УДК 539.196.3:577.32 В.Г. Зобнина, мл. науч. сотрудник, М.В

ФІЗИКА БІОМОЛЕКУЛ І ЇХ КОМПЛЕКСІВ
88
УДК 539.196.3:577.32
В.Г. Зобнина, мл. науч. сотрудник,
М.В. Косевич, д-р физ.-мат. наук,
О.А. Боряк, мл. науч. сотрудник,
В.В. Чаговец, канд. физ.-мат. наук
Физико-технический институт низких температур им. Б.И. Веркина НАН Украины,
пр. Ленина 47, Харьков, Украина, 61103
E-mail: zobnina@ilt.kharkov.ua
МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОМЕРОВ ПОЛИЭФИРОВ С
АМИНОКИСЛОТОЙ ГИСТИДИНОМ
В рамках проблемы изучения межмолекулярных взаимодействий компонентов белков –
аминокислот – с полимерными соединениями на уровне комплексов мономеров исследована
модельная система: «гистидин – олигомеры оксиэтилированного глицерина ОЕG-5».
Экспериментальным методом масс-спектрометрии в режиме положительных ионов
зарегистрирован набор протонированных ассоциатов молекулы гистидина с одним и двумя
олигомерами ОЕG-5 – ОЕGn•His•Н+ и ОЕGn•ОЕGm•His•Н+. Предложены структуры таких
комплексов, определенные методом молекулярной динамики. Установлено, что в кластерах с
гистидином происходит закручивание полимерных цепочек вокруг заряженных центров
аминокислоты.
Ключевые
слова:
гистидин,
оксиэтилированный
глицерин,
межмолекулярные
взаимодействия, масс-спектрометрия, молекулярная динамика.
Введение
Изучение межмолекулярных взаимодействий биологически активных молекул, лежащих в основе
их функционирования, является актуальной задачей молекулярной биофизики. Ряд применений такого
класса органических соединений как полиэфиры основан на специфических взаимодействиях данных
полимеров с белковыми компонентами клеток. Взаимодействие с белками осуществляется при
использовании таких представителей полиэфиров как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и его производные для
осаждения и кристаллизации белков, при криоконсервировании биологических материалов,
пегилировании белков для целенаправленной доставки лекарственных препаратов, создании наночастиц
для нанотехнологических приложений и др. [1].
Поскольку нативные белки и полидисперсные полимеры являются достаточно сложными
объектами, комплексное изучение их взаимодействий логично начинать с мономерных компонентов –
аминокислот и олигомеров полиэфиров. В рамках данной проблемы нами ранее было проведено
исследование взаимодействия аминокислоты пролина с оксиэтилированными производными глицерина
ОЕG-5 [2], показавшее возможность образования стабильных комплексов аминокислоты с олигомерами
полиэфира.
В качестве экспериментального метода исследования нами были выбраны методы
мягкоионизационной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением [3] и бомбардировкой
быстрыми атомами [4], которые являются эффективными инструментами изучения межмолекулярных
взаимодействий биомолекул. Для моделирования межмолекулярных комплексов и определения их
структуры был использован метод молекулярной динамики.
Целью данной работы явилось изучение взаимодействий между одним из представителей
аминокислот – гистидином и олигомерами оксиэтилированных производных глицерина с
использованием экспериментального метода масс-спектрометрии и моделирования методом
молекулярной динамики.
Материалы и методы
В работе использовали олигомеры оксиэтилированного глицерина H–(O-CH2-CH2)(n-х)–О-CH2CHOH-CH2-О-(CH2-CH2-O)х-H со средней степенью полимеризации n = 5 (вынесенной в название
препарата ОЕG-5), синтезированные в Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
(Харьков, Украина) [5]. Использовали гистидин производства Реахим (Российская Федерация), метанол
– Сhemapol (Республика Чехия).
Масс-спектрометрические измерения проводили с помощью двух методов ионизации:
бомбардировки быстрыми атомами (ББА) и ионизацией электрораспылением (ИЭР).
Масс-спектры с ББА в режиме положительных ионов регистрировали с помощью секторного
магнитного масс-спектрометра МИ-1201Э (ПО «SELMI», Сумы, Украина). В качестве бомбардирующего
Вісник СевНТУ: зб. наук. пр. Вип. 113/2011. Серія: Фізика біологічних систем і молекул. — Севастополь, 2011.
ФІЗИКА БІОМОЛЕКУЛ І ЇХ КОМПЛЕКСІВ
89
газа использовали аргон; энергия первичного пучка составляла 4,0 кэВ. Жидкое состояние одного из
объектов исследования – низкомолекулярного полимера ОЕG-5, характеризующегося низким давлением
насыщенных паров, позволило избежать использования стороннего вещества в качестве жидкой
матрицы.
Масс-спектрометрические эксперименты в режиме ИЭР проводили на двух экспериментальных
установках: PE Sciex API 2000 Triple Quadrupole LC/MS/MS (PE Sciex, Канада) в рамках сотрудничества
с Институтом структурной химии Химического исследовательского центра Венгерской академии наук, г.
Будапешт, Венгрия и 3200 QTrap LC/MS/MS (ABSciex, США) в демонстрационном центре фирмы «ALT
Украина Лтд», г. Киев, Украина. Для исследований методом ИЭР водные 10-2 М растворы гистидина и
ОЕG-5 смешивали и разбавляли легколетучим растворителем – метанолом до концентрации 10-4 М. Для
получения масс-спектров использовали стандартные протоколы проведения ИЭР измерений. Обработку
первичных масс-спектрометрических данных выполняли с помощью программного обеспечения Analyst
1.4.1 (Applera Corporation and MDS Inc.).
Моделирование ассоциатов методом молекулярной динамики проводили с помощью программы
NAMD [6]. Для моделирования ОЕG и его комплексов с ионами использовали силовое поле CHARMM32
[7]. Шаг интегрирования составлял 1 фс. После 1000 шагов (1 пс) оптимизации геометрии структуры –
минимизации ее потенциальной энергии, симуляция продолжалась 0,2 нс при 300 К. Во время симуляции
координаты и энергии сохраняли на каждом 100 шаге для последующего анализа. Визуализацию
результатов моделирования осуществляли с помощью программ ChemCraft [8] и Vega ZZ [9].
Результаты и обсуждение
Методом масс-спектрометрии с ИЭР была исследована система «гистидин – ОЕG-5». В работе
использовали гистидин (His) в форме гидрохлорида (His•HCl), который в растворе диссоциирует на
органический катион аминокислоты и неорганический анион хлора Cl–. Характерный масс-спектр ИЭР
положительных ионов системы «гистидин – ОЕG-5», приведенный на рисунке 1, содержит сигналы
индивидуальных компонентов системы и их комплексов. В спектре присутствуют пик протонированного
мономера аминокислоты His•Н+
и серии чистого растворителя ОЕG-5: олигомеры ОЕGn в
протонированной ОЕGn•Н+ (n = 2-10, nмакс = 6) и катионизированной ОЕGn•Na+ (n = 3-11, nмакс = 6),
ОЕGn•K+ (n = 2-15, nмакс = 6-7) формах. Основным искомым результатом является регистрация
интенсивных ассоциатов протонированного гистидина с набором олигомеров ОЕG-5 – ОЕGn•His•Н+
(n = 3-16, nмакс = 7). При данном соотношении компонентов системы возможно также образование
тройных комплексов ОЕGn•ОЕGm•His•Н+ (n + m = 8-16, [n + m]макс = 11).
Масс-спектры ИЭР отрицательных ионов данной системы содержат серию кластеров олигомеров
полиэфира с противоионом хлора.
Рисунок 1 – ИЭР масс-спектр положительных ионов системы «гистидин – ОЕG-5»
Вісник СевНТУ: зб. наук. пр. Вип. 113/2011. Серія: Фізика біологічних систем і молекул. — Севастополь, 2011
ФІЗИКА БІОМОЛЕКУЛ І ЇХ КОМПЛЕКСІВ
90
В масс-спектрах положительных ионов, полученных в режиме ББА, также была зарегистрирована
серия протонированных ассоциатов гистидина с олигомерами ОЕGn•His•Н+ (n = 4-9, nмакс = 6), что
показано на рисунке 2. Наблюдение ассоциатов с помощью двух различных методов показывает
отсутствие зависимости их образования от метода ионизации и является подтверждением образования
данных комплексов в исходном растворе.
Таким образом, экспериментально показано, что олигомеры полиэфира ОЭГ-5 образуют
стабильные комплексы с аминокислотой гистидином.
Рисунок 2 – ББА масс-спектр положительных ионов системы «гистидин – ОЕG-5».
Показана область регистрации комплексов ОЕGn•His•Н+
Для выяснения вопроса об избирательности агрегации олигомеров в комплексах
ОЕGn•ОЕGm•His•Н+, в зависимости от числа звеньев цепей n и m, были построены диаграммы,
представленные на рисунке 3. Данные диаграммы позволяют сравнить наблюдаемые экспериментальные
и ожидаемые вклады олигомеров с разной длиной полиэфирных цепочек в ассоциаты.
Vms , Vth
100%
50%
0%
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
n+m
Рисунок 3 – Экспериментально зарегистрированные и теоретически рассчитанные вклады двух мономеров в
комплекс OEGn•ОEGm•His•H+. Штрихованные столбцы диаграммы отображают теоретически рассчитанную
вероятность участия в комплексе OEGn•ОEGm•His•H+ двух олигомеров ОЕG с суммой числа звеньев n+m.
Серым цветом обозначены столбцы, показывающие экспериментальную реализацию суммы n+m в масс-спектре
Вісник СевНТУ: зб. наук. пр. Вип. 113/2011. Серія: Фізика біологічних систем і молекул. — Севастополь, 2011.
ФІЗИКА БІОМОЛЕКУЛ І ЇХ КОМПЛЕКСІВ
91
(n + m)
Значения реальных экспериментально наблюдаемых вкладов Vms
– статистическая вероятность
регистрации комплекса (n + m) – рассчитывались как отношение величины зарегистрированного сигнала,
т.е. интенсивности ассоциата I(n + m) к сумме величин интенсивностей всех комплексов His с двумя
полимерами в масс-спектре, что может быть описано следующим математическим выражением:
I ( n + m)
( n + m)
Vms
=
,
16
(1)
∑ I ( n + m)
( n + m ) =8
где изменение (n + m) в интервале от 8 до 16 соответствует наблюдаемой сумме полимерных звеньев в
комплексах ОЕGn•ОЕGm•His•Н+ в масс-спектре.
Ожидаемое теоретическое распределение определяется вероятностью Vth( n + m ) включения в
ассоциат ОЕGn•ОЕGm•His•Н+ двух олигомеров длиной n и m.
Vth( n + m) =
n + m −1
∑ δ i δ n + m −i ,
(2)
i =1
i ≤15
где для изменения (n + m) принимается во внимание интервал от 8 до 22 звеньев; интервал от 2 до 7
звеньев является малоинформативной областью диаграммы и в рассмотрении не участвует. В формуле 2,
δi есть статистическая вероятность обнаружения полимера со степенью полимеризации i, найденная на
основании статистической обработки всех серий ассоциатов, где зарегистрирован данный полимер:
δi =
I (OEGi ⋅ X + )
11
∑ I (OEG j ⋅ X
+
,
(3)
)
j =1
где в качестве I (OEGi ⋅ X + ) рассматривается суммарная интенсивность полимера ОEGi из серий
ассоциатов OEG c калием K+, натрием Na+, протонированной серии c H+ и серии с гистидином – His•H+,
т.е.:
I (OEGi ⋅ X + ) = I (OEGi ⋅ K + ) + I (OEGi ⋅ Na + ) + I (OEGi ⋅ H + ) + I (OEGi ⋅ His ⋅ H + ) .
Различия в положении максимумов диаграмм и величинах вкладов теоретически рассчитанных и
экспериментально зарегистрированных комбинаций n и m позволяют сделать предположение о
существовании избирательности комплексообразования гистидина с двумя олигомерами разной длины.
Анализ диаграммы наблюдаемых вкладов олигомеров показывает, что формирование тройных
ассоциатов в условиях ИЭР эксперимента происходит c наибольшей вероятностью из олигомеров ОЕG-5
с суммарным числом звеньев n+m=11.
С помощью метода молекулярной динамики проведена оценка структурных параметров
сольватных комплексов аминокислоты гистидина с одной и c двумя полимерными цепочками ОЕG-5. В
качестве примера полученных структур на рисунке 4 приведена визуализация парного комплекса
ОЕG5•His•Н+, а на рисунке 5 – тройного комплекса ОЕG3•ОЕG5•His•Н+. В данных модельных комплексах
гистидин находится в протонированной цвиттерионной форме, т. е. несет положительный заряд на NH3+
группе и гетероциклическом кольце и отрицательный заряд на СОО- группе. Анализ структур показал,
что предложенная нами ранее [2] модель закручивания полимерной цепочки вокруг органического
катиона справедлива и для комплексов гистидина с олигомерами ОЕG-5. В структуре ОЕG5•His•Н+ на
рисунке 4 реализуется взаимодействие посредством водородных связей практически между всеми
функциональными группами молекул, способными к образованию Н-связей. Одна из терминальных ОНгрупп олигомера образует Н-связь с СОО- группой, а вторая – с NH3+ группой цвиттериона. Центральная
ОН-группа глицеринового остатка стабилизирует комплекс посредством формирования циклической
структуры с Н-связями как с СОО-, так и с NH3+ группами. Оксиэтильная цепочка, контактирующая с
анионной СОО- группой, обращена к ней атомами водорода, несущими частичный положительный заряд.
К положительно заряженному кольцу гистидина обращены эфирные кислороды второй оксиэтильной
цепочки. Таким образом, цепочка полимера самоорганизуется вокруг заряженных групп аминокислоты.
Агрегация тройного комплекса ОЕG3•ОЕG5•His•Н+, представленного на рисунке 5, происходит
благодаря навиванию полимерной цепи ОЕG5 вокруг заряженных цвиттерионных групп гистидина COOи NH3+ и формированию водородных связей с участием всех трех ОН-групп олигомера. Контакты
олигомера ОЕG5 с заряженным кольцом гистидина в отличие от парного комплекса отсутствуют,
поскольку в данном случае кольцо окружает вторая цепочка ОЕG3.
Вісник СевНТУ: зб. наук. пр. Вип. 113/2011. Серія: Фізика біологічних систем і молекул. — Севастополь, 2011
ФІЗИКА БІОМОЛЕКУЛ І ЇХ КОМПЛЕКСІВ
92
Рисунок 4 – Структура комплекса ОЕG5•His•Н+,
полученная методом молекулярной динамики и
построенная с помощью программы визуализации
ChemCraft
Рисунок 5 – Структура тройного комплекса
ОЕG3•ОЕG5•His•Н+, полученная методом
молекулярной динамики. Визуализация
с помощью программы VegaZZ
Описанные выше закономерности формирования структур комплексов, в целом, соблюдаются при
взаимодействии с гистидином олигомеров с разной длиной цепочки и с различной комбинацией длин
двух олигомеров в тройных комплексах.
Представляет интерес рассмотреть значение полученных результатов в связи с молекулярнобиофизическим вопросом об условиях существования нейтральной и цвиттерионной форм аминоксилот.
Известно, что аминокислоты могут находиться в цвиттерионной форме в растворе и в кристалле, в
то время как при переводе в газовую фазу или изолированное состояние они имеют тенденцию к
переходу в нейтральную форму. В литературе рассматривался вопрос о минимальном количестве
молекул растворителя, необходимых для поддержания цвиттерионной структуры [10]. Образование
множественных водородных связей в комплексе аминокислоты с олигомерами ОЕGn, по всей видимости,
способствует стабилизации цвиттерионной структуры. Формирование сетки водородных связей между
олигомером и аминокислотой может являться одним из молекулярных механизмов предотвращения
криоповреждений при замещении гидратной оболочки биомолекулы на сольватную при использовании
полиэфиров в качестве криопротекторов. Возможность агрегации цепочек полиэфиров вокруг
заряженных аминокислотных остатков необходимо также учитывать при рассмотрении структуры
пегилированных белков, разрабатываемых для использования в качестве лекарственных препаратов.
Выводы
На основании проделанной работы можно сделать следующие выводы.
Масс-спектрометрически зарегистрированы комплексы протонированной аминокислоты
гистидина с набором олигомеров полиэфира ОЕG-5, а также тройные комплексы гистидина с двумя
молекулами полимера, т.е. экспериментально показана возможность агрегации полимерных цепей ОЕG-5
на заряженных группах гистидина.
Структуры зарегистрированных комплексов определены методом молекулярной динамики.
Установлено, что в ассоциатах с аминокислотой цепочки олигомеров окружают заряженные группы
гистидина, принимая квазициклическую конформацию и образуя сетку водородных связей с
заряженными группами аминоксилоты.
Полученные данные о структуре комплексов гистидина с полиэфирами могут быть полезными при
изучении молекулярных механизмов действия криопротекторов и установлении структуры
пегилированных белков.
Перспективы дальнейших исследований состоят в применении результатов настоящей работы при
изучении взаимодействия полиэфиров с другими аминокислотами и заряженными функциональными
группами на поверхности белков.
Авторы выражают благодарность доктору Зинченко А.В. за любезно предоставленные образцы
ОЕG-5; доктору Агнеш Гомори и доктору Каролю Векею за помощь в получении масс-спектров ИЭР в
рамках межакадемической программы научного обмена между Украинской и Венгерской
Вісник СевНТУ: зб. наук. пр. Вип. 113/2011. Серія: Фізика біологічних систем і молекул. — Севастополь, 2011.
ФІЗИКА БІОМОЛЕКУЛ І ЇХ КОМПЛЕКСІВ
93
национальными академиями наук, а также Кулик А.Н. за помощь в проведении экспериментов в
демонстрационном центре «ALT Украина». Моделирование методом молекулярной динамики было
проведено с использованием ресурса грид-кластера ФТИНТ НАН Украины.
Библиографический список использованной литературы
1. Harris J.M. Poly(ethylene Glycol): Chemistry and biological applications / J.M. Harris, S. Zalipsky //
Amer. Chem. Soc. — Washington, 1997. — 500 p.
2. Масс-спектрометрическое изучение взаимодействия аминокислот с криопротекторами. Пролин
и оксиэтилированные производные глицерина / В.Г. Зобнина [и др.] // Биофизический вестник. — 2009.
— Вып. 22. — № 1. — С. 103–115.
3. Cole R.B. Electrospray ionization mass spectrometry: fundamentals, instrumentation and applications /
R.B. Cole. — Wiley –Interscience. New York, 1997. — 600 p.
4. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев — М.: Бином.
Лаборатория знаний, 2003. — 493 с.
5. Чеканова В.В. Синтез, токсичность и криопротекторная активность оксиэтилированных амидов:
автореф. дис. … канд. биол. наук.: спец. 03.00.19 «Криобиология» / В.В. Чеканова. — Харьков, 1993. —
17 с.
6. Phillips J.C. Scalable molecular dynamics with NAMD / J.C. Phillips, R. Braun, W. Wang, J. Gumbart,
E. Tajkhorshid, E. Villa, C. Chipot, R.D. Skeel, L. Kale, K. Schulten // J. Comput. Chem. — 2005. — Vol. 26.
— N 16. — P. 1781–1802.
7. Brooks B.R. CHARMM: The biomolecular simulation program / B.R. Brooks, C.L. Brooks III,
A.D. Mackerell, Jr. L. Nilsson, R.J. Petrella, B. Roux, Y. Won, G. Archontis, C. Bartels, S. Boresch, A. Caflisch,
L. Caves, Q. Cui, A.R. Dinner, M. Feig, S. Fischer, J. Gao, M. Hodoscek, W. Im, K. Kuczera, T. Lazaridis,
J. Ma, V. Ovchinnikov, E. Paci, R.W. Pastor, C.B. Post, J.Z. Pu, M. Schaefer, B. Tidor, R.M. Venable,
H.L. Woodcock, X. Wu, W. Yang, D.M. York, M. Karplus // J. Comput. Chem. — 2009. — Vol. 30. — N 10. —
P. 1545–1614.
8. URL: http://www.chemcraftprog.com сайт программы ChemCraft, 2010 (дата обращения
22.02.2010).
9. Pedretti A. An open platform to develop chemo-bio-informatics applications, using plug-in architecture
and script programming Vega / A. Pedretti, L. Villa, G. Vistoli // J.C.A.M.D. — 2004. — Vol. 18. —
P. 167–173.
10. Bandyopadhyay P. An integrated effective fragment – polarizable continuum approach to solvation:
Theory and application to glycine / P. Bandyopadhyay, M.S. Gordon, B. Mennucci, J. Tomasi // J. Chem. Phys.
— 2002. — Vol. 116. — N 12. — P. 5023–5032.
Поступила в редакцию 22.09.2010 г.
Зобніна В.Г., Косевич М.В., Боряк О.А., Чаговець В.В. Міжмолекулярні взаємодії олігомерів
поліефірів з амінокислотою гістидином
В рамках проблеми взаємодій компонентів білків – амінокислот – з полімерними сполуками на
рівні міжмолекулярних комплексів було досліджено модельну систему: «гістидин – олігомери
оксиетильованого гліцерину ОЕГ-5». Експериментальним методом мас-спектрометрії в режимі
позитивних іонів зареєстровано серії протонованих асоціатів молекули гістидина з одним та двома
олігомерами ОЕГ-5 – ОЕGn•His•Н+ і ОЕGn•ОЕGm•His•Н+. Запропоновано структури таких комплексів, які
було визначено методом молекулярної динаміки. Встановлено, що в кластерах з гістидином відбувається
закручування полімерних ланцюгів навколо заряджених центрів амінокислот.
Ключові слова: гістидин, оксиетильований гліцерин, міжмолекулярні взаємодії, масспектрометрія, молекулярна динаміка.
Zobnina V.G., Kosevich M.V., Boryak O.A., Chagovets V.V. Intermolecular interactions of polyethers
oligomers with amino acid histidine
In the framework of a problem of interactions of protein components – amino acids – with polymer
compounds on the level of intermolecular complexes a model system: «histidine – oligomers of oxyethylated
glycerol OEG-5» was studied. Sets of protonated associates of histidine molecule with one and two oligomers of
OEG -5 – ОЕGn•His•Н+ and ОЕGn•ОЕGm•His•Н+ – were registered by experimental mass spectrometriс
technique in the positive ion mode. Structures of such complexes, determined by molecular dynamics simulation,
are proposed. It is found that in clusters with histidine the wrapping of the polymer chains around the charged
groups of amino acid takes place.
Keywords: histidine, oxyethylated glycerol, intermolecular interactions, mass spectrometry, molecular
dynamics.
Вісник СевНТУ: зб. наук. пр. Вип. 113/2011. Серія: Фізика біологічних систем і молекул. — Севастополь, 2011