Ао-индуцированный пропуск нескольких экзонов при миодистрофии Дюшенна.

Ао-индуцированный пропуск нескольких экзонов при миодистрофии Дюшенна.
Annemieke Aartsma-Rus, Anneke A. M. Janson, Wendy E. Kaman, Mattie Bremmer-Bout, Gert-Jan B. van Ommen, Johan T.
den Dunnen, and Judith C. T. van Deutekom
Center for Human and Clinical Genetics, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands
Address for correspondence and reprints: Dr. Judith C. T. van Deutekom, Center for Human and Clinical Genetics, Leiden
University Medical Center, Wassenaarseweg 72, 2333 AL Leiden, The Netherlands. E-mail: deutekom@lumc.nl
Received August 26, 2003; Accepted October 20, 2003.
Введение
Антисмысловые олигонуклеатиды (AO) недавно стали привлекательным инструментом для исследования и лечения
человеческих болезней. Первоначально, AO использовались для определенного блокирования генов, или чтобы
контролировать процессы связанные с развитием и подавить отклоняющуюся экспрессию гена (Деннис и др. 1998;
Стивенсон и др. 1999; Nasevicius и Ekker 2000; Кори и Абрамс 2001; Голубь 2002). Однако, AO также способны к
модуляции соединения пре-мРНК (Sierakowska и др. 1996). Так как считалось, что по крайней мере 15%
вызывающих болезнь точечных мутаций приводят к дефектам соединения РНК (Krawczak и др. 1992; Cartegni и др.
2002; Буратти и др. 2003), это последнее применение может быть очень важным для будущих генетических методов
лечения. Например, AO успешно использовались, чтобы вызвать пропуск псевдоэкзонов для блокады сайтов
сплайсинга в гене β-глобина (Sierakowska и др. 1996) и гене трансмембранного регулятора проводимости при
муковисцедозе(Фридман и др. 1999). AO также были эффективны при изменении альтернативного соединения,
которое было связанных с реализацией действия онкогенов (Mercatante и др. 2001, 2002). Наконец, что не менее
важны недавние разработки применения AO для вызова определенного пропуска экзонов, чтобы исправить рамку
считывания видоизмененного транскрипта так, чтобы это могло
привести к образованию частично
функционального белка. Ген, который кодирует дистрофин, хорошо подходит для этого последнего применения.
Белок состоит из N- терминальной области, которая связывает с нитями актина, центральной областьи стержня, и
C-терминальной областью, богатой цистеином, которая связывает белок с комплексом гликопротеина (Хоффман и
др. 1987; Koenig и др. 1988; Yoshida и Ozawa 1990). Мутации в гене дистрофина, которые нарушают рамку
считывания, что приводит к полной потере функции дистрофина, которая вызывает тяжелую мышечную
дистрофию Дюшенна(DMD [MIM 310200]) (Хоффман и др. 1988; Koenig и др. 1989; Ervasti и др. 1990). Более легкая
мышечная дистрофия Беккера (BMD [MIM 300376]), с другой стороны, является результатом мутаций в том же
самом гене, которые не изменяют рамку считывания и приводят к внутренне удаленному, но частично
функциональному дистрофину, который сохраняет его N и C концы (Koenig и др. 1989; Ди Блази и др. 1996).
Эти наблюдения привели к идее использовать AO, чтобы изменить соединение так, чтобы открытая рамка
считывания была восстановлена, и серьезный фенотип МДД преобразован в более умеренный фенотип БМД.
Несколько исследований показали терапевтический AO-индуцированный пропуск единственного экзона в клетках,
полученных от mdx мышей (Dunckley и др. 1998; Вильтон и др. 1999; Манн и др. 2001, 2002; Лютеций и др. 2003) и
пациентов с МДД (Takeshima и др. 2001; ван Деутеком и др. 2001; Aartsma-русский и др. 2002, 2003; Де Анджелис и
др. 2002). До настоящего времени мы идентифицировали серию AO, которая может использоваться, чтобы вызвать
пропуск 20 различных экзонов (экзоны 2, 8, 17, 19, 29, 40–46, 48–53, 55, и 59) (Aartsma-русский и др. 2002). Из всех
пациентов с МДД; 75 % извлекли бы выгоду из пропуска этих экзонов. До сих пор мы успешно применили пропуск
единственного экзона в клетках, полученных от восьми различных пациентов с МДД (ван Деутеком и др. 2001;
Aartsma-русский и др. 2003). В этих исследованиях пропуск экзонов, восстановил рамку считывания и вызвал синтез
дистрофина подобного дистрофину при БМД в ~75 %-80 % рассматриваемых клеток. Новый дистрофин мог быть
обнаружен уже через 16 часов после трансфекции; уровни дистрофина увеличились до существенных уровней в
пределах 4 дней и сохранялись по крайней мере до7 дней(Aartsma-русский и др. 2003).
Здесь, мы расширяем терапевтическую применимость этой техники, демонстрируя пропуск нескольких экзонов
(рис. 1). После одновременного пропуска двух экзонов, рамка считывания была восстановлена для одного пациента
с нонсенс мутацией в экзоне и для другого пациента с делецией, которая не могла быть устранена пропуском
только одного экзона. Кроме того, пропуск последовательных экзонов (пропуск мультиэкзона) обладает
потенциалом для восстановления до 14% из всех известных мутации при МДД.
Рисунок 1
Материалы и методы
АО и праймеры
Ао напровленные на экзон 44 (h44AON1) и 51 (h51AON2) описанны прежде (Aartsma-Rus et al. 2002). Ао
нацеленные
на
экзон
43
и
45
специально
спроектированы
для
исследования
(h43AON5:
CUGUAGCUUCACCCUUUCC; h45AON5: GCCCAAUGCCAUCCUGG). Все АО содержали 5′ флюоресцентную
группу (6-FAM), полную фосфоротиоат основу и 2′-O- метил модифицированные молекулы. Праймеры для ОТ-ПЦР
анализа синтезированы при помощи Eurogentec
Культура миогенных клеток и трансфекция АО
Первичные миобласты от здорового человека и двух пациентов с МДД (DL470.2 [ делеции 46–50 экзонов ] и 50685.1
[делеции 48–50 экзонов]) изолированы при мышечной биопсии и культивированы как описано прежде. (Aartsma-Rus
et al. 2002). Миобласты получены из объединенных культур миобластов. К ним было добавлено 200нМ каждого АО
У пациента DL90.3 обнаружились только фибробласты. Последующая инфекция аденовируса содержащего MyoD
ген (Ad50MyoD), вынудила фибробласты начать миогенез. (Murry et al. 1996; Roest et al. 1996; Aartsma-Rus et al.
2002; Havenga et al. 2002). Условия трансфекции описаны прежде.
Выделение РНК и ОТ-ПЦР анализ
Выделение РНК, ОТ-ПЦР и анализ последовательности выполнены как описаны прежде (Aartsma-Rus et al. 2002).
Для идентификации продуктов выполнено 24 цикла ПЦР. Продукты ПЦР проанализированы используя DNA 1000
LabChip kit и the 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).
Анализ дистрофина
Иммуногистохимический
и вестерн блот анализ выполнен как описано прежде (Aartsma-Rus et al.
2002).Поликлональные миозиновые антитела L53 использованны для обнаружения миозина. MANDYS1, NCL-DYS2
и NCL-DYS1 были использованы для обнаружения дистрофина. LumiAnalyst 3.0 (Roche) использована для вестерн
блот анализа.
Результаты
Двойной пропуск экзона
Пропуса одного экзона не достаточно эффективно восстанавливает рамку считывания для каждой мутации. Для
большинства мутаций необходим пропуск нескольких экзонов ( Рис. 1а) Например, пациент DL90.3 имеет нонсенс
мутацию в экзоне 43. Считается, что этот единственный экзон вне рамки считывания и пропуск экзона не приведет к
восстановлению рамки считывания. Мы предположили, что пропуск экзонов 43 и 44 мог бы восстановить рамку
считывания. У пациента DL470.2 обнаруженны делеции экзонов 46-50. Для восстановления рамки считывания
необходим пропуск двух экзонов. (Рис. 1а)
Культуры миобластов этих пациентов инфицированы АО для пропуска экзонов 43 и 44 (DL90.3) и 45 и 51(DL470.2)
Эффективность трансфекции была > 80%, что подтверждено специфической флюоресценцией ядер клеток. ОТ-ПЦР
анализ через 24-48 часов после трансфекции показал осуществленный двойной пропуск экзонов в обеих культурах,
что подтверждено анализом последовательностей.(Рис. 2а и 3а) Как предполагалось, в дополнение к двойному
пропуску экзона, обнаружен пропуск одного экзона: у пациента DL90.3 экзон 44- 27% всех
транскриптов; у пациента DL470.2 экзон 51- 12% всех транскриптов.
Рисунок 2.
Рисунок 3
Для верификации отсутствия изменений в других участках гена дистрофина из-за терапии АО мы провели ОТ-ПЦР
анализ всего гена. Во всех культурах миобластов мы не нашли изменений в гене дистрофина.
Рисунок 4
Иммуногистохимический анализ с использованием двух различных типов антител MANDYS1 и Dys2 показал, что
транскрипты образованные после двойного пропуска экзона были подобны таковым при МДБ. В среднем у 70%
миобластов определялась экспрессия дистрофина после лечения АО. Вестерн блот анализ подтвердил наличие
дистрофина у DL90.3 после 4 дней и у DL470.2 после 2 дней на уровне 3.3% и 1.8%, соответственно, от уровней
контроля.
Множественный пропуск экзонов
Сплайсинг экзона 44 непосредственно к экзону 52 (как у DL470.2) исправляет рамку считывания. Индукция
пропуска этих экзонов переводит мутацию в таковую как при МДБ. Пропуск нескольких экзонов протестирован
впервые у человеческих миобластов обработанных смесью АО для пропуска 45 и 51 экзонов. Мы наблюдали новый,
более короткий транскрипт.
Как показал анализ последовательности сплайсинг 44 экзона происходил
непосредственно к 52. Затем мы испытали смесь АО на миобластах пациента с МДД с делецией 48-50 экзонов. АО
индуцировали пропуск всех экзонов с 45 по 51 с образованием соответствующего транскрипта.
Рисунок 5
Дискуссия.
Индуцированный АО пропуск одного экзона на данный момент является наиболее перспективным методом в плане
лечения МДД и перевода ее в более легкую форму МДБ. Takeshima et al. 2001; van Deutekom et al. 2001; De Angelis
et al. 2002; Aartsma-Rus et al. 2003). Здесь мы демонстрируем выполнимост ьнацеленного пропуска нескольких
экзонов. Спонтанный пропуск нескольких экзонов происходит в естественных условиях но в меньших размерах.
Этот феномен был обнаружен у пациентов с МДД и здоровых людей(Sironi et al. 2002). Кроме того это был
основной механизм образования дистрофин- позитивных «реверантных» волокон у пациентов с МДД (Sherratt et al.
1993; Thanh et al. 1995; Lu et al. 2000). Пропуск нескольких экзонов также наблюдался при попытке генной терапии
нацеленной на 23 экзон в культуре клеток mdx мышей(Dunckley et al. 1998; Wilton et al. 1999; Bertoni et al. 2003).
Применение АО и химерных олигонуклеатидов , направленных на 3′ сайт сплайсинга, привело к образованию
коротких транскриптов с пропуском смежных к экзону 23 экзонов. При использовании комбинации АО был
индуцирован пропуск экзонов 43-44 и 45-51 в культурах миобластов пациентов с МДД. Иммуногистохимический
анализ показал, что это индуцировало синтез дистрофина в более чем 70% миобластов. Что показывает, что
эффективность данного метода ниже чем при пропуске одного экзона. Однако при пропуске одного экзона
сохраняется достаточное количество дистрофин-негативных волокон.
Вестерн блот анализ экстрактов протеинов из культур миобластов показал сравнительно низкий уровень (3%)
дистрофина. Сопоставляя эти данные с данными иммуногистохимии выявляется значительное
расхождение. Однако, это может быть объяснено тем фактом, что при иммуногистохимии мы
фокусируемся на обнаружении миозин-положительных волокон, тогда как образцы при вестерн блот анализе могут
содержать достаточное количество дистрофин-негативных волокон. Кроме того, контрольный образец получен из
культуры, у которой вдвое выше степень миогенеза, соответственно больше число дистрофин положительных
волокон. Контрольный образец получен из культуры клеток, которая производит дистрофин весь период своего
развития (2недели), а в культурах полученных от пациентов сссссинтез дистрофина происходит только 4 дня.
Были оценены различные соотношения АО для пропуска экзонаов 45 и 51 в смеси и самый высокий уровень
двойного пропуска экзонов был у смеси с соотношением 1:1. Оба АО были одинаково эффективны. Кроме того мы
наблюдали пропуск одного экзона 44 у пациента DL90.3 и 51 у пациента DL470.2
Мы сконструировали молекулу, состоящую из 10 нуклеатидов, которая может быть использована вместо смеси АО.
Но этот препарат не вызывал достаточно высоких уровней пропуска нескольких экзонов в миобластах. В
последующих исследованиях мы изучали влияние длины последовательности, но не получили существенных
отличий. Есть два объяснения механизмам пропуска нескольких экзонов. Во-первых, весь регион и экзонов и
интронов между экзоном 45 и 51 может быть воспроизведен, потому что большинство АО вызывают изменения
вторично в структуре пре-мРНК. Во-вторых, Сплайсинг отдельных экзонов 45 к 51 происходит раньше чем экзона
44 к 45. В этом случае экзон 45 и 51 расценивается как один большой экзон. Предполагается, что пропуск
нескольких экзонов может быть эффективен в таких областях гена, где сначала происходит сплайсинг нижележащих
интронов. В настоящее время мы проверяем эту теорию использую комбинацию АО в различных областях гена.
Когда принимается во внимание пропуск только одного экзона, данный вид терапии может быть теоретически
эффективен у 75% пациентов с МДД. Пропуск нескольких экзонов может значительно увеличить этот процент.
Пропуск экзонов 45-51 показал восстановление рамки считывания в 14 % всех делеций и в 6% при малых мутациях.
Его возможное терапевтическое применение зависит от его эффективности in vivo.
Ссылки:
Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson A, den Dunnen J, van Ommen G, van Deutekom J (2002) Targeted exon skipping
as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 12:S71. [PubMed] [Cross
Ref] doi: 10.1016/S0960-8966(02)00086-X.
Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, den Dunnen JT, Baas F, Van Ommen GJ, et al (2003) Therapeutic
antisense-induced exon skipping in cultured muscle cells from six different DMD patients. Hum Mol Genet 12:907–914.
[PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1093/hmg/ddg100.
Bertoni C, Lau C, Rando TA (2003) Restoration of dystrophin expression in mdxmuscle cells by chimeraplast-mediated exon
skipping. Hum Mol Genet 12:1087–1099. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1093/hmg/ddg133.
Buratti E, Baralle FE, Pagani F (2003) Can a “patch” in a skipped exon make the pre-mRNA splicing machine run better?
Trends Mol Med 9:229–232. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1016/S1471-4914(03)00072-8.
Cartegni L, Chew SL, Krainer AR (2002) Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect
splicing. Nat Rev Genet 3:285–298. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1038/nrg775.
Cartegni L, Krainer AR (2003) Correction of disease-associated exon skipping by synthetic exon-specific activators. Nat
Struct Biol 10:120–125. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1038/nsb887.
Corey DR, Abrams JM (2001) Morpholino antisense oligonucleotides: tools for investigating vertebrate development.
Genome Biol 2:reviews1015.1–reviews1015.3. [PMC free article] [PubMed]
De Angelis FG, Sthandier O, Berarducci B, Toso S, Galluzzi G, Ricci E, Cossu G, Bozzini I (2002) Chimeric snRNA molecules
carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and
restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48–50 DMD cells. Proc Natl Acad Sci USA 99:9456–9461. [PMC free article]
[PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1073/pnas.142302299.
den Dunnen J (1996) The Leiden Muscular Dystrophy pages. http://www.dmd.nl (accessed December 10, 2003)
den Dunnen JT, Grootscholten PM, Bakker E, Blonden LA, Ginjaar HB, Wapenaar MC, van Paassen HM, van Broeckhoven C,
Pearson PL, van Ommen GJ (1989) Topography of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis
of 194 cases reveals 115 deletions and 13 duplications. Am J Hum Genet 45:835–847. [PMC free article] [PubMed]
Dennis JU, Dean NM, Bennett CF, Griffith JW, Lang CM, Welch DR (1998) Human melanoma metastasis is inhibited
following ex vivo treatment with an antisense oligonucleotide to protein kinase C-alpha. Cancer Lett 128:65–70. [PubMed]
[Cross Ref] doi: 10.1016/S0304-3835(98)00052-4.
Di Blasi C, Morandi L, Barresi R, Blasevich F, Cornelio F, Mora M (1996) Dystrophin-associated protein abnormalities in
dystrophin-deficient muscle fibers from symptomatic and asymptomatic Duchenne/Becker muscular dystrophy carriers.
Acta Neuropathol (Berl) 92:369–377. [PubMed]
Dove A (2002) Antisense and sensibility. Nat Biotechnol 20:121–124. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1038/nbt0202-121.
Dunckley MG, Manoharan M, Villiet P, Eperon IC, Dickson G (1998) Modification of splicing in the dystrophin gene in
cultured Mdxmuscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum Mol Genet 7:1083–1090. [PubMed] [Cross Ref] doi:
10.1093/hmg/7.7.1083.
England SB, Nicholson LV, Johnson MA, Forrest SM, Love DR, Zubrzycka-Gaarn EE, Bulman DE, Harris JB, Davies KE (1990)
Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin. Nature 343:180–182. [PubMed] [Cross
Ref] doi: 10.1038/343180a0.
Ervasti JM, Ohlendieck K, Kahl SD, Gaver MG, Campbell KP (1990) Deficiency of a glycoprotein component of the dystrophin
complex in dystrophic muscle. Nature 345:315–319. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1038/345315a0.
Friedman KJ, Kole J, Cohn JA, Knowles MR, Silverman LM, Kole R (1999) Correction of aberrant splicing of the cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator (CFTR) gene by antisense oligonucleotides. J Biol Chem 274:36193–36199.
[PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1074/jbc.274.51.36193.
Havenga MJ, Lemckert AA, Ophorst OJ, van Meijer M, Germeraad WT, Grimbergen J, van Den Doel MA, Vogels R, van
Deutekom JCT, Janson AAM, de Bruijn JD, Uytdehaag F, Quax PH, Logtenberg T, Mehtali M, Bout A (2002) Exploiting the
natural diversity in adenovirus tropism for therapy and prevention of disease. J Virol 76:4612–4620. [PMC free article]
[PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1128/JVI.76.9.4612-4620.2002.
Hoffman EP, Brown RH, Jr., Kunkel LM (1987) Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.
Cell 51:919–928. [PubMed]
Hoffman EP, Fischbeck KH, Brown RH, Johnson M, Medori R, Loike JD, Harris JB, et al (1988) Characterization of dystrophin
in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne’s or Becker’s muscular dystrophy. N Engl J Med 318:1363–1368.
[PubMed]
Koenig M, Beggs AH, Moyer M, Scherpf S, Heindrich K, Bettecken T, Meng G, et al (1989) The molecular basis for Duchenne
versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet 45:498–506. [PMC free
article] [PubMed]
Koenig M, Monaco AP, Kunkel LM (1988) The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein.
Cell 53:219–226. [PubMed]
Krawczak M, Reiss J, Cooper DN (1992) The mutational spectrum of single base-pair substitutions in mRNA splice junctions
of human genes: causes and consequences. Hum Genet 90:41–54. [PubMed]
Lu QL, Mann CJ, Lou F, Bou-Gharios G, Morris GE, Xue SA, Fletcher S, Partridge TA, Wilton SD (2003) Functional amounts of
dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdxdystrophic mouse. Nat Med 9:1009–1014. [PubMed] [Cross
Ref] doi: 10.1038/nm897.
Lu QL, Morris GE, Wilton SD, Ly T, Artem'yeva OV, Strong P, Partridge TA (2000) Massive idiosyncratic exon skipping
corrects the nonsense mutation in dystrophic mouse muscle and produces functional revertant fibers by clonal expansion. J
Cell Biol 148:985–996. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1083/jcb.148.5.985.
Mann CJ, Honeyman K, Cheng AJ, Ly T, Lloyd F, Fletcher S, Morgan JE, Partridge TA, Wilton SD (2001) Antisense-induced
exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdxmouse. Proc Natl Acad Sci USA 98:42–47. [PMC free article] [PubMed]
[Cross Ref] doi: 10.1073/pnas.011408598.
Mann CJ, Honeyman K, McClorey G, Fletcher S, Wilton SD (2002) Improved antisense oligonucleotide induced exon skipping
in the mdxmouse model of muscular dystrophy. J Gene Med 4:644–654. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1002/jgm.295.
Mercatante DR, Mohler JL, Kole R (2002) Cellular response to an antisense-mediated shift of Bcl-x pre-mRNA splicing and
antineoplastic agents. J Biol Chem 277:49374–49382. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1074/jbc.M209236200.
Mercatante DR, Sazani P, Kole R (2001) Modification of alternative splicing by antisense oligonucleotides as a potential
chemotherapy for cancer and other diseases. Curr Cancer Drug Targets 1:211–230. [PubMed]
Mirabella M, Galluzzi G, Manfredi G, Bertini E, Ricci E, De Leo R, Tonali P, Servidei S (1998) Giant dystrophin deletion
associated with congenital cataract and mild muscular dystrophy. Neurology 51:592–595. [PubMed]
Murry CE, Kay MA, Bartosek T, Hauschka SD, Schwartz SM (1996) Muscle differentiation during repair of myocardial
necrosis in rats via gene transfer with MyoD. J Clin Invest 98:2209–2217. [PMC free article] [PubMed]
Nasevicius A, Ekker SC (2000) Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nat Genet 26:216–220. [PubMed] [Cross
Ref] doi: 10.1038/79951.
Roest PA, Roberts RG, van der Tuijn AC, Heikoop JC, van Ommen GJ, den Dunnen JT (1993) Protein truncation test (PTT) to
rapidly screen the DMD gene for translation terminating mutations. Neuromuscul Disord 3:391–394. [PubMed] [Cross Ref]
doi: 10.1016/0960-8966(93)90083-V.
Roest PA, van der Tuijn AC, Ginjaar HB, Hoeben RC, Hoger-Vorst FB, Bakker E, den Dunnen JT, van Ommen GJ (1996)
Application of in vitro Myo-differentiation of non-muscle cells to enhance gene expression and facilitate analysis of muscle
proteins. Neuromuscul Disord 6:195–202. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1016/0960-8966(96)00006-5.
Sherratt TG, Vulliamy T, Dubowitz V, Sewry CA, Strong PN (1993) Exon skipping and translation in patients with frameshift
deletions in the dystrophin gene. Am J Hum Genet 53:1007–1015. [PMC free article] [PubMed]
Sierakowska H, Sambade MJ, Agrawal S, Kole R (1996) Repair of thalassemic human beta-globin mRNA in mammalian cells
by antisense oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA 93:12840–12844. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref] doi:
10.1073/pnas.93.23.12840.
Sironi M, Cagliani R, Pozzoli U, Bardoni A, Comi GP, Giorda R, Bresolin N (2002) The dystrophin gene is alternatively spliced
throughout its coding sequence. FEBS Lett 517:163–166. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1016/S0014-5793(02)02613-3.
Stevenson JP, Yao KS, Gallagher M, Friedland D, Mitchell EP, Cassella A, Monia B, Kwoh TJ, Yu R, Holmlund J, Dorr FA,
O’Dwyer PJ (1999) Phase I clinical/pharmacokinetic and pharmacodynamic trial of the c-raf-1 antisense oligonucleotide ISIS
5132 (CGP 69846A). J Clin Oncol 17:2227–2236. [PubMed]
Takeshima Y, Wada H, Yagi M, Ishikawa Y, Minami R, Nakamura H, Matsuo M (2001) Oligonucleotides against a splicing
enhancer sequence led to dystrophin production in muscle cells from a Duchenne muscular dystrophy patient. Brain Dev
23:788–790. [PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1016/S0387-7604(01)00326-6.
Thanh LT, Nguyen Thi M, Hori S, Sewry CA, Dubowitz V, Morris GE (1995) Characterization of genetic deletions in Becker
muscular dystrophy using monoclonal antibodies against a deletion-prone region of dystrophin. Am J Med Genet 58:177–
186. [PubMed]
van Deutekom JC, Bremmer-Bout M, Janson AA, Ginjaar IB, Baas F, den Dunnen JT, van Ommen GJ (2001) Antisenseinduced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum Mol Genet 10:1547–1554.
[PubMed] [Cross Ref] doi: 10.1093/hmg/10.15.1547.
Wilton SD, Lloyd F, Carville K, Fletcher S, Honeyman K, Agrawal S, Kole R (1999) Specific removal of the nonsense mutation
from the mdxdystrophin mRNA using antisense oligonucleotides. Neuromuscul Disord 9:330–338. [PubMed] [Cross Ref]
doi: 10.1016/S0960-8966(99)00010-3.
Winnard AV, Klein CJ, Coovert DD, Prior T, Papp A, Snyder P, Bulman DE, et al (1993) Characterization of translational frame
exception patients in Duchenne/Becker muscular dystrophy. Hum Mol Genet 2:737–744. [PubMed]
Yoshida M, Ozawa E (1990) Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem (Tokyo) 108:748–752.
[PubMed]
Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio/org
Оригинальный текст http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1181915/?tool=pubmed