Abstract/FREE Full Text

Генная терапия кардиомиопатиии у MDX мышей.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Yongping Yue, BA;
Zhenbo Li, PhD;
Scott Q. Harper, PhD;
Robin L. Davisson, PhD;
Jeffrey S. Chamberlain, PhD;
Dongsheng Duan, PhD
+ Author Affiliations
1. From the Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Missouri School of
Medicine, Columbia, Mo (Y.Y., D.D.); the Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa
Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, Iowa City, Iowa (Z.L., R.L.D.); and the Department of
Neurology, The University of Washington School of Medicine, Seattle, Wash (S.Q.H., J.S.C.).
1. Correspondence to Dongsheng Duan, PhD, M610G, MSB, Department of Molecular Microbiology and
Immunology, University of Missouri, School of Medicine, 1 Hospital Dr, Columbia, MO 65212. E-mail
duand@missouri.edu
Миодистрофия Дюшена наиболее часто встречающееся летальное заболевание мышечной ткани. У 95%
пациентов развивается поражение сердца, а у 10%-15% развивается сердечная недостаточность.1 Кроме
того, ≥90% пациентов с миодистрофией Беккера и женщины, носители гена миодистрофии Дюшена
имеют нарушения сердечной деятельности.2 Для многих пациентов трансплантация сердца единственный
способ лечения кардиомиопатии. 3
Миодистрофия Дюшена и Беккера вызваны мутациями гена дистрофина. Замена дефектного гена
функциональным гомологичным геном представляет собой одну из возможностей лечения. В последние
несколько лет генная терапия миодистрофии Дюшена была направлена на восстановление функции
скелетной мускулатуры,4 но не уделяла достаточно внимания лечению Известно одно исследование, когда
в сердце mdx и cxmd мышей пересадили фетальные кардиомиоциты , но экспрессия была ограничена
пересаживаемы клетками..5
Небольшое число исследований генной терапии сердца, отсутствие однозначных результатов обусловлено
двумя причинами. Во-первых, труднодоступность и функции сердечной мышцы обусловливают
сложности генной терапии. Во-вторых, размер гена дистрофина превышает вместимость вектора. Что бы
преодолеть второе препядствие использовался ген микродистрофина, составляющий 30% от гена
дистрофина. 6.Такой микроген способен продуцировать функциональный дистрофин в скелетных мышцах
и в том числе и диафрагме.7,7a
Различные методы переноса генов в сердце продолжают разрабатываться. Different heart gene transfer
techniques have also been explored. Поставка генов в сердце производится прямой инъекцией или инъекцией
в коронарные сосуды.больших животных, таких как хомяки, крысы или кролики.Однако в большинстве
исследований использовали 8,9 Использование мышей представляет собой более сложную задачу.10–12
Свенсон10 сообщал о методе инъекций в миокард для доставки адено-ассоциированого вируса у взрослых мышей.
Однако, зкспрессия была обнаружена.
только в области инъекций.Эти методы
продолжают
разрабатываться для более эффективной доставки гена, предложены также метод множественных
инъекций, коронарной артериальной инъекции, внутриполостной доставки гена..10–12 Кристенсен 12
исследовал транспортировку гена в полость сердца зародышей мышей.Это исследование продолжалось в
течение 6 месяцев, при чем у мышей не обнаружено нарушений функции сердца.
В настоящем исследовании мы оптимизировали методы доставки гена к сердцу новорожденных мышей
разработанные Кристенсеном. 12 .Более важно, что мы оценили терапевтический потенциал доставки ΔR423/ΔCT микродистрофина (ΔR4)7.Для трансгенного и АVV опосредованного переноса генов мы
использовали ΔR4 ген, более функциональный в исследованиях на скелетной мускулатуре. Mdx мышей.7
Наши результаты показали, что AAV-опосредованная доставка гена более эффективна для доставки ΔR4
гена в сердце mdx мышей. Кроме того, экспрессия гена ΔR4 была достаточной для восстановления
дистрофин-гликопротеинового комплекса и встраивания его в сарколемму.
Mетоды
Рекомбинантная AAV продукция
Производство вируса проведено как описано прежде.13 pCisCMV.LacZ и pCisCK6.LacZ были описаны
прежде.14 pCisRSV.Alkaphos был сконструирован переносом фрагмента 2.2-kb XbaI содержащий ген
алкалиновой фосфатазы pDD1.14 pCisCMV.ΔR4 был синтезирован переносом фрагмента промотера 508bp KpnI/XbaI цитомегаловируса (CMV) в предварительно описанный pCisCK6.ΔR4.7
Неонатальная передача кардиального гена.
Все эксперементы с животными согласованы с руководством.Перенос генов к сердцу осуществлен в
соответствии с протоколом.12 В кратце, новорожденные мыши (<12 часов) были помещены в камеру и
доведены до состояния гипотермического шока. Рекомбинантный AAV (10 мкл) (1010 вирусных частиц)
введен в полость сердца инъекцией через переднюю грудную стенку.Инъекция в полость сердца
подтверждена визуализацией тока крови в микропипетке, установленной прежде. (Figure 1A). После
инъекции мыши были оживлены.
Рисунок 1.
Оценка доставки гена.
Экспрессия LacZ определена как описано выше.14 Экспрессия алкафоса была установлена на 8 мкм
секциях.
Иммунофлюоресценция
Микродистрофин
ΔR4 был обнаружен при помощи
анти-дистрофин N-термальных антител.
Поликлональные антитела
использованы как описано прежде.7
Человеческие специфические моноклональные антитела (Dys-3, 1:10,
Novocastra) использовались согласно протоколу.15
Проверка In Vivo интеграции в сарколемму кардиомиоцитов.
Поглощение красителя голубого эванса оценивалось после обработки β-изопротеренолом как описано в
протоколе.16 Оценка проводилась после 10 месяцев после инъекции .
Результаты
Совершенствование доставки гена к сердцу новорожденных Mdx мышей
Кристенсен
12
недавно сообщал о методе доставки генов к сердцу у новорожденных мышей ы состоянии
гипотермического шока. Что бы применить данную методику , мы оптимизировали некоторые параметры.
Анестезия проводилась с использованием специально сконструированной камеры.
Сложная система доставки гена использовалась Кристенсеном.12 Для упрощения процедуры мы использовали
микропипетку с баллоном для доставки вируса. Чтобы облегчить проникновение в грудную клетку мы сделали
небольшой разрез. Вирус был введен когда микропипетка была введена в полость сердца. (Figure 1A). В
среднем процедура продолжалась 93±2.7 секунд. .
Длительный гипотермический шок мажет быть полезен для продления контакта вируса с сердцем и
эффективной трансдукции. Однако, длительная гипотермия может в то же время увеличить процент
смертности. Мы сравнили восстановление после 2 и 5 минутного гипотермического шока. Не было
существенных различий в смертности после 2х(96%, n=84) и 5 (95%, n=102) минутного гипотермического
шока. Для инъекции вируса был выбран 5 минутный гипотермический шок.
Мы также исследовали выживаемость после введения вируса.В отсутствие инъекции процент
выживаемость составил 93% (n=23).У мышей получавших инъекцию вируса выживаемость составила
96% (n=163).Не было существенных отличий во времени восстановления у различных групп (Figure 1B).
Эффекты генной экспрессии.
Предпологалось, что генная экспрессия вызовет синтез
ткане- специфических промоторов.17
Встречающийся ЦМВ промотер мышечно-специфичный CK6 промотер были использованы 7 Для
установления промотера более эффективного промотера в сердечной ткани, мы сравнили экспрессию
AV.CMV.LacZ и AV.CK6.LacZ (n=10 для каждой группы). AAV-2 вирус (1010 вирусных частиц) доставлен
к сердцу и конечностям новорожденных собак и оценен количественно спустя месяц..Согласующиеся с
нашими предидущими исследованиями у взрослых mdx мышей14 высокие уровни ЦМВ и CK6
промотеры определяли генную экспрессию у новорожденных mdx мышей (Figure 2). Однако , ЦМВ
промотер показал существенно более высокий уровень экспрессии в сердце. [(2.96±0.26)×106 ] , чем
промотер CK6 [(7.23±0.98)×104 ]. CK6 промотер был получен из регуляторного гена мышечной
креатинкиназы..18 Трансгенные исследования показали, что промотер мышечной креатинкиназы
показывает более высокий уровень экспрессии в скелетной мускулатуре, чем в сердечной мышце. 19
Рисунок 2
Долгий период переноса генов необходим для лечения миодистрофии Дюшена. Мы сравнили AAVопосредованую экспрессию после 1 и 6 месяцев после инъекции.Для расширения полученных данных мы
использовали AV.RSV. алкафос для исследования. RSV промотер был также эффективен, как ЦМВ
промотер у mdx мышей.14 Поскольку AAV-5 опосредованная трансдукция больше чем AAV-213
опосредованная ,мы использовали AAV-5 в наших эксперементах. Как показано в эксперементах Figure 3,
количественный анализ в алкафос позитивных клетках сердца через 6 месяцев после инъекции. Возможно,
что множественные копии вируса могут поражать стволовые клетки Последующие популяции клеток
могут наследовать вирусный геном.Интересно, что в дополнение к трансдукции во внутреннем слое
миокарда мы наблюдали трансдукцию других слоев. (Figure 3).Как и в исследовании Кристенсена .12
преобразованные клетки наблюдались и в среднем слое миокарда. (Figure 3).
Рисунок 3.
Экспрессия микродистрофина в сердце Mdx мышей.
Ген микродистрофина очень усеченная версия гена дистрофина.Мы искали микродистрофин, который
можно использовать для лечения кардиомиопатии mdx мышей. Как показано Figure 4, эффективная
экспрессия микродистрофина определена во внутреннем (Figure 4, A and D) и других слоях миокарда
(Figure 4, B and E) через 10 месяцев после инхекции. .В контрольной группе mdx мышей, мы наблюдали
реверантные кардиомиоциты. (Figure 4, C and F).Экспрессия кардиоспецифичного микродистрофина
обнаружена при помощи двойного иммунного окрашивания N- термальными антителами против
дистрофина и актина (Figure 5).
Рисунок 4.
Рисунок 5.
Биологическая функция дистрофина осуществляется в составе дистрофинового-гликопротеинового
комплекса.DGC ( Blake et al20 и Rando21).В отсутствие дистрофина данный комплекс дестабилизируется,
что обуславливает мышечную патологию. Consequently,Восстановление DGC является основной целью
лечения.( Chamberlain4 и Straub и Campbell22). DGC в скелетных мышцах сходен с таковым в сердце.23 В
исследованиях сердечной мышцы показано тесное взаимодействие между дистрофином С-терминальным
домином и β-дистрогликаном.24 Есть 2 домина наиболее важных для DGC 20.Поскольку C-термальный
домин полностью отсутствовал в нашей конструкции, мы обнаружили AAV-опосредованную экспрессию
микродистрофина, которая могла восстановить DGC в сердце mdx мышей . Как показано Figure 6A, ΔR4
Микродистрофин был обнаружен только в AAV-инфицированых сердцах mdx мышей при помощи
специфических антидистрофиновых N-термальных антител. Важно, что другие компоненты DGC (такие
как β-sarcoglycan и β-dystroglycan) также обнаружены в AAV-инфицированных клетках. Согласно с
данными Figure 6A,успешная экспрессия микродистрофина восстановила β-саркогликан и βдистрогликан в модифицированных кардиомиоцитах (Figure 6B). Эти данные показывают, что экспрессия
микродистрофина восстанавливает DGC .
Рисунок 6.
Экспрессия микродистрофина в сердце Mdx мышей улучшает целостность сарколеммы.
Поглощение EBD является признаком миофибрилл с дефицитом дистрофина такие волокна не устойчивы
к механическому повреждению. 16 Как показано на рисунке Figure 7, Экспрессия микродистрофина
действительно улучшает целостность сарколеммы и уменьшает поглощение EBD.Количественная оценка 4
AAV-инфицированных сердец показала, что все EBD- позитивные клетки не содержали микродистрофина
Рисунок 7.
Дискуссия
Кардиомиопатия- одна из наиболее важных причин смерти пациентов при миодистрофии Дюшена.1 Это
также серьезная проблема для пациентов с миодистрофией Беккера и женщин, носительниц гена миодистрофии В
отличии от других форм кардиомиопатии при мышечной дистрофии поддающихся фармакологической
терапии ,25генная терапия представляется наиболее перспективной для лечения кардиомиопатии при
миодистрофии Дюшена и Беккера. В этом исследовании мы опробовали новый метод доставки вируса к
сердцу. Наши результаты показывают, что усеченный с С-терминального конца микродистрофин был
эффективен для восстановления DGC .
Левый желудочек- наиболее поражаемая область при миодистрофии Дюшена..26В настоящее время пока
непонятнокак доставить вирус к каждой клетке сердца для эффективной
трансдукции. Учитывая данные Кристенсена. 12, мы также наблюдали
трансдукцию во внутреннем и других слоях миокарда (Figures 3 and
4⇑).Трансдукция внутренних слоев обусловлена пассивной диффузии
AAV через эндокард В настоящее время не до конца понятно как внутриполостная доставка вируса
вызывает трансдукцию во внешних слоях.Иногда трансдукция клеток обнаружена в средних слоях
миокарда, поскольку вирус не мог проникнуть к этим клеткам путем простой диффузии, мы предположили
что вирус проник к клеткам через коронарные артерии. Вероятно дальнейшая оптимизация методов
может способствовать большей трансдукции клеток, возможности использования у пациентов
В этом исследовании мы также определяли эффекты различных промоторов и определении эффективности
генного переноса. Промотер мышечной креатин киназы и его производные (такие как
CK6)
использовались для определения специфической экспрессии 4.Наши исследования показали, что промотер
CK6 мене специфичен для определения экспрессии в сердечной мышце, чем в скелетной мускулатуре.
(Figure 2).Новые промотеры необходимы для определения высоких уровней экспрессии перенесенных
генов.Интересно, что мы наблюдали увеличение числа клеток, подвергшився трансдукции, через
длительный период. . (Figure 3C).
Несмотря на кардиомиотрофию наблюдаемую у взрослых mdx мышей (>20 месяцев),27 исследования у
молодых мышей (<30 недель)показывают редкие патологические изменения в сердце.28 Эти наблюдения
частично приписаны компенсаторным механизмам, обусловленным наличием утрофина. 20. Однако, нет
очевидных гистологических изменений в сердце молодых мышей (<7 недель) 29Даже у относительно старых
мышей с дефицитом дистрофина (от7 до 11 недель), только у 50% - 60% мышей обнаруживаются изменения
в сердечной мышце..29 Мегеней30 недавно сообщил о интенсивной миодистрофии скелетных мышц у мышей с
поражением MyoD у mdx мышей . Поскольку MyoD экспрессируется только в скелетной мускулатуре,
Мегеней предположил, что вторичная реакция на серьезное повреждение скелетных мышц , скорее чем
потеря дистрофина непосредственно приводит к развитию кардиомиопатии. Эта гипотеза оспаривается
несколькими научными исследованиями, показывающими прямую связь между потерей и
ремоделированием дистрофина при миокардиопатии. 31,32 Для понимания патогенеза кардиомиопатии при
миодистрофии Дюшена, важно
установление экспрессии дистрофина в скелетных мышцах и
сердце.Наводящии на размышления ответ на этот вопрос , определяется несколькими трансгенными
исследованиями у мышей с дефицитом γ-саркогликана.Работая вместе исследователи установили, что потеря
дистрофина наиболее важный фактор развития кардиомиопатии при миодистрофии Дюшена. Восстановление
дистрофина не только в скелетных мышцах, но и в сердце необходимо для успешного лечения миодистрофии
Дюшена. Наше исследование – это первый шаг в этом направлении.
Ссылки
1.
1.↵
Cox GF, Kunkel LM. Dystrophies and heart disease. Curr Opin Cardiol. 1997; 12: 329–343.
Medline
2.
2.↵
Melacini P, Fanin M, Danieli GA, et al. Myocardial involvement is very frequent among patients affected with subclinical Becker’s muscular
dystrophy. Circulation. 1996; 94: 3168–3175.
Abstract/FREE Full Text
3.
3.↵
Melacini P, Gambino A, Caforio A, et al. Heart transplantation in patients with inherited myopathies associated with end-stage
cardiomyopathy: molecular and biochemical defects on cardiac and skeletal muscle. Transplant Proc. 2001; 33: 1596–1599.
CrossRefMedline
4.
4.↵
Chamberlain JS. Gene therapy of muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 2002; 11: 2355–
2362.
Abstract/FREE Full Text
5.
5.↵
Koh GY, Soonpaa MH, Klug MG, et al. Stable fetal cardiomyocyte grafts in the hearts of dystrophic mice and dogs. J Clin Invest. 1995; 96:
2034–2042.
Medline
6.
6.↵
Dickson G, Roberts M, Wells D, et al. Recombinant micro-genes and dystrophin viral vectors. Neuromuscul Disord. 2002; 12 (suppl): S40–
S44.
Medline
7.
7.↵
Harper SQ, Hauser MA, DelloRusso C, et al. Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular
dystrophy. Nat Med. 2002; 8: 253–261.
CrossRefMedline
8.
7A.↵
Wang B, Li J, Xiao X. Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx
mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97: 13714–13719.
Abstract/FREE Full Text
9.
8.↵
Hoshijima M, Ikeda Y, Iwanaga Y, et al. Chronic suppression of heart-failure progression by a pseudophosphorylated mutant of
phospholamban via in vivo cardiac rAAV gene delivery. Nat Med. 2002; 8: 864–871.
Medline
10. 9.↵
Tevaearai HT, Eckhart AD, Walton GB, et al. Myocardial gene transfer and overexpression of β2-adrenergic receptors potentiates the
functional recovery of unloaded failing hearts. Circulation. 2002; 106: 124–129.
Abstract/FREE Full Text
11. 10.↵
Svensson EC, Marshall DJ, Woodard K, et al. Efficient and stable transduction of cardiomyocytes after intramyocardial injection or
intracoronary perfusion with recombinant adeno-associated virus vectors. Circulation. 1999; 99: 201–205.
Abstract/FREE Full Text
12. 11.↵
Su H, Lu R, Kan YW. Adeno-associated viral vector-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer induces neovascular formation
in ischemic heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97: 13801–13806.
Abstract/FREE Full Text
13. 12.↵
Christensen G, Minamisawa S, Gruber PJ, et al. High-efficiency, long-term cardiac expression of foreign genes in living mouse embryos and
neonates. Circulation. 2000; 101: 178–184.
Abstract/FREE Full Text
14. 13.↵
Duan D, Yan Z, Yue Y, et al. Enhancement of muscle gene delivery with pseudotyped AAV-5 correlates with myoblast differentiation. J Virol.
2001; 75: 7662–7671.
Abstract/FREE Full Text
15. 14.↵
Yue Y, Duan D. Development of multiple cloning site cis-vectors for recombinant adeno- associated virus production. Biotechniques. 2002;
33: 672, 674, 676–678.
16. 15.↵
Lu QL, Morris GE, Wilton SD, et al. Massive idiosyncratic exon skipping corrects the nonsense mutation in dystrophic mouse muscle and
produces functional revertant fibers by clonal expansion. J Cell Biol. 2000; 148: 985–996.
Abstract/FREE Full Text
17. 16.↵
Danialou G, Comtois AS, Dudley R, et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes are abnormally vulnerable to mechanical stress-induced
contractile failure and injury. FASEB J. 2001; 15: 1655–1657.
FREE Full Text
18. 17.↵
Cordier L, Gao GP, Hack AA, et al. Muscle-specific promoters may be necessary for adeno-associated virus-mediated gene transfer in the
treatment of muscular dystrophies. Hum Gene Ther. 2001; 12: 205–215.
CrossRefMedline
19. 18.↵
Hauser MA, Robinson A, Hartigan-O’Connor D, et al. Analysis of muscle creatine kinase regulatory elements in recombinant adenoviral
vectors. Mol Ther. 2000; 2: 16–25.
CrossRefMedline
20. 19.↵
Shield MA, Haugen HS, Clegg CH, et al. E-box sites and a proximal regulatory region of the muscle creatine kinase gene differentially
regulate expression in diverse skeletal muscles and cardiac muscle of transgenic mice. Mol Cell Biol. 1996; 16: 5058–5068.
Abstract/FREE Full Text
21. 20.↵
Blake DJ, Weir A, Newey SE, et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol Rev. 2002; 82:
291–329.
Abstract/FREE Full Text
22. 21.↵
Rando TA. The dystrophin-glycoprotein complex, cellular signaling, and the regulation of cell survival in the muscular dystrophies. Muscle
Nerve. 2001; 24: 1575–1594.
CrossRefMedline
23. 22.↵
Straub V, Campbell KP. Muscular dystrophies and the dystrophin-glycoprotein complex.
Curr Opin Neurol. 1997; 10: 168–175.
Medline
24. 23.↵
Klietsch R, Ervasti JM, Arnold W, et al. Dystrophin-glycoprotein complex and laminin colocalize to the sarcolemma and transverse tubules of
cardiac muscle. Circ Res. 1993; 72: 349–360.
Abstract/FREE Full Text
25. 24.↵
Stevenson S, Rothery S, Cullen MJ, et al. Spatial relationship of the C-terminal domains of dystrophin and β-dystroglycan in cardiac muscle
support a direct molecular interaction at the plasma membrane interface. Circ Res. 1998; 82: 82–93.
Abstract/FREE Full Text
26. 25.↵
Cohn RD, Durbeej M, Moore SA, et al. Prevention of cardiomyopathy in mouse models lacking the smooth muscle sarcoglycan-sarcospan
complex. J Clin Invest. 2001; 107: R1–R7.
Medline
27. 26.↵
Emery AE. Some unanswered questions in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 1994; 4: 301–303.
CrossRefMedline
28. 27.↵
Lefaucheur JP, Pastoret C, Sebille A. Phenotype of dystrophinopathy in old mdx mice. Anat Rec. 1995; 242: 70–76.
CrossRefMedline
29. 28.↵
Bridges LR. The association of cardiac muscle necrosis and inflammation with the degenerative and persistent myopathy of MDX mice. J
Neurol Sci. 1986; 72: 147–157.
CrossRefMedline
30. 29.↵
Grady RM, Teng H, Nichol MC, et al. Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne
muscular dystrophy. Cell. 1997; 90: 729–738.
CrossRefMedline
31. 30.↵
Megeney LA, Kablar B, Perry RL, et al. Severe cardiomyopathy in mice lacking dystrophin and MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96:
220–225.
Abstract/FREE Full Text
32. 31.↵
Badorff C, Lee GH, Lamphear BJ, et al. Enteroviral protease 2A cleaves dystrophin: evidence of cytoskeletal disruption in an acquired
cardiomyopathy. Nat Med. 1999; 5: 320–326.
CrossRefMedline
33. 32.↵
Vatta M, Stetson SJ, Perez-Verdia A, et al. Molecular remodelling of dystrophin in patients with end-stage cardiomyopathies and reversal in
patients on assistance-device therapy. Lancet. 2002; 359: 936–941.
CrossRefMedline
34. 33.↵
Zhu X, Wheeler MT, Hadhazy M, et al. Cardiomyopathy is independent of skeletal muscle disease in muscular dystrophy. FASEB J. 2002; 16:
1096–1098.
Abstract/FREE Full Text
Переведено силами проекта Мой Мио
Ссылка на оригинальный источник http://circ.ahajournals.org/content/108/13/1626.full