ТезисыМиН2015_Соболев_коррx

УДК 577.29
КИНЕТИКА БИФЕРМЕНТНОЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ РЕАКЦИИ В
УСЛОВИЯХ МОЛЕКУЛЯРНОГО КРАУДИНГА
Соболев П.В.,
научный руководитель канд. физ.-мат. наук Немцева Е. В.
Сибирский федеральный университет
Внутриклеточная среда, в которой функционируют ферменты in vivo,
существенно отличается от буферных растворов, используемых в классической
биохимии. Она отличается высокой концентрацией белков, нуклеиновых кислот,
полисахаридов и низкомолекулярных соединений, занимающих до 40% её объема. Для
обозначения таких условий используют термин «молекулярный краудинг». В условиях
молекулярного краудинга
неспецифическое стерическое отталкивание молекул
(например, за счет электростатических или гидрофобных взаимодействий) создает
эффект «исключенного объема», обусловленного взаимной непроницаемостью всех
молекул растворенных веществ [1]. Это оказывает значительное влияние на
термодинамическую активность, как макромолекул, так и низкомолекулярных
соединений. В таких условиях реакционная способность любого растворимого
макромолекулярного вещества (например, фермента) будет сильно зависеть от
доступного объема. In vitro краудинг моделируют внесением высоких концентраций
инертных молекул (краудинг-агентов).
Показано, что условия молекулярного краудинга могут существенно изменять
конформационную стабильность и структурные характеристики биологических
макромолекул, сдвигать равновесия процессов фолдинга белков, связывания их с
малыми молекулами, понижать ферментативную активность и т.д. [2].
Биолюминесцентные реакции являются удобной моделью ферментативных
процессов, т.к. активность ферментов такой системы легко регистрируется по
интенсивности свечения. Как влияет молекулярный краудинг на биолюминесцентные
системы, до сих пор не исследовалось.
Целью данной работы являлось определение кинетических параметров
биферментной биолюминесцентной системы бактерий в условиях молекулярного
краудинга.
Материалы и методы
Объектом исследования являлась биферментная биолюминесцентная система
светящихся бактерий, представляющая собой сопряженные реакции бактериальной
люциферазы (L) и NADH:FMN-оксидоредуктазы (R):
NADH + FMN _NADH:FMN-оксидоредуктаза> NAD+ + FMNH2
FMNH2 + C14 + O2 Люцифераза> FMN + C14* + H2O + h,
где NADH – никатинамидадениндинуклеотид восстановленный, FMN –
флавинмононуклеотид окисленный, NAD+ – никатинамидадениндинуклеотид
окисленный, FMNH2 – флавинмононуклеотид восстановленный, C14 - миристиновый
альдегид, O2 – кислород, C14* – миристиновая кислота H2О – вода, h – квант света (490
нм).
В работе использовали ферментативный препарат КРАБ (комплекс реактивов
аналитической биолюминесценции), содержащий бактериальную люциферазу
Photobacterium leiognathi и NADH:FMN-оксидоредуктазу Vibrio fisheri, производства
лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции Института биофизики СО РАН.
Молекулярный краудинг моделировали добавлением в среду различных концентраций
полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 Да (PEG 4000).
Активность биферментной системы регистрировали при следующей комбинации
реагентов: 100 мкл FMN (510-4M), 300 мкл буфера 0,05 М (pH 6,8) или буфера с
заданной концентрацией PEG, 50 мкл NADH (410-4M), 50 мкл С14 (2,410-5 M), 5 мкл
КРАБ (концентрация люциферазы 3 мкМ),
Кинетические кривые записывали на биолюминометре GloMax (Promega) и
анализаторе быстрых химических процессов SX-20 (Applied Photophysics).
Результаты и обсуждение
Были зарегистрированы кинетические кривые биолюминесценции биферментной
системы NADH:FMN-оксидоредуктаза+люцифераза в присутствии 1-20% PEG 4000
(Рисунок 1). Типичная кинетика такой системы протекает, как минимум, в три стадии:
стадия выхода свечения на максимум, стационарного свечения (стадия плато) и спада
свечения. По рисунку 1 видно, что при 15 и 20% содержании PEG увеличивается
интенсивность биолюминесценции и меняется кинетика начальной стадии. При низких
концентрациях (1% и 5%) наблюдается снижение интенсивности биолюминесценции
биферментной системы.
Интенсивность, отн.ед.
0.5
0.4
0% - контроль
0.3
1%
5%
0.2
15%
0.1
20%
0.0
0
50
100
Время, с
Рисунок 1 – Кинетические кривые биферментной биолюминесцентной системы
NADH:FMN-оксидоредуктаза+люцифераза в присутствии разных концентраций PEG
4000.
Изменения параметров кинетики, таких как относительный максимум свечения и
время выхода на максимум, приведены на рисунке 2. Видно, что они меняются
немонотонно.
Ранее была исследована кинетика биферментной системы в средах с разными
концентрациями желатина [3]. Была получена схожая картина – низкие концентрации
желатина вызывают ингибирование биолюминесценции, а высокие – активируют.
Авторы связывают этот эффект с образованием трехмерной сетки желатинового геля,
но почему формирование сетки выгодно для биферментной системы – не ясно.
Сопоставление с нашими данными позволяет предположить, что в обоих случаях
играет роль механизм исключенного объема, который, как известно из литературы,
может способствовать ассоциации белковых макромолекул. Можно предположить, что
в случае биферментной системы в условиях исключенного объема усиливается
взаимодействие между двумя ферментами, что приводит к усилению свечения. При
малых концентрациях PEG 4000 или желатина эффект исключенного объема выражен
слабо, и PEG или желатин играют роль ингибитора.
А
Б
100
2
80
Tmax, с
I /I0
1.5
1
0.5
60
40
20
0
0
0
5
10
15
20
25
Концентрация PEG 4000, %
0
5
10
15
20
25
Концентрация PEG 4000, %
Рисунок 2 – Параметры кинетики биферментной биолюминесцентной системы
NADH:FMN-оксидоредуктаза+люцифераза в присутствии разных концентраций PEG
4000: А – относительный максимум свечения, Б – время выхода на максимум.
Таким образом, в результате проделанной работы были сделаны следующие
выводы:
 При низкой концентрации PEG 4000 в среде (1%; 5%) наблюдается
ингибирование биферментной биолюминесцентной реакции бактерий, возможно, за
счет усиления взаимодействия краудинг-агента с компонентами системы.
 Высокая концентрация PEG 4000 (15%;20%) активирует биферментную
биолюминесцентную систему, что является проявлением эффекта краудинга, который,
как правило, реализуется за счет увеличения белок-белкового и фермент-субстратного
сродства.
Благодарности
Авторы благодарят Лисицу Альберта Евгеньевича за помощь в работе с
анализатором кинетики быстрых процессов. Работа выполнена при частичной
поддержке проекта 1762 в рамках государственного задания Минобрнауки России
Сибирскому федеральному университету.
Список использованных источников
1. Чеботарева, Н. А. Влияние молекулярного краудинга на ферменты гликогенолиза / Н.
А. Чеботарева // Успехи биологической химии. – 2007.- №47. – с. 233-258.
2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can
do to a protein / I. M. Kuznetsova , K. K. Turoverov V. N. Uversky //J. Mol. Sci.- 2014.-с.
23090-23140.
3. Bezrukikh A. et al. Gelatin and starch as stabilizers of the coupled enzyme system of
luminous bacteria NADH: FMN–oxidoreductase–luciferase //Analytical and bioanalytical
chemistry. – 2014. – Т. 406. – №. 23. – С. 5743-5747.