Пропуск экзона при помощи антисмысловых олигонуклеатидов при дупликациях при миодистрофии Дюшенна.

Пропуск экзона при помощи антисмысловых олигонуклеатидов при дупликациях при
миодистрофии Дюшенна.
Annemieke Aartsma-Rus1*, Anneke AM Janson2, Gert-Jan B van Ommen1 and Judith CT van Deutekom2
Corresponding author: Annemieke Aartsma-Rus a.m.rus@lumc.nl
Author Affiliations
1. Department of Human Genetics, Leiden University Medical Center, Leiden, the Netherlands
2. Prosensa B.V., Leiden, the Netherlands
For all author emails, please log on.
BMC Medical Genetics 2007, 8:43 doi:10.1186/1471-2350-8-43
The electronic version of this article is the complete one and can be found online at: http://www.biomedcentral.com/14712350/8/43
Received:
14 March 2007
Accepted:
5 July 2007
Published:
5 July 2007
© 2007 Aartsma-Rus et al; licensee BioMed Central Ltd.
Введение.
Миодистрофия Дюшенна(МДД) и Беккера(МДБ) представляют собой аллельные заболевания, вызванные
мутациями в гене, кодирующем дистрофин. Пациентам с МДД диагноз ставиться в молодом возрасте,
когда прогрессирует потеря мышечной функции, смерть наступает в возрасте 30 лет от сердечной или
дыхательной недостаточности. В сравнение, пациенты с миодистрофией Беккера позднее диагностируются
и дольше сохраняют возможности к передвижению. Это несоответствие может быть объяснено типом
мутаций в гене дистрофина: мутации с нарушением рамки считывания приводят, как правило, к синтезу
нефункционального дистрофина и, как следствие, к фенотипу МДД. Мутации без нарушения рамки
считывания приводят к синтезу короткого, но функционального дистрофина и фенотипу МДБ. Более 70%
всех пациентов с МДД и МДБ имеют делеции одного или нескольких экзонов, малые мутации,
приводящие к преждевременной остановке кодонов или разрушению сайтов сплайсинга, найдены у 20%,
когда дупликации обнаруживаются у 7%.
В течение последних нескольких лет обнадеживающие результаты были получены при исследовании АОопосредованного восстановления рамки считывания, как терапия пациентов с миодистрофией Дюшенна.
Эта стратегия по восстановлению рамки считывания с использованием антисмысловых олигонуклеатидов
для восстановления сплайсинга пре-мРНК. Такой, подобный при МДБ, дистрофин может перевести МДД
в более мягкий фенотип МДБ. Сначала мы наблюдали воздействие такой терапии на культуре клеток,
полученных от пациентов с различными делециями и точечными мутациями.
Тогда как пропуск одного экзона может быть эффективен в терапии около 50% пациентов с МДД, мы
также показали возможность пропуска нескольких экзонов на культурах клеток. Такой пропуск
нескольких экзонов может быть применим более чем у 70% пациентов. Такая терапевтическая
возможность предполагает устранение больших делеций, связанных с мягким фенотипом.. Однако, мы уже
сообщали о техническом ограничении, что зависит от экзонов-мишеней и длинны интронов.
Есть только один тип мутаций, дупликации одного или нескольких экзонов, для устранения которых АОопосредованный пропуск экзона еще не использовался.такие мутации могут стать идеальной мишенью для
пропуска экзона с восстановлением нормального транскрипта и синтеза дикого типа дистрофина. В этом
исследовании мы сконцентрировали свое внимание на изучении АО-индуцированного пропуска экзона в
культурах клеток, полученных от пациентов с дупликациями одного или нескольких экзонов.
Рисунок 1.
Рисунок 3.
Рисунок 4.
Методы
AO и праймеры.
AO (h44AON1, h44AON2, h45AON5, h52AON1 и h62AON1) описаны ранее. Праймеры для ОТ-ПЦР
выбраны из сопутствующих экзонов. (см. Таблица 1. )
Культуры миобластов и трансфекция АО.
Первичная культура миобластов была получена от пациента с дупликацией экзона 45, предоставлена Dr.
Francesco Muntoni (Imperial college, Лондон) и культивирована как описана прежде.Миобласты получены
после 7-14 дней культивирования в сыворотке. Фибробласты( предоставлены Dr René de Coo, Erasmus
Medical Center, Ротердам) и амниобласты (предоставленные Dr Ieke Ginjaar, Leiden University Medical
Center, Лейден) полученны от пациента с дупликацией 44 экзона и экзонов 52-62. Последующая инфекция
аденовирусного вектора с геном MyoD (Ad50MyoD; Crucell B.V.,лейден) привела к миогенезу 50-75
клеток, согласно стандартному протоколу. Полученные культуры обработаны смесью 100нМ каждого АО,
в разведениях 50-250нМ. Полиетиленамин использован как раегент для трансфекции АО in vitro.
Выделение РНК и ОТ-ПЦР анализ.
РНК выделена спустя 24-48 часов после трансфекции, согласно протоколу. Спецефическая обратная
транскрипция выполнена с использованием обратной транскриптазы (Roche Diagnostics) в течение 35
минут при 55С и 5 минут при 85С. ПЦР анализ выполнен по инструкции. Фрагменты изолированы в геле и
проведен их анализ.
Анализ дистрофина.
Образцы протеина изолированы на 2-8 дни после трансфекции. Контрольные образцы взяты в те же
промежутки времени. Иммуногистохимия и вестерн блот анализ выполнены как описано прежде.
Использовались поликлональные антитела к миозину L53 ( предоставлены Dr. M. van den Hoff, Amsterdam
Medical Center) для обнаружения миозина и MANDYS1 ( предоставлены Dr. G. Morris, North East Wales
Institue) и NCL-DYS2 (Novacastra Laboratories)- для обнаружения дистрофина. При вестерн блот анализе
использованы антитела NCL-DYS1 и MF20
Результаты
Дупликация 45 экзона.
Культура клеток, взятая у пациента с дупликацией 45 экзонв, была обработана специфическим АО. Через 2
дня выделена РНК и ОТ-ПЦР анализ показал пропуск 45 экзона в значительной степени.(Рисунок 1В)
Низкие уровни двойного пропуска экзона 45 наблюдались во всех культурах и не зависили от
концентрации АО.(Рисунок 2)Через 2-5 дней после лечения взяты образцы белков, и проведен вестерн
блот анализ с использованием Dy4 антител. Дистрофин был обнаружен в образцах, леченных АО,(5 и 8%
от уровней дикого типа после2 и 5 дней), в то время как в контрольной группе не наблюдалось наличие
дистрофина. (рисунок 1С) Экспрессия дистрофина была подтверждена при проведении
иммуногистохимии. Более 80% волокон были дистрофин-положительны. На самом деле первое время
после лечения вырабатывается дикий тип дистрофина. Отмечено, что нелеченные образцы имели низкий
уровень схожих фрагментов транскрипции, как при одиночном пропуске экзона 45. Это может быть
объяснено как ошибка ПЦР, соттветствующий дупликации первый экзон45 в одном раунде ПЦР может
подавлять второй экзон 45 в следующем раунде ПЦР, в результате могут образоваться транскрипты
подобные дикому типу. Рукаводствуясь таким объяснением мы предположили отсутствие дистрофина у
нелеченных образцов, что подтверждено иммуногистохимией и вестерн блот анализом.
Рисунок 2
Дупликация экзона 44
Вторым мы изучали пропуск экзона при дупликации экзона 44. (Рисунок 3а) По нашему опыту пропуск
экзона 44 достаточно прост и мы идентифицировали различные эффективные АО для этого. Культуры
клеток, полученные от двух братьев, обработаны различными АО. Пропуск экзона 44 был так эффективен,
что в подавляющем большинстве транскриптов недоставало двух экзонов 44. Для пропуска одного экзона
44 мы использовали серии разведений в концентрациях ниже оптимальной и использовали различные АО.
Что касается дупликации экзона 45, транскрипты подобные дикому типу были обнаружены в каждом
образце на различных уровнях. (Рисунок2) К сожалению, не было обнаружено дистрофина при
использовании таких низких концентраций. Это предпологает, что различный уровень таких транскриптов
отражает уровень ошибок при ПЦР. Это подтверждено тем, что при эффективной концентрации (100нМ и
выше) количество транскриптов с первоначальными дупликациями уменьшается, но в то же время
повышается количество транскриптов с двойным пропуском экзонов. Такие транскрипты, с двойным
пропуском экзона, имеют сдвиг рамки считывания, что отрицательно влияет на синтез дистрофина.
Имеется другая стратегия по восстановлению рамки считывания у таких пациентов. Мы можем вызвать
пропуск не только двух экзонов44, но и экзона 43 используя соответствующую комбинацию АО, что
приведет к сплайсингу экзона42 непосредственно к экзону 45, и образованию транскрипта без сдвига
рамки считывания. Вестерн блот анализ выявил дистрофин после такого лечения. Ко всему прочему,
дистрофин был обнаружен при иммуногистохимии в 70% клеток.
Дупликация экзонов 52-62.
Прежде мы упоминали пациента с дупликацией экзонов 52-62, локализованной между экзонами 63 и 64.
Как предпологалось пропуск нескольких экзонов(52-62) приведет к образованию транскриптов подобных
дикому типу. Поочередно рамка считывания может быть восстановлена или преобразована. Это может
быть достигнуто при пропуске дуплицированных экзонов 52 и 62 или пропуске оригинальных экзонов
62,63 и дуплицированных экзонов 52 и 62. Пропуск оригинальных экзонов52 или 62 приведет к сдвигу
рамки считывания. (рисунок 4)
Как мы ранее показали, пропуск нескольких экзонов возможен с использованием АО нацеленных на
другие экзоны. Действительно, после обработки культур клеток АО нацеленными на экзон 52 и 62,
пропуск экзонов между 52 и 62 наблюдался редко ( дважды в 18 образцах), показывая,
что пропуск нескольких экзонов в принципе возможен. Такой пропуск экзонов не
обнаружен в контрольных культурах, не было промежуточных продуктов, возникших из-за пропуска
экзонов из исследуемого региона. Затем мы обработали культуры смесью АО и провели анализ РНК. Мы
наблюдали пропуск как оригинальных так и дуплицированных экзонов. (Рисунок 5) Однако, рамка
считывания восстанавливалась только в транскриптах с пропуском дуплицированных экзонов и
сохранением оригинальных. Для анализа мы использовали праймер для экзона 63. Это принесло успех и
мы установили транскрипты, получившиеся после лечения АО. Неожиданно, что мы обнаружили равные
уровни сплайсинга экзона 63 в леченных и нелеченных культурах. Однако, такие уровни были ниже чем в
контрольных образцах. К сожалению, мы не наблюдали ~1900 bp фрагментовсодержащих дупликации в
леченных и нелеченных культурах.
Однако, вестерн блот анализ использован для обнаружения восстановления синтеза дистрофина. Не
обнаружено дистрофина позже 8 дней после лечения
или в нелеченных образцах. Антитела против
миозина использованные для подтверждения дифференцировки миофибрилл и синтезу дистрофина.
Рисунок 5
Обсуждение.
В принципе, дупликация –идеальная цель для пропуска экзона с возможностью
восстановления дистрофина. Мы предположили, что пропуск экзона может быть более
эффективным, так как пропуск любого из дуплицированных экзонов восстановит транскрипт. Это мы
наблюдали у пациента с дупликацией экзона 45. В этом исследовании мы получили идеальный
терапевтический результат: клетки пациента производили нормальный дистрофин. С другой стороны, для
пациента с дупликацией экзона 44 пропуск экзона не столь эффективен и производимые транскрипты не
содержат ни одного из экзонов 44. При использовании субоптимальных дозировок мы вообще не
наблюдали пропуска экзона. Мы заметили, что пропуск экзона 44 очень эффективен у всех пациентов и
культурах клеток, что может объяснить пропуск обеих экзонов в клетках с дупликацией. Этот феномен
наблюдалься для эдупликации кзона 45. Мы наблюдали пропуск одного экзона 45 после лечения
различными АО с эффективностью от 10 до 80% в контрольных и культурах клеток пациента
соответственно. Это означает, что пропуск одного или двух экзонов из дупликации зависит только от
самого экзона. Сплайсинг различных экзонов зависит от многих факторов. Некоторые экзоны более
зависимы от регуляторных сигналов, что обуславливает различную чувствительность экзонов к действию
АО. В заключение, эффективность пропуска может быть различным при подобных дупликациях.
Множественные дупликации также
могут быть целью для пропуска экзона и восстановления
нормального транскрипта. Рамка считывания может быть восстановлена при исключении некоторых
дуплицированных экзонов. Трудность состоит в том, что бы определить какой из экзонов пропущен. В
дополнение ко всему могут встречаться ошибки при ПЦР. Оригинальные и дуплицированные экзоны в
транскрипте очень похожи друг на друга, и быть источником транскриптов похожих на дикий тип. Мы
также наблюдали такие схожие нормальные фрагменты в контрольных культурах у каждого пациента.
Для дупликации одного экзона не было экзонных сигналов в восстановленном транскрипте, чего не было в
транскрипте с дупликацией. Важно, что ПЦР специфичен для РНК и нет различий между артефактами и
фрагментами. Однако, в контрольных образцах не обнаружено дистрофина. В соответствие с природой
дупликаций мы можем отличить артефакты и восстановленные фрагменты используя праймер для экзона
63. Удивительно, что фрагменты дикого типа обнаружены во всех образцах. Хотя в контрольных на очень
низких уровнях. При вестерн блот анализе не наблюдалось дистрофина, такие уровни были
незначительны, чтобы обнаружить белок.
Результаты пациентов с дупликацией экзонов в этом исследовании весма сомнительны. Однако мы
добились восстановления дистрофина для таких специфичных пациентов, другие дупликации нескольких
экзонов могут проще коррегироваться, особенно с ограниченным числом вовлеченных экзонов.
Ссылки
Hoffman EP, Brown RH Jr., Kunkel LM: Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.
Cell 1987, 51:919-28. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Hoffman EP, Fischbeck KH, Brown RH, Johnson M, Medori R, Loike JD, Harris JB, Waterston R, Brooke M, Specht L, W. K,
Chamberlain JS, Caskey CT, Shapiro F, Kunkel LM: Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients
with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy.
N Engl J Med 1988, 318:1363-8. PubMed Abstract
Emery AE: The muscular dystrophies.
Lancet 2002, 359:687-95. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Gallati S, Moser H, Kunkel LM: An explanation for the phenotypic differences between
patients bearing partial deletions of the DMD locus.
Genomics 1988, 2:90-5. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Aartsma-Rus A, van Deutekom JC, Fokkema IF, van Ommen GJ, den Dunnen JT: Entries in the Leiden Duchenne muscular
dystrophy mutation database: An overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule.
Muscle Nerve 2006, 34:135-144. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, den Dunnen JT, Baas F, van Ommen GJ, van Deutekom JC:
Therapeutic antisense-induced exon skipping in cultured muscle cells from six different DMD patients.
Hum Mol Genet 2003, 12:907-14. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, van Ommen GJ, den Dunnen JT, van Deutekom JC: Antisenseinduced multiexon skipping for duchenne muscular dystrophy makes more sense.
Am J Hum Genet 2004, 74:83-92. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
Alter J, Lou F, Rabinowitz A, Yin H, Rosenfeld J, Wilton SD, Partridge TA, Lu QL: Systemic delivery of morpholino
oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology.
Nat Med 2006, 12:175-177. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Lu QL, Rabinowitz A, Chen YC, Yokota T, Yin H, Alter J, Jadoon A, Bou-Gharios G, Partridge T: Systemic delivery of antisense
oligoribonucleotide restores dystrophin expression in body-wide skeletal muscles.
Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102:198-203. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
van Deutekom JC, Bremmer-Bout M, Janson AA, Ginjaar IB, Baas F, den Dunnen JT, van Ommen GJ: Antisense-induced
exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells.
Hum Mol Genet 2001, 10:1547-54. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Beroud C, Tuffery-Giraud S, Matsuo M, Hamroun D, Humbertclaude V, Monnier N, Moizard MP, Voelckel MA, Calemard
LM, Boisseau P, Blayau M, Philippe C, Cossee M, Pages M, Rivier F, Danos O, Garcia L, Claustres M: Multiexon skipping
leading to an artificial DMD protein lacking amino acids from exons 45 through 55 could rescue up to 63% of patients with
Duchenne muscular dystrophy.
Hum Mutat 2007, 28:196-202. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Aartsma-Rus A, Kaman WE, Weij R, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC: Exploring the Frontiers of
Therapeutic Exon Skipping for Duchenne Muscular Dystrophy by Double Targeting within One or Multiple Exons.
Mol Ther 2006, 14:401-407. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Aartsma-Rus A, Winter CL, Janson AAM, Kaman WE, van Ommen GJ, den Dunnen JT, van Deutekom JC: Functional analysis
of 114 exon-internal AONs for targeted DMD exon skipping: indication for steric hindrance of SR protein binding sites.
Oligonucleotides 2005, 15:284-297. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson A, Den Dunnen J, van Ommen G, van Deutekom J: Targeted exon skipping as a
potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy.
Neuromuscul Disord 2002, 12:S71-S77. PubMed Abstract | Publisher Full Text
Havenga MJ, Lemckert AA, Ophorst OJ, van Meijer M, Germeraad WT, Grimbergen J, van Den Doel MA, Vogels R, van
Deutekom J, Janson AA, de Bruijn JD, Uytdehaag F, Quax PH, Logtenberg T, Mehtali M, Bout A: Exploiting the natural
diversity in adenovirus tropism for therapy and prevention of disease.
J Virol 2002, 76:4612-20. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
Murry CE, Kay MA, Bartosek T, Hauschka SD, Schwartz SM: Muscle differentiation during repair of myocardial necrosis in
rats via gene transfer with MyoD.
J Clin Invest 1996, 98:2209-17. PubMed Abstract | Publisher Full Text | PubMed Central Full Text
Roest PA, van der Tuijn AC, Ginjaar HB, Hoeben RC, Hoger-Vorst FB, Bakker E, den Dunnen JT, van Ommen GJ: Application
of in vitro Myo-differentiation of non-muscle cells to enhance gene expression and facilitate analysis
of muscle proteins.
Neuromuscul Disord 1996, 6:195-202. PubMed Abstract | Publisher Full Text
White SJ, Aartsma-Rus A, Flanigan KM, Weiss RB, Kneppers AL, Lalic T, Janson AA, Ginjaar HB, Breuning MH, den Dunnen
JT: Duplications in the DMD gene.
Оригинальный текст http://www.biomedcentral.com/1471-2350/8/43
Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio.org/