Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный
реклама
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра молекулярной фармакологии и радиобиологии медикобиологического факультета имени академика П.В.Сергеева ________________________________ МАЛКИН ПЕТР АЛЕКСАНДРОВИЧ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ СТРУКТУР НАНОРАЗМЕРОВ 14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Шимановский Николай Львович Москва - 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ Раздел I. ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………….. 5 Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 2.1. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов: механизмы преобразования гормонального сигнала в биологический ответ клетокмишеней……………………………..…………………………………………10 Глава 2.2. Методы модификации лекарственных средств на наноуровне …………………………………………………………………. . . . . . . . . . . ..20 Глава 2.3. Эволюция топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии ……………………………………………………………… . 34 Раздел III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………… 42 Раздел IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Глава 4.1. Идентификация и изучение свойств специфических «систем узнавания», локализованных на плазматических мембранах фибробластов кожи …………………………………….…………………………………….57 Глава 4.2. Определение молекулярных мишеней апоптотического действия глюкокортикоидов на фибробласты кожи ………………………….62 Глава 4.3. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса для изучения механизмов регуляции функциональной активности фибробластов кожи . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 Раздел V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. . . . . . . . . . . . . 77 ВЫВОДЫ……………………………………………………………… . . …91 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………... . . 92 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5'-Н - 5'-нуклеотидаза 11-ДОК – 11-дезоксикортикостерон АДФ – аденозиндифосфат АКТГ – адренокортикотропный гормон АМФ - аденозин 5'-монофосфат АТ - антитела АТФ - аденозин 5'-трифосфат АЦ аденилатциклаза АЦС - аденилатциклазная система БАВ - биологически активные вещества БГП – t-бутилгидропероксид ГДФ - гуанозин 5'-дифосфат ГК – глюкокортикоиды ГКР - глюкокортикоидный рецептор ГМФ – гуанозинмонофосфат ГРК - гормон-рецепторный комплекс ГТФ - гуанозин 5'-трифосфат ГЦ – гуанилатциклаза ДАГ – диацилглицерин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИЛ интерлейкин ИМФ - инозинмонофосфат ИФ3 - 1,4,5-инозитолтрифосфат Кд равновесная константа диссоциации КМ – кальмодулин ЛС - лекарственное средство мРНК - матричная РНК НР-ГК - наноразмерный кортизол-полимерный комплекс ПВП - поливинилпирролидон ПГ простагландин ПК – протеинкиназа ПМ - плазматическая мембрана ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза ПФЗ – потенциалчувствительные флуоресцентные зонды ПЭГК - полиэтиленгликоль РНК - рибонуклеиновая кислота СКК - стволовая кроветворная клетка СТГ – соматотропный гормон Т3 трийодтиронин ТМП – трансмембранный потенциал ТФП – трифлуоперазин ТХУ - трихлоруксусная кислота ФИА - фенилизопропиладенозин 4 ФИФ2 – фосфатидилинозитолдифосфат ФД – фармакодинамика ФК – фармакокинетика фемтолитры (10-15 литра) фл – Фл – фосфолипиды Фл А2 – фосфолипаза А2 Фл С – фосфолипаза С ФМА – форболмеристатацетат Фн неорганический фосфат ФНО – фактор некроза опухоли альфа цАМФ - аденозин 3',5'-циклический монофосфат цГМФ – гуанозин-3,5-циклический монофосфат м – митохондриальный трансмембранный потенциал п – плазматический трансмембранный потенциал 2+ [Ca ]цит – внутриклеточная концентрация ионов кальция Bmax концентрация участков связывания лиганда DMPX - диметилпропаргилксантин Gi ингибирующий ГТФ-связывающий белок Gs стимулирующий ГТФ-связывающий белок Gt трансдуцин G-белки - ГТФ-связывающие белки TNF- - фактор некроза опухоли-гамма Vкл – объем клетки ___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ 5 Раздел I. ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования В настоящее время топические стероиды активно применяются при лечении различных воспалительных и аллергических заболеваний кожи - атопического, контактного аллергического дерматитов, псориаза и других дерматозов. Использование гидрокортизона, первого препаратa в данной группе, в дерматологической практике выявило недостаточную его эффективность при тяжелых и хронических процессах [Шимановский Н.Л., 2005; Gessi S. еt al., 2010]. Поиск препаратов, имеющих более выраженный противовоспалительный эффект привел к созданию галогенизированных стероидов, вызывающих выраженные системные и местные побочные эффекты (синдром Кушинга, снижение иммунитета и скорости заживления, психозоподобные реакции и т.д.). Ранее считали, что противовоспалительный, противоаллергический, десенсибилизирующий, антитоксический и иммунодепрессивный эффекты стероидов реализуются через один рецептор и поэтому неотделимы друг от друга [Cidlowski JA. et al., 1998]. Однако использование современных инновационных технологий открывает новые возможности в этом направлении, в частности применение нанотехнологий для разделения фармакологических эффектов глюкокортикоидных препаратов [Labeur M. et al., 2010]. Заданное изменение свойств лекарственных веществ с помощью нанотехнологического подхода включает два основных способа [Шимановский Н.Л. и др., 2010]. Первый подход - синтез лекарственных соединений, имеющих наноразмеры на основе полимерной модификации лекарственных веществ (конъюгация молекулы лекарственного вещества и полимера) [Wang, Y.S., 2002]. Второй - включение лекарственного вещества в состав наноматериалов представленных мицеллами, дендромерами, сферами (фуллерены) [Boas U. et al., 2004]. Так, конъюгация лекарственного вещества с полиэтиленгликолем или пэгилирование (ПЭГК) увеличивает растворимость лекарственного вещества за счет собственной гидрофильности, увеличивает ___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ 6 размер и массу частицы, снижая, таким образом, интенсивность почечной экскреции. ПЭГК уменьшает доступность лекарственного вещества для протеолитических ферментов и антител. Примеры препаратов такого рода, одобренных FDА: ПЭГ-аспарагиназа (Oncaspar®), предназначенная для лечения острой лимфоцитарного лейкоза и других лимфоидных опухолевых заболеваний; ПЭГ-аденозина деаминаза (Adagen®), для лечения тяжелых комбинированных иммунодефицитов. В настоящее время ведутся разработки по модификации различных лекарственных веществ с помощью дендримеров. Наиболее интенсивно разрабатываются модификации следующих классов лекарственных веществ: НПВС, противомикробные и противовирусные препараты, противоопухолевые средства (цитостатики, радионуклиды, фоточувствительные соединения), что объяснимо не только особенностями их физико-химических свойств, но и эпидемиологической значимостью соответствующих патологий. Одной из новых возможностей, связанной с получением синтетических структур глюкокортикоидов наноразмеров (наностероидов), является изучение молекулярных механизмов ранних, мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени. За последние годы появились серии публикаций, описывающих быстрые экстрагеномные мембранотропные эффекты стероидов [Stahn C. et al., 2008; Löwenberg M. et al., 2008; Revollo JR, Cidlowski JA, 2009]. К ним можно отнести инотропное и вазоконстрикторное действие альдостерона, быстрые нейрональные эффекты прогестерона, ранние эффекты витамина Д3 на уровень кальция и цАМФ в клетках костной ткани. Получены также сведения об участии мембранных рецепторов эстрогенов и гестагенов в регуляции активности аденилатциклазы, протеинкиназы мембранносвязанных ферментов С, 5'-нуклеотидазы в норме и при опухолевом росте [Dindia L. et al., 2012]. Ранее было показано, что повысить тропность стероидных модифицировать их гормонов генотропную к плазматическим активность можно мембранам с и помощью ___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ комплексирования с полимерными поливинилпирролидоном [Духанин 7 материалами, А.С. и др., в частности 2003]. с Комплекс поливинилпирролидон– глюкокортикоид, не проникая в клетку, способен через мембранные структуры усиливать эффекты (пермиссивное адреномиметиков (изадрина), и свободного глюкокортикоида действие) на модели тимоцитов крыс – повышать уровень цАМФ и цитостатическую активность глюкокортикоидов. Создание комплексов, не проникающих в клетку, но потенцирующих, например, эффекты адреномиметиков и антиаллергических средств может позволить создать новые антиаллергические, противовоспалительные средства с избирательным типом действия. Цель исследования Целью данной работы было определение фармако-биохимических особенностей действия на фибробласты мономерных глюкортикоидов и наноразмерного кортизол-полимерного комплекса. В качестве объекта исследования были выбраны фибробласты кожи – клеткимишени фармакологического действия глюкокортикоидов, участвующие в воспалительных и аллергических реакциях при дерматозах. Задачи исследования 1) Разработка экспериментальной модели для изучения геномных и негеномных эффектов глюкокортикоидов с использованием культуры клеток фибробластов. 2) Определение фармако-биохимических маркеров начальных этапов апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами. 3) Сравнительное исследование глюкокортикоидов на геномного фибробласты с и негеномного помощью действия наноразмерного кортизол-полимерного комплекса. 4) Изучение молекулярных механизмов влияния наноразмерного кортизолполимерного комплекса на обмен вторичных мессенджеров в культуре фибробластов кожи . ___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ 8 Научная новизна Впервые показано, что ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением pH цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов. Впервые показано, что величина внутриклеточного рН может служить ранним дифференциальным маркером апоптотической и некротической форм гибели фибробластов. Впервые установлено, что в терапевтической области концентраций кортизол подавляет кальциевый ответ фибробластов на ангиотензин II (АII). В физиологическом диапазоне концентраций кортизол потенцирует действие АII, его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов. Практическая значимость Предложен новый подход для изучения молекулярных механизмов ранних, мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени, основанный на использовании наноразмерных глюкокортикоидов. Применение наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет избирательно регулировать функциональную активность фибробластов на уровне мембранной рецепторной системы, что открывает новые предпосылки дальнейшей дерматологии, эволюции с топических помощью глюкокортикоидов, наноразмерного дизайна применяемых в оригинальных молекулярных комплексов - разделение терапевтического и побочных эффектов гормонотерапии. Положения выносимые на защиту ___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ 1. Ранние этапы апоптоза 9 фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением pH цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов. 2. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет разделить геномные и негеномные механизмы регуляции активности клеткимишени. 3. Выявлены два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект AII, реализуемое через минералкортикоидные мембранотропный рецепторы; 2) антагонистический глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов. Внедрение результатов исследования Результаты настоящего исследования используются в учебной работе кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.Сепгеева РНИМУ им. Н.И.Пирогова г.Москвы. Апробация Основные положения диссертации доложены на 7-ой международной научнопрактической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», май 2010 г., Астрахань; на совместной научной конференции кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии и НИЛ молекулярной фармакологии РНИМУ им Н.И.Пирогова. Публикации По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. 10 _________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ___________________ Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 2.1. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов: механизмы преобразования гормонального сигнала в биологический ответ клетокмишеней. Согласно классической «двухступенчатой» модели, рецепторный цикл состоит из нескольких этапов (рис. 1). Проникновение стероидов в клетку и связывание с внутриклеточными (цитозольными или ядерными) рецепторами ГК, представляющими минорную фракцию протеинов (10-12 от общего количества клеточного белка) [Vig E et al., 1994]. Трансформация гормон-рецепторного комплекса в активную форму. Активация, возможно, осуществляется за счет фосфорилирования in vivo рецепторного белка с использованием АТФ в качестве субстрата [Tang Y, DeFranco DB, 1996]. Взаимодействие комплекса "гормон-рецептор" с акцепторными сайтами в хроматине. После связывания освободившийся рецептор покидает ядро и возвращается в цитоплазму клетки [Голиков П.П., 1988, 2002]. Таким образом, биологическая роль рецепторов цитоплазмы сводится к захвату, первичной аккумуляции и доставке гормона в ядро. Биохимические свойства внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов. Рецепторы глюкокортикоидов (РГ) были первыми рецепторами стероидных гормонов, обнаруженными в различных тканях [Beato M., 1989]; предполагают, что они имеются в подавляющем большинстве органов и тканей [Розен В.Б., 1985, 1990]. Доказано наличие специфических рецепторов к ГК в коже, легочной ткани, печени и других органах. Внутриклеточные рецепторы глюкокортикоидных гормонов представляют собой ядерные факторы транскрипции, которые относятся к суперсемейству рецепторов стероидных гормонов/тиреоидных гормонов/ретиноидов/витамина Д3. Они состоят из одной полипептидной цепи (рис. 2), содержащей около 700 аминокислотных остатков, в их третичной 11 _________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ___________________ Рис. 1. Классическая «двухступенчатая» модель действия глюкокортикоидов, опосредованная внутриклеточными рецепторами [Rang H.P., Dale M.M., Ritter J.M., 2005]. структуре выделяют домены, которые связывают глюкокортикоидную молекулу, ДНК, участки, ответственные за регуляцию транскрипции и димеризацию рецепторов (табл.1). Точечные мутации в центральной области 4 домена приводят либо к полной, либо к значительной потере способности рецептора связывать гормон [Sato A et al., 1996]. В отсутствие гормона рецепторы представляют собой неактивные гетеротетрамерные комплексы, содержащие белки теплового шока (hsp90 и hsp70) и иммунофилины (рис. 3). _________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ___________________ 12 Рис. 2. Структурно-функциональная карта рецептора глюкокортикоидов [Miesfeld,Bloom,1996]. Рис. 3. Схема взаимодействия глюкокортикоид-рецепторного комплекса с гормончувствительными элементами генома клеток-мишеней [Weigel NL, Zhang Y., 1998]. Табл.1. Домены внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидных гормонов и их функции [Rang et al., 2005]. Название домена I II III Регуляторный ДНК“Петлевой” домен связывающий домен домен Свойства Активация Узнавание и Определение домена транскрипции связывание с гормон- локализации в ядре Белок-белковые чувстви-тельным эле- клетки, димеризавзаимодействия. ментом ДНК. Димери- ция. зация IV Стероид-связываюший домен Связывание лиганда. Активация транскрипции. Связывание белков теплового шока и иммунофилинов. Определение локализации в ядре. Димериация 13 ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ Одна из функций белков теплового шока заключается в способствовании перехода гормонсвязывающего домена рецептора в конформацию, характеризующуюся высоким сродством к стероиду. Другим важным свойством комплексообразование рецепторов ГК с белками теплового шока является предотвращение гидролиза рецепторной молекулы специфическими протеазами [Сергеев и соавт., 1998]. В интактных клетках в отсутствии лиганда указанные гетерокомлексы 9S глюкокортикоидных рецепторов связаны с микротубулярным аппаратом (колхицин - вещество, разрушающее микротрубочки, ингибирует ряд геномных эффектов глюкокортикоидов). Иммунофиллины, взаимодействующие с гетерокомплексами рецепторов стероидных гормонов всех типов, имеют молекулярную массу около 59 кДа и принимают участие в разворачивании молекулы рецептора. Число генов в клетке, экспрессия которых напрямую регулируется ГК, варьирует между 10 и 100, но транскрипция многих других генов опосредованно регулируется РГ путѐм их взаимодействия с другими факторами транскрипции. После активации рецепторы ГК образуют димер, который связывается соответствующим гормончувствительным элементом (ГЧЭ) ДНК, находящимся в 5'-промоторной зоне стероидо-чувствительных генов. Это взаимодействие изменяет порядок транскрипции, вызывая индукцию или репрессию данного гена [Beato, 1989]. ГЧЭ стимулирующего типа - это последовательность нуклеотидов, включающая 15 пар оснований ГГТАЦАnnnТГТТЦТ (где n - любой нуклеотид). Репрессию транскрипции осуществляют негативные ГЧУ (нГЧЭ), которые имеют более изменчивую последовательность расположения нуклеотидов (АТЦАЦnnТnТГАТЦn). К генам, экспрессия которых негативно регулируется ГК относятся гены цитокинов и их рецепторов, гены коллагеназы и стромелизина – т.е. БАВ, принимающих участие в воспалении и иммунных реакциях. 14 Помимо этих простых ГЧЭ существуют комбинированные ГЧЭ, которые ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ имея другую последовательность нуклеотидов, являются акцепторами действия других ядерных факторов транскрипции, в частности фактора транскрипции АР-1, состоящего из продуктов онкогенов Fos и Jun [Rang et al., 2005]. АР-1 образует белок-белковый комплекс с активным рецептором ГК, предотвращая его взаимодействие с ДНК и соответственно снижая ответ на действие стероидов. Ряд исследователей придерживаются мнения о гетерогенности внутриклеточных рецепторов ГК, основанное на различиях параметров связывания меченых лигандов. Так, на периферических лимфоцитах имеются рецепторы с Kd1 - 0,0880,025 нМ и Kd2 - 4,20,6 нМ, причем В-лимфоциты имеют рецепторы с Kd1 в 3 раза больше, чем Т-лимфоциты. Митогенная и антигенная стимуляция приводит к увеличению в несколько раз рецепторов с Kd1 [Reichardt HM et al., 1998]. Некоторые авторы считают, что не существует подтипов рецепторов ГК [Shahidi H et al., 1999], хотя одна изоформа рецептора (ГР), не связывающая гормон и являющаяся транскрипционно неактивной, была описана [Lu NZ, Cidlowski JA, 2006]. ГР был обнаружен в человеческих тканях, но функциональная его значимость неясна. Участие системы вторичных мессенджеров в механизме действия глюкокортикоидов. Данные последних лет значительно расширили представления о молекулярных механизмах действия ГК на клеточные функции [Nordeen S.K. et al., 1994]. Допускается возможность реализации отдельных ранних эффектов ГК через посредство сравнительно вторичных мессенджеров – внутриклеточной небольших молекул и ионов, системы с помощью которой осуществляется передача и реализация внеклеточного сигнала в клеткемишени. В настоящее время выделяют следующие вторичные мессенджеры: цАМФ, продукты гидролиза фосфотидилинозитола, ионы кальция, цГМФ. 15 цАМФ. За счет изменения уровня этого мессенджера происходит ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ регулирование фосфорилирования белков клетки. Синтез цАМФ из АТФ катализирует аденилатциклаза цитоплазматических мембран, (АЦ) - интегральный белок активный центр которого расположен на внутренней стороне мембраны. Мембранный рецептор и фермент сопрягаются через ГТФ-связывающий белок (G-белок). Для перехода АЦ в активное состояние необходимо взаимодействие ее каталитической субьединицы с Gбелком. Субстратом для аденилатциклазы является Mg-АТФ или Mn-АТФ, свободный АТФ является ее конкурентным ингибитором. Образовавшийся цАМФ через фосфорилирование цАМФзависимую любого белкового протеинкиназу субстрата. осуществляет Гидролиз цАМФ осуществляется фосфодиэстеразами, которые делятся на два типа, в зависимости от сродства к цАМФ. цАМФ может регулировать освобождение кальция из митохондриальной фракции и/или участвовать в освобождении кальмодулина из мембранных структур за счет фосфорилирования мембранных белков. Возможное участие цАМФ в проведении гормонального сигнала ГК основывается на том, что активация внутриклеточных гормон-рецепторных комплексов, предваряющая их транслокацию в ядро, является цАМФ зависимым процессом [Perez-Martinez L. et al., 1998]. Поэтому колебание концентрации цАМФ может приводить к изменению внутриклеточной рецепции ГК. В этом случае мембранные рецепторы, передающие внешний сигнал на аденилатциклазу, выполняют модулирующую роль: они подготавливают клетку к "восприятию" гормонального сигнала [Christ M. et al., 1999]. Стероидные гормоны потенцируют опосредованное активаторами аденилатциклазы повышение уровня цАМФ в лимфоцитах [Hirano T. et al., 1998; Shahidi H. et al., 1999; Dosiou C. et al., 2008]. Этот механизм реализации гормонального влияния не чувствителен к действию актиномицина D и 16 В ряде работ указывается на снижение активности ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ циклогексимида. фосфодиэстеразы цАМФ в присутствии стероидов [Buttgereit F, Scheffold A., 2002]. Однако, как правило, рассматриваемые эффекты проявляются при концентрации гормонов в среде 1 - 10 мкмоль/л. Поэтому, мало вероятно, что в физиологических условиях увеличение содержания цАМФ при действии ГК связано с их ингибирующим влиянием на активность фосфодиэстеразы цАМФ. Возможно, влияние стероидов на аденилатциклазную систему реализуется на уровне цАМФ-зависимых протеинкиназ, функция которых регулируется цАМФ и стероидами [Gekle M. et al., 2014]. Полифосфоинозитидная система. Стимуляция данной системы запускает два каскада реакций, приводящих к увеличению концентрации внутриклеточного кальция и активации протеинкиназы С (посредством ее осуществляется [Berridge, 1993]. плазматической дальнейшее фосфорилирование мембранных белков) Фактически все клетки млекопитающихся содержат в мембране малые количества фосфоинозитида (PI), фосфоинозитидфосфата (РIP) и фосфоинозитиддифосфата (PIP 2) [Gordeladze et al., 1994]. Их присутствие поддерживаются в равновесии двумя "холостыми циклами", катализируемыми киназами и фосфолеоноэстеразами. Внешний сигнал от различных веществ, в том числе и гормонов, после взаимодействия с мембранными рецепторами через G-белок активирует фосфолипазу С, которая гидролизует PIP2 с образованием диацилглицерола и IP3. Инозитолтрифосфат осуществляет освобождение Са из внутриклеточных депо (митохондрии, везикулы ЭПР). Диацилглицерол через протеинкиназу С модулирует потенциало- и рецепторозависимые кальциевые каналы [Авдонин, Ткачук, 1996]. Показано, что стероидные гормоны по-разному влияют на активность фосфолипазы С и, следовательно, на гидролиз РIP 2. Эстрогены, в частности эстрадиол, витамин Д3 вызывают усиление гидролиза PIP2 [Pedram A, Razandi M, Levin ER., 2006; Toran-Allerand CD, Singh M, Setalo GJr, 1999]; ГК (дексаметазон, гидрокортизол) блокируют атиген-индуцированный распад PIP2 17 в базофилах и лимфоцитах, оказывая тем самым антипролиферативное ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ действие [McEwen, 1991; Solito E. et al, 2003]. Ионы кальция. Кальций является одним из универсальных посредников в реализации внешнего сигнала, причем он филогенетически более древний, чем гормоны и циклические нуклеотиды. Установлено, что увеличение цитоплазматической концентрации ионов кальция (Са 2+) является событием, необходимым для активации ряда физиологических процессов внутри клетки [Ткачук, 1983]. В покоящейся клетке концентрация свободного Са 2+ поддерживается на довольно низком уровне, в лимфоцитах человека она составляет в среднем 100 нМ, концентрация же Са 2+ в межклеточной среде на 4 порядка выше. Такое низкое содержание кальция, по-видимому, необходимо клетке для реализации различного вида сигналов, когда его концентрация возрастает почти трехкратно [Орлов, Лабас, 1989]. Источники повышения концентрации Са2+ цитоплазмы могут находится во внутриклеточных органеллах и в самой цитоплазме внешней среде, клетки. Са2+ , присутствующий в цитоплазме, связан с фосфолипидами и белками, однако его количество незначительно. В выбросе кальция из внутриклеточных депо возможно участие кальциевых каналов, во многом напоминающих таковые на плазматической мембране, однако механизм их действия до сих пор недостаточно изучен. Вход внеклеточного кальция осуществляется за счет небольшого постоянного неспецифического тока, основанного на разности концентраций внутри и вне клетки. Благодаря этому возникает направленный внутрь клетки электрохимический градиент кальция. Поток ионов имеет низкий температурный коэффициент и не чувствителен к метаболическим ингибиторам, что говорит о его независимости от источников энергии. Для входа кальция в клетку существуют также специфические потенциало- и рецепторо-зависимые каналы. Выход иона осуществляется за счет работы СаАТФазы, участвующей концентрации, т.е. в активном транспорте иона против градиента это - энергозависимый процесс. Са-АТФазные насосы 18 поддерживают постоянное низкое содержание кальция, что обеспечивает ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ быстрое прекращение ответа на биологический стимул и предупреждает повреждающее действие внутриклеточного кальция при его избытке. Таким образом, основным механизмом входа Са2+ в клетку является, по-видимому, облегченная диффузия, а выход осуществляется путем активного транспорта. На роль ионов кальция в реализации гормонального влияния ГК указывают данные о том, что в случае отсутствия в среде Са 2+ катаболическое действие ГК на лимфоидную ткань (ингибирование синтеза РНК и белка) не проявляется. В тоже время показано, что ГК подавляют транспорт Са 2+ внутрь клеток-мишеней и уменьшают внутриклеточное содержание кальция пропорционально биологической активности стероидов и их действующей концентрации [Doolan C.M., O'Sullivan G.C., Harvey B.J., 1998]. Описанные эффекты могут объясняться способностью стимулировать обмен фосфоинозитидов вызывает стероидных плазматической гормонов мембраны, что мобилизацию кальция из внутриклеточных депо и внеклеточной жидкости. Подтверждением этого предположения служат исследования, в которых показано, что стероидные гормоны изменяют обмен мембранных фосфолипидов [Сергеев П.В. и соавт., 1996, Baran D.T. et al., 2004]. Эти и целый ряд других данных последних лет подтверждают целесообразность рассмотрения действия ГК на систему вторичных медиаторов в качестве возможного пути реализации биологической активности стероидов в клеткахмишенях. Экстрагеномные эффектыглюкокортикоидов. В последние годы установлено, что гормонрецепторные комплексы (в виде мономера) непосредственно и через молекулы СBP взаимодействуют с факторами транскрипции (активирующий протеин 1 (AP1), NF-kB и др.), которые активируются под влиянием медиаторов воспаления, оксидантов и вирусов [Zeng J et al., 2013]. Итогом этого является торможение транскрипции "воспалительных" генов (трансрепрессия) (схема 1). Последнее, в свою очередь, уменьшает образование 19 в клетках следующих белков и пептидов [Шимановский Н.Л., 2005; Schacke H ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ et al., 2004]: - провоспалительных цитокинов (интерлейкинов 1—6, 9, 11—13, 16—18, фактора некроза опухоли α, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулиующего фактора); - хемокинов (интерлейкина хемотаксического белка_4, 8, эотаксина, воспалительного RANTES, моноцитарного белка макрофагов-1α), привлекающих клетки в зону воспаления; - индуцибельной циклооксигеназы (ЦО-2), участвующей в образовании простагландинов; - индуцибельной фосфолипазы А2, катализирующей синтез арахидоновой кислоты; - молекул адгезии (ICAM-1, VCAM-1) лейкоцитов; - рецепторов субстанции P (NK1-рецепторов). Схема 1. Эффекты глюкокортикоидов, опосредованные цитозольными рецепторами. Сравнительно недавно было показано, что одним из молекулярных механизмов подавления стероидами экспрессии ― воспалительных‖ генов является 20 деацетилирование гистонов хромосом, приводящее к уплотнению структуры ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ хроматина и ограничению доступа к ДНК факторов транскрипции [Tang Y, DeFranco DB., 1996; Reichardt HM et al., 1998] Также помимо непосредственного влияния на процесс транскрипции генов, топические глюкокортикоиды, по-видимому, могут оказывать влияние на стабильность матричной РНК, уменьшая ее стабильность на посттранскрипционном уровне, и на продукцию воспалительных белков в рибосомах в процессе трансляции. Экспериментально подтверждено, что это является одним из механизмов снижения синтеза ИЛ-1,6, циклоксигеназы, гранулоцитально-макрофагального колониестимулирующего фактора, фактора некроза опухоли [Tryc AB et al., 2006]. Описанный выше механизм действия глюкокортикоидов лежит в основе их действия на различные клетки (табл.2). Таблица 2. Влияние глюкокортикоидов на клетки, принимающие участие в развитии воспалительных заболеваний кожи. Смешанный механизм действия глюкокортикоидов подразумевает вовлечение генома клетки и экстраядерных путей реализации эффектов глюкокортикоидов. По-видимому, в условиях in vivo практически все эффекты глюкокортикоидов являются смешанными, посколку разделение на геномный и внегеномный эффекты возможно лишь в экспериментальных условиях с использованием фармакологических агентов. ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ 21 Глава 2.2. Методы модификации лекарственных средств на наноуровне. Нанофармакология располагает рядом методов модификации лекарственных средств на наномолекулярном уровне (условно говоря, в диапазоне 1-100нм) с целью придания им некоторых необходимых исследователю свойств. ПЭГ-конъюгация. Рис. 4. Основные достоинства ПЭГ [Abuchowski, A et al., 1997]. ПЭГ-конъюгация (ПЭГК), или пэгилирование, впервые была описана в семидесятых Davies и Abbuchowsky на примере каталазы и альбумина. В настоящее время это метод интенсивно развивается и располагает множеством заслуживающих внимания вариаций. Мы рассмотрим основные. Что дает ПЭГК? Рассмотрим этот вопрос на примере белка. 1. ПЭГК увеличивает растворимость за счет собственной гидрофильности. 2.ПЭГК увеличивает размер и массу частицы, снижая таким образом интенсивность почечной экскреции. 3. ПЭГК снижает доступность для протеолитических ферментов и антител. (рис.4). Совершенствование методов конъюгации привело к появлению подходов к специфической конъюгации определенных химических группировок, что позволяет избежать появления смеси изомеров. К тому же, сайт-специфическая конъюгация позволяет лучшим образом сохранить нативную конформацию 22 белковой молекулы. Метод, предложенный Kinstler и соавт. (1996), использует ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ преимущество низкого pKa N-концевой аминогруппы и ε-аминогруппы лизина. С помощью восстановительного алкилирования ПЭГ-альдегидом был получен ПЭГ-Г-КСФ (Pegfilgrastim®). Также возможно, защитить активный центр фермента или центр узнавания белка, осуществляя ПЭГК в присутствии специфического обратимого ингибитора, субстрата или лиганда с последующим снятием защиты. Такие лиганды могут быть свободно находиться в растворе или быть прикреплены к нерастворимым носителям. Существует альтернативный двухступенчатый метод ПЭГК, обеспечивающий присоединение ПЭГ к определенным аминам в пептиде. Идея метода заключается в обратимой защите некоторых остатков с целью предотвратить их модификацию. Хотя такой подход был успешно применен для инсулиновых и СТГ аналогов, он не подходит для всех белков, так как в процессе создания защиты и снятия ее может быть изменена структура протеина, приведя к его биологически неактивному производному. Недостатки метода. 1. ПЭГ, как и все искусственные полимеры, является полидисперсным, то есть его цепи содержат разное количество мономеров, появляющихся в ходе химического синтеза. Их концентрации подчиняются распределению Гаусса в соответствии с их молекулярными массами. В конечном итоге это приводит к образованию смеси конъюгатов, которые могут обладать разными биологическими свойствами, что главным образом отражается на времени полужизни оных молекул и их иммуногенности. В настоящее время благодаря развитию химических технологий возможно получение ПЭГ с относительно низким уровнем полидисперсности. Однако об этой проблеме не следует забывать, особенно при работе с низкомолекулярными препаратами, когда масса ПЭГ оказывает весьма значимое влияние на свойства конъюгата, зависящие главным образом от веса частиц. 23 2. Вторая проблема связана с особенностями экскреции ПЭГ конъюгатов. Как и ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ другие полимеры ПЭГ элиминируются с мочой и калом, но в больших количествах могут накапливаться в печени, приводя к развитию макромолекулярного синдрома. Кроме того, нельзя экстраполировать на ПЭГ интенсивность почечной фильтрации, ориентируясь лишь на ее величину для белков (≈ 60кД, альбумин), так как существует ряд факторов, оказывающих в той или иной степени влияние на данный процесс и не имеющих своей силы в случае протеинов. Необходимо учитывать, что за счет высокой гигроскопичности, ПЭГ покрыт толстой гидратной оболочкой, из-за чего гидродинамический объем молекулы в 3-5 раз больше объема белка той же массы. Кроме того, подвижность отдельных связей в ПЭГ обеспечивает проникновение через гломерулярную мембрану полимера. В любом случае, почечная фильтрация зависит главным образом от массы частицы (порог молекулярной массы– преимущественно ферментативно с 65кДа),а калом. с более Также помощью крупные ПЭГ CYP450, может молекулы выводятся метаболизироватьься алкогольдегидрогеназы и неферментативно, благодаря anchimeric-assisted механизму гидролиза, в данном случае триггерами этого процесса являются амидные группировки. В настоящее время используют ПЭГ массой до 40 кДа. 3. В процессе конъюгации белок теряет свою нативную структуру. А изменение трехмерной упаковки ведет к потере в той или иной степени биологической активности протеина. Однако, в настоящее время известны примеры успешной ПЭГК для белков и пептидов. И имеются коммерческие препараты данных конъюгатов, одобренные FDA. К примеру ПЭГ-ИФНα (Pegasys®), который сохраняет лишь 7 % от биологической активности нативного ИФНα. Несмотря на это конъюгат in vivo оказался значительно более эффективен, чем неконъюгированный ИФНα, за счет улучшенных фармакокинетических свойств. ПЭГК низкомолекулярных веществ. Основные проблемы, связанные с 24 разработкой низкомолекулярных препаратов, особенно противоопухолевых ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ средств, касаются их низкой растворимости, быстрой экскреции и неспецифическим распределением в организме. Все эти недостатки можно корректировать с помощью ПЭГК. Описаны конъюгаты таких веществ как таксол, камптотецин, соль Пейроне и доксорубицин. Но с применением ПЭГ для низкомолекулярных веществ связаны следующие вопросы. Ведь в таких веществах число функциональных группировок, к которым можно присоединить полимер, очень мало. Таким образом, ПЭГ не способен экранировать в должной степени молекулу, и КПД такой процедуры сводится к нулю. С другой стороны низкомолекулярное вещество не имеет конформационных, функционально значимых вариаций, свойственных белкам, что обусловлено особенностью их строения. Кроме того, очищение конъюгатов низкомолекулярных исследователи веществ используют и ПЭГК их описание также низкомолекулярных проще. Многие соединений для пассивной избирательной доставки ЛС в твердые опухолевые образования за счет EPR эффекта (Enhanced Permeability and Retention effect), эффекта увеличенной проницаемости и удерживания или лишь для модификации кинетики. Конъюгаты обычно относят к пролекарствам, так как для их активации требуется отщепление от полимера. Не так давно были разработаны методы, обеспечивающие высвобождение активного лекарства вопределенных условиях и соответствующих клеточных/организменных компартментах. Можно использовать для этих целей низкий рН эндосом, к примеру соединив полимер и активное вещество N-цис аконитовой кислотой или гидразоновым мостиком, или действие лизосомальных ферментов, соединив молекулу активного вещества и полимера олигопептидом, к примеру –G-F-L-G-OH или – G-L-F-G-OH. Чтобы решить основную проблему – наличие одного-двух гидроксильных остатка в молекуле лекарственного вещества, исследователи прибегают к синтезу дендримерных структур, о которых пойдет речь ниже. ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ 25 Таким образом, ПЭГ в общем случае: 1. Увеличивает растворимость ЛС, корректирует его заряд, увеличивает молекулярную массу, время полужизни. В случае противоопухолевых препаратов имеет значение EPR эффект; 2. Обеспечивает защиту ЛС от взаимодействий с протеазами, нуклеазами и АТ, таким образом уменьшая иммуногенность препаратов, что важно в случае введения негомологичных белков. И в заключение приведем некоторые примеры одобренных FDA препаратов (табл.3). Таблица 3. Примеры наноразмерных лекарственных препаратов, одобренных FDA. Дендримеры. Дендримеры представляют собой синтетические каскадно-разветвленные древообразные, поливалентные и монодисперсные структуры. Они имеют сердцевину, из которой берут свое начало дендроны (кроны), образующие в дальнейшем повторяющиеся и разветвляющиеся единицы, дающие в свою очередь несколько генераций (рис.5). На концах своих дендримеры имеют поверхностно-активные, терминальные группировки. Таким образом «…ключевыми параметрами, определяющими строение и размер макромолекул дендримера, являются Nc - индекс ветвления ядра, то есть число дендронов (крон), растущих из ядра макромолекулы; Nb - индекс 26 ветвления звеньев - число ветвей, образуемых каждой повторяющейся ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ единицей; G - номер генерации…» [Семчиков Ю.Д., 1998]. Количество генераций и структура элементарной единицы определяет размер, форму, валентность, растворимость дендримера и другие его ф/х свойства. Каждое звено заканчивается узлом ветвления, образуемым в данном случае одной из групп NH2 диамина (Б). Узлы ветвлений, замыкающие последовательности из одинакового количества звеньев, образуют генерации или слои разветвлений. Функциональные группы, вызывающие разветвления (в данном случае NH2), расположенные на периферии дендримера, называются терминальными. Число терминальных групп возрастает в геометрической прогрессии при увеличении числа слоев (генераций) дендримера…» Рис. 5. Схематическая иллюстрация возможных методов ассоциации ЛС с дендримером. (а) инкапсулированное ЛС, (b) ковалентно связанное ЛС, (c) нековалентно связанное ЛС. Использование ПАМАМд возможно для придания необходимых ФК и ФД свойств лекарственным средствам. Гидрофобная сердцевина является потенциальным местом ассоциации с гидрофобным соединением. Окончания веточек также могут быть местом взаимодействия дендримера и лекарственного средства либо за счет кулоновских сил с образованием своего рода комплекса, либо за счет валентных связей через соответствующие мостики и образованием конъюгата. Причем возможно присоединение как молекул лекарственного средства, так и молекул другого функционального назначения, к примеру, обеспечивающих активную прицельную доставку препарата. Так или иначе связанные с дендримерами лекарственные средства имеют фармакокинетические и фармакодинамические свойства 27 принципиально отличные от таковых для свободных молекул лекарственного ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ средства, при условии, что взаимосвязь между дендримером и лекарственным средством достаточно прочна (рис.5). При размещении гидрофобного соединения в гидрофобном ядре дендримера образуется своего рода агрегат, комплекс гость-хозяин, в котором капсула дендримера обеспечит прекрасную растворимость и стабильность гостю лекарственному средству. Модификация химически активных поверхностных группировок делает возможным изменение in vivo таких параметров как сайтспецифичность, уровень деградации, время полужизни препарата и его токсичность. Таким образом возможны следующие манипуляции с дендримером: 1. Нековалентное связывание с лекарственным средством за счет а) гидрофобных взаимодействий с образованием агрегата, б)электростатических взаимодействий с образованием комплекса; 2. Ковалентное связывание с лекарственным средством с образованием конъюгата а) напрямую, б) через специальный линкер (мостик). Отдельно необходимо выделить функционально различающиеся классы присоединяемых фармацевтические различным препараты, образом к дендримеру молекулы-адрессаты, молекул: хромофоры, радиологически активные молекулы, поверхностно активные молекулы. В общем случае использование дендримеров дает ряд преимуществ: (1) высокую плотность и активность терминальных группировок на поверхности частицы и возможность их модификации, (2) контролируемую форму, задаваемую Мr, монодисперсность частиц и, следовательно, хорошую воспроизводимость фармакокинетического профиля, (3) определенный размер (зависящий от генерации), удовлетворяющий различным биомедицинским замыслам, (4) высокие проникающие способности частицы через плазматическую мембрану, что приводит в свою очередь к высокому уровню захвата ЛС, связанных с частицами, (5) отсутствие иммуногенных свойств у ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ дендримеров делает их применение более безопасным, 28 нежели синтезированных пептидных переносчиков или белковых переносчиков, (6) наличие EPR эффекта, обеспечивающего пассивно направленную доставку ЛС в опухолевую ткань, (7) возможность присоединения к дендримерам функционально активных молекул, таких как антитела (АТ), хромофоры, радионуклиды с образованием частиц различной направленности применения, (8) постоянное и равномерное образование активного лекарственного средства из пролекарства обеспечивает снижение токсичности частиц, увеличение накопления препарата и его пролонгированное действие. В настоящее время ведутся разработки по модификации различных ЛС с помощью дендримеров. Наиболее интенсивно разрабатываются модификации следующих классов ЛС: НПВС, противомикробные и противовирусные препараты, противоопухолевые средства (цитостатики, радионуклиды, фоточувствительные соединения), что объяснимо не только особенностями их ф/х свойств, но и эпидемиологической значимостью соответствующих патологий. Так как большинство карбоксильную НПВС группу, - гидрофобные положительно молекулы, заряженные имеющие дендримеры (модифицированные аминогруппами) являются потенциальными кандидатами на роль их переносчиков. В настоящее время комплексы НПВС-дендример наиболее активно исследуемые препараты из всех комплексов дендримеров. Аспирин, индометацин, флурбипрофен, кетопрофен, ибупрофен, напроксен, дифлунизал, диклофенак натрий и пироксикам – были успешно тем или иным образом связаны с модифицированными аминами ПАМАМд или ППИд и испытаны рядом исследовательских групп. В частности недавно были получены данные об активности комплекса дендримера и доксорубицина, по эффективности сравнимого с одобренной FDA эмульсией из раствора липосом, груженных доксорубицином. Ниже приведены таблицы с некоторыми результатами испытаний комплексов 29 ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ дендримеров с противоопухолевыми препаратами и НПВС (Табл. 4, 5). Таблица. 4. Фармакокинетические и вармакодинамические эффекты конъюгации некоторых НПВС с дендримерами. Примечания. AUC – площадь под фармакокинетической кривой. Таблица 5. Влияние дендримеров на терапевтическую активность некоторых противоопухолевых прпаратов. Сообщается о синтезе пролекарства ацетилсалицилата на основе G1-3 дендримеров. К сожалению данных о его испытаниях in vivo пока нет. Существуют данные о противовоспалительной гликодендримеров. Необходимо отметить активности ПЭО- и о других потенциально возможных применениях дендримеров, связанных с присоединением к их оболочке биологически функциональных молекул различного назначения, 30 среди которых РФП, хромофоры, АТ. Таким образом, возможна активная сайт________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ специфическая доставка ЛС в требуемую ткань и осуществление через присоединенные агенты направленной специфической терапии. Наглядно проиллюстрируем вышесказанное. Мицеллы. Полимерные наночастицы, способные самоорганизовываться в термодинамически устойчивые конгломераты за счет ионных, гидрофобных и ван-дер-ваальсовых взаимодействий привлекали умы исследователей на протяжении последних десятилетий (рис. 7). Рис. 7. Схематическое изображение мицеллы. Серый круг - гидрофобная сердцевина. Жирные короткие отрезки - ЛС. Извитые нити - полимер [13]. Начиная с 1980-х годов, когда были созданы звездообразные дендримерные полимеры «Starburst», было разработано множество различных подходов к созданию инкапсулированных ЛС. Главным достоинством использования ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ полимерных мицелл являются их биосовместимость и 31 способность контролируемо и равномерно высвобождать ЛС относительно избирательно в определенном органе, ткани, специфическом клеточном компартменте. PLGA, полилактогликолевая кислота, к примеру, долгое время использовалась и продолжает использоваться, как основа для формирования биодеградирующих мицелл (рис.8, 9). Рис. 8. Химическая структура PLGA. Полимеры, построенные из PLGA, расщепляются и образуют продукты, вступающие на универсальный общебиологический путь метаболизма - в цикл Кребса, и затем удаляются через почки. Рис. 9. Синтез поли-α,β-аспартата. Исследования показывают, что PLGA-мицеллы, содержащие в себе пДНК, меченные флуоресцентной меткой, захватываются in vitro NIH 3T3 клетками и быстро выходят в цитоплазму из эндолизосом, что может использоваться в целях генной трансфекции. Labhasetwar успешно продемонстрировал инкапсуляцию дексаметазона в PLGA мицеллы, осуществленную с помощью техники double-emulsion, и последующую доставку комплекса в цитоплазму клеток. Благодаря постоянному уровню ЛС в цитоплазме, был зафиксирован увеличенный терапевтический эффект комплекса на ГМК по сравнению со свободным ЛС. Исследования in vivo также демонстрируют многообещающие результаты. Возможна пассивная прицельная доставка мицелл в опухолевые 32 ткани за счет EPR эффекта. Кроме того, возможна и активная прицельная ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ доставка комплексов с присоединением к ним пептидов, олигонуклеотидов, олигосахаридов, АТ, способных взаимодействовать с определенными, специфическими для той или иной ткани молекулами. Такого рода модификации обеспечивают сайт-специфическую доставку ЛС, существенно снижают побочные эффекты препарата и определяют более высокую LD50 и, соответственно, более широкий терапевтический интервал доз. Другие классы полимерных наноструктур включают в себя самоорганизовывающиеся амфифильные полимерные мицеллы, демонстрирующие высокую стабильность в водном растворе, к которым относятся в частности PEG-поли-α,β-аспартат и PEG-поли-β-бензил-L-аспартат, обладающие высокой водной растворимостью и стабильностью (рис. 9). Структура наночастиц типа гидрофобное ядро-гидрофильная оболочка делает возможным помещение в сердцевину гидрофобную молекулу ЛС и присоединение молекул, обеспечивающих прицельную доставку мицелл, через поверхностные группировки оболочки. Такие мицеллы образуются спонтанно в водном растворе путем самосборки, когда концентрация полимера достигает критической величины. Более того, ЛС можно поместить в сердцевину мицеллы и методом прямой конъюгации. Высвобождение ЛС в таком случае будет состоять из нескольких этапов: деградация сферической мицеллы и разрыв ковалентной связи между ЛС и полимером. Приведем несколько примеров успешного применения наночастиц такого рода. Maysinger продемонстрировал быстрый эндоцитоз меченных флуоресцентной меткой мицелл, сформированных феохромоцитомы крысы. поли-капролактон-β-ПЭО, клетками В дополнение добавим, что эксперименты показывают способность эффективной доставки различных терапевтических агентов с помощью мицелл. Наночастицы, построенные ПЭО-β-поли-L-АК, были эффективно использованы для доставки доксорубицина и циклофосфамида in vivo и продемонстрировали более высокие значения 33 противоопухолевого действия по сравнению со свободными аналогами данных ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ цитостатиков. Однако необходимо проводить новые исследования на предмет иммунногенности и других нежелательных эффектов, способных проявить себя in vivo. Фуллерены. Фуллерены представляют собой одну из аллотропных модификаций углерода, открытую в 85-ом при изучении квантовым химиком Крото вместе со своими сотрудниками Керлом и Смолли масс-спектров паров графита, полученных при лазерном облучении твердого образца. Рис. 10. Бакминстерфуллерен. Были обнаружены пики с максимальной амплитудой, соответствующей кластерам 60-ти и 70-ти атомов углерода. Названы они были в честь американского архитектора Бакминстера Фуллера, применявшего для постройки куполов своих зданий пяти- и шестиугольники, являющиеся основными структурными элементами молекулярных каркасов всех фуллеренов. Следует отметить, что возможность существования фуллеренов была предсказана ещѐ в 1971 году в Японии и теоретически обоснована в 1973 году в России. Кроме того, в записях да Винчи можно найти «фуллерен», являющийся по форме своей усеченным икосаэдром. Интерес к фуллеренам растет не только в связи с их необычной трехмерной, совершенной в некотором роде структуре и физико-химическим свойствам, но и заманчивыми перспективами их прикладного использования. Мы же рассмотрим некоторые аспекты их применения в нанофармакологии. Как правило, используют 34 фуллерен С60, бакминстерфуллерен (рис.10). Так как это полые сферические ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ образования, можно поместить какие-нибудь молекулы внутрь их, а можно снаружи. Возникает проблема, которая связана с гидрофобностью фуллеренов, а значит с их нерастворимостью в воде. Проблема решается присоединением снаружи поверхностно-активных, заряженных карбоксильных и первичных аминных группировок. Такие производные фуллеренов эффективно проникают через клеточную мембрану и другие биологические барьеры, в частности, через ГЭБ, что представляет несомненный интерес для более эффективной доставки ЛС в область фармакологического воздействия. Особенности поведения фуллеренов в биологическом объекте говорят об их потенциальном широком применении в нанофармакологии. При внутривенном введении они быстро перераспределяются в различных органах и тканях. За счет поверхностноактивных группировок возможна конъюгация фуллеренов и различных ЛС. К примеру, показано, что паклитаксел, ассоциированный с фуллеренами увеличивает свое время полужизни в четыре раза в бычьей плазме по сравнению со свободным паклитакселом. Wilson и сотрудники успешно присоединили к фуллеренам специфические ZME-018 АТ, для прицельной доставки к клеткам меланомы человека, усиленно экспрессирующим поверхностный АГ gp240. В настоящее время обсуждается перспектива помещения внутрь фуллеренов гемоглобина и создание искусственных эритроцитов. Существуют противники такого рода начинаний вследствие недостаточных знаний о функциях этих постклеточных структур. Ведь эритроцит не просто упругий мешок с гемоглобином, и в обязанности его входит не только транспорт кислорода. Имеются разработки, касающиеся использования фуллеренов фотодинамической гипотетических терапии. как переносчиков Данные возможностях фармакологически активных молекул. примеры фуллеренов хромофоров в целях свидетельствуют как о переносчиков 35 ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ Глава 2.3. Эволюция топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии. Топические кортикостероиды в настоящее время являются незаменимыми препаратами для лечения воспалительных и аллергических заболеваний кожи. Первым препаратом этой группы был естественный стероид гидрокортизон (Sulzberger & Witten, 1952), который оказался безопасным, но недостаточно эффективным (особенно при тяжелых и хронических воспалительных процессах) препаратом. В 70-е гг. были созданы более активные галогенизированные стероиды, которые обладают сильным и очень сильным противовоспалительным эффектом. Однако, параллельно с возрастанием активности, у галогенизированных стероидов увеличилась частота и выраженность местных и системных побочных эффектов. В эти годы были получены новые данные о механизмах действия и биотранспорта стероидов, которые стали фундаментальной базой поиска новых более безопасных, но достаточно активных препаратов топических стероидов [Buttgereit F, Burmester GR, Lipworth BJ., 2005]. Было показано, что для реализации фармакологической активности глюкокортикоид (ГК) должен взаимодействовать с мембранными и со специфическими цитоплазматическими рецепторами, образуя комплекс, проникающий в ядро клетки, и регулирующий 10 – 20% генома компетентных клеток, путем изменения процессов транскрипции. Топические стероиды взаимодействуют с глюкокортикоидными рецепторами клеток кожи. Такие рецепторы имеются на лимфоцитах, тучных клетках, моноцитах, эндотелиальных клетках, фибробластах и других клетках, участвующих в воспалительных и аллергических реакциях. ГК стимулирует синтез мРНК, которая индуцирует образование белков, (например, липокортина), опосредующих различные, в том числе противовоспалительные клеточные эффекты. Липокортин угнетает фосфолипазу А2, подавляя высвобождение арахидоновой кислоты и синтез эндоперекисей, простагландинов, 36 ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ лейкотриенов, способствующих процессам воспаления и аллергии. Противоаллергический эффект развивается также в результате торможения высвобождения из сенсибилизированных тучных клеток и базофилов гистамина и др. биологически активных веществ, уменьшения числа циркулирующих базофилов, подавления развития лимфоидной и соединительной ткани, снижения количества T- и B-лимфоцитов, тучных клеток, снижения чувствительности эффекторных клеток к медиаторам аллергии, угнетения антителообразования, изменения иммунного ответа организма. Кроме того ГК тормозит высвобождение интерлейкина1, интерлейкина-2, интерферона гамма из лимфоцитов и макрофагов, уменьшает уровень гиалуроновой кислоты, стабилизирует клеточные мембраны и мембраны органелл (особенно лизосомальных), уменьшая проницаемость капилляров [Schoneveld JL, Fritsch-Stork RD, Bijlsma JW., 2011; Strehl C, Buttgereit F., 2013]. В отличие от цитостатиков, иммунодепрессивные свойства не связаны с митостатическим действием, а являются суммарным результатом подавления разных этапов иммуногенеза: миграции стволовых клеток (костного мозга), миграции B-клеток и взаимодействия T- и B-лимфоцитов. Тормозя миграцию клеток в очаг воспаления, блокируя синтез и выделение медиаторов воспаления, тормозя пролиферацию клеток и синтез белков в очаге воспаления ГК вызывает следующие эффекты: противовоспалительный – кортикостероиды устраняют экссудацию, отек, зуд, вызывают вазоконстрикцию в месте применения. Кортикостероиды эффективны при остром, хроническом, а также аллергическом (иммунном) воспалении; антимитотический – кортикостероиды тормозят пролиферацию кератиноцитов и фибробластов и синтез коллагена. Представленные сведения противовоспалительных и о многофаторности противоаллергических и комплексности эффектов ГК свидетельствуют о том, что никакие иные противовоспалительные средства, 37 действующие на отдельные компоненты воспалительной реакции или ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ блокирующие некоторые рецепторы медиаторов воспаления (напрмер. антигистаминные средства, или антагонисты лейкотриеновых рецепторов) не сопоставимы по своей эффективнгости. Применение последних оправдано лишь при развитии резистентности к ГК. Ранее считали, что десенсибилизирующий противовоспалительный, противошоковый, противоаллергический, антитоксический и иммунодепрессивный эффекты реализуются через один рецептор и поэтому неотделимы друг от друга. Однако, молекулярные механизмы действия ГК продолжают интенсивно изучаться и были обнаружены подтипы рецепторы ГК – изофрмы α и β. Так как для проявления генотропной активности ГК необходима димеризация рецепторов ясно, что возможно образование трех вариантов димеров и от их соотношения в различных клетках может зависеть степень развития глюкокортикоидного эффекта в той или иной ткани. Установлено, что от характера димеризации, даунрегуляции β-изоформы рецептора и репрессии фактора транскрипции NF-κB зависит как величина терапевтического ответа на ГК, так и развитие к нему резистентности. Было показано, что фторированные стероиды быстрее образуют димеры рецепторов ГК и быстрее вызывают апоптоз некоторых клеток, например гипоталамуса, что приводит к развитию зависимости к ГК, а производные преднизолона стимулируют образование как димеров рецепторов ГК, так и их гетеродимеров с минералокортикоидными рецепторами, способствуя развитию более мягких, физиологичных эффектов регуляции оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники или пролиферации клеток эпидермиса. Силу противовоспалительного действия топических кортикостероидов определяют следующие факторы: 1. Внутренняя активность, т.е., способность молекулы стероида связываться и активировать глюкокортикоидный рецептор. Следующие модификации молекулы гидрокортизона повышают внутреннюю активность: 38 ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ введение двойной связи между С1 и С2 стероидного кольца; добавление галогена (фтора или хлора) в позиции 6 и/или 9; добавление метильной группы СН3 в положении 6 (как у метилпреднизолона); этерификация по С17. 2. Концентрация стероида в очаге воспаления. Способность топического стероида проникать в кожу зависит от: липофильности молекулы. Проникновение стероидов через фосфолипидные слои эпидермиса в дерму повышается с увеличением липофильности молекулы. Липофильность возрастает при этерификации молекулы стероида по С17 и С21; лекарственной основы; состояния рогового слоя. Роговой слой является основным барьером и резервуаром для топических стероидов. Поступление стероидов в глубокие слои кожи увеличивается: - при удалении рогового слоя (в клинических условиях такая ситуация наблюдается при повреждении эпидермиса в результате различных заболеваний); - на участках кожи с тонким роговым слоем (лицо, голова, подмышечные и паховые области) - у детей и пожилых людей; способа нанесения. Окклюзионная повязка и «естественная окклюзия» в складках кожи увеличивают поступление стероида вглубь кожи. Для топических стероидов важно, чтобы при нанесении на кожу они могли бы проникнусь через роговой слой кожи и затем эффективно взаимодействовали с клеточными рецепторами для ГК, а затем медленно проникая в кровоток прочно связывались с транспортными белками крови, которые бы их 39 переносили в печень для инактивации. При этом низкая свободная ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ концентрация топического стероида в крови предотвратит развитие системного эффекта. Местные побочные эффекты. Атрофия кожи, стрии и телеангиэктазии являются следствием антимитотического действия стероидов, которое наиболее выражено у галогенизированных препаратов. Риск развития местных побочных эффектов увеличивается при длительном использовании топических кортикостероидов. Системные побочные эффекты Кортикостероиды могут всасываться в системный кровоток через кожу, особенно поврежденную вследствие заболевания. В таких случаях возможно возникновение системных побочных эффектов. Обычно в кровь попадают очень незначительные количества стероида, которые не могут вызвать такие побочные эффекты как остеопороз, кушингоидный синдром или замедление роста у детей. Однако даже малые количества стероидов при попадании в системный кровоток могут подавлять систему «гипоталамус-гипофиз- надпочечники», что проявляется снижением выработки эндогенного кортизола. Это особенно актуально при длительном использовании топических стероидов, а также у детей, поскольку у них кожа более тонкая (что облегчает всасывание стероида через кожу), и выше соотношение «поверхность/масса тела». Риск системного действия зависит от: количества стероида, всосавшегося из кожи в кровь; времени, в течение которого активный (свободный от связи с белками плазмы) препарат циркулирует в крови. Максимально безопасным является стероид, который мало всасывается из кожи в кровь; циркулирует в крови преимущественно в неактивной (связанной с транскортином) форме; быстро инактивируется (путем глюкуронидизации в 40 быстро выводится из организма. Галогенизированные стероиды ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ печени) и медленно метаболизируются, плохо связываются с транспортным белком транскортином и медленно выводятся. Период полувыведения галогенизированных препаратов в 2-3 раза больше, чем у естественного гидрокортизона. Поэтому галогенизированные даже стероиды при могут малом всасывании оказывать через системные кожу эффекты, поскольку в крови может длительно циркулировать активный препарат в свободной (несвязанной с транскортином) форме. Базируясь на этих фундаментальных данных, был проведен направленный поиск топических кортикостероидов с улучшенным соотношением «пользариск», которые были бы также эффективны, как галогенизированные, но при этом более безопасны. В 90-е годы были созданы препараты нового поколения – «диссоциированные» кортикостероиды, для которых характерна высокая местная противовоспалительная системном эффекте активность (наиболее при оптимальным пренебрежимо малом соотношение между терапевтическими и побочными эффектами оказалось у топического стероида метилпреднизолона ацепоната, который применяется в клинической практике с 1994 года). * * * В заключении определим актуальные вопросы молекулярной фармакологии глюкокортикоидов, рационального использования их в практической для комплексного медицине. 1. Разработка изучения экспериментальных негеномных эффектов подходов ГК, взаимоотношений между внутриклеточными и мембранными рецепторами ГК 2. Определение роли каждой из этих систем в преобразовании гормонального сигнала в биохимическую реакцию клетки-мишени. 41 Создание научной основы целенаправленного поиска новых ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ 3. высокоэффективных и безопасных глюкокортикоидных препаратов, обладающих преимущественно мембранотропным действием. 4. Разработка новых чувствительности способов больных диагностики дерматозами к индивидуальной глюкокортикоидным препаратам, учитывающим мембранный этап в действии ГК. Данная работа является продолжением научных разработок кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии имени академика П.В. Сергеева. Впервые в обобщенном виде мембраннорецепторная теория монографии различные П.В.Сергеева ― Стероидные методологические гормоны‖ подходы, приведена в (1984). исследователи Используя убедительно продемонстрировали первоочередную роль плазматической мембраны в ― узнавании‖ стероидов, впервые суммировали экспериментальные свидетельства мембранных участков специфического связывания стероидных гормонов. Таким образом, результатом первого этапа исследования экстрагеномного пути действия СГ стала идентификация и характеристика специфических участков связывания стероидов на плазматической мембране клеток-мишеней. Содержанием второго этапа развития данной научной проблемы явилось изучение эффектов стероидов, пусковые механизмы которых локализованы на ПМ, т.н. мембранотропные негеномные эффекты стероидных гормонов. Значительный вклад в этой области исследований принадлежит коллективам лабораторий, возглавляемых U.Wehling (Германия), E.Baldi (Швейцария), T. Chen (США), B.S. McEwen (Англия) впервые доказавшим экстрагеномный характер действия альдостерона, прогестерона, витамина Д 3 и нейростероидов, соответственно. В мае 1999 г. в Мангейме прошел I Всемирный конгресс с участием фармакологов, биохимиков, клиницистов, посвященный механизмам 42 развития быстрых (негеномных) эффектов стероидов [Falkenstein et al., 2000]. ________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ________________ Следует отметить, что наши исследования негеномных эффектов глюкокортикоидов имеют приоритетный характер. Целью настоящей диссертационной работы явилось определение фармако-биохимических особенностей действия на фибробласты мономерных глюкортикоидов и наноразмерного кортизол-полимерного комплекса. В качестве объекта исследования были выбраны фибробласты кожи – клеткимишени фармакологического действия глюкокортикоидов, участвующие в воспалительных и аллергических реакциях при дерматозах. 43 _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В качестве гормональных препаратов использованы: природные гормоны кортизол и кортикостерон, синтетические ГК преднизолон, дексаметазон, а также полимерные производные указанных соединений, иммобилизованные на поливинилпирролидоне м.м. 24 000 Д. В контрольных опытах использовали эстрадиол, тестостерон. В качестве специфических антагонистов ГК применяли прогестерон, дексаметазон21-мезилат, ДОК и препарат мефепристон. В работе использованы следующие реактивы: [1,2,6,7,-3Н] Kортизол (80 Ci/ммоль), [1,2,4,6,7-3Н] Преднизолон (75 Ci/ммоль), 3 Н- тимидин (5 Ci/ммоль); МЕСА, фениламиноаденозин, DMPX ("Amersham"); 6меркаптопурин ("Jarma"); набор для определения цАМФ и цГМФ производства фирмы “Amersham”; кортизол, преднизолон ("Merck"), гидрокортизон, дексаметазон (“Sigma”); HEPES, твин-80, среда Хенкса ("Serva"); форболовый эфир, 4аминопиридин, актиномицин Д, циклогексимид, трифлуоперазин, t- бутилгидропероксид ("Sigma"); культуральная среда (MEM Eagle's Medium) ("Sigma"); среда разделения Mono-Poly resolving medium “Flow”;; фура-2/АМ ("Calbiochem"); дигитонин, ЭДТА, АДФ, бычий сывороточный альбумин ("Sigma"); HEPES, PPO, POPOP, аденозин ("Serva"); перколл, фиколл (“Pharmacia Fine Chemicals“); креатинфосфокиназы ("Reanal"),азатиоприн, 2-хлораденозин, 5'-АМФ, Histopaque-1077, дигитонин, актиномицин D ("Sigma"). Диоксан, толуол, соли, кислоты, щелочи отечественного производства высокой чистоты. Полимерные производные глюкокортикоидов синтезированы в Институте высокомолекулярных соединений РАН (С.-Петербург). По химической структуре полимерные производные ГК представляют собой водорастворимый тройной сополимер винилпирролидона, малеиновой кислоты и монозамещенного малеата стероида (рис.11). Средний молекулярный вес сополимеров 20000; содержание гидрокортизона 4,4 мольн% (13,2 масс%), преднизолона 3,8 мольн% (11,5 масс%). Сложноэфирная _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 44 связь между макромоле-кулой и стероидом образована ангидридной группой полимера и гидрок-сильной группой при С(21) глюкокортикоида. Удельная радиоактивность для 14 С-ПВП-кортизола - 150 ГБк/ммоль, 14 С-ПВП-преднизолона - 160 ГБк/ммоль. где R: гидрокортизон, преднизолон. гидрокортизон преднизолон Рис. 11. Химическое строение полимерных производных глюкокортикоидов. _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 45 Химическое строение меченых глюкокортикоидных гормонов, использованных для изучения связывания с внутриклеточными ГК рецепторами представлено на рис.12. [1,2,6,7 - 3H] Кортизол [1,2,4,6,7 - 3H] Преднизолон Рис. 12. Химическое строение меченых тритием аналогов глюкокортикоидных гормонов. В качестве объекта исследования использованы фибробласты кожи из биоптатов белых крыс линии Wistar весом 100-200г, взятых из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАМН и содержащихся на стандартном рационе вивария в ЦНИЛе. Выведение животных из эксперимента проводили путем передозировки эфирного наркоза с соблюдением всех условий гуманности и в соответствии с _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 46 "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных". 3.1.Фибробласты получали из кожи крыс как описано в работе Lu and Finkel, 2008. Клетки культивировали в лунках 96-луночного планшета в атмосфере с 5% СО2 при 37оС в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС и пенициллин (100ед/мл) со стрептомицином (100 мкг/мл) фирмы “Gibco”. Фибробласты стимулировали добавлением ангиотензина II в концентрации 100 нМ, время инкубации составляло 24 ч. Изучаемые соединения - препараты глюкокортикоидов в дипазоне конечной концентрации (10 нМ -1 мкМ) ПВП-ГК, кортизол, дексаметазон; антагонисты минералкортикоидных рецепторов спиронолактон, рецепторов глюкокортикоидов мифепристон, в конечной концентрации 10 мкМ – добавляли в среду за 1 ч до внесения АII. 3.2. Оценка жизнеспособности фибробластов. Жизнеспособность фибробластов определяли методом витального окрашивания клеток трипановым синим. В отношении 1:1 суспензию клеток (3 млн в мл) смешивали с 0,2% раствором трипанового синего (приготовленного на HEPES-буфере) и через 40 секунд под микроскопом подсчитывали число окрашенных и неокрашенных клеток. Жизнеспособность оценивали в процентах по формуле: число неокрашенных клеток ---------------------------------------- х 100% общее число клеток Для оценки жизнеспособности фибробластов в условиях инкубации их с глюкокортикоидными гормонами 1 мл суспензии клеток инкубировали без (контроль) и в присутствии гормонов (конечная концентрация 1 – 2 мкМ) при 37О С в атмосфере, содержащей 10% СО2 в течение 4 часов. Через 2 и 4 часа из опытных и контрольных проб отбирали аликвоты суспензии клеток для оценки их жизнеспособности. 3.3. Определение уровня цитоплазматического рН в фибробластах. Исследования проводились с помощью флуоресцентного зонда BCECF/AM, который является внутриклеточным индикатором рН (рис. 10). Флуоресцентный зонд в виде тетраацетоксиметилового эфира (BCECF/AM) в силу своей гидрофобности проникает через плазматическую мембрану в цитоплаз- _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 47 му, где благодаря высокой активности неспецифических внутриклеточных эстераз, быстро гидролизуется до тетракислоты, не успевая проникнуть в матрикс митохондрий или во внутривезикулярное пространство ретикулума. В зависимости от величины рН изменяется конформационное состояние данного зонда, что находит отражение в изменении параметров флуоресценции и позволяет судить о величине внутриклеточного рН. Нагружение клеток зондом проводили по следующей методике [Патрашев Д.В. и др., 1999]. К выделенным фибробластам (10-20 млн/мл) добавляли 1 мМ раствор BCECF/AM в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 3 мкМ и инкубировали 20 мин при 37С. После этого клетки отмывали и ресуспендировали в HEPESбуфере. 2 мл суспензии фибробластов (концентрация 3 млн/мл) помещали в ячейку спектрофлуориметра”Hitachi MPF-4”, термостатируемую при 37С. Спектр возбуждения флуоресценции и спектр флуоресценции регистрировался при 500 и 530 нм соответственно. Значения уровня рН вычисляли с использованием калибровочных кривых флуоресценции BCECF/AM. Их получали посредством установления равновесия между рНо (значение рН инкубационной среды) и рНi с помощью нигерицина в следующих буферах: MES (6,5-6,8), HEPES (7,1-7,4), Tricine (7,4-8,8). 3.4. Определение внутриклеточной концентрации ионов кальция в фибробластах с помощью флуоресцентного зонда FURA-2. Зонд FURA-2 относится к семейству флуоресцентных зондов, способных регистрировать концентрацию свободных ионов кальция в клетках [Grynkievich и др, 1985]. Он содержит 4 карбонильные группы, связывающие ионы кальция координационными связями по типу EGTA, и хромофорные группы, изменяющие свои свойства при образовании комплексов с ионами Са 2+. В виде тетраацетоксиметилового эфира, который обозначается как FURA-2/AM, в силу своей гидрофобно- _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 48 сти, флуоресцентный индикатор проникает через плазматическую мембрану в цитоплазму, где гидролизуется до тетракислоты внутриклеточными эстеразами. Преимуществом этого зонда является высокое абсолютное значение квантового выхода при существенном влиянии Са2+ на положение максимумов спектра возбуждения флуоресценции. Влияние на спектр флуоресценции при этом незначительно. Химическая строение и спектральные свойства зонда FURA-2/AM приведены на рис. 13 и в таблице 6. Рис. 13. Химическое строение зонда FURA-2 и его ацетоксиметилового производного. Таблица 6. Спектральные характеристики зонда FURA-2. Максимум поглощения, нм Максимум флуоресценции, нм Квант. Выход флуоресценции Free anion Ca2+ complex Free anion Ca2+ complex Free anion Ca2+ complex 385 340 518 510 0.23 0.49 _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 49 Нагружение фибробластов флуоресцентным зондом FURA-2. Полученную суспензию клеток (10-15 х 105 кл/мл) инкубировали с FURA-2/AM (конечная концентрация 5 мкМ) при 20 оС в течение 40. Невключившийся индикатор отделяли, дважды отмывая клетки свежим Кребс буфером, перед определением флуоресценции тимоциты переводили в HEPES-буфер следующего состава (мМ): 145 NaCl, 5 KCl, 1 Na2HPO4, 1 CaCl2, 0.5 MgSO4, 5 глюкоза, 10 NaHEPES, pH 7.4 при 37 oС. Пробы объемом 1 мл помещали в ячейку спектрофлуориметра MPF-4 "Hitachi" и регистрировали флуоресценцию (500 нм) при длинах возбуждающего света 340 нм и 380 нм, соответствующих максимуму поглощения связанной с ионами и свободной формы зонда FURA-2. Изменение мутности среды, общей концентрации зонда в рабо- чем объеме и другие факторы, вызывающие пропорциональное изменение составляющих спектра, не влияют на конечный результат. Для подсчета количества клеток использовали камеру Горяева, жизнеспособность фибробластов оценивали по исключению трипанового синего (85-90 % жизнеспособных клеток на начало экспериментов). Расчет концентрации ионов Са2+ в цитоплазме клеток. Внутриклеточную концентрацию кальция рассчитывали на основании измерений при двух длинах волн возбуждения (F340 и F380), используя следующий прием. В общем виде значения интенсивностей, соответствующие этим двум длинам волн, можно выразить как F340 = Sf340 * сf + Sb380 * сb; F380 = Sf380 * сf + Sb380 * сb, где cf и cb - концентрации свободного индикатора и его комплекса с кальцием соответственно, а S - фактор, зависящий от коэффициента поглощения, интенсивности возбуждающего света, длины оптического пути в кювете, квантового выхода. Вводя параметр R = F340/F380 и применив уравнение закона действующих масс для реакций первого порядка cb = cf * [Сa++]цит /Kd можно перейти к выражению: (Sf340 + Sb340 * [Сa2+]цит /Kd) относительно R, получаем * (Sf380 + Sb380 * [Сa2+]цит /Kd) = R и, решая его _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 50 [Сa2+]цит = Kd (R - Rmin) / (Rmax - R) / (Sf380 / Sb380), где Rmin= R при cb= 0, т.е. Rmin = Sf 340/Sf380 , Rmax= R при cf = 0, т.е. Rmax= Sb340 /Sb380 . Конечная формула принимает вид : [Сa2+]цит = Kd * k * (R - Rmin) / (Rmax - R) . R - регистрируемый уровень флуо- ресценции. Значение Кдисс -равновесной константы диссоциации Fura-2 с Ca2+ - определяли в модельных опытах, используя раствор Fura-2. Рассчитанная с помощью анализа Скетчарда величина Кдисс составила 140 нМ. Для определения Rmax плазматическую мембрану фибробластов, содержащихся в среде с насыщающей для FURA концентрацией Са 2+ (более 1000 Kd), разрушали 40 мкМ дигитонином, разрушающим мембрану с высоким содержанием холестерина, которой является плазматическая мембрана клетки (в отличии от мембраны внутриклеточных органелл). Rmin определяли, добавляя после этого 5 мМ MnCl2, который вытесняет Са2+ из комплекса с красителем (рис. 14). В нашем случае F340 - интенсивность флуоресценции, регистрируемая при 500 нм, длина волны возбуждения 340 нм, F380 - интенсивность флуоресценции, регистрируемая при 500 нм, длина волны возбуждения 380 нм; k - отношение интенсвности флуоресценции при 380 нм для свободного и связанного зонда (7,3 0,5). Опти- мальное время инкубации суспензии клеток (10-15 х 105 кл/мл) с FURA-2/AM (конечная концентрация 5 мкМ) было определено в контрольных экспериментах (рис. 15). С увеличением продолжительности инкубационного периода от 10 до 40 мин изменения спектра флуоресценции отражают повышение содержания в клетках комплекса зонд-кальций, одновременно снижается уровень несвязанного с Са 2+ FURA-2. Дальнейшее увеличение времени инкубации при приводило к достоверному изменению интенсивности флуоресценции. Таким образом, 40 мин - оптимальная продолжительность нагружения фибробластов зондом FURA-2/AM. _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 51 7 флуоресценция, отн.ед. 4(5) 6 3 5 2 4 3 1 2 1 300 6 315 330 345 360 375 390 длина волны возбуждения, нм Рис. 14. Изменение спектра возбуждения флуоресценции нагруженных FURA2/AM фибробластов от времени предварительной инкубации с зондом. Обозначения: 1 - 0 мин; 2 - 15 мин; 3 - 30 мин; 4 - 40 мин; 5 - 60 мин; 6 - аутофлуоресценция фибробластов (10-15 млн/мл). _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 52 6 флуоресценция, отн.ед. 1 5 4 2 3 3 2 1 300 315 330 345 360 375 390 длина волны возбуждения, нм Рис.15. Изменение спектра возбуждения флуоресценции нагруженных FURA-2/AM клеток в присутствии 40 мкМ дигитонина (1); 5 мМ МnCl 2 (3); контрольный образец (2). 53 _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 3.5. Определение параметров специфического связывания глюкокортикоидов фибробластами. I. Изучение характера связывания меченых полимерных аналогов глюкокортикоидов проводили по следующей схеме. 0,2 мл суспензии клеток (10-20106 кл/мл) инкубировали при 40С в течение 1 часа в присутствии 14 С-ПВП-кортизола или 14 С-ПВП-преднизоло-на. Их концентрация в среде инкубации составляла от 0,1 до 510-6 М. Для определения неспецифического связывания в пробы с 14 С -ПВП-ГК вносили 1000-кратный избыток немеченых свободных гормонов: кортизола или преднизолона. Далее содержимое проб переносили на фильтры GF/C "Whatman" и дважды отмывали их 5 мл HEPES-буфера (t=4C). После высушивания фильтры помещали в сцинтилляционные флаконы для последующей радиометрии. Количество специфических мест связывания на плазматической мембране определяли с учетом эффективности счета и удельной радиоактивности 14 С-ПВП- аналогов. Специфическое связывание вычисляли как разницу между количеством связанных клетками полимеров в отсутствии немеченых гормонов (общее связывание) и количеством 14 С -ПВП-аналогов, связанных клетками в присутствии 1000- кратного избытка немеченых свободных гормонов (неспецифическое связывание). II. Исследование связывания меченых ГК внутриклеточными рецепторами фибробластов. 0,2 мл суспензии клеток (10-20106 кл/мл) инкубировали в течение часа при 40С в присутствии 3 Н-кортизола или 3 Н-преднизолона ( конечная кон- центрация 2-30 нМ): без этих препаратов (контроль) и в присутствии 100- кратного избытка немеченых аналогов гормонов. Анализ содержания внутриклеточных рецепторов проводили по методике Lippman (1978). К суспензии клеток добавлялся дигитонин в конечной концентрации 50 мкМ, который вызывал разрушение мембраны. Для определения цитоплазматического связывания 3Н-гормонов _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 54 отбирали аликвоты (20 мкл) суспензии клеток и переносили их в пробирки, содержащие 100 мкл 1,5 мМ MgCl2 в растворе декстран-покрытого угля, тщательно перемешивали и оставляли на 15 минут. Далее пробы центрифугировали (15000g, 10 мин) и супернатант радиометрировали. 3.6. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК фибробластов. Интенсивность биосинтеза ДНК в фибробластах оценивали по включению 3Н- тимидина в ДНК клеток по следующей методике. К 0,5 мл клеточной суспензии фибробластов в среде 199 с эмбриональной сывороткой (3 млн клеток в 1 мл суспензии) добавляли 20 мкл раствора гормона (конечная концентрация кортизола и преднизолона в пробах 10-6 М) , после чего клетки инкубировали при температуре 37С в течение 24 часов. При исследовании сочетанного действия ГК гормонов и лигандов пуриновых рецепторов препараты вносили одновременно (конечная концентрация в пробах аденозина 10-6 М, азатиоприна и 6-меркаптопурина 10-5 М). В контрольных пробах клетки инкубировали без стероида. Через 24 часа в каждую пробирку вносили по 2 мкКи 3Н-тимидина в объеме 10 мкл. Пробы инкубировали еще 1 час, затем пробирки охлаждали до 4С и центрифугировали (3000 g, 10 мин). К осадку добавляли 3 мл 5% раствора предварительно охлажденной до 4С трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Полученную суспензию центрифугировали (3000 g, 10 мин) и дважды отмывали в 3 мл раствора ТХУ. Makman M.H. и соавт. (1968) показали, что образующийся в результате материал (осаждаемый ТХУ) состоит из преципитированной 3Н-тимидин-ДНК. Полученный после центрифугирования осадок переносили во флаконы для определения содержания меченого тимидина мето- дом жидкостной радиометрии. 3.7. Радиоиндикаторный метод определения внутриклеточного уровня цАМФ. Метод основан на конкуренции за связывание с белком немеченого цАМФ, содержащегося в исследуемом материале или стандартной пробе, с известным количеством меченого тритием цАМФ (Brown et al., 1971). Радиоактивность связанного с _______________МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ___________________ 55 белком меченого цАМФ обратно пропорциональна количеству немеченого цАМФ в тестируемом материале. На этом основано построение соответствующей стандартной кривой и расчет концентрации цАМФ. Ход определения цАМФ включал инкубацию со связывающим белком, разделение свободного и связанного с белком цАМФ, измерение радиоактивности и подсчет полученных результатов исследования. Для определения содержания цАМФ использовали стандартный набор реактивов фирмы "Amersham" (Англия) с соблюдением условий и требований, указанных в прилагаемой инструкции. При подведении окончательного результата производился пересчет на соответствующее число клеток (106 фибробластов). 3.8. Жидкостная сцинтилляционная радиометрия. В основе метода лежит свойство бета-частиц вызывать сцинтилляцию веществ в специальных средах. Это дает возможность с большой эффективностью регистрировать бета-излучение, обладающее малой энергией. Для регистрации радиоактивности образец на фильтре помещали в 5 мл сцинтилляционной жидкости. Ее состав: РРО (2,5-дифенилоксазол) - 4 г, РОРОР (1,4-бис-2-метил-5-фенилоксазолилбензол) - 0,4 г, толуол - до 1 литра. Смесь тщательно перемешивали и радиоактивность образца регистрировали на жидкостном сцинтилляционном радиометре SL-30 "Intertechnique" (Франция). Эффективность счета для 3Н составляла 20-25%, для 14С - 70% (в среднем). 3.9. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ Pharmacological Basic Statistics. Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними проводили с использованием непараметрического парного критерия ВилкоксонаМанни-Уитни (при обработке данных опытов in vivo) и t-критерия Стьюдента (в опытах in vitro) при уровне значимости Р=0,05. Экспериментальные данные представляли в виде среднее значение доверительный интервал. 56 Раздел IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Глава 4.1. Идентификация и изучение свойств специфических «систем узнавания», локализованных на плазматических мембранах фибробластов кожи. С помощью радиолигандного метода изучали связывание иммобилизованных на полимере глюкокортикоидов клетками в присутствии различных немеченых стероидных гормонов. Особенностью данных экспериментов по сравнению с проведенными ранее явилось возможность определения количества связанного клетками полимерного препарата, в состав которого включен радиоактивный изотоп углерода 14 С (сополимер С помощью кортизола, 14 меченых 14 С-винилпирролидона с глюкокортикоидом). С-НР-аналогов С- НР-дексаметазона и 14 глюкокортикоидов (14С-НР- С- НР-преднизолона) нами были идентифицированы специфические участки связывания ГК, локализованные на плазматической мембране фибробластов. зависимость специфического связывания На рис. 16 14 представлена С-НР-ГК фибробластами от концентрации гормонов в среде инкубации. На примере 14 С- НР-кортизола показано, что кривая связывания этого гормона фибробластами в диапазоне используемых концентраций (0,5-5х10-7 М) отражает полное насыщение рецепторов. Для количественной мембранными участками характеристики взаимодействия 14 С-НР-ГК с связывания полученные результаты были представлены в обратных координатах Лайнуивера-Берка (рис. 17). Графики описываются уравнениями: y = 0,44 + 0,66х, у = 0,56 + 2,15х и у = 0,51 + 1,96х соответственно. Для количественной характеристики взаимодействия ГК с мембранными участками 14 С-НР- связывания полученные результаты были представлены в обратных координатах Лайнуивера-Берка (рис. 17). Графики описываются уравнениями: y = 0,44 + 0,66х, у = 0,56 + 2,15х и у = 0,51 + 1,96х соответственно. 57 Рис.16. Специфическое связывание представленное в прямых координатах. 14 С-НР-кортизола фибробластами, Обозначения: В - количество связанного 14С-НР-ГК, (имп/мин)/106 клеток. С - концентрация 14С-НР-ГК в инкубационной среде, М. Прямолинейный вид графика наличии одного типа мест для всех НР-аналогов свидетельствует связывания для гормонов на о мембране фибробластов, что подтверждается литературными данными [Гуковская А.С., Зинченко В.П., 1986]. 58 Рис. 17. Специфическое связывание 14С-НР-кортизола (А) преднизолона (В), представленное в обратных координатах. и 14 С-НР- Обозначения как на рис.16. С помощью стандартных программ математического обеспечения для рассчитаны численные значения числа мест связывания (Bmax) и констант диссоциации (Кd) НР-ГК, которые составили: для 14С-НР-кортизола: Кд = 0,15 0,02 мкМ, Вmax = 3,7 0,3 пмоль/мг белка или 85000 мест на клетку (при расчете количества мест связывания на клетку взята средняя величина); для 14С-НР-преднизолона: Кд = 0,38 0,04 мкМ и Вmax = 3,6 0,5 пмоль/мг белка (77000 мест на клетку); для 14С-НР-дексаметазона: Кд = 0,45 0,05 мкМ и Вmax = 3,6 0,5 пмоль/мг белка (81000 мест на клетку). Вычисленные значения параметров специфических «систем узнавания» глюкокортикоидов, локализованных фибробластов суммированы в табл. 7. на плазматических мембранах 59 Таблица 7. Параметры специфического связывания глюкокортикоидов фибробластами. Параметры связывания Кд , нМ В макс, пмоль/мг белка Мест на клетку Кд , мкМ В макс, пмоль/мг белка Мест на клетку Последующий гидрокортизон дексаметазон преднизолон внутриклеточные рецепторы 18,3 - 30,5 4,8-7,2 8,4 - 15,4 0,29 - 0,41 7100 0,13 - 0,17 0,24-0,30 0,28 - 0,36 5500 6300 мембранные рецепторы 0,32-0,46 0,34 - 0,42 3,5 - 4,9 2,6-3,8 3,1 - 4,1 85000 65000 77000 конкурентный анализ связывания 14 С-НР-ГК фибробластами позволил установить его специфичность. Связывающая способность участков, взаимодействующих с иммобилизованным на полимере кортизолом, уменьшается в ряду: кортизол кортикостерон > прогестерон > 11-ДОК > преднизолон > дексаметазон >> тестостерон > эстрадиол . Поливинилпирролидон и НР-холестерин не влияли на специфическое связывание НР-кортизола клетками. Отсутствие конкуренции указывает на неспецифический характер взаимодействия и отсутствие насыщаемости плазматических мембран фибробластов для холестерина и винилпирролидона. С использованием 3 Н-дексаметазона, 3 Н-преднизолона и 3 Н- дексаметазона изучены параметры связывания меченых ГК внутриклеточными рецепторами. Для исключения возможности взаимодействия глюкокортикоидов с мембранными участками связывания плазматическую мембрану фибробластов разрушали путем добавления к суспензии клеток дигитонина до конечной концентрации 50 мкМ [Lippman, 1978]. Анализ специфического связывания 3 Н-гормонов фибробластами в координатах Скетчарда представлен на рис 17. По оси абцисс представлена концентрация связанного лиганда, по оси ординат - отношение связанного меченого гормона к концентрации свободного. Графики описываются 60 следующими уравнениями: у = 0,463 –0,17х для дексаметазона; у = 0,37 – 0,12х для преднизолона; у = 0,19 – 0,07х для кортизола. Рис. 18. Специфическое связывание 3Н-кортизола (1) и 3Н-преднизолона (2) фибробластами, представленное в координатах Скэтчарда. По оси абсцисс - концентрация связанного лиганда, пмоль/106 клеток. По оси ординат - отношение количества связанного и свободного гормона, пмоль/нМ106 клеток. Величина В/F для 3Н -дексаметазона почти в два раза выше, чем у 3Н кортизола, что свидетельствует о преимущественном связывании дексаметазона внутриклеточными рецепторами ГК клеток. Преднизолон занимает промежуточное положение. В табл. 6 приведены параметры специфического связывания (Кд равновесная константа диссоциации, Вмакс - концентрация связывающих участков) дексаметазона, кортизола и преднизолона внутриклеточными и мембранными рецепторами ГК фибробластов. При расчете количества мест связывания на клетку взята средняя величина. Обращает внимание, что внутриклеточные рецепторы ГК отличаются высоким аффинитетом (Кд не превышает 18 нМ) и относительно небольшой связывающей емкостью (0.270.36 пмоль/кг белка или в среднем 6х103 участков связывания на клетку). В зависимости от степени сродства к рецепторам ГК располагаются в ряду: 61 дексаметазон дексаметазон-21-мезилат > преднизолон > кортизол > прогестерон > 11-ДОК >> тестостерон > эстрадиол. Полученные результаты согласуются с литературными данными [ Raneletti F.O. et al., 1987, Голиков П.П. и соавт., 1992 ]. Для мембранных «систем узнавания» ГК характерны более высокая концентрация мест связывания (3-4,3 пмоль/мг белка, 75х103 /клетку) и менее выраженная аффинность (Кд порядка 0.3 мкМ). Тропность ГК к мембранной рецепторной системе подчиняется следующей закономерности: кортизол > преднизолон > дексаметазон. Таким образом, взаимодействие различных ГК с внутриклеточной и мембранной рецепторными системами клеток имеет характерные особенности. Синтетические препараты дексаметазон и преднизолон в изученном диапазоне концентраций (2-30 нМ) избирательно связываются внутриклеточными рецепторами ГК. Отношение Кдмем /Кдвн , отражающее характер распределения ГК между внутриклеточными и мембранными рецепторами, для дексаметазона и преднизолона равно соответственно 66,6 и 40,8. В то же время Кд мем /Кдвн, вычисленное для кортизола, преимущественном составляет 10.3, что свидетельствует о связывании природного гормона плазматической основных характеристик мембраной фибробластов. Проведено сравнительное изучение мембранных и внутриклеточных участков связывания ГК, определены параметры специфического связывания Кд (равновесная константа диссоциации гормон-рецепторного комплекса), максимальная связывающая емкость, получены данные об относительном сродстве рецепторов к различным стероидам. Установлено, что мембранные и внутриклеточные участки связывания различаются как аффинностью к гормонам, так и концентрацией мест связывания. характеризуются более высоким Внутриклеточные рецепторы ГК сродством (Кд порядка 10 нМ) и значительно меньшим числом связывающих участков (примерно в 20 раз). Отличаются эти две рецепторные системы и по способности связывать ГК 62 гормоны и синтетические стероиды. Для синтетических глюкокортикоидов дексаметазона и преднизолона характерна избирательность связывания с цитозольными рецепторами ГК. Тропность природных глюкокортикоидов кортизола и кортикостерона к внутриклеточным рецепторам проявляется в значительно меньшей степени. Глава 4.2. Определение молекулярных мишеней апоптотического действия глюкокортикоидов на фибробласты кожи. Апоптотическая реакция лежит в основе фармакологического действия глюкокортикоидов при лечении многих аллергических, в том числе кожных заболеваний, в патогенезе которых принимают участие фибробласты. При этом возможны как желательные иммунодепрессивные эффекты гормональной терапии (апоптоз имунокомпетентных Т-лимфоцитов), так и нежелательное атрофическое влияние стероидов на кожу (апоптоз фибробластов). I. Важным интегральным показателем клеточного гомеостаза является внутриклеточный рН (рНi). Постоянство рНi в покоящихся клетках определяется буферными свойствами внутриклеточных компонентов: белков, нуклеотидов, неорганических фосфатов и карбонатов. Активным компонентом Н+-обмена служит Na/H-переносчик, локализованный в плазматической мембране, осуществляющий внутриклеточный протон. обмен внеклеточного Движущей силой иона натрия переноса на является электрохимический градиент Na+ (потенциал покоя ПМ фибробластов составляет примерно –60мВ). В задачи первой глюкокортикоидов части на исследования величину входило внутриклеточного изучение рН с влияния помощью флуоресцентного зонда BCECF; сравнение закономерностей изменения внутриклеточного рН при апоптотической и некротической формах гибели фибробластов. Величина рНвн в контрольных образцах клеток, в отсутствие химического воздействия (контроль 1), составляла 7,120,05 (n=6) и незначительно 63 изменялась в течение всего времени наблюдения. Через 1,5 ч рНвн в контрольных пробах приближалось к величине 7,030,05 (n=3). В начальный момент времени значение рНвн в клетках, подвергшихся воздействию БГП, равнялось 7,090,06 (n=4), достоверно не отличаясь от контрольных. По мере увеличения времени инкубации с БГП величина рН вн плавно повышалась, выходя на плато к 60-75 мин наблюдения. При этом конечное значение рНвн составляло 7,350,04 (n=4), примерно соответствующее величине рН инкубационной среды (рНвнеш). По-видимому, происходило выравнивание рНвн во внеклеточном и внутриклеточном пространствах. Для проверки этого предположения была использована инкубационная среда с заданным значением рНвнеш, равным 7,5. В новых условиях эксперимента динамика изменений рНвн в целом имела сходный характер (рис. 19), однако, конечные значения рНвн уже составляли 7,510,07 (n=3). Следует отметить, что значения рНвн в контрольных образцах фибробластов (контроль 2), инкубировавшихся в среде с рНвнеш=7,5, колебались в пределах 7,02– 7,16, достоверно не отличаясь от уровня рНвн в контроле 1. 7,70 7,60 3 рНi 7,50 2 7,40 1 7,30 7,20 7,10 7,00 0 15 30 45 60 75 90 Время, мин. Рис. 19. Динамика изменения рНi в фибробластах при некротической форме гибели (модель окислительного стресса). Обозначения: кривая 1 - в присутствии 100 мкМ бутилгидропероксида (рН инкубационной среды 7,35); кривая 2 - в присутствии 100 мкМ бутилгидропероксида (рН инкубационной среды 7,5); кривая 3 - в присутствии 100 мкМ бутилгидропероксида, 30 мМ 2-дезоксиглюкозы, 50 мкМ трифлуоперазина. 64 Таким образом, при некротической форме гибели клеток наблюдаются нарушения гомеостатической функции плазматической мембраны, выражающиеся в выравнивании рНвн и рНвнеш к 60-й мин после начала воздействия БГП. Маловероятно, что повышение рНвн связано с активацией Na/H-обмена, так как добавление в суспензию клеток селективного ингибитора антипорта препарата амилорида не влияло на динамику изменения рНвн. Внесение в среду инкубации, наряду с БГП, ингибитора синтеза АТФ 2дезоксиглюкозы (30 мМ) и блокатора киназных реакций трифлуоперазина (ТФП, 50 мкМ) только усугубляло нарушения клеточного гомеостаза, приводя к выравниванию рНвн и рНвнеш к 45-ой мин инкубации (рис. 19, кривая 3). Апоптотическую форму гибели фибробластов индуцировали дексаметазоном (1 мкМ). Инкубация клеток с дексаметазоном приводила к закислению внутриклеточной среды, достоверные изменения рНвн регистрировали, начиная с 45-ой мин инкубации (рНвн = 6,950,04; n=4). В последующий отрезок времени величина рНвн плавно уменьшалось, достигая значений 6,870,04 к концу наблюдения (рис. 20). Предварительное внесение в среду инкубации 2-дезоксиглюкозы и ТФП отменяло изменения рНвн, индуцированные дексаметазоном. Полученные данные указывают на участие в рН-ответе фибробластов энергетически-зависимых реакций. 65 7,20 2 рНi 7,10 7,00 1 6,90 6,80 0 15 30 45 60 75 90 Время, мин. Рис. 20. Динамика изменения рНi в фибробластах при апоптотической форме гибели, индуцированной дексаметазоном (1 мкМ). Обозначения: кривая 1 - в присутствии 1 мкМ дексаметазона; кривая 2 - в присутствии 1 мкМ дексаметазона, 30 мМ 2-дезоксиглюкозы, 50 мкМ трифлуоперазина. Для изучения молекулярных механизмов действия дексаметазона на Na/Hобмен были использованы 3 экспериментальных подхода, включающие оценку влияния глюкокортикоида на активацию Na/H-обмена в фибробластах с помощью ангиотензина II (100 нМ, АII), активатора фосфоинозитидного обмена форболмеристатацетата (20 нМ, ФМА) и осмотическую стимуляцию. Вне зависимости от природы воздействия, изменение рНвн наступало быстро (в пределах 5-10 мин), блокировалось амилоридом (200 мкМ), внутриклеточная среда защелачивалась, диапазон значений рНвн составлял от 7,28 до 7,32. Дексаметазон (1 мкМ) достоверно ингибировал подъем рН вн на всех экспериментальных моделях; предварительная инкубация с дексаметазоном не требовалась, достаточно было внести глюкокортикоид за 3-5 мин до воздействия AII, ФМА или гиперосмотического шока. Полученные данные суммированы в таблице 8. 66 Таблица 8. Влияние различных экспериментальных условий на рНвн фибробластов Экспериментальные условия Контроль 0 7,12±0,05 15 7,12±0,05 Время инкубации, мин 30 45 7,10±0,06 7,08±0,05 60 7,06±0,05 75 7,03±0,05 Дексаметазон, 1 мкМ 7,10±0,04 7,06±0,05 7,02±0,04 6,95±0,04* 6,92±0,04* 6,89±0,05* Ангиотензин II, 100 нМ Ангиотензин II, 100 нМ + амилорид, 200 мкМ Ангиотензин II, 100 нМ + дексаметазон, 1 мкМ 7,12±0,05 7,17±0,05 7,20±0,06 7,25±0,04* 7,30±0,05* 7,28±0,05* 7,12±0,05 - 7,11±0,05 - 7,08±0,05 - 7,12±0,05 7,06±0,05 7,12±0,04 7,09±0,04** 7,08±0,04** 7,10±0,05** ФМА, 20 нМ 7,11±0,05 7,18±0,05 7,21±0,04 7,26±0,05* 7,30±0,06* 7,32±0,05* ФМА, 20 нМ + амилорид, 200 мкМ ФМА, 20 нМ + дексаметазон, 1 мкМ 7,11±0,05 - 7,11±0,05 - 7,08±0,05 - 7,11±0,05 7,06±0,05 7,10±0,04 7,06±0,04*** 7,09±0,04*** 7,11±0,05*** Условия: дексаметазон добавляли в инкубационную среду за 3–5 мин до внесения изучаемых препаратов (ФМА, ангиотензин II, амилорид). Отсчет времени в таблице указан с момента введения изучаемых препаратов. Обозначения: ФМА – форболмеристатацетат. *– достоверное отличие (p <0,05) от контрольных значений; ** – достоверное отличие (p <0,05) по отношению к действию ангиотензина II; *** – достоверное отличие (p <0,05) по отношению к действию ФМА. Достоверное увеличение рНвн наблюдали, начиная с 45-й минуты инкубации с ангиотензином II (100 нМ) или ФМА (20 нМ). Подъем рНвн, вызванный ангиотензином II или ФМА, блокировался амилоридом (200 мкМ): внутриклеточная среда защелачивалась, диапазон значений рНвн составлял от 7,28 до 7,32. Дексаметазон (1 мкМ) ингибировал подъем рНвн на всех экспериментальных моделях (таблица). Таким образом, ингибирующее действие дексаметазона на Na/H-обмен в фибробластах может быть отнесено к ранним, негеномным эффектам глюкокортикоидов, а ингибирование Na/H-обмена – к ранним проявлениям апоптотического пути гибели клеток, индуцированных дексаметазоном. II. В задачи второй части исследования входило исследование динамики апоптотического изменения концентрации ионов Са2+ в фибробластов с помощью флуоресцентного индикатора FURA-2. цитоплазме По нашим данным, базальный уровень [Ca2+]цит 67 в фибробластах составляет в среднем 105 нМ. Влияние дексаметазона на уровень [Ca2+]цит в фибробластах характеризуется дозовой и временной зависимостью (рис. 21). Выявлены две фазы кальциевого ответа на ГК. 200 * * Концентрация Са в цитозоле, нМ 180 160 * 140 * 120 * * * * * 0,1 мкМ 1 мкМ 10 мкМ 100 80 0,5 1 1,5 2 2,5 Время инкубации, часы Рис. 21. Изменения уровня [Ca++]цит в фибробластах на ранних стадиях апоптоза, индуцированного дексаметазоном (0,1 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ). Обозначения: * - достоверное отличие от исходных значений при р < 0,05. Первая фаза характеризуется плавным нарастанием, начиная с 60 мин, внутриклеточного содержания Са2+ . Во второй фазе (после 120 мин инкубации) отмечается максимальное увеличение концентрации цитозольного Са2+ (до 187 нМ или 178% от начальной величины). При повторении эксперимента в бескальциевой среде увеличения [Ca2+]цит не наблюдалось. Это позволило нам предположить, что эффект дексаметазона реализуется на уровне плазматической мембраны клеток. По-видимому, увеличение [Ca2+]цит связано с изменением проницаемости мембраны для ионов Ca2+, а не с мобилизацией их из внутриклеточных депо. Для определения механизма изменения проницаемости мембраны при действии ГК были поставлены следующие эксперименты. Одновременно с дексаметазоном (10 68 мкМ) в суспензию клеток вносили блокатор синтеза РНК актиномицин Д (1 мкМ) или ингибитор трансляции циклогексемид (30 мкМ). Указанные соединения достоверно изменяли динамику Са-ответа фибробластов на дексаметазон: отсутствовал резкий подъем уровня [Ca++]цит после 120 мин инкубации с дексаметазоном. Однако тот факт, что ответ не отменялся полностью, свидетельствует о вкладе как геномных, так и негеномных механизмов глюкокортикоидного эффекта. Таким образом, с помощью флуоресцентного зонда FURA-2 определен уровень [Ca2+]цит в суспензии фибробластов на начальных этапах дексаметазониидуцированного апоптоза, выяснен вклад геномных и негеномных механизмов действия ГК в изменение кальциевого гомеостаза. Базальный уровень [Ca2+]цит в фибробластах составляет 10512 нМ. Влияние дексаметазона (0,1-10 мкМ) на уровень [Ca2+]цит в фибробластах характеризуется дозовой и временной зависимостью. Выявлены две фазы кальциевого ответа на ГК. Первая фаза характеризуется плавным нарастанием, начиная с 60 мин, внутриклеточного содержания Са2+. Во второй фазе (после 120 мин инкубации) отмечается максимальное увеличение концентрации цитозольного Са2+ (187 13 нМ или 78 6% от начальной величины). Одновременное с дексаметазоном внесение блокатора синтеза РНК актиномицина Д (1 мкМ) и ингибитора процесса трансляции циклогексемида (30 мкМ) достоверно изменяло ответ фибробластов, однако не отменяло его полностью. Можно предположить, что увеличение [Ca2+]цит связано с изменением проницаемости мембраны для ионов Ca2+, а не с мобилизацией их из внутриклеточных депо. Увеличение [Ca2+]цит является результатом как геномных, так и негеномных механизмов глюкокортикоидного эффекта. Таким образом, на экспериментальной модели окислительного стресса установлено, что некротический путь лизиса фибробластов характеризуется ранними нарушениями механизмов поддержания рНвн, значения которого выравнивается с рН внеклеточной среды после 60-й минуты инкубации с БГП. 69 На экспериментальной модели апоптоза показано, что через 1 ч после воздействия дексаметазона наблюдается достоверное закисление внутриклеточной среды (рНвн =6,870,04). К одному из молекулярных механизмов рН-ответа фибробластов относится ингибирование активности Na/H-обмена. Глава 4.3. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса для изучения механизмов регуляции функциональной активности фибробластов кожи 4.3.1. Изучаемые геномные механизмы регуляции функциональной активности фибробластов включали: 1) влияние глюкокортикоидов на базальную и стимулированную ангиотензином II (AII) клеточную пролиферацию; 2) влияние глюкокортикоидов на базальный и индуцированный синтез коллагена, оцениваемый по включению меченного тритием пролина. АII достоверно увеличивает инкорпорацию меченых предшественников: включение тимидина в среднем на 57%, пролина – на 31%. Пролиферативный эффект ангиотензина II (100 нМ) и его влияние на синтез коллагена в фибробластах опосредовано АТ1-типом мембранных рецепторов [11], действие АII отменяется конкурентным антагонистом АТ1-рецепторов ирбесартаном (1 мкМ). ГК во всем изученном диапазоне концентраций (1нМ – 10 мкМ) ингибировали включение [3H]-тимидина в ДНК фибробластов. В концентрации ГК выше 10 нМ наблюдается достоверное снижение стимулированнго АII синтеза ДНК; начиная с концентрации 1 мкМ ГК подавляют и базальный уровень включения меченого тимидина (рис. 22А). Влияние ГК на синтез коллагена определяется в основном подавлением индуцированного АII уровня, базальный уровень включения меченого пролина снижается не более, чем 1015%. Сравнение активности глюкокортикоидов свидетельствует о 4-5-кратном превосходстве дексаметазона по сравнению с кортизолом угнетать как пролиферацию клеток, так и синтез коллагена. Действие ГК отменяется в 70 присутствии 10-кратного избытка антагониста внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов мифепристона. НР-ГК не оказывал достоверного влияния на базальную и стимулированную АII синтетическую активность фибробластов (рис. 22Б). А синтез ДНК 170 Кортизол 150 Дексаметазон Б 170 150 130 % от контроля % от контроля 190 синтез коллагена 130 110 110 90 ПВП-Кортизол 90 70 70 Дексаметазон 50 50 -9 -8 -7 -6 -9 -5 -8 -7 -6 -5 lg[глюкокортикоид], M lg[глюкокортикоид], M Рис. 22. Влияние глюкокортикоидов на базальный и стимулированный ангиотензином II синтез ДНК (А) и коллагена (Б) в фибробластах. По оси ординат – включение [3H] тимидина (А) или [3H] пролина (Б), % от контроля; по оси абсцисс – log10 конечной концентрации стероидов в среде инкубации, М. 4.3.2. Исследуемый в нашей работе эктрагеномный механизм функциональной активности фибробластов включал влияние ГК на базальный и стимулированный АII внутриклеточный уровень свободных ионов кальция ([Са2+]цит). В качестве мебраноопосредованных инструмента эффектов ГК исследования негеномных использовали кортизол, модифицированный НР. [Са2+]цит в покоящихся клетках не превышал значения 73 нМ (6112 нМ). Внесение в суспензию клеток 100 нМ АII вызывало максимальное увеличение внутриклеточной концентрации кальция до величины 20932 нМ (n=6) на 15-20 сек инкубации. Предварительное добавление к фибробластам НР-ГК приводило к достоверному изменению Са-ответа клеток на AII. В наномолярном диапазоне концентраций (2-10 нМ) НР-ГК потенцировал кальций-стимулирующее действие AII: кривая доза-эффект смещалась влево 71 (рис. 23). Логично предположить, что это действие ГК опосредовано мембранными рецепторами минералкортикоидов. В пользу этого свидетельствуют следующие факты: 1) потенцирующий эффект НР-ГК отменяет антагонист минералкортикоидных рецепторов спиронолактон; 2) минералкортикоид альдостерон в концентрации 0,5 нМ сходным образом потенцирует действие АII (рис. 23). Следует отметить, что синтетический глюкокортикоид дексаметазон значительно уступал по своей активности кортизолу. Са-ответ 250 150 2+ [Ca ]цит 200 100 Контроль Альдостерон 50 ПВП-ГК, 10 нМ ПВП-ГК, 1 мкМ 0 -9 -8 -7 -6 -5 lg[AII], M Рис. 23. Влияние стероидов на ангиотензин II -индуцированный уровень ионов кальция в фибробластах. По оси ординат – внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция, нМ; по оси абсцисс – log10 конечной концентрации ангиотензина II в среде инкубации, М. В микромолярном фармакологических диапазоне концентраций) концентраций НР-ГК 0,5-2 подавлял мкМ (область индуцированное увеличение [Са2+]цит и не влиял на базальный уровень кальция в фибробластах. Для проявления кальций-блокирующего эффекта ГК латентный период не требовался. Полученные нами данные свидетельствуют, что в зависимости от концентрации экстрагеномный эффект ГК на [Са2+]цит имеет четко выраженное 72 двухфазное действие. Выявленное различие в действии гормона кортизола и синтетического глюкокортикоида дексаметазона на уровне мембранных рецепторов согласуется с ранее установленными фактами различной чувствительности мебранных рецепторов стероидов к природным гормонам и их синтетическим производным [Сергеев П.В. и др., 1995]. Таким образом, использование препарата кортизола наноразмеров позволило выявить два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект AII, реализуемое через минералкортикоидные мембранотропный рецепторы; глюкокортикоидов, 2) антагонистический выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов. Можно предположить, что применение наноразмерного кортизолполимерного комплекса позволит избирательно регулировать функциональную активность фибробластов на уровне мембранной рецепторной системы, что открывает новые предпосылки дальнейшей эволюции топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии, с помощью наноразмерного дизайна оригинальных молекулярных комплексов. 4.3.3. Молекулярные механизмы влияния наноразмерного кортизолполимерного комплекса на обмен вторичных мессенжеров в культуре фибробластов кожи. В задачи данного раздела работы входило изучение мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на систему вторичных мессенджеров в фибробластах кожи. Одним из критериев, свидетельствующих о чувствительности клеток к ГК, является антипролиферативное действие гормонов, которое обусловлено их способностью ингибировать ранние этапы активации клеток. К таким ранним этапам относятся изменения в системе вторичных мессенджеров (Са2+; цАМФ), являющиеся триггерными пусковым механизмам активации и деления клеток. Внутриклеточный уровень ионов кальция ([Са2+]цит) в покоящихся клетках не превышал значения 110 нМ (9812 нМ). Внесение в суспензию 73 клеток 3 мкМ наноразмерного кортизол-полимерного комплекса (НР-ГК) (соответствует средней терапевтической концентрации гидрокортизона в дерме при топическом применении) не приводило к достоверному изменению концентрации Са2+. В качестве стимуляторов активации фибробластов кожи в нашей работе был использован ангиотензин II (AII). Добавление к фибробластам 100 нМ АII вызывало быстрое увеличение [Са2+]цит до 240 25 нМ (р <0,05). Для того, чтобы определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток при действии АII, были проведены эксперименты в бескальциевой среде. Ca2+ в инкубационной среде связывали ЭГТА (конечная концентрация 1 мкМ), что приводило к резкому снижению базального уровня флуоресценции (рис. 24,б). АII (100 нМ) на фоне ЭГТА вызывала увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция примерно на 55 12 нМ (р<0,05), что примерно в два раза меньше реакции, наблюдаемой в инкубационной среде с нормальным содержанием ионов кальция. Данный факт, а также характерная кинетика Саответа на АII в среде без кальция позволяют предположить, что ангиотензин II индуцирует выход ионов кальция из внутриклеточных депо клеток. Если в среде с ионами Ca2+ на фоне действия АII к суспензии клеток добавляли ЕGТА (1 мМ), наблюдалось резкое снижение уровня [Ca2+]цит (рис. 24,а), который восстанавливался при добавлении CaCl2 за счет поступления ионов кальция через каналы плазматических мембран. Таким образом, при действии АА на фибробласты Са-ответ является суперпозицией двух процессов: транспорта ионов Са из инкубационной среды в цитоплазму, а также выхода Ca2+ из внутриклеточных депо. 74 Рис. 24. Влияние ЭГТА на индуцированное ангиотензином II (АII) повышение уровня [Са2+]цит в среде, содержащей 1 мМ CaCl2 (а) и в бескальциевом буфере (б). Обозначения: 1 - АII (100 нМ), 2 – ЭГТА (1 мM), 3 - CaCl2 (4.5 mM). Добавление АII (100 нМ) на фоне действия НР-ГК (3 мкМ) приводило к росту [Ca2+]цит на 52 ± 13 нМ (р<0,02) от базального уровня, что напоминает увеличение Ca2+ в бескальциевой среде (рис. 25). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в терапевтической области концентраций наноразмерный кортизол-полимерный комплекс блокирует Са-каналы плазматических мембран и препятствует индуцированному ангиотензинном II входу Ca2+ извне в клетки. В то же время наноразмерный кортизол-полимерный комплекс практически не влияет на стимулированный АII выход Ca2+ из внутриклеточных депо. Исследование аденилатциклазного звена клеточного ответа фибробластов показало, что базальный уровень цАМФ составил в среднем 2.3 ± 0,6 пмоль/107 клеток (n=10). При определении влияния АII на содержание цАМФ в фибробластах были обнаружены значительные индивидуальные различия. Добавление к суспензии фибробластов АII (100 нМ) в одних случаях (7 наблюдений) приводило к достоверному снижению уровня цАМФ (1.2 ± 0,4 пмоль/107 клеток), в других (6 наблюдений) вызывало увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ Исследование влияния (3мкМ) на (3.1 7 ± 0,4 пмоль/10 75 клеток). наноразмерного кортизол-полимерного комплекса цАМФ-ответ клеток не позволило выявить какие-либо закономерности. Рис. 25. Влияние ангиотензина II (АII) на уровень ионов кальция в фибробластах на фоне действия НР-ГК. Условия и обозначения как на рис. 1. АА - ангиотензин II (100 нМ), ГК - наноразмерный кортизолполимерный комплекс (3 мкМ). Полученные нами данные свидетельствуют, что наноразмерный кортизолполимерный комплекс в концентрации 3 мкМ подавлял индуцированное увеличение [Са2+]цит и не влиял на базальный уровень кальция в фибробластах. Для проявления Са-блокирующего эффекта НР-ГК латентный период не требовался. Механизмы регуляции активности клеток-мишеней, включающие аденилатциклазную систему, по-видимому, не являются точкой приложения негеномного действия ГК. В качестве индикатора чувствительности фибробластов к ГК использовали интенсивность включения меченого пролина в коллаген. Применение меченых предшественников - классический прием для выявления действия изучаемых соединений на клеточный ответ фибробластов [Abe A., 1995]. Гидрокортизон (10 угнетали накопление -6 М) и преднизолон (10 меченого -6 76 М) после 8 ч инкубации предшественника на 32,3% и 45,1% соответственно (рис. 26). С увеличением концентрации гормонов различия нивелировались: если в концентрации 3 мкМ преднизолон ингибировал включение 3Н-пролина в 1,2 раза сильнее гидрокортизона, то в концентрации 25 мкМ достоверных различий в действии гормонов не отмечено. Таким образом, при повышении концентрации наряду с геномным эффектом проявляется негеномный, более выраженный у природного кортикостероида гидрокортизона. При исследовании сочетанного действия ГК (3 *106 М) и циклогексимида (30*106 М) установлено, что циклогексимид частично подавлял действие ГК. 120 100 80 к онтроль гидрок ортизон 60 преднизолон 40 20 0 1 2 3 4 5 Рис. 26. Влияние гидрокортизона и преднизолона на включение 3Нпролина в коллаген фибробластов. По оси ординат - количество включенного 3Н-пролин, %. Обозначения: 1 - контроль; 2 - концентрация ГК в среде инкубации 1 мкМ; 3 3 мкМ; 4 - 10 мкМ; 5 - 3 мкМ+циклогексимид 30 мкМ. Условия: время инкубации 8 часов, t=370С. Полученные влиянии ГК на результаты включение свидетельствуют меченого о геном-опосредованном предшественника в коллаген 77 фибробластов, поскольку эффект кортикостероидов проявлялся как минимум через 2 ч и ингибировался блокатором синтеза белка циклогексимидом. Итак, одним и перспективных направлений для дальнейшего совершенствования препаратов топических стероидов является создание средств с преимущественно внегеномным механизмом действия. По нашим данным, именно это позволит повысить их клиническую эффективность и уменьшить потенциальную возможность развития нежелательного действия на кожу. Один из потенциальных путей разработки новых глюкокортикоидных препаратов включает разделение геномных и негеномных эффектов за счет модификация фармакологических свойств глюкокортикоидов на основе использования наноразмерных полимеров. 78 Раздел IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Стимулом к активному изучению молекулярных механизмов действия глюкокортикоидных гормонов послужило внедрение в практику радиолигандного анализа. С использованием меченных тритием стероидов в гомогенате печени, а потом и в других органах-мишенях глюкокортикоидных гормонов, были обнаружены белки, с высоким сродством и селективностью связывающие стероидные молекулы. Поскольку гормонсвязывающие белки впервые были выявлены в растворимой фракции гомогенатов они получили название «цитозольных рецепторов глюкокортикоидных гормонов». На основе дальнейшего изучения молекулярных и физико-химических свойств рецепторов была сформулирована двухэтапная модель действия стероидов. Согласно данной концепции, глюкокортикоидные гормоны путем простой диффузии проникают в компетентную клетку и связываются цитозольными рецепторами. Образовавшиеся гормон-рецепторные комплексы активируются, приобретая способность транслоцироваться в ядро, инициируют экспрессию генов, что, в конечном счете, приводит к синтезу специфических белков, определяющих ответ клетки на гормональный сигнал. Таким образом, плазматической мембране (ПМ) в указанной схеме отводилась пассивная роль. С привлечением новых методов исследования и развитием теории избирательности действия лекарственных веществ в течение последних 10-15 лет накоплен значительный экспериментальный материал, расширяющий представления о действии глюкокортикоидных гормонов. Для идентификации и количественной характеристики мембранных участков связывания глюкокортикоидов были применены классические препаративные биохимические методы и радиолигандный анализ. Именно таким путем в ПМ клеток-мишеней обнаружены специфические места связывания для всех классов стероидных гормонов - эстрогенов, прогестинов, глюкокортикоидов и минералкортикоидов. В цитоплазматических мембранах выявлены две системы, связывающие стероиды: одна из них характеризуется 79 насыщением, высоким сродством и специфичностью к тропным гормонам; вторая - отличается ненасыщаемостью, низким сродством и отсутствием специфичности. Для определения химической природы данных «систем узнавания» были проведены предварительные обработки. Так, преинкубация гепатоцитов или их плазматических мембран с блокатором SH-групп парахлормеркурибензоатом, протеолитическими ферментами (проназой, папаином) значительно снижала включение глюкокортикоидных гормонов. Важно отметить, что способность цитозольных рецепторов связывать стероиды в этих услових не изменялась. В отношении биологической роли найденной специфической системы связывания глюкокортикоидных гормонов существует несколько мнений. Часть авторов, принимая во внимание низкую скорость диссоциации образующихся гормон-рецепторных комплексов, отводит мембранным белкам, связывающим стероиды, функцию транспорта гормонов через ПМ. собой Другие исследователи полагают, что эта система представляет мембраносвязанные ферменты метаболизма стероидов, в частности, когда имеется в виду ПМ гепатоцитов. Следующим этапом в дискуссии между сторонниками мембранного этапа в механизме действия глюкокортикоидных гормонов и приверженцами классической схемы действия стероидов стали взаимные упреки в "нечистоте" экспериментов. Действительно, современные биохимические методики не позволяют выделить из гомогената чистые препараты мембранной или цитозольной фракций клеток. Степень очистки, определяемая по активности маркерных ферментов ПМ (5'-нуклеотидаза) и цитоплазмы (кетозо-1-фосфатальдолаза), в представленных работах составляет от 15 до 50 раз (отношение удельной активности фермента в конечном препарате к таковой в исходном гомогенате). Следовательно, наличие мембранных участков связывания глюкокортикоидных гормонов может определяться примесью цитозольной фракции и наоборот. Казалось точку в этом споре должны были поставить работы, в которых использовались авторадиографический и иммунногистохимический методы, 80 позволяющие визуализировать глюкокортикоидных гормонов в целых клетках. На основании мембранных, проведенных так и исследований цитозольных установлено гормон-рецепторных наличие как комплексов. Неожиданностью стало обнаружение несвязанных с лигандами рецепторов эстрогенов и прогестерона в ядрах клеток-мишеней. Полученные результаты привели к созданию трех независимых моделей внутриклеточной локализации рецепторов глюкокортикоидных гормонов и способствовали росту скептического отношения к данным, полученным на клеточных гомогенатах. В последующих публикациях были определенные ограничения и установлены артефакты, и проанализированы характерные для методов радиоавтографии и иммунногистохимии. Вопрос о функциональной роли мембранных участков связывания глюкокортикоидных гормонов так и остался нерешенным. Предложенный в данной работе подход включает использование в качестве инструментов исследования локализации рецепторного аппарата глюкокортикоидных гормонов и молекулярного механизма их действия полимерных производных ряда природных и снтетических глюкокортикоидов (ГК): гидрокортизона, преднизолона, дексаметазона. В качестве гидрофильного макромолекулярного носителя (м.м. порядка 25 000 Д) был выбран поли-(Nвинил-2-пирролидон), применяемый в медицинских целях и зарекомендовавший себя как биологически инертный препарат. В контрольных экспериментах установлено, что в водных растворах макромолекулы сополимеров структурированы и имеют более высокую компактность по сравнению с полимером носителя за счет гидрофобных взаимодействий стероидных фрагментов; обладают высокой гидролитической стабильностью в условиях, близких к физиологическим; не проникают в жизнеспособные клетки млекопитающих. Иммобилизация ГК по положению 21 на поливинилпирролидоне (НР-ГК) полностью сохраняет комплексообразующую активность исходных стероидов с молекулярными биологическими мишенями в модельных системах - сывороточным альбумином, специфическим транспортным белком плазмы 81 крови транскортином и моноклональными антителами к ГК. С использованием НР-ГК нами получены доказательства существования специфических мест связывания ГК на ПМ фибробластов кожи. Определены параметры связывания, относительная связывающая активность, исследованы механизмы трансмембранной передачи сигнала, их роль в формировании конечного биологического ответа клеток. В таблице 9 суммированы основные характеристики мембранных рецепторов ГК: параметры специфического связывания Кд (равновесная константа диссоциации гормон-рецепторного комплекса), максимальная связывающая емкость, а также приведены данные об относительном сродстве рецепторов к различным стероидам. Табл. 9. Характеристика рецепторных участков связывания ГК Параметры Мембранные рецепторы Внутриклеточные рецепторы Аффинность, Кд 0,12-0,60 мкМ 5-30 нМ Рецепторная 4-6 пмоль/мг белка (в среднем 65 000 мест связывания/клетку) 0,2-0,3 пмоль/мг белка (3 000 мест/клетку) емкость Относительное сродство Видно, кортизол кортикостерон > прогестерон > 11-ДОК > преднизолон > дексаметазон > тестостерон > эстрадиол что мембранные дексаметазон дексаметазон-21-мезилат > преднизолон > кортизол > прогестерон > 11-ДОК > тестостерон > эстрадиол и внутриклеточные участки связывания различаются как аффинностью к гормонам, так и связывания. Внутриклеточные ГК рецепторы концентрацией характеризуются мест более высоким сродством (Кд порядка 10 нМ) и значительно меньшим числом связывающих участков (примерно в 20 раз). Отличаются эти две рецепторные системы и по способности связывать ГК гормоны и синтетические стероиды. Для синтетических глюкокортикоидов дексаметазона и преднизолона 82 характерна избирательность связывания с внутриклеточными рецепторами ГК (значения Кд мембранных и цитозольных рецепторов отличаются в среднем в 60 раз). Тропность природных глюкокортикоидов кортизола и кортикостерона к внутриклеточным рецепторам проявляется в меньшей степени (отношение соответствующих Кд составляет 4,2). Следующим этапом наших исследований стало выяснение природы и механизмов развития мембранотропных эффектов ГК (схема 2). Экпериментальная модель Апоптоз фибробластов Оцениваемые параметры: Внутриклеточный рН Внутриклеточный Са2+ деструкция хроматина ГЛЮКОКОРТИКОИДЫ Гидрокортизон Дексаметазон Пролиферация фибробластов Синтез коллагена Внутриклеточный Са2+ НАНОРАЗМЕРНЫЙ КОРТИЗОЛ-ПОЛИМЕРНОГО КОМПЛЕКС 83 Схема работы: Разработка экспериментальной модели изучения геномных и негеномных эффектов глюклокортикоидов – модели апоптоза и клеточной пролиферации отбор оцениваемых параметров Определение возможных кандидатов на молекулярные мишени для наноразмерного кортизол-полимерного комплекса Оценка влияния наноразмерного кортизол-полимерного комплекса на внутриклеточные события, опосредованные его молекулярными мишенями Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что мембранные эффекты ГК, пусковые опосредуются механизмы системой которых вторичных локализуются внутриклеточных на ПМ, медиаторов. Взаимодействие ГК с плазматическими мембранами клеток-мишеней изменяет внутриклеточный уровень цАМФ, ионов кальция, инозитолфосфатов. В зависимости от концентрации глюкокортикоиды выступают в качестве модуляторов или ингибиторов цАМФ- и Са- ответа клеток: в концентрации 0,1-1,0 мкМ, соответствующей диапазону физиологических колебаний концентрации кортикостероидных гормонов в плазме крови человека, ГК не изменяют базальный уровень цАМФ и Ca2+ , потенцируют вызванное агонистами повышение содержания цАМФ, опосредованно ингибируя Са-ответ клеток; в диапазоне концентраций 2,0-5,0 мкМ (средняя терапевтическая концентрация препаратов глюкокортикоидов в плазме) ГК не влияют на базальный уровень вторичных мессенджеров, уменьшают агонист- индуцированный вход кальция через рецептор-управляемые Са-каналы; в концентрации выше 5 мкМ (экспериментальные фармакологические дозы глюкокортикоидов) ГК повышают базальный 84 уровень цАМФ, угнетая эффекторные звенья Са-ответа, активируемые продуктами гидролиза фосфатидилинозитол-трифосфата. Ранее на различных экспериментальных моделях нами было показано, что ГК повышают базальную концентрацию цАМФ, а также способны потенцировать действие других соединений, активирующих аденилатциклазу. ГК по механизму конкурентной или синергистической активации усиливают повышение цАМФ, вызванное аденозином, изопротеронолом, простагландином Е2. В то же время ГК не влияют на подъем цАМФ под действием фторида натрия, который по механизму стимуляции аденилатциклазы принципиально отличается от других активаторов. В отличие от перечисленных биологически активных веществ, влияние которых опосредовано взаимодействием с мембранными рецепторами, NaF способен непосредственно активировать регуляторные ГТФ-связывающие белки (Gбелки), передающие сигнал аденилатциклазного комплекса. на каталитическую Полученные данные субъединицу позволили авторам высказать предположение о том, что ГК непосредственно взаимодействуют с G-белками ПМ. Эволюционно G-белки появились в животных клетках (в бактериях нет промежуточного звена в виде ГТФ-связывающих белков), они служат дополнительным уровнем регуляции трансмембранной передачи сигнала. Обработка лимфоцитов периферической крови человека коклюшным токсином - селективным ингибитором Gi-белка приводила к значительному снижению цАМФ-ответа клеток на ГК, что подтверждает выдвинутое предположение. Однако, для окончательного решения вопроса о роли G-белков в механизме мембранотропного действия СГ требуются дополнительные исследования. Существование рецепторов ГК, локализованных в цитоплазме клетки и на поверхности клеточной мембраны, обуславливает принципиальную возможность разделения регуляторных функций стероидов на разных уровнях клеточной организации. Так, внутриклеточные рецепторы ГК опосредуют геномные эффекты стероидов – влияние на синтез мРНК; способность 85 индуцировать запрограммированную клеточную гибель (апоптоз); стимуляция и ингибирование синтеза тканеспецифичных беклков, например, медиаторов воспаления и цитокинов, пуриновых и адренорецепторов. Негеномные, мембраноопосредуемые эффекты включают влияние ГК на обмен вторичных мессенджеров, ионную проницаемость ПМ, трансмембранный транспорт глюкозы, нуклеозидов; высвобождение гистамина, продуктов метаболизма арахидоновой кислоты. В задачи нашей работы входило определение вклада геномных и негеномных эффектов глюкокортикоидов в реализации их фармакологического действия (глюкокортикоид-индуцированный апоптоз фибробластов). Последовательность биохимических и морфологических изменений отражена на схеме (схема 3); изучение фармако-биохимических маркеров начальных этапов апоптоза включало следующие этапы: анализ изменения митохондриального (м) и клеточного (п) мембранного потенциала на начальных этапах глюкокортикоид- индуцированного апоптоза фибробластов с помощью амфифильного зонда-катиона ДСМ; изучение влияния глюкокортикоидов на величину внутриклеточного рН с помощью флуоресцентного зонда BCECF; сравнение закономерностей изменения внутриклеточного рН (рНвн) при апоптотической и некротической формах гибели фибробластов; оценка динамики изменения концентрации внутриклеточного Са2+ ([Са2+]вн) при ГК-индуцированном апоптозе. 86 [Ca]вн Индукция апоптоза 0 рНвн M 4 Vкл 12-24 Гибель клетки Морфологические изменения Биохимические изменения Время, часы Схема 3. Последовательность событий при апоптозе. На основе полученных результатов и литературных данных мы предлагаем следующую модель глюкокортикоид-индуцированного апоптоза. На начальных этапах (1-1,5 часа после индукции апоптоза) преобладают мембранотропные эффекты глюкокортикоидов (геномные и негеномные по механизму развития). В фибробластах отмечается уменьшение трансмембранного потенциала, усиление кальциевого обмена, характеризующееся [Ca++]цит и ростом увеличением начальной скорости поглощения Са2+ [Halestrap, 1994; Скулачев, 1999]. Фактически, в начальный период еще не запущен механизм необратимого накопления ионов Са2+, которые, как полагают, при избыточном поступлении во внутриклеточные пулы (митохондрии, ядро и др.) сами могут оказывать прямое повреждающее действие на различные клеточные структуры, в частности, ДНК [Mills et al., 2004; Snider et al., 2006]. Негеномные мембранотропные эффекты глюкокортикоидов, обусловленные непосредственным воздействием гормонов на плазматическую мембрану клеток, включают увеличение активности К+-каналов, ингибирование Na+/H+ обмена. Сущность последующих стадиий апоптоза – манифестация геномных внутриклеточных эффектов глюкокортикоидов, которые определяются рецептор-опосредованной активацией определенных генов (Fas, c-myc, E1A, p53, bcl-2) и следующим за этим синтезом белков-продуктов онкогенов [KleinHitpass et al., 1998]. В цитоплазме клеток активируются Са2+/Mg2+-зависимая эндонуклеаза, сериновые и цистеиновые протеиназы, циклинзависимые 87 протеинкиназы [Mewes, Ravens, 2004; Golden et al, 1998]. Происходит встраивание продукта протоонкогена bcl-2 в митохондриальную мембрану, что вызывает увеличение ее проницаемости [Lou, Chen, 1998; Kulkarni, McCulloch, 2009]. Перестройка фосфолипидной структуры мембран приводит к экспозиции на поверхности клеток детерминантных групп (например, фосфатидилсерина), распознаваемых фагоцитами, что способствует быстрому поглощению ими апоптотических клеток [Moir, Zammit, 1995; Fadok et al, 2008]. Вышеперечисленные изменения, в конечном счете, приводят к снижению объема клетки, энергетическому голоду вследствие истощения запасов АТФ [Bowen, 1990], фрагментации ДНК и образованию апоптотических телец. Завершается апоптоз фагоцитозом апоптотических телец макрофагами или гистиоцитами. Воспалительная реакция при этом не развивается. Итак, начальные этапы апоптоза включают как геномные, так и негеномные механизмы действия изменения транспорта ионов глюкокортикоидов, складываются из кальция, калия, активности Na/H-обмена, снижения трансмембранных потенциалов. Фенотипическим проявлением начальных этапов апоптоза фибробластов является уменьшение их объема. К фармако-биохимическим маркерам начальных этапов глюкокортикоид- индуцированного апоптоза могут быть отнесены показатели внутриклеточного значения рН, Са2+, величина митохондриального и плазматического потенциала. Обобщая результаты, полученные на различных типах клеток, в зависимости от механизма развития мембранотропные эффекты ГК могут быть разделены на три группы. I. ГЕНОМ-ОПОСРЕДОВАННЫЕ ЭФФЕКТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ ингибирование включения 3Н-тимидина в ДНК; ингибирование включения 3Н-пролина в коллаген; 88 супрессия ферментативной активности фосфолипазы А2. Данная группа эффектов характеризуется следующими особенностями: длительным лаг-периодом (1-2 ч), продолжительным действием (часы-сутки), зависимостью от синтеза РНК и белка de novo. ГК необходим на этапе инициации геномных эффектов, далее его присутствие не является обязательным. II. НЕГЕНОМНЫЕ МЕМБРАНОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ изменение базального уровня цАМФ; модуляция активности мембраносвязанного фермента АЦ; влияние на базальный уровень свободных ионов кальция. К отличительными признакам экстраядерных механизмов действия ГК относятся: отсутствие латентного периода, кратковременность эффекта (менее 30 мин), резистентность по отношению к действию ингибиторов синтеза белка и РНК. После удаления ГК из среды инкубации эффект исчезает. III. СМЕШАННЫЕ ЭФФЕКТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ влияние на рецептор-опосредованное повышение концентрации цАМФ; действие на индуцированный подъем [Ca2+]вн. Смешанный механизм действия ГК подразумевает вовлечение генома клетки и экстраядерных путей реализации эффектов глюкокортикоидов. По-видимому, в условиях in vivo практически все эффекты ГК являются смешанными, поскольку разделение на геномное и негеномное действие возможно только в экспериментальных фармакологических агентов. условиях с использованием 89 На основе собственных результатов и литературных данных предлагаем классификацию антагонистов глюкокортикоидов, основанную на их способности блокировать мембранные и/или внутриклеточные механизмы гормонального эффекта. АНТАГОНИСТЫ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ Мембранного типа Антагонисты действия Полные внутриклеточных рецепторов антагонисты (прогестерон, 11-ДОК) Антагонисты (мифепристон) (дексаметазон-21-мезилат) мембранного типа действия (прогестерон, 11- дезоксикортикостерон) отменяют негеномные мембранотропные эффекты глюкокортикоидов, пусковые механизмы которых локализованы на плазматической мембране клеток-мишеней - влияние глюкокортикоидов на уровень цАМФ, ионов кальция, рН, активность Na/H-обмена. • Антагонисты внутриклеточных (дексаметазон-21-мезилат) препятствуют рецепторов развитию глюкокортикоидов геномных эффектов кортикостероидов - влиянию глюкокортикоидов на синтез РНК, белка. • Полные антагонисты глюкокортикоидов (мифепристон) подавляют все типы гормональной активности, опосредованной как мембранными, так и внутриклеточными рецепторами ГК, в том числе смешанные эффекты ГК. Глюкокортикоиды модулируют трансмембранную передачу внеклеточного сигнала, изменяя сопряжение мембранных рецепторов (Р) с G-белками и эффекторными молекулами (Э). При этом трансдукция активирующего сигнала – действие митогенов на лимфоидные клетки, активаторов тромбоцитов – ингибируется ГК уже на уровне плазматической мембраны (ПМ). Вторичным посредником активирующего сигнала выступают ионы кальция, их внутриклеточная концентрация увеличивается в 3-5 раз по отношению с 90 2+ базальной ( 100 нМ). В присутствии ГК подъем уровня Са не превышает 200 нМ. В то же время ингибирующий внешний сигнал – действие стимуляторов аденилатциклазы – усиливается ГК, которые повышают эффективность сопряжения регуляторного белка Gs-типа с соответствующими мембранными рецепторами. В данном случае вторичный посредник – циклический АМФ, его уровень в присутствии ГК повышается в 2-3 раза. На клеточном уровне Ca2+ и цАМФ являются антагонистами, запускаемые ими каскадные реакции с участием Са/КаМ- и А-киназ носят противоположный характер. Конечный клеточный ответ на стимулирующее действие БАВ – активация и пролиферация клеток, регистрируемая по увеличению включения меченых предшественников РНК (уридина) и ДНК (тимидина). Геномные мембранотропные эффекты ГК заключаются в подавлении экспрессии мембранных рецепторов и G-белков ингибиторного типа (Gi), вовлеченных в трансдукцию стимулирующего сигнала [Lee, Gilman, 1997]. Открытие мембранного этапа в действии ГК послужило теоретической предпосылкой для поиска и синтеза новых глюкокортикоидных препаратов, оказывающих избирательное действие на мембранные рецепторы. Были использованы два методических подхода. Сотрудниками кафедры фармакологии Санкт-Петербургского педиатрического института совместно с Институтом высокомолекулярных соединений (Санкт-Петербург) был разработан оригинальный способ иммобилизации уже известных ГК на гидрофильных полимерах [Байков В.Е. соавт, 1992; Тимофеевский С.Л. и соавт.,1994]. Связанные с высокомолекулярным носителем ГК утрачивают способность проникать внутрь клетки, ограничивается Полученные цитоплазматическими исследователями область приложения их действия мембранами полиэфиры ГК не клеток-мишеней. уступают по 91 противовоспалительной активности исходным соединениям (дексаметазон, гидрокортизон), а по противошоковой активности (при травматическом шоке) значительно превосходят их. Приведенные эффекты, возможно, обусловлены не только взаимодействием модифицированных гормонов с мембранными рецепторами клеток-мишеней, но также повышением локальной концентрации стероида. Вместе с тем, у полиэфиров ГК значительно ослаблены такие нежелательные эффекты, как угнетение роста, гипотрофия тимуса. Второй подход к созданию "мембраноторопных" препаратов ГК предложен в работах сотрудников Центра по химии лекарственных средств Научно-исследовательского химико-фармацевтического института (Москва). Коллектив авторов под руководством Г.С. Гриненко и М.Э. Каминки осуществил поиск новых соединений в ряду производных 16-метилпрегнанов, оказывающих избирательное местное противовоспалительное и антиаллергическое действие (Авт. свид. №1823392, Патент РФ №2030421). При местном применении они существенно превосходят по широте терапвтического действия дексаметазон, синафлан, триамцинолон ацетонид. У соединений этого ряда отсутствовал ряд побочных системных эффектов – общее катаболическое действие, нарушения обмена углеводов и электролитов, угнетение гормональной функции тимуса и надпочечников. С помощью радиолигандного анализа подтверждена высокая тропность препаратов к мембранным рецепторам ГК, с меньшей эффективностью они связываются цитозольными рецепторами ГК печени и тимуса. Таким образом, модификация кортизола - наноразмерный кортизол- полимерный комплекс – не вызывает характерный для глюкокортикоидов побочный эффект в виде апоптоза (атрофия кожи и т.д.), в то же время сохраняется фармакологический эффект глюкокортикоидов – антипролиферативное действие на фибробласты как возможное проявление их терапевтического противовоспалительного действия. Использование препаратов ГК с преимущественно "мембранным" 92 типом действия открывает новые возможности для проведения рациональной гормональной терапии и диагностики ряда заболеваний. ______________ ВЫВОДЫ ________________________ 93 ВЫВОДЫ 1. Предложена экспериментальная модель негеномных эффектов для изучения геномных и глюкокортикоидов в фибробластах кожи, основанная на определении внутреклоточного рН как показателя раннего апапотоза и изменения внутриклеточного гомеостаза. 2. Ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза, которые определяются уменьшением pH цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Саканалы плазматических мембран фибробластов. 3. Ингибирующее влияние мономерных глюкокортикоидов на клеточную пролиферацию и синтез коллагена относится к проявлениям их геномного действия, опосредованного внутриклеточными рецепторами. 4. В терапевтической концентрации наноразмерный кортизол-полимерный комплекс блокирует Са-каналы плазматических мембран и препятствует индуцированному ангиотензинном II входу Ca2+ извне в клетки. В то же время наноразмерный кортизол-полимерный комплекс практически не влияет на стимулированный АII выход Ca2+ из внутриклеточных депо. 5. В физиологическом диапазоне концентраций наноразмерный кортизолполимерный комплекс потенцирует действие ангиотензин II, его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов. 6. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволило разделить геномные и негеномные механизмы регуляции активности клетки-мишени. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94 1. Авдонин П.В., Ткачук В.А., Рецепторы и внутриклеточный кальций.-М.: Наука, 1994. 2. Базисная и клиническая фармакология / Пер.с англ. Под ред. Бертрама Г.Катцунга. – М.: Бином. 1998. – Т.1,2. 3. Владимиров Ю.А. Дизрегуляция проницаемости мембран митохондрий, некроз и апоптоз // Дизрегуляционная патология. М., 2002. С. 127-157. 4. Голиков П.П. Рецепторные механизмы глюкокортикоидного эффекта. М., "Медицина", 1988. 286с. 5. Голиков П.П. Рецепторные механизмы антиглюкокортикоидного эффекта при неотложных состояниях. М.: Медицина, 2002. - 312 С. 6. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л.- 1973. 7. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран, и липопротеинов. М.- Наука.-1989. 8. Духанин А.С., Сергеев П.В., Патрашев Д.В. Молекулярные механизмы реализации начальных этапов глюкокортикоид-индуцированного апоптоза // Иммунология. 1998. №1. С.18–21. 9. Лига А.Б., Ухина Т.В., Ржезников В.М., Шимановский Н.Л. Исследование пролиферативной активности фибробластов кожи крыс при воздействии глюкокортикоидов и гестагенов // Экспер. и клин. фармакол. 2008. Т.71. №5. С.44–47. 10.Лушников Е.Ф., Загребин В.М. Апоптоз клеток: морфология, биологическая роль, механизмы развития.//Архив анатомии, гистологии и эмбриологии.- 1990.- 99(12).- С. 68-77. 11.Никитин В.Б. Поиск новых противовоспалительных и антиаллергических препаратов в ряду производных 17(-гидроперокси-16-метилпрегнанов //Автореф.канд.дисс., М., 1991. 12.Омельяновский В.В. Состояние пуриновой рецепции у больных бронхиальной астмой и влияние различных методов лечения на рецепторный статус//Автореф. дис. канд. мед. наук. Москва.- 1992.- с.24. 13.Орлов С.Н., Лабас Ю.А. // Биологические мембраны. - 1989. – 6(9). - с. 901938. 14.Палеев Я.Р., Ильченко В.А., Голиков П.П. и др. Индивидуальная чувствительность больных к глюкокортикоидам и гормонрезистентность при бронхиальной астме // Тер.арх., 1994, N12, с.56-59. 15.Патрашев Д.В., Духанин А.С., Огурцов С.И. Внутриклеточный рН на ранних стадиях апоптоза и некроза тимоцитов // Бюл. экспер. биол. и мед. 1999. №10. С.387–390. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 95 16.Попова НЮ, Духанин АС, Шимановский НЛ. Негеномный эффект андрогенов на содержание ионов кальция в лимфоцитах человека. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2007; т.142, № 5: 542-544 17.Розен В.Б. Циторецепторы в молекулярных механизмах действия гормонов. //Пробл.эндокринол., 1985, N5, с.21-26. 18.Самойликов РВ, Семейкин АВ, Духанин АС, Шимановский НЛ. Геномные и негеномные механизмы антиглюкокортикоидного эффекта гестагенов. //Экспер. фармакология и терапия. 2006; №4: 43-46. 19.Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. М.: 1998.- с 400. 20.Сергеев П.В., Галенко-Ярошевский П.А., Ханкоева А.И., Духанин А.С. Исследование влияния бефола на кальциевый обмен в кардиомиоцитах с помощью флуоресцентного зонда Fura-2 // Бюл. экспер. биол. и мед. 1996. №3. С.288–291. 21.Сергеев П.В., Галенко-Ярошевский П.А., Шимановский Н.Л. Очерки биохимической фармакологии.- М.: РЦ"Фармединфо", 1996.- с.384. 22.Сергеев П.В., Духанин А.С., Шимановский H.Л. Плазматическая мембрана клетки-мишени и стероидные гормоны: начало спора или его завершение. //Бюл.эксперим.биол. и мед. 1995. -Т.120. -№10. - С. 342- 348. 23.Сергеев П.В., Шимановский H.Л, Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. М.- Волгоград, 1999. - 638 С. 24.Сергеев П.В., Шимановский H.Л. Рецепторы. М., 1987. - 400 С. 25.Чучалин А.Г., Шмушкевич Б.И., Мавраев Д.Э. Кортикозависимая форма бронхиальной астмы (вопросы клиники, патоге- неза и лечения) // Тер.арх., 1984, N3, с.142-150. 26.Шимановский Н.Л. Резистентность к глюкокортикоидам: механизмы и клиническое значение // Фарматека. 2005. №3. С.7–12. 27.Шимановский Н.Л., Епинетов М.А., Мельников М.Я. Молекулярная и нанофармакология. М.: Физматлит, 2010. - 624 с. 28.Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах. //Иммунология.1996.-6.- С. 10-23. 29.Abdalla, S., Lother, H., Abdel-tawab, A. M. and Quitterer, U. The angiotensin II AT2 receptor is an ATI receptor antagonist // J Biol Chem. 2001.-V.276.-№.43 .P.39721 -39726 30.Amsterdam A., Sasson R. The anti-inflammatory action of glucocorticoids is mediated by cell type specific regulation of apoptosis // Mol Cell Endocrinol. 2002. V.189. P.1–9. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 96 31.Amsterdam A., Tajima K., Sasson R. Cell-specific regulation of apoptosis by glucocorticoids: implication to their anti-inflammatory action // Biochem Pharmacol. 2002. V.64. P.843–850. 32.Ashwell JD, King LB, Vacchio MS. Cross-talk between the T cell antigen receptor and the glucocorticoid receptor regulates thymocyte development. // Stem Cells 1996 Sep; 14(5): 490-500. 33.Ayroldi E, Cannarile L, Migliorati G, Nocentini G, Delfino DV, Riccardi C. Mechanisms of the anti-inflammatory effects of glucocorticoids: genomic and nongenomic interference with MAPK signaling pathways.// FASEB J. 2012 Dec;26(12):4805-20. 34.Bartholome B, Spies CM, Gaber T, Schuchmann S, Berki T, Kunkel D, et al. Membrane glucocorticoid receptors (mGCR) are expressed in normal human peripheral blood mononuclear cellsand up-regulated after in vitro stimulation and in patients with rheumatoid arthritis. FASEB J 2004;18:70–80. 35.Bartis D, Boldizsar F, Szabo M, Palinkas L, Nemeth P, Berki T. Dexamethasone induces rapid tyrosine-phosphorylation of ZAP-70 in Jurkat cells. J Steroid Biochem Mol Biol 2006;98:147–54. 36.Baschant U., Tuckermann J. The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity // J Steroid Biochem Mol Biol. 2010. V.120. P.69–75. 37.Baulieu ЕЕ. Neurosteroids: A new function in the brain. // Biol Cell 1991; 71:310. 38.Beato M. Gene regulation by steroid hormones. // Cell 1989; 56:335-344. 39.Bedner E., Li X., Gorczyca W., Melamed M.R., Darzynkiewicz Z. Analysis of apoptosis by laser scanning cytometry.//Cytometry. – 1999. - 35(3). – Р.181-195 40.Benten WP, Lieberherr M, Giese G, Wrehike C, Stamm O, Sekeris CE, Mossmann H, Wunderlich P. Functional testosterone receptors in plasma membranes of T cells. // FASEB J 1999;13:123-133. 41.Boas U., Heegaard P.M.H. Dendrimers in drug research. // Chem. Soc. Rev. – 2004. - Vol.33, P.43-63 42.Boldizsar F, Talaber G, Szabo M, Bartis D, Palinkas L, Nemeth P, et al. Emerging pathways of non-genomic glucocorticoid (GC) signalling in T cells. Immunobiology 2010; 215:521–6. 43.Boonyaratnakonkit V., McGowan E., Sherman L. et al. The Role of Extranuclear Signaling Actions of Progesterone Receptor in Mediating Progesterone Regulation of Gene Expression and the Cell Cycle. // Mol Endocrinol, 2007; Vol.21, P.359– 375. 44.Bowen I.D., Bowen S.M. Programmed cell death in tumors and tissues. London.- 1990.- P. 4-45. 45.Boyan BD, Posner GH, Greising DM, White MC, Sylvia VL, Dean DD, Schwartz Z. Hybrid structural analogues of 1,26-(OH)2D3 regulate chondrocyte proliferation and proteoglycan production as well aa protein kinase С through a _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 97 nongenomic pathway. // J Cell Biochem 1997;66:457-470. 46.Brilla CG, Maisch B, Zhou G, Weber KT. Hormonal regulation of cardiac fibroblast function. //Eur Heart J. 1995.Vol.16, Suppl C:45-50. 47.Buttgereit F, Burmester GR, Lipworth BJ. Optimised glucocorticoid therapy: the sharpening of an old spear. Lancet 2005;365: 801–3. 48.Buttgereit F, Scheffold A. Rapid glucocorticoid effects on immune cells. Steroids 2002;67:529–34. 49.Chang A.S., Chang S.M. Nongenomic steroidal modulation of high-affinity serotonin transport. //Biochim. Biophys. Acta. – 1999. - 1417(1). – Р.157-166 50.Christ M., Gunther A., Heck M., Schmidt B.M., Falkenstein E., Wehling M. Aldosterone, not estradiol, is the physiological agonist for rapid increases in cAMP in vascular smooth muscle cells. // Circulation. – 1999. - 99(11). – Р.14851491 51.Croxtall JD, Choudhury Q, Flower RJ. Glucocorticoids act within minutes to inhibit recruitment of signalling factors to activated EGF receptors through a receptor-dependent, transcription-independent mechanism. Br J Pharmacol 2000;130:289–98. 52.De Giusti VC, Nolly MB, Yeves AM, Caldiz CI, Villa-Abrille MC, Chiappe de Cingolani GE, Ennis IL, Cingolani HE, Aiello EA. Aldosterone stimulates the cardiac Na(+)/H(+) exchanger via transactivation of the epidermal growth factor receptor. // Hypertension. 2011 Nov;58(5):912-9. 53.Dindia L, Murray J, Faught E, Davis TL, Leonenko Z, Vijayan MM. Novel nongenomic signaling by glucocorticoid may involve changes to liver membrane order in rainbow trout.// PLoS One. 2012;7(10):e46859 – 62. 54.Doolan C.M., O'Sullivan G.C., Harvey B.J. Rapid effects of corticosteroids on cytosolic protein kinase C and intracellular calcium concentration in human distal colon.//Mol. Cell. Endocrinol. – 1998. - 138(1-2). – Р.71-79 55.Dopp E., Vollmer G., Hahnel C., Grevesmuhl Y., Schiffmann D. Modulation of the intracellular calcium level in mammalian cells caused by 17beta-estradiol, different phytoestrogens and the anti-estrogen ICI 182780.//J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 1999. - 68(1-2). – Р.57-64 56.Dosiou, C., Hamilton, A. E., Pang, Y., Overgaard, M. T., Tulac, S., Dong, J., Thomas, P., Giudice, L. C. Expression of membrane progesterone receptors on human T lymphocytes and Jurkat cells and activation of G-proteins by progesterone // Endocrinology 2008; 196 (1): 67-77 57.Engmann L, Losel R, Wehling M, Peluso JJ. Progesterone regulation of human granulosa/luteal cell viability by an RU486-independent mechanism. // J Clin Endocrinol Meta, 2006; Vol.91,P.4962–4968. 58.Falkenstein E, Norman AW, Wehling M. Mannheim classification of nongenomically initiated (rapid) steroid action(s). // J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85, 2072-2075. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 98 59.Frye CA, Vongher JM. Progesterone has rapid and membrane effects in the facilitation of female mouse sexual behavior. // Brain Res 1999; 815: 259-269. 60.Funder JW. Mineralocorticoids, glucocorticoids, receptors and response elements. // Science 1993;259:1132-1133. 61.Gekle M, Bretschneider M, Meinel S, Ruhs S, Grossmann C. Rapid mineralocorticoid receptor trafficking. // Steroids. 2014 Mar;81:103-8. 62.Gekle M, Golenhofen N, Oberleithner H, Silbernagi S. Rapid activation of Na +/H+ exchange by aldosterone in renal epithelial cells requires Ca2+ and stimulation of a plasma membrane proton conductance. // Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:10500-10504. 63.Gessi S, Merighi S, Borea PA Glucocorticoid's pharmacology: past, present and future.// Curr Pharm Des. 2010; 16(32):3540-53. 64.Grinstein S., Woodside M., Goss G.G., Kapus A. Osmotic activation of the Na+/H+ antiporter during volume regulation. // Biochem.Soc.Trans.- 1994.22(2).- P.512-516. 65.Hafizi S, Wharton J, Morgan K, Allen SP et al. Expression of functional angiotensin-converting enzyme and AT1 receptors in cultured human cardiac fibroblasts. // Circulation. 1998, Vol.98, P.2553-2559 66.Haller J, Mikics E, Makara GB. The effects of non-genomic glucocorticoid mechanisms on bodily functions and the central neural system: a critical evaluation of findings. Front Neuroendocrinol 2008;29:273–91. 67.Hirano T, Homma M, Oka K, Tsushima H, Niitsuma T, Hayashi T. Individual variations in lymphocyte-responses to glucocorticoids in patients with bronchial asthma: comparison of potencies for five glucocorticoids.// Immunopharmacology 1998 Jul;40(l):57-66. 68.Huang MH, So EC, Liu YC, Wu SN. Glucocorticoids stimulate the activity of large-conductance Ca2_-activated K_ channels in pituitary GH3 and AtT-20 cells via a non-genomic mechanism. Steroids 2006;71:129–40. 69.Jiang CL, Liu L, Tasker JG. Why do we need nongenomic glucocorticoid mechanisms? // Front Neuroendocrinol. 2014 Jan;35(1):72-5. 70.Kadmiel M, Cidlowski JA. Glucocorticoid receptor signaling in health and disease.//Trends Pharmacol Sci. 2013; 34(9):518-30. 71.Klein-Hitpass L., Schwerk C., Kahmann S., Vassen L. Targets of activated steroid hormone receptors: basal transcription factors and receptor interacting proteins.//J. Mol. Med. – 1998. - 76(7). – Р.490-496 72.Koukouritaki SB, Theodoropooulos PA, MargiorisAN, GravanisA, Stournaras C. Dexamethasone alters rapidly actin polymerization dynamics in human endometrial cells: Evidence for nongenomic actions involving cAMP turnover. // J Cell Biochem 1996; 62:251-261. 73.Labeur M, Holsboer F. Molecular mechanisms of glucocorticoid receptor signaling.// Medicina (B Aires). 2010; 70(5):457-62. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 99 74.Lau T, Heimann F, Bartsch D, Schloss P, Weber T. Nongenomic, glucocorticoid receptor-mediated regulation of serotonin transporter cell surface expression in embryonic stem cell derived serotonergic neurons.// Neurosci Lett. 2013 Oct 25;554:115-20. 75.Lee SR, Kim HK, Youm JB, Dizon LA, Song IS, Jeong SH, Seo DY, Ko KS, Rhee BD, Kim N, Han J. Non-genomic effect of glucocorticoids on cardiovascular system. // Pflugers Arch. 2012 Dec;464(6):549-59. 76.Li L, Haynes MP, Bender JR. Plasma membrane localization and function of the estrogen receptor _ variant (ER46) in human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:4807–12. 77.Liu G, Liu G, Alzoubi K, Umbach AT, Pelzl L, Borst O, Gawaz M, Lang F. Upregulation of Store Operated Ca Channel Orai1, Stimulation of Ca(2+) Entry and Triggering of Cell Membrane Scrambling in Platelets by Mineralocorticoid DOCA.// Kidney Blood Press Res. 2013;38(1):21-30. 78.Liu L, Wang YX, Zhou J, Long F, Sun HW, Liu Y, et al. Rapid non-genomic inhibitory effects of glucocorticoids on human neutrophil degranulation. Inflamm Res 2005;54:37–41. 79.Lou S.J., Chen Y.Z. The rapid inhibitory effect of glucocorticoid on cytosolic free Ca2+ increment induced by high extracellular K+ and its underlying mechanism in PC12 cells.//Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1998. - 244(2). – Р.403-407 80.Löwenberg M, Stahn C, Hommes DW, Buttgereit F. Novel insights into mechanisms of glucocorticoid action and the development of new glucocorticoid receptor ligands.// Steroids. 2008;73(9-10):1025-9. 81.Lowenberg M, Tuynman J, Bilderbeek J, Gaber T, Buttgereit F, van Deventer S, et al. Rapid immunosuppressive effects of glucocorticoidsmediated through Lck and Fyn. Blood 2005;106:1703–10. 82.Lowenberg M, Verhaar AP, Bilderbeek J, Marle J, Buttgereit F, Peppelenbosch MP, et al. Glucocorticoids cause rapid dissociation of a T-cell-receptor-associated protein complex containing LCK and FYN. EMBO Rep 2006;7:1023–9. 83.Lu NZ, Cidlowski JA. Glucocorticoid receptor isoforms generate transcription specificity. Trends Cell Biol 2006;16:301–7. 84.Lubman R.L., Chao D.C., Crandall E.D. Basolateral localization of Na(+)-HCO3- cotransporter activity in alveolar epithelial cells. // Respir.Physiol.- 1995.-100(1).- P. 15-24. 85.Luconi M, Bonaccorsi L, Maggi M, Pecchioli P, Krausz C, Forti G, Baldi E. Identification and characterization of functional nongenomic progesterone receptors on human sperm membrane. // J Clin Endocrinol Metab 1998; 83:877885. 86.Machelon V, Nome F, Tesarik J. Nongenomic effects of androstenedione on human granulosa luteinizing cells. // J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 263-269. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 100 87.Maier C, Runzler D, Schindelar J, Grabner G, Waldhausl W, Kohler G, et al. Gprotein-coupled glucocorticoid receptors on the pituitary cell membrane. J Cell Sci 2005;118:3353–61. 88.Medh RD, Lay RH, Schmidt TJ. Agonist-specific modulation of glucocorticoid receptor-mediated transcription by immunosuppressants.// Mol Cell Endocrinol 1998Mar 16;138(1-2):11-23. 89.Monje P., Boland R. Characterization of membrane estrogen binding proteins from rabbit uterus. //Mol. Cell Endocrinol. – 1999. - 147(1-2). – Р.75-84 90.Moore F.L., Orchinik M., Lowry C. Functional studies of corticosterone receptors in neuronal membranes.//Receptor.- 1995.-vol.5, N1.- p.21-28. 91.Nemere I, Schwartz Z, Pedrozo H, Sylvia VL, Dean DD, Boyan BD. Identification of a membrane receptor for 1,25-dihydroxyvitamin D3 which mediates rapid activation of protein kinase C.// J Bone Miner Res 1998; 13:13531359. 92.Norman AW, Wehling M. Overview of the first international meeting on rapid responses to steroid hormones. // Steroids 1999; 64:3-4. 93.Pedram A, Razandi M, Levin ER. Nature of functional estrogen receptors at the plasma membrane. Mol Endocrinol 2006;20: 1996–2009. 94.Pedram A, Razandi M, Sainson RC, Kim JK, Hughes CC, Levin ER. A conserved mechanism for steroid receptor translocation to the plasma membrane. J Biol Chem 2007;282:22278–88. 95.Perez-Martinez L, Carreon-RodriguezA, Gonzalez-Alzati ME. Morales С Charii JL, Joseph-Bravo P. Dexamethasone rapidly regulates TRH mRNA levels in hypothalamic cell cultures: interaction with the cAMP pathway. // Neuroendocrinology 1998 Nov;68(5):345-354. 96.Rang H.P., Dale M.M., Ritter J.M. Pharmacology. – Churchill Livingstone edinburgh, london, N.Y., Philadelphia, Sydney, Toronto, 2005. 97.Reichardt HM, Kaestner KH, Tuckermann J, Kretz 0, Wessely 0, Bock R, Gass P, Schmid W, Herrlich P, Angel P, Schutz G. DNA binding of the glucocorticoid receptor is not essential for survival. // Cell 1998 May 15;93(4):531-541. 98.Revollo JR, Cidlowski JA. Mechanisms generating diversity in glucocorticoid receptor signaling.// Ann N Y Acad Sci. 2009 Oct;1179:167-78. 99.Samarasinghe RA, Di Maio R, Volonte D, Galbiati F, Lewis M, Romero G, DeFranco DB. Nongenomic glucocorticoid receptor action regulates gap junction intercellular communication and neural progenitor cell proliferation.// Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Oct 4;108(40):16657-62. 100. Sato A, Sheppard KE, Fullerton MJ, Funder JW. cAMP modulates glucocorticoid-induced protein accumulation and glucocorticoid receptor in cardiomyocytes. // Am J Physiol 1996 Nov; 271(5 Pt 1):E827-E833. 101. Schacke H, Docke WD, Asadullah K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids. Pharmacol Ther 2002;96:23–43. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 101 102. Schacke H, Schottelius A, Docke WD, Strehlke P, Jaroch S, Schmees N, et al. Dissociation of transactivation from transrepression by a selective glucocorticoid receptor agonist leads to separation of therapeutic effects from side effects. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:227–32. 103. Schmidt B, Gerdes D, Feuring M et al. Rapid, Nongenomic Steroid Actions: A New Age? //Frontiers in Neuroendocrin. 2000, 21, 57-94. 104. Schmidt B.M., Christ M., Falkenstein E., Wehling M. Nongenomic steroid actions: completing the puzzle. Aldosterone as an example.//Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. – 1998. - 106(6). – Р.441-445 105. Schoneveld JL, Fritsch-Stork RD, Bijlsma JW. Nongenomic glucocorticoid signaling: new targets for immunosuppressive therapy? //Arthritis Rheum. 2011 Dec;63(12):3665-7. 106. Shahidi H, Vottero A. Stratakis CA, Taymans SE, Kari M, Longui CA, Chrousos GP, Daughaday WH, Gregory SA, Plate JM. Imbalanced expression of the glucocorticoid receptor isoforms in cultured lymphocytes from a patient with systemic glucocorticoid resistance and chronic lymphocytic leukemia.// Biochem Biophys Res Commun 1999 Jan 27;254(3):559-65 107. Sheppard KA, Phelps KM, Williams AJ, Thanos D, Glass CK, Rosenfeld MG, Gerritsen ME, Collins T. Nuclear integration of glucocorticoid receptor and nuclear factor-kappaB signaling by CREB-binding protein and steroid receptor coactivator-1. // J Biol Chem 1998 Nov 6;273(45):29291-29294. 108. Solito E, Mulla A, Morris JF, Christian HC, Flower RJ, Buckingham JC. Dexamethasone induces rapid serine-phosphorylation and membrane translocation of annexin 1 in a human folliculostellate cell line via a novel nongenomic mechanism involving the glucocorticoid receptor, protein kinase C, phosphatidylinositol 3-kinase, and mitogen-activated protein kinase. Endocrinology 2003;144:1164–74. 109. Song IH, Buttgereit F. Non-genomic glucocorticoid effects to provide the basis for new drug developments. Mol Cell Endocrinol 2006;246:142–6. 110. Spies CM, Schaumann DH, Berki T, Mayer K, Jakstadt M, Huscher D, et al. Membrane glucocorticoid receptors are down regulated by glucocorticoids in patients with systemic lupus erythematosus and use a caveolin-1-independent expression pathway. Ann Rheum Dis 2006;65:1139–46. 111. Stahn C, Buttgereit F. Genomic and nongenomic effects of glucocorticoids. Nat Clin Pract Rheumatol 2008;4:525–33. 112. Stahn C, Lowenberg M, Hommes DW, Buttgereit F. Molecular mechanisms of glucocorticoid action and selective glucocorticoid receptor agonists. Mol Cell Endocrinol 2007;275:71–8. 113. Strehl C, Buttgereit F. Optimized glucocorticoid therapy: teaching old drugs new tricks. // Mol Cell Endocrinol. 2013 Nov 5;380(1-2):32-40. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 102 114. Strehl C, Buttgereit F. Unraveling the functions of the membrane-bound glucocorticoid receptors: first clues on origin and functional activity.// Ann N Y Acad Sci. 2014 Feb 25. doi: 10.1111/nyas.12364. 115. Strehl C, Gaber T, Lowenberg M, Hommes DW, Verhaar AP, Schellmann S, et al. Origin and functional activity of the membranebound glucocorticoid receptor. Arthritis Rheum 2011;63:3779–88. 116. Szondy Z. Adenosine stimulates DNA fragmentation in human thymocytes by Ca(2+) -mediated mechanisms.//Biochem. J.- 1994.-vol.304.- p.877-885. 117. Tang Y, DeFranco DB. ATP-dependent release of glucocorticoid receptors from the nuclear matrix. // Mol Cell Biol 1996 May; 1 б( 5): 1989-2001. 118. Tatton W.G., Olanow C.W. Apoptosis in neurodegenerative diseases: the role of mitochondria.//Biochim. Biophys. Acta. – 1999. - 1410(2). – Р.195-213 119. Toran-Allerand CD, Singh M, Setalo GJr. Novel mechanisms of estrogen action in the brain: new players in an old story. // Front Neuroendocrinol 1999; 20: 97-121. 120. Tryc AB, Spies CM, Schneider U, Kunkel D, Berki T, Sieper J, et al. Membrane glucocorticoid receptor expression on peripheral blood mononuclear cells in patients with ankylosing spondylitis. J Rheumatol 2006;33:2249–53. 121. Vernocchi S, Battello N, Schmitz S, Revets D, Billing AM, Turner JD, Muller CP. Membrane glucocorticoid receptor activation induces proteomic changes aligning with classical glucocorticoid effects. //Mol Cell Proteomics. 2013 Jul;12(7):1764-79. 122. Viegas L.R., Hoijman E., Beato M., Pecci A. Mechanisms involved in tissuespecific apoptosis regulated by glucocorticoids // J Steroid Biochem Mol Biol. 2008. V.109. P.273–278. 123. Vig E., Barrett T.J., Vedeckis W.V. Coordinate regulation of glucocorticoid receptor and c-jun mRNA levels: evidence for cross-talk between two signaling pathways' at the transcriptional level.//Mol. Endocrinol.- 1994.- vol.8, N10.p.1336-1346. 124. Wang, Y.S. Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. // Adv. Drug Deliv. Rev., 2002, Vol. 54, P.547-570. 125. Watson C.S., Gametchu B. Membrane-initiated steroid actions and the proteins that mediate them.//Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1999. - 220(1). – Р.9-19 126. Wehling M, Spes CH, Win N, Janson CP, Schmidt BM, Theisen K, Christ M. Rapid cardiovascular action of aldosterone in man.// J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 3517-3522. 127. Wehling M. Specific, nongenomic actions of steroid hormones.//Annu. Rev. Physiol. – 1997. – 59. – Р.365-393 128. Weigel NL, Zhang Y. Ligand-independent activation of steroid hormone receptors. //Mol Med 1998 Jun; 7 6(7): 469-479. _____________СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _______________ 103 129. Zeng J, Li M, Xiao Z, Chen Y, Chang Q, Tian H, Jin H, Liu X. Rapid elevation of calcium concentration in cultured dorsal spinal cord astrocytes by corticosterone.// Neurochem Res. 2013 Feb;38(2):382-8 130. Zhang T, Shi WL, Tasker JG, Zhou JR, Peng YL, Miao CY, Yang YJ, Jiang CL. Dexamethasone induces rapid promotion of norepinephrine-mediated vascular smooth muscle cell contraction. // Mol Med Rep. 2013 Feb;7(2):549-54.
