Маркеры воспаления и окислительного стресса

Маркеры воспаления
и окислительного стресса
Окислительный стресс 809
Воспаление 821
8-гидрокси-2’-дезоксигуанозин (DNA Damage) / α1-антитрипсин (α1-АТ) / Альфа-2-макроглобулин
(α2-МГ) / Амилоидный белок А, сывороточный (SAA) / Гаптоглобин / Гемоксигеназа (НО) / Гепсидин /
Глутатионпероксидаза (ГП) / Кальпротектин (MRP8/14, S100A8/A9, 27E10) / Липокалин-2 (NGAL) /
Липополисахарид-связывающий белок (LBP) / Миелопероксидаза (МРО) / Неоптерин / Нитротирозин (НТ) / Определение общей антиоксидантной системы / С-реактивный белок (СРБ) / Супероксиддисмутаза (Cu/ZnSOD) / Транстиретин / Фибриноген / Циркулирующие иммунные комплексы
(ЦИК-C1q, ЦИК-С3d) / Эластаза полиморфонуклеарных гранулоцитов (PMN-эластаза) / Эотаксин /
Эотаксин-2 / AOPP / Oxystat (пероксиды)
25
МАРКЕРЫ,
ОПИСАННЫЕ
В I ТОМЕ
КАТАЛОГА
cокращения раздела:
АО – антиоксидант
ПОЛ – перекисное окисление
липидов
СР – свободные радикалы
ПФ – прооксидативные
факторы
ADS – системы
антиоксидантной защиты
Окислительный стресс
Окислительный стресс – это процесс повреждения активными формами кислорода
(ROS) различных клеток и органов. Он происходит тогда, когда образование ROS в системе
превышает способность системы их нейтрализовать и элиминировать. Дисбаланс может быть
результатом недостатка системы антиоксидантной защиты (ADS), вызванного нарушениями
продукции или распределения антиоксидантов
(АО) или избытком ROS.
Нитрозативный стресс происходит тогда,
когда образование активных форм азота (RNS)
превышает способность биологической систе-
WWW.BIOCHEMMACK.RU
NO – оксид азота
RNS – активные формы азота
ROS – активные формы
кислорода
мы их нейтрализовать и элиминировать. Нитрозативный стресс может привести к нитрозированию, и, соответственно, изменению структур
различных белков, ингибированию их биологических функций.
Кислород абсолютно необходим для жизни
всех аэробных организмов, однако при определенных условиях он становится токсичным. В
процессе адаптации к деструктивным свойствам
кислорода сформировались различные защитные механизмы, включающие антиоксиданты
и ферменты, обладающие антиоксидантной активностью. На рисунке приведены некоторые
их этих ферментов и реакции, которые они опосредуют:
809
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
O 2 + O 2 + 2H +
2H 2 0 2
Каталаза
H 2 0 2 + R(OH) 2
25
Супероксиддисмутаза
H 2 O 2 + 2GSH
H 2O 2 + O 2
2H 2 0 + 1/2O 2
Пероксидаза
H 2 O + RO 2
Глутатион
GSSG + 2H 2 O
Пероксидаза
Поддержка механизмов защиты клеток от
окислительного повреждения происходит на
минимальном необходимом уровне. Усиление
действия повреждающих факторов по сравнению
с базовым уровнем вызывает дополнительный
адаптивный ответ, и/или окислительные повреждения, в зависимости от силы и скорости повреждающего воздействия.
Таким образом, в организме существует баланс
между действием различных прооксидативных
факторов (ПФ) и способностью ADS им противостоять.
Некоторые данные позволяют предположить
существование (в норме) незначительного сдвига
этого баланса в сторону ПФ: например, накопление таких продуктов, как липофусцин. То есть, в
норме интенсивность действия ПФ равна или несколько выше, чем антиоксидантная способность.
Кроме того, ПФ могут быстро меняться, и биологической системе требуется какое-то время для
адаптации, особенно если воздействие ПФ значительно усиливается за короткий период времени,
и ADS биологической системы оказывается подавлена, что может приводить к серьезным последствиям. Таким образом, важное значение имеют
не только сила, но и скорость образования ПФ,
и преобладание действия ПФ над способностью
биологической системы защитить себя является
одной из важнейших причин, ведущих к возникновению и/или развитию многих патологических
состояний (см. рисунок).
В настоящее время много исследований посвящено важной роли окислительного и нитрозативного стресса в:
• сердечно-сосудистых заболеваниях (атеросклероз, повреждения при ишемии/реперфузии, рестеноз и гипертензия)
• злокачественных и воспалительных заболеваниях (синдром острой дыхательной недостаточности, астма, воспалительные заболевания
кишечника, воспаление глаз и кожи, артриты)
• метаболических заболеваниях (диабет)
• патологиях центральной нервной системы
(боковой амиотрофический склероз – болезнь
Шарко, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, инсульт и др.)
Заболевания, в возникновение и/или развитие которых вовлечен окислительный стресс
Дегенеративное поражение сетчатки
Развитие катаракты
Глаз
Ишемия кишечника
Повреждения печени
Эндотоксины
Трансплантация почек
Гломерулонефрит
ЖКТ
Кожа
Сердце
Ангиопластика
Кэшаньская болезнь
Окислительный стресс
Сосуды
Вазоспазм
Атеросклероз
Др. органы
Радиация
Старение
Рак
Нарушение иммунной системы
Ишемия/реперфузия
Диабет
810
Почки
Ожоги
Дерматиты
Псориаз
Суставы
Ревматоидный
артрит
Легкие
Мозг
Астма
Травма
ARDS
Инсульт
Гипероксия
Нейротоксины
Болезнь Паркинсона
Болезнь Альцгеймера
Группа компаний «БиоХимМак»
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Свободные радикалы (СР) – это любые химические вещества, способные к независимому
существованию и обладающие одним (или более) неспаренным электроном. СР нестабильны,
очень реактивны, взаимодействуют практически
с любыми органическими соединениями и вызывают цепь химических реакций. В процессе повреждения биологических систем участвуют как
минимум три формы активного кислорода: супероксид, перекись водорода и гидроксильный радикал (см. рисунок).
Различные реакции присоединения электрона с участием кислорода, в результате которых образуются СР
O2 + 1eO2 + 2e- +2H+
O2 + 3e- +3H+
O2H2O2
OH + H2O2
O2 + 4e- +4H+
2H2O2
СР могут взаимодействовать с образованием
еще более токсичных соединений, таких как пероксинитрит (O=NOO¯), продукт взаимодействия
супероксида и оксида азота.
ROS – это термин, объединяющий радикальные и нерадикальные производные активного
кислорода (см. таблицу). Эти соединения могут
участвовать в цепной свободнорадикальной реакции или повреждать органические субстраты (см. рисунок). Цепная реакция – это одна из
основных причин, почему свободные радикалы
кислорода могут вызывать повреждения далеко
от места их образования. Аналогичная ситуация
существует для RNS (см. таблицу).
ROS, образующиеся в живых организмах
Радикалы
Нерадикальные
Гидроксильный
радикал
OH•
Пероксинитрит
ONOO¯
Супероксид
O2•¯
Хлорноватистая
кислота
HOCl
Оксид азота
NO•
Перекись
водорода
H2O2
Тиол
RS•
Синглетный
кислород
1
Пероксил
RO2•
Озон
O3
Липидный пероксильный радикал
LOO• Липоперекись
WWW.BIOCHEMMACK.RU
Δg (¯1O2)
LOOH
RNS, образующиеся в живых системах
Радикалы
Нерадикальные
NO•
Нитрозил катион
Пероксинитрит
OONO¯
Перекись азота
Пероксоазотная
кислота
ONOOH Азотистый ангидрид (трёхокись
азота)
Оксид азота
Нитроксил анион NO¯
Нитрилхлорид
NO+
NO •
2
N2O3
25
Азотистая кислота HNO2
NO2Cl
Цепь реакций, вызываемых гидроксильным радикалом
HROH
(3)
R ROOH
OH + RH
(4)
H 2O + R
O2
(5)
(6)
ROO + RH
Гидроксильный радикал вступает в реакцию либо с водородом
биомолекул (4), либо присоединяется к биомолекуле (3). В присутствии молекулярного кислорода цепная реакция приводит
к образованию перекисных свободных радикалов (5), которые
затем легко отбирают водород у другой биомолекулы (6), таким
образом, продолжая развитие цепи.
В результате разнообразных биологических
реакций могут возникать многие другие виды СР,
например, фенольные или другие ароматические
соединения, часто образующиеся в процессе метаболизма ксенобиотиков как часть естественных
механизмов детоксикации. Многие СР образуются
в результате нормальных биологических процессов, таких как метаболизм кислорода или процесс
воспаления. СР выделяются в результате синтеза
АТР в митохондриях (О2-• и Н2О2), в пероксисомах
(Н2О2), в микросомах (О2-•), в фагоцитах (NO•). Они
участвуют в нормальных клеточных функциях
(для примера – лейкоциты используют супероксид для уничтожения бактерий и опухолевых клеток), в передаче клеточных сигналов в качестве
мессенджеров, синтезе гормонов, процессах пролиферации клетки. Уровень СР может повышаться
за счет внешних воздействий (радиация, токсины,
озон, окись азота, сигаретный дым, алкоголь).
Супероксид проникает через мембраны. Перекись водорода также легко проникает через
мембраны, но, в отсутствии переходных металлов
(железа или меди), реагирует с супероксидом медленно. В присутствии таких металлов образуется
811
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
высоко реактивный гидроксильный радикал, реагирующий практически со всеми биомолекулами.
Описанные выше реакции верны для гомогенной водной среды, но биологические системы неоднородны. Поверхностные свойства органелл,
электрический заряд, свойства белков, мембран,
нуклеиновых кислот и других биомолекул, присутствие переходных металлов имеют определяющее значение в степени и типе повреждений,
обусловленных СР.
Любой орган или система могут подвергаться окислительному или нитрозативному стрессу.
Наиболее предрасположены к стрессу дыхательная система (воздействие большого количества
кислорода), мозг (высокая метаболическая активность и низкий уровень эндогенных АО), глаз
(постоянное УФ-облучение), система кровообращения (колебания уровней кислорода и оксида
азота) и репродуктивная система (высокая метаболическая активность сперматозоидов).
Практически все ткани получают повреждения при ишемии/реперфузии. Их тяжесть зависит
от многих факторов, один из которых – длительность ишемии. К настоящему времени накоплено
множество данных, подтверждающих важнейшую
роль окислительного повреждения в развитии
поражения на этапе реперфузии.
Клеточные мембраны содержат большое количество ненасыщенных липидов. Эти молекулы
легко повреждаются при воздействии СР. Окисление липидов мембран приводит к изменениям
их структуры, в результате которых повышается
жесткость мембран и изменяется активность мембранных белков, нарушается мембранный транспорт, в том числе и работа ионных насосов.
Взаимодействие СР кислорода с белками
приводит к разнообразным нарушениям: кросссшивки реагирующих веществ и других клеточных компонентов; фрагментация белков;
сайт-специфические повреждения белковой молекулы, изменяющие ее структуру и влияющие на
функциональную активность белка.
Такие изменения могут иметь значительные последствия. Например, окисление одного
аминокислотного остатка в активном сайте α1протеазного ингибитора приводит к его инактивации, в результате активируются протеазы и происходит повреждение ткани. Предполагается, что
25
812
такой механизм способствует развитию эмфиземы
легких. Аналогичное окисление специфического аминокислотного остатка глутаминсинтетазы,
приводящее к ее инактивации, может приводить
к накоплению нейротоксичного глутамата.
Одним из первичных сайтов окислительного
повреждения является митохондриальная ДНК.
Ее окисление вызывает выключение митохондрий и гибель клеток.
Окислительное повреждение клеточной ДНК
происходит, в первую очередь, под действием
гидроксильного радикала (супероксид и перекись водорода напрямую не взаимодействуют
с ДНК). Гидроксильный радикал способен инициировать множественные модификации ДНК:
реакция с дезоксирибозной группой ведет к
одноцепочечным разрывам и выпадению оснований, различным модификациям сахаров и образованию АР-сайтов (участков с удаленными
азотистыми основаниями); кроме того, возможны широкий спектр окислительных модификаций оснований (см. рисунок) и кросс-сшивки
ДНК-белков. Одним из последствий таких модификаций может быть блокада репликации ДНК,
приводящая к гибели клетки.
Структура некоторых стабильных модификаций оснований, вызванных окислительным повреждением ДНК
FAPY-дериваты – производные аденина или гуанина с открытым
кольцом.
Группа компаний «БиоХимМак»
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Окислительные повреждения ДНК играют
важную роль во многих патологических процессах: канцерогенезе, нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера. Доказана роль окислительного повреждения ДНК в
процессе старения – накопление окислительных
повреждений ДНК в неделящихся клетках способствует развитию возрастных заболеваний.
ADS включает ферменты и АО, которые предотвращают окислительное повреждение и/или
контролируют его распространение. Кроме того,
она включает механизмы устранения окислительного повреждения, направленные на репарацию,
удаление или замещение поврежденных молекул. АО могут быть эндогенными или экзогенными. Обычно их подразделяют на скавенджер-АО
(удаляют ROS) и защитные АО.
• Скавенджер-АО:
– Малые молекулы-АО (водорастворимые: витамин C, глутатион; жирорастворимые: витамин
E, каротин, липоевая кислота, коэнзим Q10)
– Большие молекулы – ферменты с антиоксидантной активностью (супероксиддисмутаза
(SOD), каталаза, глутатионпероксидаза (GPx))
Эти ферменты синтезируются клетками и имеют большой антиоксидантный потенциал.
• Защитные АО препятствуют формированию
новых ROS. К этой группе относят альбумин,
металлотионин, трансферрин, церулоплазмин,
миоглобин, ферритин.
Прямая количественная оценка ROS и RNS,
присутствующих в биологических системах,
очень сложна или практически невозможна.
Для определения окислительного статуса либо
анализируют продукты реакций свободных радикалов с биомолекулами, либо используют
экзогенные «ловушки» и анализируют стабилизированные продукты. Кроме того, можно проводить оценку повреждений и изменений ADS,
например, регуляторных механизмов экспрессии эндогенных АО.
Наша компания предлагает широкий спектр
точных и удобных методов оценки баланса, существующего между СР и ADS, необходимого для понимания взаимосвязи окислительного стресса и
патологических процессов в организме.
WWW.BIOCHEMMACK.RU
8-гидрокси-2-дезоксигуанозин
(DNA-damage)
8-гидрокси-2-дезоксигуанозин (8-OH-dG) является продуктом окислительного повреждения
ДНК, вызванного ROS и RNS, и служит доказанным
маркером окислительного стресса. Гидроксилирование гуанозина происходит и в результате
нормальных метаболических процессов, и под
действием различных факторов окружающей
среды. Повышенный уровень 8-OH-dG ассоциирован с процессом старения, а также со многими
патологическими состояниями, включая злокачественные опухоли, диабет и гипертензию.
Предлагаемый метод определения 8-OH-dG может быть использован для измерения уровня этого маркера в моче, клеточных культурах, плазме и
других жидкостях. Важно отметить, что используемые антитела к 8-OH-dG распознают как свободный
маркер, так и включенный в состав ДНК.
25
Формирование 8-OH-dG под действием ROS
O
O
N
HN
H₂N
HOH₂C
N
HN
N
N
H₂N
O
OH
HOH₂C
OH
2’-dG
N
N
O
OH
8-OH-dG
Глутатион пероксидаза 1 (Gpx1)
Глутатион пероксидазы (Gpx) экспрессируются
повсеместно, они катализируют восстановление
перекиси водорода и органических гидроперекисей с использованием глутатиона. Таким образом, они обеспечивают двойную защиту клеток
от окислительного стресса: утилизация перекиси
водорода и обезвреживание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Кроме того, Gpx обеспечивают защиту клеточных мембран, особенно от экзогенного повреждения. Они регулируют содержание органических перекисей, тем самым участвуя в регуляции
синтеза эйкозаноидов. Gpx обладают антиапоптозным эффектом, т.к. предотвращают выход цитохрома С из митохондрий.
813
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Существуют несколько изоформ Gpx, различающихся по своей первичной структуре и локализации. Первой из Gpx была открыта классическая
цитозольная/митохондриальная Gpx1 (cGpx) –
селен-зависимый фермент. Gpx2, также известная
как гастроинтестинальная Gpx (GI-Gpx), это внутриклеточный фермент, экспрессируемый только
в эпителии ЖКТ. Внеклеточная Gpx плазмы (pGpx
или Gpx3) в основном экспрессируется в почках
и поступает в кровоток. Фосфолипид гидропероксидаза Gpx4 (PH-Gpx) экспрессируется в большинстве тканей и может восстанавливать многие гидроперекиси, включая интегрированные в
мембраны липопероксиды, окисленные липиды
липопротеинов низкой плотности и тимин. Все
Gpx млекопитающих, за исключением недавно
открытой Cys-содержащей Gpx3 и эпидидимисспецифичной секреторной Gpx (eGpx или Gpx5),
содержат в активном центре остаток селеноцистеина (аналога цистеина, в котором атом серы
замещен атомом селена).
Gpx1 играет основную роль в механизмах защиты от окислительного повреждения, она может быть важным антиатерогенным фактором. В
экспериментах на мышах показано, что дефицит
Gpx1 приводит к нарушению структуры и функций сердца и сосудов. Существуют данные, подтверждающие, что низкий уровень активности
Gpx1 эритроцитов позволяет выявить пациентов с
болезнью коронарных артерий с высоким риском
сердечно-сосудистых осложнений. Измерение
активности Gpx1 предоставляет дополнительную
информацию для выявления больных, у которых
будет полезным проведение превентивной антиоксидантной терапии.
25
8-изопростан (8-ИП)
•cм. главу
«Медиаторы
аллергических
реакций»
стр. 773
814
Определение 8-изопростана в крови или моче
является чувствительным методом определения
интенсивности окислительного стресса. Это вещество относят к семейству эйкозаноидов, образование которых происходит при неферментативном
(свободнорадикальном) окислении фосфолипидов клеточных биомембран. Являясь продуктом
метаболизма арахидоновой кислоты, 8-ИП может
служить надежным маркером уровня окислительного стресса в организме при различной патологии. В современной литературе представлены
данные о повышении уровня 8-ИП при нейродегенеративных заболеваниях, ишемической болезни
сердца, артериальной гипертензии.•
Тиоловый статус
Метод предназначен для количественного
определения тиоловых групп в биологических
образцах. Является прямым методом оценки
окислительно-восстановительного статуса и отражает степень окислительного повреждения, т.к.
тиоловые группы непосредственно реагируют с
ROS с образованием дисульфидов.
Супероксиддисмутазы (SOD)
SOD – ферменты, обладающие антиоксидантной активностью и являющиеся частью ADS. SOD
катализируют реакцию дисмутации супероксидного радикала в Н2О2 и кислород. Таким образом,
они играют важнейшую роль в антиоксидантной
защите практически всех клеток, находящихся в
контакте с кислородом. Сегодня у человека известны три супероксиддисмутазы, различающиеся по своей локализации в организме. SOD1
или CuZn-SOD, представляет собой димер с м.м.
32,5 кДа, котрый локализуется в цитоплазме клеток и содержит медь (кофактор активного центра)
и цинк (кофактор, стабилизирующий конформацию). SOD2 или Mn-SOD – содержится в митохондриях, это тетрамер с м.м. 86-88 кДа, содержащий
в качестве кофактора активного центра марганец.
SOD3 или EC-SOD – эта внеклеточная форма также
представляет собой тетрамер с м.м. 135 кДа, содержит медь в активном центре и цинк как структурный компонент и гепарин-связывающий домен со стороны С-конца.
Высокая экспрессия SOD3 наблюдается в тканях кровеносных сосудов, сердце, легких, почках
и плаценте. Она выявляется во внеклеточном матриксе и благодаря такой локализации способна
препятствовать повреждению клеток и тканей, вызванному ROS, продуцируемыми вне клеток. SOD3
играет важную роль в поддержании сосудистого
тонуса, уменьшении влияния возрастного фактора
на когнитивные способности, функции легких, метаболизме NO, патогенезе различных заболеваний,
включая атеросклероз, диабет и артриты.
Показано, что уровни SOD1 и SOD3 в плазме
значительно выше у пациентов, проходящих геГруппа компаний «БиоХимМак»
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
модиализ по сравнению со здоровыми людьми.
Повышение SOD2 и снижение SOD3 в плазме наблюдается у женщин при гипертиреозе.
Тиоредоксин-1 (Trx-1)
Человеческий тиоредоксин (Trx) был выявлен различными исследователями как: IL-1подобный цитокин, продуцируемый лимфобластными В-клетками, инфицированными вирусом
Эпштейна-Барр (EBV); фактор, продуцируемый
клетками Т-клеточного лейкоза; IL-2-рецептор индуцирующий фактор, продуцируемый Т-клетками,
инфицированными T-лимфотропным вирусом 1
типа; часть комплекса фактора ранней беременности, выявляемого в сыворотке беременных, повышающего комплемент-зависимое подавление
связывания лимфоцитов с гетерологичными клетками крови (розеткообразование).
Trx млекопитающих – это семейство небольших
(м.м. ~12 кДа) окислительно-восстановительных
белков, которые подвергаются NADPHзависимому восстановлению тиоредоксинредуктазой, и, в свою очередь, восстанавливают окисленный цистеин в составе белков. Основными Trx
являются тиоредоксин-1 (Trx1) – цитозольная и
ядерная форма, и тиоредоксин-2 (Trx2) – митохондриальная форма.
Trx-1 – это глобулярный белок, состоящий из
104 аминокислот с м.м. 12 кДа. Trx-1 образует ковалентно связанные гомодимеры, особенно при
высокой его концентрации или в присутствии
сильного окислителя.
Промотор гена Trx содержит много регуляторных мотивов, совместимых как с конститутивной, так и с индуцибельной экспрессией, а также
элемент, отвечающий на окислительный стресс.
Множество стимулов повышают экспрессию
Trx-1, в том числе гипоксия, S. aureus, липополисахариды, O2, H202, форболовый эфир, вирусные
инфекции, окислительный стресс, рентгеновское
и УФ-излучение, ретинол (витамин А), эстрадиол.
Показана зависимость экспресии Trx-1 от клеточного цикла.
Trx-1 является преимущественно цитоплазматическим белком, но выявляется и в ядрах различных типов клеток. Показано, что транслокация
Trx-1 из цитоплазмы в ядро может происходить
под действием таких факторов, как H202, форболWWW.BIOCHEMMACK.RU
миристатацетат (PMA), УФ-излучение, гипоксия,
цисплатин. Trx проявляют свою активность вне
клеток (стимуляция клеточного роста и хемотаксиса), в цитоплазме (как АО и восстановительный
кофактор), в ядре (регуляция активности факторов транскрипции) и в митохондриях. Продемонстрировано взаимодействие внеклеточного Trx-1
с цитоплазматическими мембранами.
Trx-1 – это многофункциональный белок. Он
проявляет широкий спектр биологических функций (см. рисунок).
25
Биологические эффекты Trx
Trx(ox)
Trx редуктаза
фактор роста
Trx(red)
Trx пероксидаза
H2O2
рибонуклеотид
редуктаза
H2O
рибонуклеотиды
связывание факторов
транскрипции с ДНК:
p53
AP-1
дезоксиAP-2
рибоNF-кВ
нуклеотиды
PEBP2/CBF
GR
ER
клеточная пролиферация
связывание
с белками:
Trx (гомодимер)
Ref-1
ASK1
PKCα,δ,ε,ζ
GR
витамин D регулируемый
белок
p40phox
липокалин
антиапоптоз
Trx является поставщиком восстановительных
субстратов для тиоредоксинпероксидаз и рибонуклеотидредуктаз. Он содержит консервативный
каталитический сайт (-Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys-),
который подвергается обратимому окислению с
образованием дисульфидной связи (Trx-S2) при
переносе восстановительных субстратов от цистеинов, содержащихся в этом сайте, на субстратакцептор (X-S2). Окисленный Trx затем восстанавливается обратно до Cys-формы [Trx-(SH)2]
тиоредоксинредуктазой в NADPH-зависимой реакции (см. рисунок).
Окислительно-восстановительные реакции с участием Trx
Trx-(SH)₂ + X-S₂
Trx-S₂ + X(SH)₂
TrxR
Trx-S₂ + NADPH
Trx-(SH)₂ + NADP+
Trx-1 действует как фактор роста. Он секретируется лимфоцитами, гепатоцитами, фибробласта-
815
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
ми и многими опухолевыми клетками. Механизм
пролиферативного действия Trx-1 нетипичен для
факторов роста. Предполагается, что он сенсибилизирует клетки к ростовым факторам. В экспериментах in vitro показано, что Trx-1 препятствует
апоптозу, индуцированному различными агентами (L-цистеином, TNF-α, дексаметазоном).
Trx-1 селективно активирует связывание с
ДНК многих транскрипционных факторов (ТФ),
одним из которых является NF-κB, играющий
важную роль в клеточном ответе на окислительный стресс, апоптозе и канцерогенезе. Trx1 повышает связывание NF-κB с ДНК сильнее,
чем L-цистеин, восстановленный глутатион или
нефосфорилированные
восстановительные
агенты (N-ацетилцистеин, 2-меркаптоэтанол,
дитиотриэтол). Другим ТФ, чья активность регулируется Trx-1, является глюкокортикоидный
рецептор (ГР). Окисление ГР ведет к снижению
его лиганд- и ДНК-связывающей активности. В
ядре Trx-1 взаимодействует с ДНК-связывающим
доменом ГР, что ведет к повышению взаимодействия ГР-ДНК. Кроме того, Trx-1 усиливает
связывание с ДНК и других ТФ, AP-2, рецептора
эстрогена и PEBP2/CBF. В экспериментах показано, что каскад событий, развивающихся под
действием Trx-1 и Ref-1, ведет к усилению экспрессии таких белков, как эритропоэтин.
Таким образом, in vivo Trx-1 способствует и выживанию, и росту опухолей, в отличие от Bcl-2,
способствующего только выживанию и требующего дополнительных генетических изменений
для стимуляции роста опухоли.
Непосредственным антиоксидантным свойством Trx-1 является удаление перекиси водорода. Другой клеточный механизм удаления H202 с
помощью селеноцистеин-содержащей глутатионпероксидазы использует восстановленный
глутатион как восстановительный субстрат. Считается, что окислительно-восстановительные
системы глутатиона и Trx не связаны. Селен
оказывает разное действие на них, повышая
активность тиоредоксинредуктазы и не изменяя активность тиоредоксинпероксидазы. И,
наоборот, он повышает активность глутатионпероксидазы, но не повышает активность глутатионредуктазы (см. рисунок). Это означает, что
в присутствии большого количества перекиси
25
816
увеличение доступного селена приведет к повышению уровня восстановленного Trx по сравнению с восстановленным глутатионом.
Влияние селена на тиоредоксинпероксидазный (TrxP)
и глутатионпероксидазный циклы
H₂O₂
GSH
Trx(red)
TrxR
(Se)
GPx
(Se)
TrxP
Trx(ox)
GR
GSSG
H₂O
Trx(red) – восстановленный Trx; Trx(ox) – окисленный Trx, GSH –
восстановленный глутатион; GSSG – окисленный глутатион.
Ферменты: селенопротеины (TrxR и глутатионпероксидаза)
и неселенопротеины (TrxР и глутатионредуктаза).
Кроме того, Trx-1 является источником
восстановительных субстратов для витамин
K-эпоксидредуктазы, необходимой для синтеза
факторов свертывания крови. Показано, что бактериальная Trx является источником восстановительных субстратов для рибонуклеотидредуктазы, катализирующей превращение нуклеотидов в
дезоксинуклеотиды, первого ключевого шага синтеза ДНК и обязательного этапа пролиферации
клеток. Аналогичные механизмы Trx-1 у эукариот
до конца не изучены, но показано, что ингибирование его редуктазы (TrxR) некоторыми противоопухолевыми хинонами сопровождается снижением активности рибонуклеотидредуктазы. Trx-1
может непосредственно реактивировать белки,
утратившие функцию в результате окислительного повреждения, например, глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназу и др.
Уровень Trx-1 в плазме здоровых людей составляет 10-80 нг/мл. Trx участвуют в развитии
многих заболеваний, включая опухолевые.
Экспрессия Trx-1 во многих опухолях человека
значительно превышает таковую в нормальных
тканях и ассоциирована с агрессивным опухолевым ростом (см. таблицу). Например, экспрессия Trx-1 наблюдается у более половины
больных с первичным раком желудка. Уровни
Trx-1 положительно коррелируют (p < 0,001)
со скоростью пролиферации и отрицательно
(p < 0,001) с уровнем апоптоза.
Группа компаний «БиоХимМак»
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Гиперэкспрессия Trx-1 в тканях первичных человеческих
опухолей
Опухоль/ткань
Объект
Повышение
экспрессии, %
Легкие
мРНК
50*
Толстая кишка
Шейка матки
Гепатома
Желудок
мРНК
60*
Белок
55*
Белок
78
мРНК
85
Белок
52
Белок
50
Белок
41
Поджелудочная железа
7 (дифференцированный)
Плоскоклеточная
карцинома
Белок
6 (с метастазами)
Миелома
Белок
9
Неходжкинские лимфомы
Белок
7 (поздние стадии)
Острый лимфоцитарный
Белок
лейкоз
15
*По сравнению с соответствующей нормальной тканью этого
же пациента.
Недавно было показано, что уровень Trx-1 при
раке толстого кишечника повышен приблизительно в 6 раз по сравнению с нормальным, но не
повышен при предраковом состоянии – полипозе толстого кишечника. Его уровень в сыворотке
повышается практически в 2 раза у пациентов с
раком печени, а после хирургического удаления
опухоли падает до нормальных значений. Это особенно интересно в связи с тем, что уровень Trx-1 у
больных с хроническим гепатитом или циррозом
печени остается в норме. У больных с протоковой
карциномой концентрация Trx-1 в плазме повышена более чем в 2 раза по сравнению со здоровыми людьми.
Многие исследования подтверждают, что Trx
может влиять на устойчивость клеток к противоопухолевым препаратам. Показано, что наименьшая
чувствительность клеток Т-клеточного лейкоза к
доксорубицину наблюдалась при самом высоком
уровне Trx-1. Чувствительность клеток гепатомы
человека к цисплатину падала при повышении
концентрации Trx-1. При повышении уровня мРНК
и белка Trx-1 в 4-6 раз в клетках рака мочевого пузыря и предстательной железы они становились
WWW.BIOCHEMMACK.RU
резистентными к цисплатину. Эта устойчивость обратима при снижении уровня Trx-1. Концентрация
Trx-1 в клетках рака желудка и рака толстого кишечника, устойчивых к цисплатину, была в 2,5 раза
выше, а активность – в 2 раза выше. Наблюдается
прямая зависимость устойчивости к цисплатину от
уровня Trx-1 в клетках рака яичника. В связи с этим
разрабатываются лекарственные противоопухолевые препараты, ингибирующие Trx.
На животных моделях показано, что человеческий Trx-1 оказывал защитное действие при
аритмии, индуцированной реперфузией, поддерживал функцию легких и снижал степень повреждения ткани, внутриальвеолярную экссудацию
и клеточную инфильтрацию при повреждении
легких в результате ишемии/реперфузии. После
трансплантации легких человеческий Trx-1 защищал от потери легочной функции и предупреждал
появление признаков повреждения. Также в экспериментах показано, что Trx-1 защищает эндотелиальные клетки от реперфузионного повреждения и от повреждения сетчатки, вызванного
ишемией/реперфузией.
В нормальной коже с помощью иммуногистохимического окрашивания Trx-1 выявляется
в сальных железах, секреторных компонентах
потовых желез и эпителии наружного корневого
влагалища волосяного фолликула. Повышенная
экспрессия Trx-1 показана в эпидермальных клетках кожи после солнечного облучения и может
являться защитным ответом на окислительное
повреждение.
Trx-1 вовлечен в патогенез атеросклероза. NO и
пероксинитрит способствуют повреждению гладкомышечных и эндотелиальных клеток, наблюдаемому при формировании атеросклеротических
бляшек. Trx-1 препятствует NO-зависимому ингибированию NO-синтазы. Показана повышенная
экспрессия Trx-1 и TrxR в эндотелиальных клетках
и макрофагах человеческих атеросклеротических
бляшек.
Trx-1 является компонентом комплекса фактора ранней беременности в сыворотке, обеспечивающего иммунную защиту развивающегося
эмбриона. Первоначально Trx-1 продуцируется
материнскими тканями, но после имплантации
плод начинает продуцировать этот белок самостоятельно.
25
817
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Показано, что у пациентов с болезнью Альцгеймера уровень Trx-1 в тканях мозга (миндалевидной
железе и гиппокампе) снижен, а активность TrxR повышена. Предполагается, что эти изменения могут
способствовать окислительному стрессу и развитию нейродегенеративного процесса.
Trx-1 усиливает миграцию и цитотоксичность
эозинофилов, секрецию основного белка эозинофилов. Экспрессия Trx-1 повышена в инфильтрирующих B-клетках, эпителиальных клетках
у больных с синдромом Шегрена и при аутоиммунных патологиях, ассоциированных с EBV. В
лимфатических узлах больных СПИДом и пациентов со СПИД-ассоциированным комплексом
отсутствуют клетки, продуцирующие Trx-1. Однако уровень Trx-1 в плазме у 25% этих больных
значительно повышен и коррелирует с низким
уровнем CD4+ клеток. Кроме того, повышение
Trx-1 в плазме соответствует изменению набора
экспрессируемых антигенов клеточной поверхности (CD62L, CD38 и CD20), происходящему на
поздней стадии ВИЧ инфекции. Показано, что
введение Trx-1 ингибирует репликацию ВИЧ в
человеческих макрофагах (определение по продукции антигена р24), а также интеграцию провируса и репликацию интегрированного вируса
в инфицированных клетках. Trx-1 является гораздо более сильным ингибитором продукции ВИЧ,
чем N-ацетилцистеин.
25
Тиоредоксинредуктазы (TrxR)
TrxR – это единственные известные ферменты, способные восстанавливать активный сайт
Trx. TrxR млекопитающих – гомодимерные белки,
содержащие динуклеотид флавин-аденин и селеноцистеин на С-конце. Селеноцистеин консервативного каталитического сайта TrxR подвергаются
обратимому окислению-восстановлению по почти такому же механизму, как и Trx. В настоящее
время известны две TrxR: преимущественно цитозольная (TrxR-1, м.м. 54,4 кДа) и митохондриальная (TrxR-2, м.м. 56,2 кДа).
Определение антиоксидантов
(Antioxidant Assay)
Antioxidant Assay – это метод оценки состояния ADS. Определяет общую антиоксидантную
активность, что позволяет выявлять людей с по-
818
вышенным риском развития рака, аутоиммунных
и сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного
диабета и др., а также проводить мониторинг течения заболевания и эффективности применяемой терапии, оценивать необходимость применения АО.
Анализатор FORMox
FORMox – это компактный экспресс-анализатор
(Point of Care), предназначенный для оценки
окислительного стресса в образцах цельной капиллярной крови (объем образца 10 мкл; время
выполнения анализа < 10 мин.). Инструмент разработан для выполнения экспресс-тестов:
• FORT – на определение СР (оценка СРповреждения тканей)
• FORD – на устойчивость к окислению биологических субстратов ROS (оценка состояния ADS)
Схема реакции FORT
R-OOH + Fe2+
A
R-Ot+ OH- + Fe3+
R-OOH + Fe3+
B
R-OOt+ H- + Fe2+
ROt+ ROO + 2CrNH₂
C
RO- + ROO-
А. Образование алкоксильных радикалов
В. Образование перекисных радикалов
С. Образование окрашенного соединения
FORT является колориметрическим тестом,
основанным на способности переходных металлов, таких как железо, катализировать расщепление гидропероксидов с образованием производных радикалов согласно реакции Фентона.
Образующийся в клетках ROOH сохраняет свою
химическую активность и окислительную способность генерировать образование пропорциональных количеств алкоксильных (RO·) и перекисных (ROO·) радикалов (см. рисунок, реакции A и B).
Эти производные радикалы затем захватываются
хромогеном в соответствующем буфере (аминопроизводное, реагент R1, содержит CrNH2) и при
37°C развивается реакция с образованием окрашенного стабильного продукта, определяемого
фотометрически. (см. рисунок, реакция C). Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна
количеству радикалов.
Группа компаний «БиоХимМак»
!*-(+?!*-(fL
WeWc`_Wjfhs
gEBD6V?7RHIG6VEM;DA6EA?HB?I;BSDE9EHIG;HH6
fDFH5H>7CQ:è5C5A>=5HDFQè ),'ç*è
>è ),'çeKè>9:5ARCDèED9KD9UHè9AUè6QGHFD?è>è
HDMCD?èDL:C@>èGH5HIG5èD@>GA>H:ARCD8DèGHF:GG5è
7èD6F5=L5KèL:ARCD?è@FD7>èC5èDGCD7:èB:HD95è
GIKD?èK>B>>
aeb_n[hiX[ddr[ç
tahfg[hhši[hir‚ç
Xrfebdv[cr[ç
dVç ),'çelƒ
ˆè D6O5Uè5CH>D@G>95CHš
C5UèGEDGD6CDGHR
ˆè G7D6D9CQ:èF59>@5AQ
aeb_n[hiX[ddr[ç
tahfg[hhši[hir‚ç
Xrfebdv[cr[ç
dVç ),'ç*&/-ƒ
ˆè D6O5Uè5CH>D@G>95CHC5Uè
ˆè
ˆè
ˆè
ˆè
GEDGD6CDGHR
G7D6D9CQ:èF59>@5AQ
8:BD8AD6>C
8:B5HD@F>H
BDM:75Uè@>GADH5
VdVb_^Viegç ),'ç*&/-çZefebd_i[bsdeç
eWegjZeXVdƒ
ˆè G:CGDFCQBèS@F5CDB
ˆè EF>CH:FDBè˜H:FBD6IB585™
ˆè EDFHDBè/-
VC5A>=5HDFèBD<:Hè6QHRèED9@ATM:Cè@èE:FGDš
C5ARCDBIè@DBERTH:FI
ZDGHIECDçGE:L>5A>=>FD75CCD:çEFD8F5BBš
CD:çD6:GE:M:C>:ç’&ç-“
fF>è7@ATM:C>>èEF>6DFQè ),'è*è>è ),'èeKè
57HDB5H>M:G@>è7QEDACUTHèG5BD9>58CDGH>@I‚è
EFD7:FUUèDGCD7CQ:èK5F5@H:F>GH>@>èG>GH:BQè
d:èHF:6I:HGUè9DEDAC>H:ARCQ?è5C5A>=èGH5C95Fš
HD7è>è@DCHFDA:?
fDèIBDAM5C>Tè5C5A>=5HDFQè7QEDACUTHè5C5A>=è
7è57HDB5H>M:G@DBèF:<>B:èfDGA:èIGH5CD7@>è
@T7:HQè7è9:F<5H:ARèGM>HQ75H:ARèNHF>Kš@D95è
D6F565HQ7:HèèC:D6KD9>BITè>CJDFB5L>TèDèH>E:è
B:HD95è˜ ),.‚è ),‚èBDM:75Uè@>GADH5‚è8:BD8ADš
6>Cè>A>è8:B5HD@F>H™‚è>èH:GH>FD75C>:èC5M>C5š
:HGUè57HDB5H>M:G@>
XF:BUèH:GH>FD75C>UèGDGH57AU:HèDHèwè9Dè}è
B>CIHè7è=57>G>BDGH>èDHèH>E5èH:GH5èg:=IARH5HQè
7Q7D9UHGUèC5è9>GEA:?è>èGDKF5CUTHGUè57HDB5š
H>M:G@>
_WfX?Em?Cd6A wwwècDG@75‚èb:C>CG@>:èYDFQ‚ècYjè>B:C>ècXèbDBDCDGD75‚è9w‚èGHFD:C>:èwwè H:A:JDCè˜z{™è|z}šx}šz€‚èyšw€š|€ J5@Gè˜z{™èyš€š} šƒè» 
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
FORD является колориметрическим тестом,
основанным на способности АО, присутствующих
в плазме крови, сокращать количество катионов.
FORD-тест основан на степени редукции радикалов за фиксированное время. Стабильный окрашенный катион (определяемый фотометрически
при длине волны 505 нм) образуется в присутствии кислого буфера (pH 5,2) и оксиданта (FeCl3).
АО, присутствующие в образцах, снижают содержание катионов, что приводит в конечном итоге
к обесцвечиванию раствора пропорционально
количеству АО в образце. Значения абсорбции в
диапазоне 0,80-1,00 достигаются через 3-4 мин.
при образовании стабильного окрашенного раствора (см. рисунки). Полученные результаты выражаются в эквивалентах тролокса (ммоль/л).
25
Схема реакции теста FORD
Хромоген (бесцветный) + окислитель (Fe3+) + H+
t
Хромоген (окрашенный)
+ AOH
t
Хромоген (окрашенный)
+
Хромоген (бесцветный)
+ AO
Абсорбция теста FORD
2.5
2.0
оп
1.5
1.0
0.5
0.08
300
350
400
450
нм
500
550
600
Динамика образования хромогенного радикала
1
0.8
оп
0.6
0.4
0.2
0
2
4
время, мин
6
8
ОП – оптическая плотность
Анализатор FORMplus
FORMplus – это компактный экспрессанализатор (Point of Care), предназначенный для
оценки окислительного стресса в образцах цель-
820
γ-CEHC (2,7,8-триметил-2-(β-карбоксиэтил)6-гидроксихроман), метаболит витамина Е
γ-токоферол – наиболее распространенная
форма витамина E, обладающего АО свойствами. Его метаболит – γ-CEHC (2,7,8-триметил-2-(βкарбоксиэтил)-6-гидроксихроман), продуцируется печенью под действием ферментов системы
цитохрома P450 и выводится с мочой. Уровень
экскреции γ-CEHC превышает концентрацию
всех других метаболитов токоферола. В плазме γ-токоферол способен нейтрализовать RNS.
Также как токоферол, γ-CEHC ингибирует активность циклооксигеназ макрофагов и эпителиальных клеткок. Концентрация γ-CEHC в плазме
может быть использована для оценки риска развития сердечно-сосудистых и онкологических
заболеваний.
Гидроперекиси липидов (LPO)
ОП – оптическая плотность
0
ной капиллярной крови. Инструмент разработан
для выполнения экспресс-тестов:
• FORT – на определение СР (оценка СР-повреждения тканей)
• FORD – на устойчивость к окислению биологических субстратов ROS (оценка состояния ADS)
• Мочевая кислота
• Гемоглобин
• Гематокрит
Время выполнения любого из анализов < 10
мин.
Количественная оценка продуктов ПОЛ
очень важна для определения роли окислительного повреждения в патофизиологии различных заболеваний. В процессе ПОЛ образуются
высокоактивные и нестабильные гидроперекиси как насыщенных, так и ненасыщенных жирных кислот. Предлагаемый метод определения
продуктов ПОЛ основан на прямом использовании окислительно-восстановительных реакций с участием ионов железа. Метод включает
простую в исполнении процедуру экстракции
гидроперекисей липидов. Эта процедура позволяет элиминировать любое влияние, вызванное
перекисью или эндогенными ионами железа, на
результаты тестирования и обеспечивает чувствительный и достоверный метод определеГруппа компаний «БиоХимМак»
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
ния оценки ПОЛ в микропланшетном формате
с использованием специального 96-луночного
микропланшета, устойчивого к действию органических растворителей.
L-цитруллин
NO является внутри- и межклеточной сигнальной молекулой. Он взаимодействует с СР, металлопротеиназами и специфическими аминокислотными остатками белков. NO играет важную роль в
регуляции сосудистого тонуса. Эндотелиальный
NO (eNO) диффундирует к близлежащим гладкомышечным клеткам (VSMC), где активирует растворимую гуанилатциклазу (sGC), которая, в свою
очередь, повышает внутриклеточную продукцию
cGMP из GTP, что в итоге приводит к релаксации
гладкой мускулатуры и вазодилатации. Функциональные изменения эндотелия при ишемической
болезни сердца могут быть важным фактором
развития вазоспазма, ишемии и тромбоза.
Определение NO in vivo очень сложно из-за его
очень короткого периода полувыведения и требует специального дорогостоящего оборудования.
Суррогатным маркером NO является L-цитруллин.
NO синтезируется в цикле цитруллин-NO, когда
L-аргинин окисляется до цитруллина под действием NO-синтазы (NOS). Во второй части орнитинового цикла аргинин ресинтезируется из цитруллина. Катализируемая NOS продукция L-цитруллина
и NO происходит в два этапа, и количественное
соотношение между образуемыми L-цитруллином
и NO составляет 1:1. Таким образом, превращение
L-аргинина в L-цитруллин может быть использовано как маркер синтеза NO.
Патологически высокие уровни L-цитруллина
служат показателем нитрозативного стресса. Назначение теста:
• оценка активности NOS (продукции NO)
• определение нитрозативного стресса
Карбонилированные белки
ROS, как уже было сказано, могут окислять
белки, липиды и ДНК, вызывая повреждение их
структуры и функций. При окислении СР аминокислотные остатки белков модифицируются или
разрушаются. В результате образуются новые
функциональные группы, в том числе гидроксильные или карбонильные. Карбонилирован-
WWW.BIOCHEMMACK.RU
ные белки могут образовываться в результате
действия различных окислительных механизмов
и являются чувствительными индикаторами окислительного повреждения. Предлагаемый метод
определения карбонилированных белков основан на дериватизации динитрофенилгидразином (DNPH) и выявлении связавшихся анти-DNPH
антител. Метод может быть использован для анализа широкого спектра биологических образцов,
включая плазму (ЭДТА), бронхоальвеолярную
жидкость, спинномозговую жидкость, клеточные
экстракты и другие образцы белковых растворов.
Метод предназначен для диагностики:
• атеросклероза
• болезни Альцгеймера
• болезни Паркинсона
• ревматоидного артрита
• уремии
• диабета
• старения
• злокачественных опухолей
25
Воспаление
Воспаление лежит в основе широкого спектра
физиологических и патологических процессов.
Классическими инициаторами воспаления являются инфекции и повреждение ткани. Однако это
только часть большого количества разнообразных неблагоприятных событий, таких как тканевой стресс и дисфункция, индуцирующих адаптивный ответ и воспаление (см. рисунок).
В общем случае считается, что контролируемый воспалительный ответ благоприятен (например, он обеспечивает защиту от инфекций), но он
может стать губительным при нарушении его регуляции (например, вызвать септический шок).
На первом этапе острый воспалительный
ответ, обусловленный инфекцией или повреждением ткани, вызывает координированное поступление компонентов крови (белков и лейкоцитов) в пораженное место. Так, первоначальное
распознавание инфекции опосредуется тканевыми макрофагами и тучными клетками, что приводит к продукции широкого спектра медиаторов
воспаления, включая хемокины, цитокины, вазоактивные амины, эйкозаноиды, продукты протеолитических каскадов.
821
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Причины, физиологические и патологические последствия воспаления
Триггеры воспаления
Инфекции
25
Повреждение
ткани
Тканевой стресс и дисфункция
Воспаление
Физиологическое Защита организма от инфекции
значение
Патологические
последствия
Аутоиммунные заболевания,
воспалительные
повреждения тканей, сепсис
Репарация ткани
Фиброз, метаплазия,
и/или
развитие опухоли
Адаптация к стрессу,
восстановление
гомеостаза
Сдвиг гомеостаза,
нарушения гомеостаза,
аутовоспаление
В зависимости от триггера воспалительный ответ приводит к различным физиологическим и патологическим последствиям.
Главной целью и немедленным эффектом появления этих медиаторов является локальное образование воспалительного экссудата: белки плазмы и лейкоциты (в первую очередь нейтрофилы),
которые в норме присутствуют в кровеносных
сосудах, «получают доступ» к ткани вне сосуда, в
пораженную область. Через активированный эндотелий сосудов начинается селективный выход
нейтрофилов. Эта селективность обеспечивается
индуцированным связыванием селектинов эндотелиальных клеток с рецепторами интегринов и
хемокинов на лейкоцитах.
Достигая поврежденной области, нейтрофилы активируются либо при прямом контакте с
патогеном, либо под действием цитокинов, секретируемых тканевыми клетками. Нейтрофилы
стараются уничтожить инвазирующий агент, секретируя токсичные вещества, содержащиеся в
нейтрофильных гранулах, такие как ROS, RNS и
ферменты. Учитывая, что эти эффекторы не специфичны, происходит параллельное повреждение
и собственной ткани.
Успешный острый воспалительный ответ приводит к элиминации инвазирующего агента и
переходу к восстановительной фазе, опосредуе-
822
мой в основном тканевыми и мобилизованными
макрофагами.
Если острый воспалительный ответ не способен элиминировать проникший чужеродный
агент, процесс воспаления персистирует и приобретает новые характеристики. В очаг воспаления поступают макрофаги, а в случае инфекции –
T-клетки. Если сочетанного действия данных
клеток оказывается недостаточно, развивается
состояние хронического воспаления, включая
формирование гранулем и лимфоидной ткани.
Характеристики этого воспалительного состояния могут различаться в зависимости от типа мигрировавших Т-клеток. Кроме персистирующей
инфекции, хроническое воспаление может быть
обусловлено и другими причинами, вызывающими повреждение ткани, такими как аутоиммунный
ответ и т.д.
Можно сказать, что воспалительный «механизм» включают и направляют индукторы, сенсоры, медиаторы и эффекторы (ткани и клетки,
на функциональное состояние которых оказали
влияние медиаторы воспаления), где каждый из
компонентов определяет направление ответа (см.
рисунок и таблицу).
Группа компаний «БиоХимМак»
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Пути развития воспаления (инициируется и определяется индукторами, сенсорами, медиаторами и эффекторами)
РАМР
Факторы вирулентности
Микробные
Экзогенные
25
Аллергены
Раздражающие вещества
Инородные тела
Токсичные соединения
Немикробные
Индукторы
Клеточные
Сигналы, выходящие из клеток в
состоянии стресса, гибнущих клеток,
клеток с нарушенными функциями,
поврежденных клеток
Эндогенные кристаллы
Продукты деградации внеклеточного
матрикса
Тканевые
Эндогенные
Плазменные
Внеклеточного
матрикса
PAMP – патоген-ассоциированный молекулярный паттерн
Примеры некоторых компонентов воспаления и ответа, индуцируемого ими
Индуктор
Сенсор
Медиаторы
Эффекторы
Липополисахариды
TLR4
TNF-α, IL-6 и PGE2
Эндотелиальные клетки, гепатоциты,
лейкоциты, гипоталамус и др.
Аллергены
IgE
Вазоактивные амины
Эндотелиальные и гладкомышечные
клетки
Кристаллы солей мочевой кислоты или
NALP3
пирофосфата дигидрата кальция
IL-1β
Эндотелиальные клетки, гепатоциты,
лейкоциты, гипоталамус и др
Коллаген
Брадикинин
Эндотелиальные и гладкомышечные
клетки
Фактор XII
Индукторы воспаления. К эндогенным индукторам воспаления можно отнести вещества,
продуцируемые клетками в состоянии стресса,
поврежденными клетками или клетками с нарушенными функциями.
Например, при некрозе из гибнущей клетки в
межклеточное пространство выходит огромное
количество клеточных компонентов, включая ATP,
K+, мочевую кислоту, HMGB1 и Са-связывающие
белки семейства S100. Известно, что HMGB1 и
S100A12 взаимодействуют с рецептором RAGE,
активируя каскад реакций, приводящий к воспалительному ответу.
WWW.BIOCHEMMACK.RU
Повреждение сосудистого эндотелия позволяет белкам плазмы и тромбоцитам проникать во
внесосудистое пространство. Фактор XII – один из
ключевых белков системы свертывания крови –
активируется при контакте с коллагеном и другими
компонентами внеклеточного матрикса. Активированный фактор XII действует как сенсор и инициирует протеолитические каскады (калликреинкининовый, коагуляционный, фибринолитический
и каскад реакций комплемента), в результате чего
вырабатываются медиаторы воспаления. Тромбоциты также активируются при контакте с коллагеном, и продуцируют различные медиаторы
823
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
воспаления, включая тромбоксаны и серотонин.
Эти эндогенные индукторы участвуют в остром
воспалительном ответе. Кристаллы солей мочевой кислоты или кальция пирофосфата дигидрата,
конечные продукты гликозилирования (AGE) или
окисленные липопротеины (ЛВП, ЛНП) больше
характерны для состояния хронического воспаления. Так, образование кристаллов солей мочевой
кислоты или пирофосфата дигидрата кальция является причиной развития подагры или псевдоподагры. Их распознавание и фагоцитоз макрофагами приводят к активации NALP3 инфламмасомы,
что делает возможным продукцию субстратов каспазы-1, включая белки семейства IL-1.
AGE могут образовывать перекрестные сшивки, вызывая тем самым потерю биологических
функций содержащих их белков. Кроме того, AGE
распознаются специфическим рецептором (RAGE),
обладающим провоспалительной активностью, как
самостоятельно, так и в сочетании с Toll-подобными
рецепторами (TLR). AGE могут накапливаться при
гипергликемических и проокислительных состояниях, включая диабет 1 и 2 типа, старение и др.
ROS, продуцируемые фагоцитами, могут окислять липидную и белковую части липопротеинов
низкой и высокой плотности, тем самым придавая
им провоспалительные свойства.
При нарушении функции или повреждении
ткани образуются продукты деградации внеклеточного матрикса, например, низкомолекулярные фрагменты расщепления гиалуроновой
кислоты, обладающие провоспалительными
свойствами, активирующие TLR и способствующие репарации ткани. Многие эндогенные пути,
инициирующие воспалительный ответ, зависят
от присутствия ROS.
Медиаторы могут поступать из плазмы или секретироваться клетками. Некоторые медиаторы
(например, гистамин или серотонин) хранятся в
гранулах тучных клеток, базофилов и тромбоцитов; другие циркулируют в виде неактивных предшественников в плазме. Концентрация медиаторов в плазме может очень сильно повышаться при
острофазном ответе. Некоторые медиаторы продуцируются непосредственно в ответ на соответствующую стимуляцию индукторами воспаления.
Медиаторы воспаления. Медиаторы воспаления можно разделить на группы, согласно их биохи-
25
824
мическим свойствам: вазоактивные амины и пептиды, компоненты комплемента, липидные медиаторы,
цитокины, хемокины, протеолитические ферменты.
Липидные медиаторы (эйкозаноиды и факторы активации тромбоцитов) являются производными фосфолипидов, таких как фосфатидилхолин, присутствующих на внутренней части
клеточной мембраны. После активации ионами
Ca2+, под действием фермента фосфолипазы A2 из
фосфолипидов образуются арахидоновая и лизофосфатидиловая кислоты, являющиеся предшественниками двух классов липидных медиаторов.
Из арахидоновой кислоты под действием циклооксигеназ (COX1-3) образуются простагландины и
тромбоксаны, а действие липоксигеназ приводит
к образованию лейкотриенов и липоксинов.
Эйкозаноиды обладают чрезвычайно разносторонней физиологической активностью. Они
служат вторичными мессенджерами гидрофильных гормонов, контролируют сокращение гладкомышечных клеток (кровеносных сосудов, бронхов, матки), принимают участие в высвобождении
продуктов внутриклеточного синтеза (гормонов,
HCl, мукоидов), оказывают влияние на метаболизм костной ткани, периферическую нервную и
иммунную системы, передвижение и агрегацию
клеток (лейкоцитов и тромбоцитов), являются эффективными лигандами болевых рецепторов. Эйкозаноиды играют очень важную роль в развитии
острого и хронического воспаления. Они могут
служить маркерами воспалительного ответа, и их
определение может предоставлять полезную информацию в оценке воспалительного ответа при
различных заболеваниях, хирургическом вмешательстве, определении эффективности проводимой лекарственной терапии и т.д.
Другой класс липидных медиаторов, факторы
активации тромбоцитов, образуются при ацетилировании лизофосфатидиловой кислоты, и стимулируют различные процессы, происходящие
при воспалительном процессе: рекрутинг лейкоцитов, сужение и расширение кровеносных сосудов, повышение проницаемости сосудистой стенки и активацию тромбоцитов.
Провоспалительные цитокины ( TNF-α, IL-1, IL-6
и многие другие) продуцируются разными типами
клеток, включая макрофаги и тучные клетки. Они
вовлечены во все этапы воспалительного ответа,
Группа компаний «БиоХимМак»
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
особенно в активацию эндотелия и лейкоцитов,
индукцию острофазного ответа. Хемокины также
секретируются различными клетками под действием индукторов воспаления. Они контролируют экстравазацию лейкоцитов и хемотаксис этих
клеток к поврежденной ткани.
Многие протеолитические ферменты (такие
как эластаза, катепсины и матриксные металлопротеиназы) участвуют в деградации внеклеточного матрикса и белков базальной мембраны.
Они играют важную роль во многих биологических процессах, включая защиту организма, ремоделирование ткани и миграцию лейкоцитов.
Возможно, в общем случае воспалительный
ответ развивается всякий раз, когда выявляется
дисфункция ткани. Такие нарушения могут варьировать от легких тканеспецифичных нарушений
до обширных повреждений. Соответственно, и
характеристики воспалительного ответа могут
значительно различаться. Природа и степень тканевой дисфункции будут влиять на то, сможет ли
воспалительный ответ быть выявлен с помощью
биомаркеров и какие из них будут наиболее информативны.
Негистоновый ядерный белок HMGB1
(амфотерин)
HMGB1 является поздним медиатором в процессе воспаления, т.к. он появляется во внеклеточном пространстве через 8-12 ч после инициации
макрофагального ответа на провоспалительные
стимулы и участвует в патогенезе системного воспаления.•
TREM-1
Белок TREM-1 индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов. Показано, что его
экспрессия у пациентов с острым панкреатитом
(ОП) повышается и коррелирует с тяжестью заболевания. Уровень экспрессии TREM-1 достоверно
различается у пациентов с различными формами ОП (легкой – ЛОП и тяжелой – ТОП), а также с
контрольной группой здоровых людей. При этом
самый высокий уровень наблюдается у больных
с ТОП, у больных с ЛОП он достоверно ниже, а в
группе здоровых людей – минимальный.••
Экспрессия TREM-1 повышена в синовиальной
жидкости у пациентов с ревматоидным артритом.
У беременных женщин концентрация TREM-1 в
амниотической жидкости (АЖ) достоверно повышалась при спонтанных преждевременных родах
и достигала максимума при сопутствующей внутриутробной инфекции (см. рисунок). Оказалось,
что экспрессия TREM-1 индуцируется в амниохорионе под действием LPS и при преждевременных родах. Более высокий уровень TREM-1 при
преждевременных родах в случае микробного заражения свидетельствует о его важном значении
в диагностике преждевременных родов, ассоциированных с инфекцией.
25
• cм. главу
«Сепсис»
стр. 739
•• Подробную
информацию о
маркере TREM-1
можно найти в
главе «Сепсис»
I тома каталога
Концентрация TREM-1 в амниотической жидкости в зависимости от срока родов (А) или наличия микробного заражения (В)
55.00
A
60.00
p < .001
50.00
B
p = .008
50.00
45.00
40.00
40.00
пг/мл
пг/мл
35.00
30.00
25.00
20.00
30.00
20.00
15.00
10.00
10.00
5.00
0
0
РТВ
n=98
срочные роды
n=99
без MIAC
n=73
MIAC
n=25
MIAC – микробное заражение АЖ, PTB – преждевременные роды
WWW.BIOCHEMMACK.RU
825
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Кривые выживаемости Каплана-Мейера (безрецидивной и общей) больных с НМРЛ в зависимости от уровня TREM-1
(высокого/низкого)
25
B
1.0
0.8
низкий уровень
TREM-1
n = 34
0.6
0.4
высокий уровень
TREM-1
n = 34
0.2
Общая выживаемость
Безрецидивная выживаемость
A
1.0
низкий уровень
TREM-1
n = 34
0.8
0.6
высокий уровень
TREM-1
n = 34
0.4
0.2
P=0.011
P=0.002
0.0
0.0
0
10
20
30
40
50
0
10
Месяцы
20
30
40
50
Месяцы
Показано, что уровень TREM-1 в плевральном выпоте у больных с немелкоклеточным раком легких (НМРЛ) коррелирует с периодами безрецидивной и общей выживаемости (см. рисунок).
ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ЗАКАЗА
Кат.№
Производитель
Наименование
AD-17000
Callegari
Form Plus 3000 Анализатор для оценки окислительного стресса, антиокислительной способности, уровня мочевой кислоты, гемоглобина и гематокрита
в цельной крови
AD-16014
Callegari
Form OX Анализатор для мониторинга свободных радикалов
AD-12051
Callegari
Мини центрифуга для анализаторов Form Plus 3000 и Form OX
AD-12101
Callegari
Набор реагентов для определения гемоглобина в цельной крови для анали-
AD-12102
Callegari
Набор реагентов для определения гематокрита в цельной крови для анали-
AD-12007
Callegari
Набор реагентов для определения мочевой кислоты, включая фермент, в
затора Form Plus 3000, 10 тестов
затора Form Plus 3000, 10 тестов
цельной крови для анализатора Form Plus 3000, 10 тестов
AD-12107-A
Callegari
Набор реагентов для определения окислительного стресса в цельной крови
AD-12136
Callegari
Набор реагентов для определения антиоксидантной способности в цельной
для анализатора Form Plus 3000, 30 тестов
крови для анализатора Form Plus 3000, 10 тестов
826
RE59321
IBL
EK-MRP8/14
Buhlmann
Неоптерин, 96
Кальпротектин (S100A8/A9), 96
B-MRP8/14
Buhlmann
Контроли к Кальпротектину для мочи, 2 флакона
KHA0012
BCM Diagnostics
Белок амилоида А, сывороточный (SAA), 192
K 6750
Immundiagnostik
a1-антитрипсин (определение в сыворотке, кале), 96
K 6610
Immundiagnostik
Альфа-2-макроглобулин (α2-МГ) в моче и сыворотке/плазме, 96
7033
Biomerica
С-реактивный белок, hs, (0,1 мг/л) 96
BMS288
Bender Medsystems
C-реактивный белок (3 нг/л), 96
HK501
HBT
Нитротирозин, 192
EK-CIC
Buhlmann
Циркулирующие иммунные комплексы C1q, 96
CG59221
IBL
Циркулирующие иммунные комплексы C3d, 96
Группа компаний «БиоХимМак»
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Кат.№
Производитель
Наименование
DKO017
BCM Diagnostics
Циркулирующие иммунные комплексы C3d, 96
KGE001
BCM Diagnostics
Окись азота (NО), 192 (детекция - 540 нм)
K 6331
Immundiagnostik
Tранстиретин (Преальбумин), 96
HK315
HBT
LPS-связывающий белок (LBP), 192
HK324
HBT
Миелопероксидаза, 192
BMS2038
BCM Diagnostics
Миелопероксидаза, 96
191-1022
BCM Diagnostics
Липокалин 2/NGAL, 96
HK330
BCM Diagnostics
NGAL, 192
473-6600
BCM Diagnostics
L-цитруллин, 96
RE54051
IBL
Гепсидин прогормон, 96
BMS269
Bender Medsystems
Эластаза полиморфонуклеарных гранулоцитов (PMN-Elastase), 96
KAC2231
BCM Diagnostics
Эотаксин, 96
DCC240
BCM Diagnostics
Эотаксин-2, 96
442-5007
Biomedica
Oxystat (количественное определение перекиси), 96
K 7811w
Immundiagnostik
Продукты окисления белков (AOPP),96
705003
BCM Diagnostics
Гидроперикиси липидов (LPO), 96
488-8000
BCM Diagnostics
Гем-оксигеназа, 96 (в лизате клеток)
BMS222
Bender Medsystems
Супероксиддисмутаза (Cu/ZnSOD), 96
RSCN213300R BCM Diagnostics
Акролеин, 96
EKS-350
BCM Diagnostics
DNA Damage (определение 8-ОН-2-дезоксигуанозина), 96
K 1800
Immundiagnostik
Тиоловый статус, 96
RLF-EK011
BCM Diagnostics
Глутатион пероксидаза 1, 96
ST51011
IBL
Негистоновый ядерный белок HMGB1, 96
KC 5100
Immundiagnostik
PerOx, 96
KC 5200
Immundiagnostik
Общий антиоксидантный статус, 96
RLF-EK0131R
BioVendor
Пероксиредоксин (Prx), 96
709001
BCM Diagnostics
Определение антиоксидантов, 96
K7822
Immundiagnostik
Карбонилированные белки, 96
RLF-EK0125R
BioVendor
Тиоредоксин 1, 96
K 7960
Immundiagnostik
Глутатион-S-трансфераза , 96
DTRM10
BCM Diagnostics
Триггерный рецептор миелоидных клеток (TREM-1), 96
10010621
BCM Diagnostics
γ-CEHC (2,7,8-триметил-2-(β-карбоксиэтил)-6-гидроксихроман), 96
LF-EK0122
BCM Diagnostics
Тиоредоксин редуктаза 1, 96
RSCN213100R BioVendor
DNA Damage (определение 8-ОН-2-дезоксигуанозина в моче), 96
LF-EK0101
BCM Diagnostics
Супероксиддисмутаза 1 (SOD1), 96
LF-EK0104
BCM Diagnostics
Супероксиддисмутаза 2 (SOD2), 96
LF-EK0107
BCM Diagnostics
Супероксиддисмутаза 3 (SOD3), 96
706002
BCM Diagnostics
Активность супероксиддисмутазы, 96
516351
BCM Diagnostics
8-изопростан ( в плазме), 96
WWW.BIOCHEMMACK.RU
25
827