Изучение ранних эффектов гепатоканцерогенов в печени

ИЗУЧЕНИЕ РАННИХ ЭФФЕКТОВ
ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНОВ В ПЕЧЕНИ
ЖИВОТНЫХ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ
И РЕЗИСТЕНТНЫХ К ИНДУКЦИИ ОПУХОЛЕЙ
Т.И.Меркулова, В.И.Каледин, К.Ю.Кропачев, С.Ю.Плисов,
З.Б.Левашова, В.Ф.Кобзев
Лаборатория регуляции экспрессии генов
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10
тел.: (3832) 33–28–60, факс: (3832) 33–12–78
еmail: merk@cgi.nsk.su
Введение
Канцерогенез является сложным многоступенчатым процессом, основные события которого (приобретение клетками автономности, способности к инвазии и метастазированию) происходят в отдаленные от действия канцерогена сроки. Поэтому
изучение метаболических и молекулярно-генетических особенностей зрелых опухолей может не дать ответа на вопрос, каким образом канцерогены запускают процесс, для этого следует, очевидно, изучать их ранние эффекты. Одним из ранних
эффектов гепатоканцерогенов (азокрасителей, диэтилнитрозамина, афлатоксина ВI,
стеригматоцистина и др.) является нарушение глюкокортикоидной регуляции активности ряда адаптивных ферментов печени (тирозинаминотрансферазы (ТАТ), аланинаминотрансферазы, триптофаноксигеназы) [1]. Изучая этот эффект на примере
действия на индукцию ТАТ, мы показали, что он имеет место только у чувствительных к канцерогену животных и выражается в 30-50%-м снижении уровня индукции
гидрокортизоном, оцениваемой как по ферментативной активности, так и по количеству мРНК ТАТ [1, 2]. Было также показано, что ингибирующее влияние на глюкокортикоидную индукцию ТАТ оказывают только соединения, обладающие гепатоканцерогенной активностью, но не их неканцерогенные аналоги и не канцерогены, тропные к другим органам [1]. Исходя из этих данных, можно было предположить, что
гепатоканцерогены действуют на некое регуляторное звено в клетках печени, повреждение которого в ранние сроки приводит к нарушению глюкокортикоидной регуляции экспрессии гена ТАТ, а в более поздние – к развитию опухоли. Целью настоящего исследования был поиск такого рода мишени.
Глюкокортикоидный рецептор представлялся маловероятным кандидатом на
роль подобной мишени, поскольку гепатоканцерогены угнетают глюкокортикоидную
индукцию лишь части контролируемых этим гормоном ферментов печени (ТАТ, но
не фосфоенолкарбоксикиназы (PEРCK) и аспартатаминотрансферазы [3]. Сравнение регуляторных районов этих генов, описанных в базе данных TRRD, позволило
выделить такие специфичные для ТАТ факторы транскрипции, участвующие в ее
глюкокортикоидной регуляции, как члены семейств HNF3 и Ets, а также белки, взаимодействующие с GME элементом [4, 5]. В связи с этим мы оценили ДНКсвязывающую активность перечисленных факторов в экстрактах ядер, выделенных
из печени интактных и обработанных о-аминоазотолуолом (ОАТ) мышей двух чувствительных (A, SWR) и двух резистентных(AKR, BR) к действию этого канцерогена
линий. В этих же условиях была определена ДНК-связывающая активность белков
семейства AP1, члены которого, в зависимости от ситуации, могут выступать в роли
антагонистов либо синергистов рецептора глюкокортикоидов [6, 7].
Материалы и методы
Опыты проводили на 2,5–4-месячных мышах-самцах разводки Института цитологии и генетики СО РАН. Ранее было показано, что при хроническом введении
ОАТ опухоли печени развиваются у 86–100% мышей линий SWR и A, и не более
чем у 10% мышей AKR и CC57BR [8]. В представленных экспериментах ОАТ растворяли в оливковом масле и вводили внутрибрюшинно по 22,5 мг на 100 г массы
тела. Контрольным животным вводили растворитель. Экстракты ядер клеток печени
готовили согласно [9, 10] через 1–24 ч после введения ОАТ или масла. Активность
ТАТ определяли по [11]. Суммарную РНК выделяли методом гуанидинийтиоцианатфенольной экстракции; после осаждения изопропанолом осадок РНК подвергали
обработке протеиназой К с последующей фенольной экстракцией и осаждением
этанолом. Электрофоретическое разделение препаратов РНК, перенос на мембрану и Northern-blot гибридизацию с мечеными ДНК-зондами проводили, так как описано в [12].
Олигонуклеотиды, соответствующие обеим цепям известных сайтов связывания HNF3 [13], Ets [14] и AP1 [15] транскрипционных факторов и GME элемента [16],
синтезировали на автоматическом синтезаторе АСМ-102И (Биоссет, Новосибирск)
Н-фосфонатным методом и очищали гель-электрофорезом [17]. После отжига олигонуклеотиды метили с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии [32Р]dATP.
Связывание белков экстракта ядер с мечеными олигонуклеотидами определяли методом торможения в геле. Реакционная смесь (10 мкл) содержала: 5 мМ
Hepes, pH=7,6; 50 мМ KCl; 0,1 мМ ЕДТА, рН=8,0; 1 мМ DTT; 10% глицерин; 3нг меченого олигонуклеотида; 4 мкг белка ядерного экстракта, прединкубированного с
0,4 мкг ДНК тимуса теленка в течение 10 мин при 0оС. После инкубации при 20оС в
течение 10 мин смесь подвергали электрофорезу в 5% ПААГ в 0,6 х TBE буфере.
При использовании антител специфические антисыворотки к HNF3α, β и γ (1 мкл)
прединкубировали с 4 мкг белка ядерного экстракта в течение 10 мин при 0оС. Антисыворотки были любезно предоставлены д-рами Дж.Дарнеллом и В.Прециозо (Рокфеллеровский университет, Нью-Йорк).
Результаты и обсуждение
Как видно в таблице, имеется прямая связь между чувствительностью мышей
к гепатоканцерогенному действию ОАТ и степенью его влияния на глюкокортикоидную индукцию ТАТ: ОАТ почти вдвое снижает уровень индукции фермента у мышей
линий SWR и A/He, у которых он с высокой частотой вызывает развитие опухолей
печени, и оказывает лишь незначительное действие на гормональную индукцию
этого фермента у мышей AKR и CC57BR, у которых индуцированные опухоли развиваются весьма редко. Из таблицы также видно, что чувствительным к гепатоканцерогену линиям присущ более высокий уровень глюкокортикоидной индукции в
контроле, на фоне которого и проявляется более выраженный эффект ОАТ у этих
линий.
Эксперименты по задержке в геле выявили связь между снижением глюкокортикоидной индуцибельности ТАТ в результате действия канцерогена и уменьшением HNF3 ДНК-связывающей активности в экстрактах ядер клеток печени: если у
мышей чувствительных линий (SWR, A) ДНК-связывающая активность этого фактора через 24 часа после введения ОАТ снижается на 60%, то у резистентных (AKR,
CC57BR) – только на 25–30% (рис. 1 и обобщение количественных данных на
рис. 2). Из данных, приведенных на рисунке 1, видно также, что исходный уровень
HNF3 ДНК-связывающей активности выше в ядрах печени мышей чувствительной
линии (межлинейные различия по этому показателю в настоящее время исследуются). ДНК-связывающая активность факторов транскрипции Ets, AP1 и белков, взаимодействующих с GME, не изменялась после введения ОАТ (рис. 1).
Таблица
Частота развития опухолей печени при хроническом применении ОАТ
и уровень глюкокортикоидной индукции ТАТ через 24 ч после его
однократного введения у мышей-самцов разных линий
Линия
мышей
% опухолей
SWR
Индуцированная активность ТАТ (ед.)
в контроле
на фоне ОАТ
% от контроля
100 (17)
133,1±7,9 (8)
75,6±8,3 (8)
56,8
A/He
75,4 (49)
138,0±11,1 (12)
88,1±5,9 (12)
63,8
AKR
5,1 (17)
73,2±4,6 (6)
61,6±4,4 (7)
84,2
CC57BR
0 (35)
82,2±5,1 (22)
74,5±4,8 (21)
90,5
П р и м е ч а н и е . В скобках – число животных.
А (чувствительные)
AP1
GME
HNF3
PEA
AP1
СС57BR (устойчивые)
GME
HNF3
PEA
Рис. 1. ДНК-связывающая активность факторов транскрипции HNF3, AP1, Ets семейств и
белков, взаимодействующих с GME элементом, в экстрактах ядер печени мышей. В случае
каждого олигонуклеотида: слева – подвижность свободного олигонуклеотидного зонда, в середине – подвижность зонда после инкубации с экстрактом ядер печени контрольных животных; справа то же, но животных, обработанных ОАТ (типичный радиоавтограф).
С помощью специфических антисывороток к HNF3α, β и γ мы показали, что исследуемая HNF3 ДНК-связывающая активность представлена транскрипционным
фактором HNF3γ (рис. 3).
Уменьшение HNF3 ДНК-связывающей активности под действием ОАТ наблюдается уже через час после его введения и сохраняется на протяжении по крайней
мере месяца (рис. 4), и в этом случае совпадая с динамикой снижения глюкокортикоидной индукции ТАТ.
Полученные результаты хорошо согласуются с известными данными о ведущей роли белков HNF3 семейства в определении амплитуды глюкокортикоидной
индукции ТАТ [18] и позволяют заключить, что именно через эти транскрипционные
факторы осуществляется антиглюкокортикоидный эффект ОАТ на экспрессию ТАТ.
R E S IS T A N T
AKR
10 0%
S E N S IT IV E
C C 5 7B r
SW R
A
75 ,8 ±4 ,5
n= 4
7 2,9± 4,5
n =4
3 9,3± 0,6
n =4
43 ,1 ±7 ,5
n= 7
Рис. 2. Результаты денситометрии радиоавтографов HNF3-ДНК комплексов.
A
C C 57BR
100%
2-е введение ОАТ
АНТИТЕЛА
α β γ
−
α β
γ −
2 -е в в е д е н и е О А Т
80%
1
60%
H N F 3
2
40%
20%
1ч 1д
Рис. 3. Идентификация HNF3 ДНКсвязывающей активности.
1мес
2м ес
В р е м я д е й с т в и я к а н ц е р о ге н а
Рис. 4. Влияние ОАТ на глюкокортикоидную индукцию ТАТ (1) и HNF-3 ДНКсвязывающую активность (2) при длительном его введении.
Поскольку ДНК-связывающая активность является интегральным показателем,
отражающим как количество белка в клетке, так и его состояние, возникает вопрос,
на каком уровне осуществляется угнетающее действие гепатоканцерогена на активность HNF3. В целях разрешения этого вопроса мы определили содержание мRNA
для HNF3γ в печени мышей чувствительных и устойчивых линий в контроле и после
введения ОАТ. Оказалось, что данный канцероген либо не оказывал влияния, либо
приводил к некоторому увеличению уровня исследуемой мРНК (рис. 5). Следовательно, угнетающее влияние ОАТ на HNF3 ДНК-связывающую активность осуществляется на посттранскрипционном уровне.
Рис. 5. Оценка изменения количества РНК HNF-3γ методом
Northern blot в препаратах суммарной РНК, полученных из
печени мышей линий, устойчивых (CC57BR и AKR) и чувствительных (DD и SWR) к гепатоканцерогенному действию ОАТ,
до (-) и после (+) введения животным канцерогена. Контроль
– 18s РНК.
HNF3 принадлежат к одному из главных семейств транскрипционных факторов,
обеспечивающих дифференцировку и поддержание фенотипа дефинитивных клеток
печени [19], поэтому длительное угнетение функции этого фактора может играть существенную роль и в канцерогенном действии ОАТ. Весомым аргументом в пользу
такого предположения являются результаты наших опытов с видоспецифическими
гепатоканцерогенами: ОАТ и 3’-метил-4-диметиламинобензолом (3’-МеДАБ). ОАТ является сильным гепатоканцерогеном для мышей и очень слабым для крыс,
3’-МеДАБ наоборот, – сильным для крыс и слабым для мышей [20]. Из представленных на рисунке 6 данных видно, что только соединение, обладающее выраженной
канцерогенной активностью для данного вида животных, вызывает существенное
снижение как глюкокортикоидной индукции ТАТ, так и HNF3 ДНК-связывающей активности в печени животных этого вида.
Канцерогенез, индуцируемый по предлагаемому нами механизму, должен
осуществляться, очевидно, на базе эпигенетических изменений. Развитие опухолей
по эпигенетическому механизму, т.е. за счет нарушения программы экспрессии генов, допускается в настоящее время не только для немутагенных, но и для многих
мутагенных канцерогенов, действие которых приводит к мутационной активации
(или инактивации) клеточных онкогенов и антионкогенов, многие из которых являются факторами транскрипции [21]. Этот же механизм развития опухоли будет иметь
место и в случае, если мутация или канцерогенный аддукт затронут соответствующий регуляторный район гена-мишени и будут препятствовать связыванию с ним
неизмененного фактора транскрипции. Результаты нашей работы показывают, что
такой же эффект и, очевидно, с теми же последствиями, может наблюдаться и в том
случае, если действию канцерогена подвергается не регуляторный элемент в составе ДНК, а сам белок-фактор транскипции. В настоящее время мы предпринимаем попытки выяснить, является ли это действие прямым или опосредуется через
клеточные системы, модулирующие активность белковых молекул (фосфорилирование/дефосфорилирование и т.п.).
КРЫ СЫ W istar
Контроль
ОАТ
МЫ Ш И A
3’-МеДАБ
Контроль
ОАТ
1
100%
100%
79,8±
± 11,8%
103±
± 3,3%
2
53,9±
± 3,5%
58,8±
± 1,3%
3’-МеДАБ
100%
100%
45,0 ± 3,5%
42,3 ± 3,6%
80,0 ± 4,8%
96,8±
± 6,1%
Рис. 6. Снижение глюкокортикоидной индукции ТАТ и HNF-3 ДНК-связывающей активности в
печени мышей и крыс под действием ОАТ и 3’-МеДАБ.
1 – индукция ТАТ глюкокортикоидами; 2 – HNF3-ДНК связываяющая активность.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 97–04–49434).
Список литературы
1. Каледин В.И., Захарова Н.П. Влияние гепатоканцерогенов на гормональную индукцию тирозинаминотрансферазы в печени чувствительных и резистентных
животных // Исследования по индукции и метастазированию злокачественных
опухолей у экспериментальных животных. Новосибирск, 1984. C. 146–185.
2. Позднякова Л.Д., Дашкевич В.С., Каледин В.И., Мертвецов Н.П. Влияние
3’-метил-4-диметиламинобензола и его неканцерогенного аналога на глюкокортикоидную индукцию тирозинаминотрансферазы в печени крыс // Докл. АН.
1995. Т. 340. С. 119–122.
3. Yeah G.C.T. The effect of 3’-methyl-4-dimethylaminoazobenzene on foetal rat
hepatocytes in culture // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1981. V. 17. P. 743–752.
4. Меркулова Т.И., Меркулов В.М., Митина Р.Л. Механизмы глюкокортикоидной регуляции и регуляторные зоны генов, контролируемых глюкокортикоидами: описание в базе данных TRRD // Мол. биология. 1997. Т. 31, № 4. С. 714–725.
5. Kaestner K.H., Hiemisch H., Luckow B., Schutz G. The HNF-3 gene family of
transcription factors in mice: gene structure, cDNA sequence, and mRNA distribution //
Genomics. 1994. V. 20. P. 377–385.
6. Ponta H., Cato A.C.B., Herrlich P. Interference of pathway specific transcription factors //
Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1129. P. 255–261.
7. Diamond M.I., Miner J.N., Yoshinaga S.K., Yamamoto K.R. Transcription factors
interactions: Selectors of positive or negative regulation from single DNA element //
Science. 1990. V. 249. P. 1266–1272.
8. Каледин В.И., Серова И.А. Целлариус Ю.Г. и др. Межлинейные различия по частоте спонтанных и индуцированных орто-аминоазотолуолом опухолей у мышей //
Исследования по индукции и метастазированию злокачественных опухолей у
экспериментальных животных. Новосибирск, 1984. C. 146–185.
9. Gorski K., Carnero M., Schibler U. Tissue-specific in vitro transcription from the mouse
albumin promoter // Cell. 1986. V. 47. P. 767–776.
10. Shapiro D.G., Sharp P.A., Wahli W.W., Keller M.J. A high-efficiency HeLa cell nuclear
transcription extract // DNA. 1988. V. 7. P. 47–55.
11. Diamondston T.I. Assay of tyrosine aminotransferase activity by convertion of phydroxyphenilpyruvate to p-hydroxybenzaldehyde // Anal. Biochem. 1966. V. 16.
P. 395–401.
12. Колмен А. Экспрессия экзогенной ДНК в ооцитах Xenopus // Транскрипция и
трансляция. Методы / Под ред. Б.Хеймса и С.Хиггинса. М.: Мир, 1987. С. 80.
13. Lai E., Prezioso V.R., Smith E. et al. HNF-3A, a hepatocyte-enriched transcription
factor of novel structure is regulated transcriptionally // Genes and Dev. 1990. V. 4.
P. 1427–1438.
14. Espinas M.L., Roux J., Ghysdael J. et al. Participation of Ets transcription factor in the
glucocorticoid response of the rat tyrosine aminotransferase gene // Mol. and Cell.
Biol. 1994. V. 14. Р. 4116–4125.
15. Jonat C., Rahmsdorf H.J., Park K.-K. et al. Antitumor promotion and antiinflammation:
Down-Modulation of AP-1 (Fos/Jun) activity by glucocorticoid hormone // Cell. 1990.
V. 62. P. 1189–1204.
16. Oshima H., Szapary D., Simons S.S. The factor binding to the glucocorticoid
modulatory element of the tyrosine aminotransferase gene is a novel and ubiquites
heteromeric complex // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 21893–21901.
17. Kumarev V.P., Kobzev V.F., Kuznedelov K.D., Sredin Yu.G. Super-rapid synthesis of
oligodeoxyribonucleotides on micro-scale // Nucl. Acids Res., Symposium Series.
1991. V. 24. P. 234.
18. Roux J., Pictet R., Grange T. Hepatocyte nuclear factor 3 determines the amplitude of
the glucocorticoid response of the rat tyrosine aminotransferase gene // DNA and Cell
Biol. 1995. V. 14. Р. 385–396.
19. Cereghini S. Liver-enriched transcription factors and hepatocyte differentiation //
FASEB J. 1996. V. 10. Р. 267–282.
20. Kinosita R. // Gann. 1936. V. 30. Р. 423–426 (на японском языке), цитируется по
сб.: Успехи в изучении рака. Том I. Под ред. Шабада Л.М., Изд-во иностранной
литературы, Москва, 1955.
21. Latchman D.S. Eukaryotic Transcription Factors. London: Academic Press, 1995. 324 p.