и при уменьшении его концентрации происходит активация липолиза. В результате этого свободные жирные кислоты, образующиеся при гидролизе триацилглицеридов, в больших количествах поступают в кровь, где значительно увеличивается их концентрация. Так как сами свободные жирные кислоты являются субстратом окисления, то при увеличении их содержания можно ожидать усиления интенсивности свободнорадикального окисления в целом и, в частности, увеличения первичных продуктов ПОЛ - ДК. При этом в группе больных СД между концентрацией ДК и уровнем НЬА1с имеется прямая корреляционная связь с тенденцией к достоверности, что подтверждает 104 влияние углеводного обмена на уровень продуктов перекисной модификации липидов. По сравнению с группой компенсированного сахарного диабета при развитии декомпенсации снижение концентрации основного клеточного, низкомолекулярного, тиольного антиоксиданта - GSH обусловлено, вероятно, усиленным его использованием на метаболические процессы. Снижение активности ферментов, участвующих в рециклизации глутатиона также может оказывать влияние на снижение концентрации представленного антиоксиданта. Наиболее выраженное снижение активности всех исследуемых ферментов при декомпенсации сахарного диабета подчеркивает особую значимость гипергликемии в изменении активности белков - ферментов. При этом, проведение корреляционного анализа обнаружило наличие обратной зависимости между уровнем HbAlc с одной стороны и содержанием GSH и активностью KT и СОД с другой. В отличие от остальных компонентов глутатионовой системы не найдено корреляционной зависимости между активностью ГПО и уровнем HbА1с. По всей видимости, данный фермент является функционально активным и более лабильным, быстрее гликозилированного гемоглобина реагирует на изменение внутриклеточных процессов. В частности, показано наличие достоверной положительной корреляционной связи между активностью глутатионпероксидазы и уровнем гликемии (r=0,69). Активность данного фермента, вероятно, более других зависит от постоянных колебаний уровня глюкозы в крови больных диабетом. В группах больных с осложнениями и без них при сравнении всех исследуемых показателей отмечено, что наличие поздних осложнений сопровождается повышением уровня плазменного МДА и снижением активности СОД. В то же время при наличии осложнений недостоверно возрастает содержание МДА в эритроцитах. Это может быть обусловлено тем, что осложнения СД обычно развиваются через годы течения основного заболевания, когда происходит утяжеление патологического процесса в целом. В литературе имеются данные о том, что тяжесть патологического процесса влияет на концентрацию МДА, который способен ковалентно связываться с липидами и белками клеточных мембран [91]. 105 Возможно, вследствие этого, в группе больных СД второго типа с осложнениями не наблюдается повышения уровня МДА в эритроцитах, в то время как достоверно повышается концентрация МДА в млазме крови относительно группы без осложнений диабета. Супероксиддисмутаза является основным ферментом специфической антиоксидантной защиты организма. Активность ее зависит от уровня О2• индуцирующего и активирующего фактора по отношению к антиоксидантному ферменту [2]. Развитие поздних осложнений при диабете обусловлено в основном воздействием супероксидного радикала [18]. Обнаруженное нами снижение активности СОД можно рассматривать как фактор, определяющий развитие ряда осложнений СД второго типа, что позволяет рекомендовать использование антиоксидантной терапии, первостепенной задачей которой является обезвреживание O2•. Таким образом, у больных СД второго типа наблюдается активация процессов липидной пероксидации, которая проявляется увеличением содержания как первичных, так и вторичных продуктов перекисной модификации, а также изменение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов и нарушение в системе антиоксидантной защиты, которые имеют разнонаправленные изменения при данной патологии. На фоне чего выявлены особенности изменения изучаемых показателей в зависимости от уровня компенсации, наличия осложнений и длительности течения основного заболевания. Полученные результаты показывают целесообразность добавления к инсулину и гипогликемической терапии антиоксидантов и мембраностабилизирующих препаратов сразу на ранних этапах патологического процесса с целью защиты клеток организма, и в частности - β-клеток, от токсического действия продуктов липидной пероксидации и самих активных форм кислорода, а также для профилактики сосудистых осложнений сахарного диабета первого и второго типов. 106 ВЫВОДЫ: 1. Нарушения липопротеинового обмена более выражены у пациентов с сахарным диабетом второго типа по сравнению с таковыми у больных сахарным диабетом первого типа и характеризуются значительным увеличением содержания в крови холектерина липопротеинов очень низкой плотности, триглицеридов и общего холестерина. Выраженность указанных изменений при сахарном диабете зависит от длительности заболевания, наличия декомпенсации углеводного обмена и сосудистых осложнений. 2. Сахарный диабет (СД) у больных сопровождается активацией процессов липидной пероксидации, которая проявляется увеличением содержания как первичных, так и вторичных продуктов перекисной модификации, а также изменением структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов и нарушением в системе антиоксидантной защиты, которые имеют разнонаправленные изменения при данной патологии. Содержание диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) в крови больных СД второго типа увеличивается уже в ранние сроки заболевания. При увеличении срока заболевания наблюдается повышение как эритроцитарного, так и плазменного уровня МДА, тогда как содержание ДК возрастает в более поздние сроки заболевания. 3.У больных с декомпенсацией СД второго типа выявляется более выраженное повышение плазменного уровня МДА, увеличение содержания ДК, снижение активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КТ), а также снижение степени утилизации глюкозы эритроцитами и активности ферментов тиосульфидного обмена по сравнению с соответствующими показателями в группе компенсированного диабета. 4. При сахарном диабете второго типа, осложнённом диабетической нейропатией активация ПОЛ и нарушение тиосульфидного обмена более выражены по сравнении с таковыми у диабетических больных без осложнений. 5. Установлено, что при СД первого типа, осложнённом полинейропатией на фоне дислипидемии и нарушения энергетического обмена, двухнедельное 107 применение мембраностабилизирующего препарата липостабила и антиоксиданта тиоктовой кислоты, достоверно снизило уровень гликемии и лактата крови и повысило степень утилизации глюкозы эритроцитами по сравнению с диабетическими больными, принимающими только гипогликемическую терапию. 108 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для повышения эффективности лечения сахарного диабета и его осложнений рекомендовано добавление к инсулинотерапии и гипогликемическим лекарственным средствам антиоксидантных и мембранстабилизирующих препаратов. Применение такой комплексной терапии уже на ранних стадиях заболевания может способствовать профилактике различных диабетических осложнений. 109 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АКМ Активные кислородные метаболиты АОЗ Антиоксидантная защита АОС Антиоксидантная система АТФ Аденозинтрифосфат АФК Активные формы кислорода ГП Гидроперекиси ГПО Глутатионпероксидаза ДК Диеновые конъюгаты ДПН Диабетическая полинейропатия КА Коэффициент атерогенности КТ Каталаза ЛПВП Липопротеины высокой плотности ЛПНП Липопротеины низкой плотности ЛПОНП Липопротеины очень низкой плотности МДА Малоновый диальдегид НАДФ+ Никотинамиддинуклеозидфосфат ОС Окислительный стресс ПОЛ Перекисное окисление липидов СД Сахарный диабет СОД Супероксиддисмутаза СРО Свободно-радикальное окисление ТБК Тиобарбитуровая кислота ТГ Триацилглицериды ХС Холестерин ЭФЛ Эссенциальные фосфолипиды GSH Восстановленный глутатион GSSG Окисленный глутатион HbAlc Гликированный гемоглобин 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Агарков, А.А. Влияние мелатонина на активность глутатионовой антиоксидантной системы и некоторых НАДФН-генерирующих ферментов в печени и крови крыс при сахарном диабете 2 типа / Т.Н.Попова, Л.В.Матасова и др. // Химикофармацевтический журнал. -2011.-Т. 45.- № 7.-С.7-10. 2. Азизов, В.А. Анализ взаимосвязей между липидным спектром и другими клинико-лабораторными показателями при сахарном диабете 2-го типа и артериальной гипертензии у женщин / В.А.Азизов // Кардиология. -2007.- 47(2).-С.39-40. 3. Аметов, А.С. Окислительный стресс при сахарном диабете 2-го типа и пути его коррекции / О.Л.Соловьева // Проблемы эндокринологии. -2011.-№6.-Т.57.С.52-56. 4. Антонеева, И.И. Система перекисное окисление липидов - антиоксиданты в норме и патологии / Д.Р.Арсланова, Л.А.Белозерова, Т.П.Генинг, Н.Н.Иванская. Ульяновск: Вектор-С. 2008. -235с. 5. Антонова, К.В. Влияние антиоксидантной терапии на показатели окислительного стресса, чувствительность к инсулину и секреторную активность инсулярного аппарата при сахарном диабете типа 2: автореф.дис. ... канд.мед.наук: 14.00.03 / Антонова Ксения Валентиновна. -М., 2008.-24с. 6. Антонова, К.В. Влияние компенсации углеводного обмена на свободнорадикальное окисление липопротеинов низкой плотности и активность ферментативной антиоксидантной системы при сахарном диабете типа 2 / Л.В.Недосугова, М.И.Балаболкин и др. // Проблемы эндокринологии. - 2003.- Т.49.-№2. - С.51 - 54. 7. Арчаков, А.И. Микросомальное окисление /А.И.Арчаков. -Москва: Наука. 1975.-326с. 8. Бабаджанова, Г.Ю. Инсулинрезистентность и сахарный диабет как результат лечения глюкокортикостероидами / Г.Ю.Бабаджанова // Терапевтический архив. 2005.-Т.77.-№ 3.-С.93-96. 9. Балаболкин, М.И. Диабетология / М.И.Балаболкин. - Москва: Медицина. 2000.-672с. 111 10. Балаболкин, М.И. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете / М.И.Балаболкин // Сахарный диабет. -1999. -№1. -С.2 - 9. 11. Балаболкин, М.И. Патогенез и механизмы развития ангиопатий при сахарном диабете / Е.М.Клебанова // Кардиология. -2000.-Т.40.-№10.-C.74-87. 12. Балаболкин, М.И. Применение препарата мультигамма в комплексной терапии диабетической нейропатии: методические рекомендации // М.И.Балаболкин. Москва: Медицина. - 2002.-12с. 13. Балаболкин, М.И. Роль гликирования белков, окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений при сахарном диабете / М.И.Балаболкин // Сахарный диабет. -2001.-Т.12.-№ 3.-С.2-4. 14. Балаболкин, М.И. Роль окислительного стресса в патогенезе диабетической нейропатии и возможность его коррекции препаратами альфа-липоевой кислоты / М.И.Балаболкин // Проблемы эндокринологии. -2005. -Т.51.-№ 3.-С.22-33. 15. Балаболкин, М.И. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений диабета / Е.М.Клебанова // Проблемы эндокринологии. - 2000. Т.46.-№6.-С.29-34. 16. Бизунок, Н.А. Влияние адренергических средств на НАДФ-оксидазную продукцию активных форм кислорода в макрофагах / Б.В.Дубовик // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2008.-Т.71.-№1.-С.43-46. 17. Биоантиоксидант. VIII Международная конференция. 4-6 октября 2010 года. Москва.- РУДН.- тезисы докладов. -558 с. 18. Бобырева, Л. Е. Антиоксиданты в комплексной терапии диабетических ангиопатий / Л.Е.Бобырева // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1998.-Т.61.-№1.-C.74-80. 19. Бондарь, И.А. Антиоксиданты в лечении и профилактике сахарного диабета / В.В.Климентов // Сахарный диабет. -2001.- №1. -С.46-49. 20. Бондарь, И.А. Перекисное окисление липидов и активность лизосомальных ферментов сыворотки крови при сахарном диабете 1 типа и их коррекция /А.Б.Пупышев, В.В.Климонтов // Консилиум. -1999.-№6.-С.23-26. 112 21. Ботова, С.Н. Диагностика и прогностическое значение кардиоваскулярной автономной нейропатии у больных сахарных диабетом 2-го типа в сочетании с хронической сердечной недостаточностью: автореф.дис. ... канд.мед.наук: 14.00.05 / Ботова Светлана Николаевна. -Нижний Новгород, 2009. -26с. 22. Вахрушева, Л.Л. Адениннуклеотиды крови при сахарном диабете у детей / В.Б.Голованова, Л.В.Демидова // Педиатрия. -1976.-№ 9.-С.17-18. 23. Владимиров, Ю.А. Активные формы кислорода и азота: диагностическое, превентивное и терапевтическое значения / Ю.А.Владимиров // Биохимия. -2004.Т.69.-вып.1.-С.1-3. 24. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / А.И.Арчаков. - М.: Наука. 1972. -249с. 25. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестн. РАМН. -1998.-№7.-С.43-51. 26. Волчегорский, И.А. Влияние про- и антиоксидантов на чувствительность к инсулину и толерантность к глюкозе / Л.М.Рассохина, И.Ю.Мирошниченко и др. // Бюлл.экспер.биол. и мед. - 2010. -Том 150.-№9.-С.295-301. 27. Гаврилов, В.Б. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови / М.И.Мишкорудная // Лабораторное дело. 1983.-№3.-С.33-35. 28. Галиева, О.Р. Лечение диабетической нейропатии / П.Х.Джанашия, Е.Ю.Мирина // Русский медицинский журнал. -2005.-№10.-С.648-654. 29. Галлеев, И.В. Роль метаболических нарушений в развитии дистальной диабетической полинейропатии при инсулинзависимом сахарном диабете: дис. ... канд. мед.наук: 14.00.03 / Галеев Иван Викторович. - Москва, 2003. -161с. 30. Гарднер, Д. Базисная и клиническая эндокринология / Д.Шобек. -Книга 1. Перевод с англ. под редакцией Мельниченко Г.А.- 2010. -С.464. 31. Гершкорон, Ф.А. Особенности состояния системы глутатиона, перекисного окисления липидов и метаболизма лимфоцитов крови в патогенезе инсулинзависимого сахарного диабета: автореф.дис. ... канд. мед.наук: 14.00.16 / Гершкорон Фрима Ароновна. - Иркутск, 2005.-23с. 113 32. Голиков, А.П. Свободнорадикальное окисление и сердечно-сосудистая патология: коррекция антиоксидантами / А.П.Голиков, С.А.Бойцов, В.П.Михин // Лечащий врач. -2003.-№4.-С.70 -74. 33. Горбенко, Н.И. Влияние сочетанного применения витаминов Е и С на липидный профиль и активность параоксоназы в сыворотке крови кроликов с дитизоновым диабетом / В.В.Полторак, А.И.Гладких, О.В.Иванова // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. -2002.-№4.-С.41-44. 34. Горожанская, Э.Г. Свободнорадикальное окисление и основные механизмы антиоксидантной защиты в норме и при злокачественной патологии / Э.Г.Горожанская // Клиническая лабораторная диагностика. -2010.-№ 6.-С.28-44. 35. Горожанская, Э.Г. Свободнорадикальное окисление и основные механизмы антиоксидантной защиты в норме и при злокачественной патологии: уч.пос. / Г.Н.Зубрихина, С.П.Свиридова. –Москва. -2010.-45с. 36. Гузенко, В.Е. Окислительный стресс при сахарном диабете и его фармакологическая коррекция / Л.М.Макарова, В.Е.Погорелый // Российский педиатрический журнал. -2010.-№5.-С.42-50. 37. Гучетль, Е.В. Оксидантные и антиоксидантные системы при внелегочном туберкулезе различной локализации / Н.В.Колесникова, А.Е.Дорошенкова // Тегга Medica-Лабораторная диагностика. -2004.-№3.-С.4-7. 38. Данилова, Л. А. Калориметрический метод определения гликозилированных гемоглобинов / Н.И.Лопатина // Лаб. Дело. -1986.-№5.-С.281-283. 39. Дедов, И.И. Влияние антиоксидантов на состояние перекисного окисления липидов и функцию β-клеток у больных с впервые выявленным сахарным диабетом / В.А.Горелышева, О.М.Смирнова, Г.А.Романова, И.Х.Филлипов // Практическая эндокринология. -1995.-Т.41.-С.16-20. 40. Дедов, И.И. Роль окислительного стресса, апоптоза, инсулиновой резистентности и нарушении липидного обмена в патогенезе сахарного диабета и его сосудистых осложнений: пособие для врачей / М.И.Балаболкин, Г.Г.Мамаева и др. Москва: ГУ ЭНЦ. 2005. -73с. 114 41. Дедов, И.И. Сахарный диабет / М.В.Шестакова. -М.: «Универсум паблишинг». 2003. -456с. 42. Дедов, И.И. Сахарный диабет. Диагностика, лечение, профилактика / М.В.Шестакова. -Москва: МИА. 2011.-808с. 43. Дедов, И.И. Сахарный диабет: ангиопатии и окислительный стресс: пособие для врачей / М.И.Балаболкин, Г.Г.Мамаева и др. - М: МЗРФ, ГУ Эндокринологический научный центр РАМН, 2003. -86с. 44. Дементьева, И.И. Мониторинг концентрации лактата и кислородного статуса для диагностики и коррекции гипоксии у больных в критическом состоянии / И.И.Дементьева // Клиническая диагностика. - 2003.-№3.-С.25-32. 45. Денисенко, В. С. Структурно-функциональные изменения эритроцитов у больных ИБС с поздними осложнениями сахарного диабета и их коррекция эссенциальными фосфолипидами: автореф.дис. … канд.мед.наук: 14.00.06 / Денисенко Вера Степановна. -Москва, 2002. -22с. 46. Деримедведь, Л.В. Антиоксиданты в терапии сахарного диабета / И.П.Бухтиярова // Провизор. -2007.-№24.-С.14-18. 47. Добрынина, И.Ю. Перекисное окисление липидов и состояние системы антиоксидантной защиты в мембранах тромбоцитов у больных инсулиннезависимым сахарным диабетом в сочетании с САГ 1 / И.Ю.Добрынина. -Сургут. -2000. Секция 1-3.-Ч.1.-C.242-244. 48. Дубинина, Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса / Е.Е.Дубинина // Вопросы медицинской химии. -2001.-Т.47.-№6.-С.561-581. 49. Жукова, О.Ю. Патогенетическая значимость активации свободнорадикальных процессов в печени при алкоголизации на фоне сахарного диабета: автореф.дисс. … канд.мед.наук: 14.00.16; 03.00.04 / Жукова Олбга Юрьевна. -Омск. 2008.-21с. 50. Зайчик, А.Ш. ЭЛБИ-СПб. 2001.-687с. Основы патохимии / Л.П.Чурилов. -Б.г.- 115 51. Занозина, О.В. Роль окислительного стресса в развитии и прогрессировании поздних осложнений сахарного диабета 2 типа. Возможности антиоксидантной терапии: автореф.дис. … док.мед.наук: 14.01.04 / Занозина Ольга Владимировна. Нижний Новгород, 2010. -50с. 52. Занозина, О.В. Роль свободнорадикального опосредованного окислительного стресса в развитии диабетической полинейропатии / О.В. Занозина, Г.П. Рунов, К. М. Беляков // Сахарный диабет. - 2004.-№3.-С.22-26. 53. Зенков, Н.К. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологические аспекты / Н.К.Зенков, В.З.Ланкин, Е.Б.Менщикова. - М.: МАИК «Наука / Интерпериодика». 2001. - 343с. 54. Зенков, Н.К. Фенольные антиоксиданты / Н.К.Зенков, Н.В.Кандалинцева, В.З.Ланкин. -Новосибирск: СО РАМН. 2003. -328с. 55. Иванов, В.В. Адипоциты. Сахарный диабет. Окислительный стресс / Е.В.Шахристова, Е.А.Степова и др.- Томск. 2013. -110с. 56. Казимирко, В.К. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия / В.К.Казимирко. - К.: Морион. 2004. -160с. 57. Карлова, Н.Г. Генетические механизмы клиническая картина сахарного диабета I типа у больных бурятской популяции: автореф.дис. … канд.мед.наук: 14.00.16; 14.00.03 / Карлова Наталья Геннадьевна. - Иркутск, 2005. -21с. 58. Касаткина, Э.П. Профмлактика поздних осложнений сахарного диабета у детей и подростков. Пути оптимизации диспансерной службы / Э.П.Касаткина // Сахарный диабет. -1999.-№1.-C.18-22. 59. Киреев, Р.А. Перекисное окисление липидов, антиоксидантная защита и содержание 2,3-дифосфоглицерата у детей, больныхсахарным диабетом 1 типа / Н.А.Курмачева, В.В.Игнатов // Сахарный диабет. -2001.-№1.С.6-9. 60. Киреев, Р.А. Эффективность влияния комплексных антигомотоксических препаратов на состояние перекисного окисления липидов, антиоксидантную защиту и углеводный обмен у детей с инсулинозависимым сахарным диабетом / Р.А.Киреев, Н.А.Курмачева, А.А.Марьяновский // Рос. педиатр. журн. - 2002. №2. - С.52 - 55. 116 61. Клебанова, Е.М. Инсулинорезистентность: ее роль в патогенезе сахарного диабета 2 типа и возможности коррекции / Е.М.Клебанова // Лечащий врач. 2005.-№ 5.-С.16-20. 62. Клебанова, Е.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений / В.М.Креминская. - М: Медицина. 2005.-43с. 63. Клебанова, Е.М. Функциональная активность бета-клеток, инсулинорезистентность, перекисное окисление липидов и состояние системы антиоксидантной защиты у больных сахарным диабетом типа 2: дис. ... канд.мед.наук: 14.00.03 / Клебанова Елена Михайловна. –М., 2004.-105с. 64. Климов, А.Н. Биохимические основы патогенеза атеросклероза / А.Н.Климов, В.А.Нагорнев, Ю.Н.Зубжигский, А.Д. Денисенко. -Л.:Медицина.1980.-С.46-76. 65. Князев, Ю.А. Гликозилированный гемоглобин и АТФ крови при сахарном диабете у детей / Л.Л.Вахрушева, Т.Т.Чеснокова, Н.А.Сергеева и др. // Вопросы медицинской химии. -1985.-т.31.-вып.3.-С.67-71. 66. Колесникова, Л.И. Оценка системы липопероксидации у больных сахарным диабетом 1-го типа в разных этнических группах / М.А.Даренская, Т.П.Бардымова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. -2012.-№4.-С.19-21. 67. Колосова. М.В. Эритроциты и злокачественные новообразования / Н.В.Рязанцева, В.И.Корчин и др.-Томск. 2000.-286с. 68. Кольман, Я. Наглядная биохимия / К.-Г.Рем. - Москва: Бином Лаборатория знаний. 2011.-672с. 69. Кондратьева, Е.И. Гены синтаз оксида азота (NOS) в патогенезе сахарного диабета и его осложнений / Е.И.Кондратьева, Т.В.Косянкова // Проблемы эндокринологии. - 2002. -Т48. -№2. -С.33-37. 70. Корчин. В.И. Перекисное окисление липидов и его роль в патогенезе сахарного диабета: Материалы Всерос. науч. - практ.конф. / В.И.Корчин. – Сургут. 2000.-251с. 71. Кравченко, Т. В. Применение никотинамида и других антиоксидантных препаратов в комплексной терапии сахарного диабета 2 типа / Б.П.Мищенко, А.П.Князева и др. // Сахарный диабет. -2001.-№1.-C.21-23. 117 Кулинский, В.И. Система глутатиона в эритроцитах и плазме при вирусном 72. гепатите / З.А.Леонова, Л.С.Колиснеченко и др. // Биомедицинская химия. -2007. Т 53.-вып 1.- С.91-98. Лавренко, А.В. Влияние метформина на продукцию провоспалительных 73. цитокинов и инсулинрезистентность (F-kB-сигнальный путь) / Н.Л.Куценко, Л.А.Куценко и др. // Проблемы эндокринологии. -2012.-Т.58.-№ 2.-С.25-28. Левин, О.С. Полиневропатии: клиническое руководство / О.С.Левин. - 74. Москва: Медицинское информационное агенство. 2011.-490с. 75. Лилли, Л. Патофизиология заболеваний сердечно-сосудистой систе- мы: Пер. с англ. / Л.Лилли. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2003.598с. 76. Мамедова, И.Н. Коррекция окислительного стресса в течении диабетической автономной нейропатии при сахарном диабете 2 типа: автореф.дис. … канд.мед.наук: 14.00.03; 14.00.13 / Мамедова Ирина Наримановна. – Москва, 2003. -24с. 77. Марри, Р. Биохимия человека / Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. – М.: Мир. 2009.-Т.2.- 415с. 78. Матвеева, И.В. Патобиохимия: учеб.пос. / И.В.Матвеева, Е.А.Строев и др. – М.: ГОУ ВУНМЦ. 2002.-233с. 79. Меньщикова, Е.Б. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания / Н.К.Зенков, В.З.Ланкин, И.А.Бондарь, В.А.Труфакин. –Новосибирск: «АРТА». 2008.-284с. 80. Меньщикова, Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и оксиданты / Н.К.Зенков, В.З.Ланкин и др. –Москва: «Слово». 2006.-553с. 81. Микаелян, Н.П. Липид-белковые взаимодействия в мембранах эритроцитов и плаценты при инсулинорезистентности у женщин / А.А.Терентьев, А.Г.Максина и др. // Биомедицинская химия. - 2012. -том 58.-вып.2.-С.244-229. 82. Микаелян, Н.П. Метаболические эффекты ЭФЛ и инсулинрецепторные взаимодействия при сахарном диабете: программа симпозиума А.В.Курников, Ю.Б.Калачик. –М. 1993.-С.11-12. / Э.П.Микаелян, 118 Микаелян, Н.П. Окислительный стресс у беременных, больных сахар- 83. ным диабетом / А.Г.Максина, В.А.Петрухин и др. // Проблемы эндокринологии. - 2002. –Т.48.-№5. -С.33-36. Микаелян, Н.П. Состояние системы «ПОЛ - антиоксиданты» у беременных, 84. больных сахарным диабетом типа 1, и их плодов / Ю.А.Князев, В.А.Петрухин и др. // Сахарный диабет. - 2002. -№2. -С.З0-34. Микашинович, З.И. Клинико-диагностическое значение биохимических пара- 85. метров в оценке компенсации сахарного диабета 2-го типа / О.Г.Ишонина, Е.В.Олемпиева // Клинико-лабораторная диагностика. -2011.-№1.-С.19-22. Мкртумян, А.М. Инсулин - в норме и при патологии. Актуальные вопросы 86. медицины / А.М.Мкртумян. -Москва. 2008.-62с. Недосугова, Л.В. Влияние метформина на выраженность окислительного 87. стресса у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа / В.З.Ланкин, С.М.Резник и др. // Проблемы эндокринологии. -2007. -Т.53.-№ 1.-С.3-7. Нелаева, А.А. Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах 88. тромбоцитов у больных СД 1 типа, осложненного диабетической нефропатией (ДН) / А.А.Нелаева, Е.А.Александрова, Ю.В.Нелаева // Сахарный диабет и его осложнения: Материалы IV Всерос. конгр. эндокринологов 1-5 июня 2001г. СПб., 2001. -145с. Огурков, Е.В. Механизмы продукции активных форм кислорода при инсу- 89. линнезависимом сахарном диабете / Е.В.Огурков // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины. -2000.-C.68-69. Окороков, А.Н. Метаболический синдром / А.Н.Окороков. –Минск: Равно- 90. денствие. 2012.-130с. Панасенко, О.М. Свободнорадикальная модификация липопротеинов крови и 91. атеросклероз / В.И.Сергиенко // Биол. мембраны. -1993.-Т.10.-№4.-C.341-382. Панкин, В.З. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et 92. contra / В.З.Панкин, А.К.Тихазе, Ю.Н.Беленков // Кардиология. -2004.-№2. - С.7281. 119 93. Панкин, В.З. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сер- дечно-сосудистой системы / В.З.Панкин, А.К.Тихазе, Ю.Н.Беленков // Кардиология. - 2000. - №7.-С.45-50. Паранич, Л.И. Действие нитробензола и его хлорпроизводных на некоторые 94. показатели антиокислительного гомеостаза в тканях крыс / А.В.Паранич, Е.В.Бугай, Н.М.Василенко // Бюл. экспер. биологии и медицины. -1993.-Т.116.№10.-С.402-405. Пасечник, И.Н. Механизмы повреждающего действия активированных форм 95. кислорода на биологические структуры у больных в критических состояниях / И.Н. Пасечник // Вестник интенсивной терапии. - 2001. -№ 4. - С.3-9. Пекарева, Е.В. Маркеры апоптоза у больных сахарным диатетом 1 типа в 96. дебюте заболевания / Т.В.Никонова, В.А.Горелышева и др. // Сахарный диабет. 2009.-№4.-С.86-89. Попова, Т.П. Свободнорадикальные процессы в крови и структурно- 97. функциональное состояние мембран эритроцитов при метаболическом синдроме: автореф.дис. … канд.биол.наук: 03.00.04 / Попова Татьяна Петровна. –Ростов-наДону, 2009. -25с. 98. Родбард, Х.Е. Нарушения липидного обмена при сахарном диабете: совре- менные концепции и лечение / Х.Е. Родбард // Сахарный диабет. -2004.-№2.-С.1420. Сергеева, Е.С. Система глутатиона и ее коррекция у больных сахарным диа- 99. бетом: автореф.дис. … канд.мед.наук: 14.00.03 / Сергеева Елена Сергеевна. – Москва, 2009. -22с. 100. Сивоус, Г.И. Профилактика и лечение поздних осложнений сахарного диабе- та у детей и подростков / Г.И.Сивоус // Проблемы эндокринологии. -2000.-Т.46.№1.-C.3-7. 101. Сидорова, Л.Д. Окислительный стресс при сахарном диабете и его коррекция тиоктовой кислотой / И.А.Бондарь, В.В.Климонтов и др. // Бюллетень СО РАМН. 2000.-№1(95).-С.94-98. 120 102. Смирнова, О.М. Показатели перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов в лимфоцитах периферической крови в дебюте ИЗСД / О.М.Смирнова, В.А.Горелышева // Сахарный диабет. - 1999. - №2. - С.7 10. 103. Соколов, Е.И. Диабетическое сердце / Е.И.Соколов. -Москва. 2002.-415с. 104. Сторожук, П.Г. Ферменты прямой и косвенной антирадикальной защиты эритроцитов и их роль в инициации процессов оксигенации гемоглобина, антибактериальной защите и делении клеток / П.Г.Сторожук // Вестн. интенсив. терапии. -2000.-№3. C.8-13. 105. Суханова, Г.А. Биохимия клетки / В.Ю.Серебров. –Томск: Чародей. 2000.- 183с. 106. Сыркин, А.Л. Особенности атерогенной модификации липидов у больных ишемической болезнью сердца с сопутствующим сахарным диабетом / О.А.Азизова, С.В.Дриницина и др. // Клиническая медицина. -2001.-№4.-С.25-29. 107. Титов, В.Н. Изогликемический интервал крови и механизмы его регуляции. Факты и гипотеза: Обзор литературы / В.Н.Титов // Клинич. лаб. диагностика. 2001.- №3.- C.3-10. 108. Титович, Е.В. Маркеры разрушения бета-клеток на этапах развития СД тип 1 / Т.Л.Кураева // Сахарный диабет. -2002.-№2.-С.18-22. 109. Туракулов, Р.А. Стратегия поиска маркеров генетической предрасположен- ности к сосудистым осложнениям сахарного диабета на примере диабетической нефропатии / Д.А.Чистяков, О.К.Викулова и др. // Сахарный диабет. -1998.-№1.C.22-25. 110. Турбина, Л.Г. Диабетическая полинейропатия: эпидемиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение / С.А.Гордеев, А.А.Зусьман // Журнал неврологии и психиатрии имени С. С. Корсакова. - 2010.-Т.110.-№ 11.-С.56-62. 111. Туркина, Т.И. Влияние эссенциале на показатели липидного обмена при лечении детей, больных сахарным диабетом / Л.Ф.Марченко, Л.В.Сапелкина // Рос. педиатр. журн.- 2000.- №5.- C.59-61. 121 112. Фадеева, Н.И. Влияние состояния системы антиоксидантной защиты на частоту развития и течение диабетической ангиопатии: автореф.дис. … канд.мед.наук: 14.00.03 / Фадеева Наталья Ивановна. -М., 2000.-24с. 113. Флеров, М.А. Перекисное окисление белков плазмы крови больных сахарным диабетом типа 1 / Н.Н.Смирнова, З.В.Светлова // Проблемы эндокринологии. 2003. - Т.49.-№4. - С.З - 4. 114. Фомина, Г.Б. Показатели углеводно-фосфорного и энергетического обмена у больных сахарным диабетом. Ишемическая болезнь сердца и сахарный диабет / Т.А.Лукичева, Г.А.Бараблина. -Горький. 1974.-С.152-155. 115. Хавинсон, В.Х. Свободнорадикальное окисление и старение / В.Х.Хавинсон // СПб: Наука. 2003.-327с. 116. Хвойницкая, Л.Г. Гормонально-метаболические изменения у лиц с нарушен- ной толерантностью к глюкозе / Л.Г.Хвойницкая // Общая патология. -2001.-C. 211-213. 117. Хоробрых, О.Ю. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах периферической крови при сахарном диабете / Н.А.Терехина // Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии. -1998.- C.111-113. 118. Храмилин, В.Н. Диабетическая нейропатия / В.Н.Храмилин // Русский меди- цинский журнал. -2002.-№11.-С.155. 119. Храмилин, В.Н. Распространенность диабетической полинейропатии при впервые выявленном сахарном диабете типа 2 / В.Н.Храмилин // Врач. -2009.№5.- С.40-43. 120. Чещевик, А.Б. Биоэнергетические процессы в различных по чувствительно- сти к инсулину тканях при экспериментальном диабете и эритроцитах больных сахарным диабетом: автореф.дис. ... док.биол.наук: 14.00.16 / Чещевик Антон Болеславович. -Москва. -1988.-36с. 121. Шанин, Ю.Н. Антиоксидантная терапия в клинической практике (теоретиче- ское обоснование и стратегия проведения) / Ю.Н.Шанин, В.Ю.Шанин, Е.В.Зиновьев. - Санкт-Петербург: ЭЛБИ-СПб. 2003. -128с. 122 122. Шахристова, Е.В. Липолиз, система глутатиона и окислительная модифика- ция белков в адипоцитах крыс при аллоксановом диабете: автореф.дис. … канд.мед.наук: 03.01.04; 14.03.03 / Шахристова Евгения Викторовна. – Новосибирск, 2012. -23с. 123. Шепелев, А.П. Перекисное окисление липидов и система антиоксидантов в норме и патологии / Л.А.Шовкун. –Ростов-на-Дону. 2012.-363с. 124. Шестакова, М.В. Инсулинрезистентность: патофизиология, клинические проявления, подходы к лечению / О.Ю.Брескина // Consilium medicum. -2002.-Т.4.№10.-С.523-527. 125. Шпаков, А.О. Роль сульфгидрильных групп в функционировании аденилат- циклазной сигнальной системы / А.О.Шпаков // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. -2002.-Т.38.- №1.- C.97-107. 126. Щербачева, Л.Н. Сахарный диабет 1-го типа у детей Российской Федерации / Т.Ю.Ширяева, Ю.И.Слунцов и др. // Проблемы эндокринологии. -2007.-Т.53.№2.-С.24-29. 127. Aguirre, V. The c-jun NH (2)-terminal kinase promotes insulin resistance during association with insulin receptor substrate-1and phosphorylation of Ser(307) / Т.Uchida, L.Yenush et al. // J Biol Chem. - 2000. -V.275. - P.9047-9054. 128. American Diabetes Association Nutrition Recommendations and Interven- tionsfor Diabetes: A position statement of the American Diabetes Association // Diabetes Care. -2007.-Vol.30.-№1.-P.48-65. 129. Anderson, M.E. Determination of glutathione and glutathione sulfide in biological samples / M.E. Anderson // Methods Enzymol. -1985.-113.-Р.548-555. 130. Arbeláez, A.M. Lactate and the mechanism of hypoglycemia-associated autonom- ic failure in diabetes / P.E.Cryer // Diabetes. -2013.-Dec.-62(12).-Р.3999-4001. 131. Arnalich, F. Intracellular glutathione deficiency is associated with enhanced nucle- ar factor-kappa B activation in older non-insulin dependent diabetic patients / F.Arnalich // Free Radic Res. -2001.-Vol.35.-№6.-P.873-884. 132. Atkinson, M.A. Thirty years of investigating the autoimmune basis for the type 1 diabetes / M.A.Atkinson //Diabetes.-2005.-Vol.54.-P.1253-1263. 123 133. Aydin, A. Oxidative stress and nitric oxide related parameters in type II diabetes mellitus: effects of glycemic control / H.Orhan, A.Sayal еt al. // Clin.Biochem. -2001.Vol.34.-P.65-70. 134. Bonnefont-Rousselot, D. Conseguences of the diabetic status on the oxi- dant/antioxidant balance / J.P.Bastard, M.C.Jaudon // Diabetic. Metab. -2000.Vol.1/26.-№3.-P.163-176. 135. Bono, A. Red cell peroxide metabolism in diabetes mellitus / G.Caimi, A.Catania et al. // Horm.Metab.Res.-1987.-Vol.19.-P.264-266. 136. Boucek, P. Diabetic nephropathy / Р.Boucek // Diabetic kidney disease. Vnitr Lek. -2013.-Mar.-59(3).-Р.201-203. 137. Brownlee, M. Negative consequence of glycation / М.Brownlee // Metabolizm.- 2000.-Vol.49.-Suppl.1.-P.9-13. 138. Cavalca, V. Oxidative stress and homocysteine in coronary artery disease / G.Cighetti, F.Bamonti, A.Loaldi, L.Bortone // Clin. Chem.-2001.-May.-47(5).-P.887892. 139. Ceriello, A. Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin re- sistance, diabetes, and cardiovascular disease. The common soil hyporthesis revisited / Е.Morz // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. -2004. -№24. P.816. 140. Ceriello, A. Oxidative stress and glycemic regulation / А.Ceriello // Metabolism. - 2000.-V. 49.-P.27-29. 141. Chen, G. Glucosamine-induced insulin resistance is coupled to O-linked glycosyla- tion of Muncl8c / P.Liu, D.C.Thurmond, J.S.Elmendorf // FEBS Lett. -2003.-V.534.-P. 54-60. 142. Choudhuri, S. Association of hyperglycemia mediated increased advanced gly- cation and erythrocyte antioxidant enzyme activity in different stages of diabetic retinopathy / D.Dutta, I.H.Chowdhury, В.Mitra et al. // Diabetes Res Clin Pract. -2013.Jun.-100(3).-Р.376-384. 143. Corbin, J.A. Improved glucose metabolism in vitro and in vivo by an allosteric monoclonal antibody that increases insulin receptor binding affinity / V.Bhaskar, I.D. // Goldfine PLoS One.-2014/-Feb 12.-9(2):e88684. 124 144. Davison, G.W. Exercise, free radicals, and lipid peroxidation in type 1 diabetes mellitus / L.George, S.K. Jackson et al. // Free Radic. Biol. Med. -2002.-Vol.33.-№ll.P.1543-1551. 145. Dierckx, N. Oxidative stress status in patients with diabetes mellitus: relationship to diet / N. Dierckx, G. Horvath, С. Van Gils // Eur J Clin Nutr. - 2003.-Vol.57.-№8.P.999–1008. 146. Donath, M.Y. Inflammatory mediators and islet beta-cell failure: a link between type 1 and type 2 diabetes / M.Y.Donath // J. Mol. Med. -2003.-№81.-P.455-470. 147. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function / W.Droge // Physiological Reviews. -2002.-Vol.82.-P.47 - 95. 148. Eisenbarth, G.S. Type 1 diabetes mellitus: a chronic autoimmune disease / G.S. Eisenbarth // New Engl.J.Med.-1986.-Vol.314.-P.1360-1368. 149. Engelen, W. Effects of long-term supplementation with moderate pharmacologic doses of vitamin E are saturable and reversible in patients with type 1 diabetes / B.M.Keenoy, J.Vertommen, De Leeow I. // Am. J. Clin. Nutr.-2000.-Nov.-72(5).P.1142-1149. 150. Folden, D.V. Malondialdegyde inhibits cardiac contractile function in ventricular myocytes via a p38 mitogen-activated protein kinase-dependent mechanism / A.Gupta, A.C. Sharma. // British J. Pharmacol. -2003.-Vol.139.-P.1310 -1316. 151. Friedewald, W.T. Estimation of the concentration of low density lipoprotion cho- lesterol use of preparative ultracentrifugation / W.T. Friedewald, R.I.Lewy, D.S.Fredrickson. Clin.Chem.-1972.-18.-C.499. 152. Furukawa, S. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome / T.Fujita, M.Shimabucuro // Clin. Invest.-2004.-114(12).-P.1752-1761. 153. Goth, L. Blood catalase deficiency and diabetes in Hungary/ A.Lenkey, W.N.Bigler // Diabetes Care. -2001.-№24.-P.1839-1840. 154. Green, K. Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes / M.D. Brand, M.P.Murphy // Diabetes.-2004.-Vol.53.-№1.-P.110-118. 125 155. Groener, J.B. Fleming TC332C genotype of glyoxalase 1 and its association with late diabetic complications / P.Reismann // Exp Clin Endocrinol Diabetes. -2013.-Jul.121(7).-P.436-439. 156. Hoidal, J.R. Reactive oxyden specils and cell signaling / J.R. Hoidal // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 2001. -Vol.25.-№6. P.661-663. 157. Hsu, W.T. Effects of diabetes duration and glycemic control on free radicals in children with type 1 diabetes mellitus / L.Y.Tsai, S.K.Lin et al. // Ann.Clin.Lab.Sci.2006.-Vol.36.-P.174-178. 158. Ide, A. Genetic susceptibility in type 1 diabetes and its associated autoimmune disorders / G.S.Eisenbarth // Rev.Endocr.Metab. Disord.-2003.-Vol.4.-P.243-253. 159. Jain, S.K. Vitamin E supplementation restores glutathione and malondialdehyde to normal concentrations in erythrocytes of type 1 diabetic children / S.K. Jain, R.Me Vie, T.Smith // Diabetes Care. -2000. -Vol.23.-№9.-P.1389-1394. 160. Jakuš, V. Monitoring of glycation, oxidative stress and inflammation in relation to the occurrence of vascular complications in patients with type 2 diabetes mellitus / E.Sándorová, J.Kalninová, B.Krahulec // Physiol Res. -2014. - Feb24.-Р.345-348. 161. Jannot, M.F. Relationship between neuropathy, hypertension and red blood cell Na/K ATPase in patients with insulin-dependent diabetes mellitus / D.Raccah, Dufayet de la Tour D. // Diabetes Metab. -1999.-Mar.-25(1).-Р.35-42. 162. Januszewski, A.S. Chemical modification of proteins during peroxidation of phos- pholipids / N.L. Alderson, A.J. Jenkins, S.R. Thorpe, J.W. Baynes // J Lipid Res. -2005 Jul.-46(7).-Р.1440-1449. 163. Jiang, F.I. The role of insulin-like growth factor I and hypoxia inducible factor 1α in vascular endothelial growth factor expression in type 2 diabetes / Y.T. Tang, L.Guo, X.Y. Jiao. // Ann Clin Lab Sci. -2013.-43(1).-Р.37-44. 164. Kaji, H. Increased lipoperoxide value and glutathione peroxidase activity in blood of type 2 diabetic women / M.Kurasaki, K.Ito et al. // Klin.Wochenschr.-1985.-B.63.-P.765768. 126 165. Kaviarasan, R. Lipid profile, oxidant-antioxidant status and glycoprotein compo- nents in hyperlipedemic patients with/without diabetes / M.M.Arjunan, K.V.Pugalendi // Clin.Chim.Acta.-2005.-Vol.362.-P.49-56. 166. Kocić, R. New aspects about the impact of oxidative stress on development of chronic diabetic complications / V.Cirić. // Med Pregl. -2009.-62.-Suppl 3.-P.70-74. 167. Komosinska-Vassev, K. Effects of metabolic control and vascular complications on indices of oxidative stress in type II diabetic patients / К.Olezyk, Р.Olezyk, K. Winsz-Szezotka // Diabetes Res.Clin. Pract.-2005.-Vol.-68.-P.207-216. 168. Kumar, R. Biochemical changes in erythrocyte membrane in type 2 diabetes melli- tus / R. Kumar // Indian J Med Sci. -2012.-66(5-6).-Р.131-135. 169. Lankin, V.Z. The enzymatic systems in the regulation of free redical lipid peroxi- dation. In: Free Radicals, Nitric Oxide, and mflanjmation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects / V. Lankin. - Amsterdam: IOS Press, 2003. -23p. 170. Lankin, V.Z. The influence of natural dicarbonils on the antioxidant enzymes activity in vitro and in vivo / G.G. Konovalova, A.K. Tikhaze, L.V. Nedosugova // Biomed Khim. -2012 Nov-Dec.-58(6).-Р.727-736. 171. Laudahn, G. Clin.Wschr.-1959.-T.37.-P.850-858. 172. Lauridsen, C. Hydrolysis of tocopheryl and retinyl esters by porcine car- boxyl ester hydrolase is affected by their carbox ylate moiety and acids / M.S. Hedemann // J. Nutr. Biochem. -2001.-Vol.12.-P.219-224. 173. Liu, L.L. A role for diallyl trisulfide in mitochondrial antioxidative stress contrib- utes to its protective effects against vascular endothelial impairment / L.Yan, Y.H.Chen // Eur J Pharmacol. -2014 Feb.-15.-725.-Р.23-31. 174. Liu, T. The isoprostanes: novel prostaglandinike products of the free radical- catalyzed peroxidation of arachidonic acid / T. Liu, A.Stern, J.Roberts //J. Biomed Sci. -1999. -Jul-Aug.-Vol.6 (4).-P.226-235. 175. Lloyd, D.J. Antidiabetic effects of glucokinase regulatory protein small-molecule disruptors / St Jean DJ Jr, R.J. Kurzeja // Nature. -2013.-Dec 19.-504(7480).-Р.437-440. 176. Llrownlee, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications / М.Llrownlee // Nature. -2001.-414.-Р.813-820. 127 177. Ma, Z.A. The role of peroxidation of mitochondrial membrane phospholipids in pancreatic β -cell failure / Z.A. Ma // Curr Diabetes Rev. -2012 Jan.-8(1).-Р.69-75. 178. Majchrzak, A. Evaluation of selected components in antioxidant systems of blood in patients with diabetes / A. Majchrzak, D. Zozulinska, B. Wierasz -Wysocka // Pol Merkuriusz Lek. - 2001. - Vol.10. - №57. - P.150 -152. 179. Mandrup-Poulsen, T. Apoptotic signal transduction pathways in diabetes / Т.Mandrup-Poulsen // Biochem Pharmacol. - 2003. - №66. - P.1433-1440. 180. Martin-Gallan, P. Biomarkers of diabetes-associated oxidative stress and antioxi- dant status in young diabetic patients with or without subclinical complications / A.Carrascosa, M.Gussinye, C.Dominguez // Free Radic. Biol. Med.-2003.-Vol.34.P.1563-1574. 181. Matteucci, E. Oxidative stress in families of type 1 diabetic patients / E. Matteucci, O. Giampietro // Diabetes Care. - 2000. - Vol.23. -№8.-P.1182-1186. 182. Mezzetti, A. Oxidative stress and cardiovascular complications in diabetes: iso- prostanes asnew markers on an old paradigm / A. Mezzetti, F. CipoUone, F. Cuccurullo // Cardiovasc Res. - 2000.-Vol.47.-№3.-P.475-488. 183. Mishra, N. Blood viscosity, lipid profile, and lipid peroxidation in type-1 diabetic patients with good and poor glycemic control / N. Singh // N Am J Med Sci.-2013 Sep.5(9).-Р.562-566. 184. Motta, M. The value of glycosylated hemoglobin (HbA1c) as a predictive risk factor in the diagnosis of diabetes mellitus (DM) in the elderly / Е.Bennati, Е.Cardillo et al. // Arch Gerontol Geriatr. -2010 Jan-Feb/-50(1).-P.60-64. 185. Myhal', LIa. Activity of tubular enzymes and lipoperoxidation processes in patients with progressive diabethic nephropathy / L.V.Korol', I/O. Dudar et al. // Lik Sprava.2006 Jan-Sep.-(1-2).-P.18-22. 186. Mylona-Karayanni, C. Oxidative stress and abhesion molecules in children with type I diabetes mellitus: a possibl link / D.Gourgiotis, A.Bossions, E.Kamper // Pediatr. Diabetes.-2006.-Vol.7.-P.52-59. 128 187. Nyengaard, J.R. Interactions between hyperglycemia and hypoxia: implications for diabetic retinopathy / Y. Ido, C. Kilo, J.R. Williamson // Diabetes.- 2004 Nov.-53(11)/P.2931-2938. 188. Oomen, P.H.N. Human plasma phospholipid transfer protein activity isdecreased by acute hyperglycaemia: studies without and with hyperinsulinaemia in type 1 diabetes mellitus / P.H.N. Oomen, A.VanTol, H.Hattori // Diabetologia. - 2004. - Vol.47. P.205. 189. Packer, L. Molecular aspects of lipoic acid in the prevention of diabetes complica- tions / K. Kraemer, G.Rimbach // Nutrition. -2001 Oct.-17(10).-P.888-895. 190. Palazzo, P. Cerebral hemodynamics and systemic endothelial function are already impaired in well-controlled type 2 diabetic patients, with short-term disease / P. Maggio, R. Altavilla // PLoS One. - 2013. - Dec 31.-8(12).-e83287. 191. Quintero, M. The effects of intermittent hypoxia on redox status, NF-κB activation, and plasma lipid levels are dependent on the lowest oxygen saturation / C.GonzalezMartin Mdel, V.Vega-Agapito et.al. // Free Radic Biol Med. -2013 Dec.-65.-P.11431154. 192. Robertson, R.P. Glucose toxicity of the сell: cellular and molecular mechanisms / Y.Tanaka, G.Sacchi et al. // In Diabetes Mellitus. LeRoith D, Olefsky JM, Taylor S, Eds. New York, Lippincott Williams & Wilkins. -2000.- P.125–132. 193. Rodríguez-Carrizalez, A.D. Oxidants, antioxidants and mitochondrial function in non-proliferative diabetic retinopathy / J.A.Castellanos-González, E.C.Martínez- Romero // J Diabetes. -2014 Mar.-6(2).-P.167-175. 194. Romanenko, I.A. Outpatient diagnosis of oxidant stress in patients with carbohy- drate metabolism disturbance in metabolic syndrome / T.S. Poliatykina, N.V. Budnikova // Ter Arkh.-2005.-77(6).-P.68-72. 195. Rosen, P. The role of oxidative stress in the onset and its complications: a summary of a Congress Series sponsored by UNESCO-MCBN, the American Diabetes Association and the Germam Diabetes Society / P.P. Nawroth G.King et al. // Deabetes Metab. Res. Rev. -2001.-Vol.17.-№3.-Р.189-212. 129 196. Ryan, G.J. Clinical effects of once-weekly exenatide for the treatment of type 2 diabetes mellitus / N.H. Moniri, D.D.Smiley // Am J Health Syst Pharm. -2013 Jul 1.70(13). - P.1123-1131. 197. Safinya, C.R. Liquid crystal assemblies in biologically inspired systems / J. Deek, R.Beck et al. // Liq Cryst. -2013 Jan 1.-40(12).-P.1748-1758. 198. Saltiel, A.R. New perspectives into the molecular pathogenesis and treatment of type 2 deabetes / A.R Saltiel //Cell.-2001.-Vol.104.-P.517-529. 199. Samarghandian, S. Safranal treatment improves hyperglycemia, hyperlipidemia and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats / A.Borji, M.B. et al. // J Pharm Pharm Sci. -2013.-16(2).-P.352-362. 200. Seghrouchni, I. Oxidative stress parameters in type I, type II and insulin-treated type II diabetes mellitus; insulin treatment efficiency / J.Drai, E.Bannier et al. // Clin.Chim.Acta.-2002.-Vol.321.-P.89-96. 201. Sherwani, S.I. Intermittent hypoxia exacerbates pancreatic β-cell dysfunction in A mouse model of diabetes mellitus / C.Aldana, S.Usmani // Sleep. -2013 Dec 1.-36(12).P.1849-1858. 202. Sies, H. Oxidative stress / D.P. Jones // Encyclopedia of stress / Eds. Fink G. - San Diego: Elsevier.-2007. -Vol.3. - P.45-48. 203. Singh, B.M. Is microalbuminuria a reliable indicator of underlying renal reserve in diabetes? / B.M. Singh, M.R. Holland, V. Bascar // Diabetologia. -2004.-Vol.47.-P.393. 204. Strange, R.C. Glutathione S-transferase: genetics end role in toxicology / R.C. Strange, P.W. Jones, A.A. Fryere // Toxicol. Lett. - 2000. - Vol.112-113.-P.357-363. 205. Subbotina, T.N. Lipid peroxidation and erythrocyte membrane permeability in children and adolescents with diabetes mellitus type 1 / N.M.Titova, A.A.Savchenko et al. // Klin Lab Diagn. - 2004 May.-(5).-20.-P.33-35. 206. Tanito, M. Enhanced oxidative stress and impaired thioredoxin expression in spontaneously hypertensive rats / H.Nakamura, Y.W.Kwon et al. // Antioxid. Redox Signal -2004. -Vol.6. –P.89-97. 130 207. Titov, V.N. In vivo peroxidation regulation as a stage of inflammation. Oleic acid, acceptors of active oxygen forms, and antioxidants / D.M.Lisitsin // Klin Lab Diagn. 2005 Jun.-(6).-P.3-12. 208. Towler, D.A. Mitochondrial ROS deficiency and diabetic complications: AMP [K]-lifying the adaptation to hyperglycemia / D.A.Towler // J Clin Invest.-2013 Nov 1.123(11).-P.4573-4576. 209. VanderJagt, D.J. Oxidative stress indices in IDDM subjects with and without long- term diabetic complications / DJ. VanderJagt, JM. Harrison, DM. Ratliff et al. / Clin Biochem. - 2001. - Vol.34. - №4. - P.265 - 270. 210. Vantyghem, M.C. Oxidative markers in diabetic ketoacidosis / M.Balduyck, F.Zerimech et al. // J Endocrinol Invest. - 2000. - Vol.23. -№11. -P.732 - 736. 211. Vessby, J. Oxidative stress and antioxidant status in type 1 diabetes mellitus/ J. Vessby, S. Basu, R. Mohsen et al/ J Intern Med. - 2002. - Vol.251. -№l.-P.69-76. 212. Wenardos, K.M. Myocardial ischemia-reperfusion injury, antioxidant enzyme systems, and selenium: a review / D.M. Kaye // Curr. Med. Chem. - 2007. - Vol 14 -P. 1539-1549. 213. West, I.C. Radicals and oxidative stress in diabetes / I.C.West // Diabet Med. -2000.-Vol.17. - N3. - P.171 - 180. 214. Winiarska, У.К. Drozak J. // Postepy Hig Med Dosw. Article in Polish - 2002. - Vol.56. - №4. - P.521 - 536. 215. Wood, L.G. Improved antioxidant and fatty acid status of patients with cystic fibrosis after antioxidant supplementation in linked to improved lung function / L.G. Wood, D.A. Fitzgerald, A.K. Lee // Am. J. Clinical Nutrition. - 2003. - Vol.77. - C.150 159. 216. Yagi, Y. Formation of lipoperoxide in isolated sciatic nerve by chinoformferric chelate / M.Matsuda, K.Yagi // Experementia. -1976.-32(7). - P.905-906. 217. Yan, H. Glycation-induced inactivation and loss of antigenicits of catalase and superoxide dismutase / J.J. Harding // Biochem. J. - 1997.-Dec.1.-328(Pt2).-P.599-605. 131 218. Yessoufou, A. Antioxidant status in alcohol-related diabetes mellitus in Beninese subjects / K.Moutairou, A.Girard et. al. // Cell.Mol.Biol.-2005.-Vol.51.-Suppl.-P.849858. 219. Yigit, S. Association of MTHFR gene C677T mutation with diabetic peripheral neuropathy and diabetic retinopathy / N.Karakus, A.Inanir // Mol Vis. -2013 Jul 25.-19.P.1626-1630. 220. Yim, M.B. Protein glycation: creation of catalytic sites for free radical generation / H.S.Yim, C. Lee et al. // Ann.N.Y.Acad.Sci.-2001.-Vol.928.-P.48-53. 221. Zhang, W. TRIB3 mediates glucose-induced insulin resistance via a mechanism that requires the hexosamine biosynthetic pathway / J.Liu, L.Tian // Diabetes. -2013 Dec.-62(12).-P.4192-4200.
