Ажикова Альфия Кадыровна - Астраханский государственный

На правах рукописи
Ажикова Альфия Кадыровна
ПОСЛЕОЖОГОВАЯ РЕПАРАЦИЯ КОЖИ ПРИ
ВОЗДЕЙСТВИИ КОМПОНЕНТОВ ПУПОВИННОЙ
КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
(экспериментальное исследование)
03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Астрахань – 2010
Работа выполнена на кафедре биотехнологии и биоэкологии Астраханского
государственного университета
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Лазько Марина Владимировна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Неваленный Александр Николаевич
доктор медицинских наук, профессор
Наумова Любовь Ивановна
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Ставропольский
государственный университет
Защита диссертации состоится «25» июня 2010 года в 15-00 часов на
заседании диссертационного совета при Астраханском государственном
университете по адресу: 414000, г.Астрахань, пл. Шаумяна, д. 1, Естественный
институт АГУ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского
государственного университета по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна,
д.1.
Автореферат разослан
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
мая
2010 г.
Ю.В. Нестеров
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Изучение закономерностей воспаления и репаративной регенерации
является одной из фундаментальных задач современной патологии.
Репаративные процессы в ране неразрывно связаны с воспалением и
формируют с ним единую реакцию на повреждение (Серов В.В., Пауков В.С.,
1995; Пальцев М.А., Аничков Н.М., 2001). Репаративная регенерация является
процессом, который имеет свои особенности в различных органах и тканях, но
в целом её основные механизмы присутствуют в заживлении кожных ран (Trent
J.F., Kirsner R.S., 1998; Nwomeh B.C. еt al., 1998).
Особую актуальность изучение регенерации ран кожного покрова
приобретает в связи с постоянным ростом количества дефектов кожи и рубцов
вследствие ожогов, операций, порезов, трещин, травм, язв, постакне (Ахтямов
С.Н., Бутов Ю.С., 2003; Sahi W.J. et al., 1994). В последнее время участились
случаи термического поражения кожи из-за взрывов, пожаров, и это требует
быстрой и качественной терапии. Несмотря на обилие препаратов для
местного лечения ожогов, совершенствование методов их лечения по-прежнему
остается актуальной задачей (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990; Парамонов
Б.А. и др., 2000).
В последние годы для улучшения результатов лечения ожоговых ран и
снижения
травматичности
хирургического
лечения
осуществляют
трансплантацию клеток и биоинженерных конструкций с иммобилизованными
клетками (Расулов М.Ф. с соавт.,2005).
Источниками клеточного материала могут служить костный мозг,
абортивный материал, периферическая и пуповинная кровь (Шумаков В.И,
Онищенко Н.А., 2009).
Пуповинная кровь (ПК) представляет особый интерес ввиду ее
доступности, относительной легкости получения и безопасности для
потенциального донора (Белоконева О.С., 2002). Она содержит в своем составе
биологически
активные
компоненты,
активирующие
репаративнопролиферативные процессы: витамины, гормоны, ферменты, белки.
Весьма важно, что через активацию репаративно-пролиферативных
процессов можно добиться снижения выраженности воспалительной реакции
не только непосредственно в месте приложения активирующего усилия
(Саидгалин Г.З., Салистый П.В.,Панова О.В. и др. 2000), но и в отдаленных
органах и тканях, что является результатом существования реципрокных
отношений между этими процессами гомеостаза (Воздвиженский С.И. с соавт.,
1999).
Целью работы явилось сравнительное экспериментальное выявление
особенностей послеожоговой репарации кожи крыс в условиях воздействия
биологически активных компонентов пуповинной крови человека и при
стандартном лечении.
3
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи
исследования:
1. Разработать методику применения пуповинной крови человека, как
нативной, так и криоконсервированной, для лечения ожогов кожи.
2. Провести оценку процессов репарации ожогов кожи крыс в норме, как
местно, так и на уровне целостного организма.
3. Экспериментально изучить в сравнении процессы репарации ожогов
кожи крыс при воздействии нативной пуповинной крови человека и при
использовании препарата «10% линимент синтомицина»
4. Провести сравнительную оценку процессов репарации ожогов кожи
экспериментальных
животных
при
использовании
нативной
и
криоконсервированной пуповинной крови человека.
Научная новизна исследования заключается в том, что впервые
изучено влияние пуповинной крови на регенераторные процессы в тканевых
структурах кожи после ожоговой травмы при её аппликации на ожоговую
поверхность.
Впервые установлена динамика изменений клеточного состава ожоговых
ран при экспериментальной ожоговой травме в условиях воздействия
пуповинной крови человека.
Изучены морфологические особенности заживления раневых дефектов
кожного покрова после термической травмы при использовании пуповинной
крови в сравнении с 10% линиментом синтомицина.
Исследованы качественные и количественные изменения клеток
периферической крови экспериментальных животных (крыс) после
термической травмы и её лечения биологически активными компонентами
пуповинной крови человека.
Разработан способ лечения раневых дефектов кожного покрова после
термической травмы с использованием биологически активных компонентов
пуповинной крови человека (заявка на изобретение «Биологический
стимулятор для интенсификации поврежденной кожи» авторы Ажикова А.К.,
Лазько М.В., регистрационный номер 2008151998 от 26.12.2008.).
Научно-практическая значимость работы.
Результаты настоящего исследования демонстрируют преимущество
использования пуповинной крови как альтернативного способа лечения
ожоговых повреждений кожи. Внедрение способа лечения раневых дефектов
кожного покрова после термических ожогов за счет использования пуповинной
крови человека позволит оптимизировать течение репаративных процессов в
ране и снизить риск формирования рубцов.
На основании экспериментальной части диссертации был выигран
открытый конкурс № 2008-Н-067 Фонда содействия развитию малых форм
предприятий
в
научно-технической
сфере
«Проведение
научноисследовательских и опытно-конструкторских работ по приоритетным
направлениям развития науки и техники в рамках реализации Программы
«СТАРТ-09»: Лот № 2. Проведение научно-исследовательских и опытно4
конструкторских работ по приоритетным направлениям развития науки и
техники в области медицины, фармакологии, биотехнологии для медицины
(Направление Н 2).
Подписан государственный контракт №6550р/9141 от 21.01.2009 г. Тема
НИОКР «Исследование репаративной возможности поврежденной кожи белых
крыс в условиях воздействия биологически активных компонентов пуповинной
крови человека». Результаты НИОКР зарегистрированы во Всероссийском
Научно-техническом информационном центре (ВНТИЦ), работе присвоен
регистрационный номер № 01200956788.
Реализация и внедрение результатов исследования.
Разработанная методика применения пуповинной крови человека для
целей комбустиологии, сравнительные комплексные данные о процессах
заживления ожоговых дефектов кожи крыс в норме, а также при воздействии
нативной и криоконсервированной пуповинной крови человека, не только в
месте ожоговой раны, но и на уровне целостного организма, раскрывают
перспективы поиска оптимальных методов лечения ожогов.
Разработанный открытый способ лечения ожогов, базирующийся на
замене химического медикаментозного струпа биологическим, может активно
применяться в медицинской практике. При воздействии пуповинной крови
человека на обожженную поверхность отмечается отчетливый болеутоляющий
эффект, образуется более тонкий струп, под ним быстро протекает
эпителизация, рубцов почти не образуется.
Основные положения и выводы работы используются при обучении
студентов, слушателей на кафедрах биотехнологии и биоэкологии,
зооинженерии и морфологии животных Инновационного Естественного
института Астраханского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту:

Разработанная методика применения пуповинной крови человека при
ожоговых травмах отличается безопасностью, эффективностью и простотой
выполнения.

Процесс регенерации ожогового дефекта кожи и местно и на уровне
организма в целом имеет более благоприятное течение при лечении
пуповинной крови человека в сравнении с традиционным лечением «10%-ным
линиментом синтомицина».

Пуповинная кровь проявляет качества индуктора пролиферационной
активности эпителиальных и соединительнотканных элементов, приводящий к
значительному сокращению продолжительности всех стадий раневого
процесса.

Допускается криоконсервирование пуповинной крови, приводящее,
однако, к снижению её репаративных свойств.
5
Апробация результатов исследования
Материалы диссертационного исследования обсуждены на IV
международной
конференции
"Фундаментальные
исследования"
(Доминиканская республика, 2009), на IV научной международной
конференции «Проблемы международной интеграции национальных
образовательных стандартов», (Париж-Лондон, 2009).
Научно-исследовательская работа одержала победу в открытом конкурсе
№ 2008-Н-067 Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научнотехнической сфере «Проведение научно-исследовательских и опытноконструкторских работ по приоритетным направлениям развития науки и
техники в рамках реализации Программы «СТАРТ-09»: Лот №2. Проведение
научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ по приоритетным
направлениям развития науки и техники в области медицины, фармакологии,
биотехнологии для медицины (Направление Н2) (Пятигорск, 2009).
Положения диссертации были доложены на расширенном заседании
кафедр биотехнологии и биоэкологии, зооинженерии и морфологии животных
Естественного института Астраханского государственного университета
(Астрахань, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в
т.ч. 1 статья в реферируемом журнале ВАК РФ, 1 статья опубликована в
зарубежном издании.
Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве, результаты
которых включены в диссертацию, включает теоретическое обоснование
проблем, выбор общего направления исследований, непосредственное участие
в постановке экспериментов и выполнении исследований.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав,
посвященных обзору литературы, описанию материалов и методов
исследования, изложению и обсуждению результатов собственных
исследований, заключения, выводов. Общий объем диссертации – 133
страницы, работа иллюстрирована 13 рисунками и 8 таблицами.
Библиографический список включает 151 источник, из них – 78 иностранных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальный раздел работы выполнен на базе лаборатории
экспериментальной физиологии Астраханского государственного университета
(АГУ) (заведующий – профессор Д.Л.Теплый) и лаборатории биотехнологий
АГУ (заведующий – профессор М.А.Егоров). Все процедуры по уходу за
экспериметальными животными осуществляли в соответствии с нормами и
правилами обращения с лабораторными животными с учетом требований
Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (1973). Во
время эксперимента регистрировали общее состояние и поведение животных
(Ронин В.С., 1989).
Экспериментальное исследование проведено на 120 белых беспородных
крысах–самцах массой 220 – 250 г. Для повышения репрезентативности
6
результатов исследования эксперимент проводился 3 раза в осенне-зимний
период.
В работе использовалась пуповинная кровь рожениц родильного
отделения ГУЗ Александро-Мариинской областной клинической больницы
(истории родов № 4232-4280), в осенне-зимний период.
На следующие сутки после нанесения термического ожога у всех
животных измеряли величину ожоговой поверхности. После этого были
сформированы 4 экспериментальные группы по 10 особей в каждой.
Животные I группы (контроль) после нанесения ожога не получали
никакого лечения и заживление ожоговой раны происходило спонтанно.
Животным II группы через сутки после нанесения ожога, а затем ежедневно 2
раза на ожоговую рану наносили по 1 мл. препарата «10% линимент
синтомицина» и закрывали стерильным перевязочным материалом.
Животные III группы получали лечение по аналогичной программе, но
вместо «10% линимент синтомицина» наносили на ожоговую рану по 1 мл.
нативной пуповинной крови человека. Кровь для аппликаций брали ежедневно
и хранили при температуре -4°С не более 8 часов.
Животным IV группы аналогично наносилось по 1 мл.
криоконсервированной, а затем размороженной и подогретой до +37оС
пуповинной крови человека.
Животных во всех группах выводили из эксперимента на 3, 5, 7 и 10-е
сутки путем внутрибрюшинного введения этаминала натрия в дозе 4 мг/100 г
массы тела. Учитывая, что ускоренное заживление поверхностных ран при
применении пуповинной крови уже на 10 сутки способствовало почти полному
покрытию их эпидермисом, дальнейшее исследование ран не проводилось.
Количественные данные, полученные в ходе выполнения исследования,
проанализированы методами вариационной статистики и определения
достоверности различий. При проведении статистической обработки
использовалась утилита OpenOffice Calc из свободно распространяемого
программного продукта OpenOffice (Ver. 3.0), работающая под управлением
операционной системы Windows XP Home Edition (сертификат OEM X1253766).
Количество биологически активных (живых) клеточных элементов
нативной и криоконсервированной пуповинной крови человека оценивали
путем окрашивания смесью акридинового оранжевого (Sigma) и бромистого
этидия (Sigma) (раствор по 100 мкг/мл каждого в буферный раствор (PBS).
Данный красящий раствор приливали к равному объему крови и просматривали
в камере Горяева. Жизнеспособность клеточных элементов проводили
визуально под микроскопом (зеленые – живые, а оранжевые нежизнеспособные).
Уровень гемоглобина
в образцах крови крыс определяли
электрофотометрическим
способом
на
гемоглобинометре
APEL
Hemoglobinmeter HG-202. Мазки фиксировали и окрашивали по РомановскомуГимзе. Идентификация форменных элементов крови проводилась согласно
7
методике Н.Т. Ивановой (1982). Количество эритроцитов крови подсчитывали
по стандартной методике в камере Горяева.
Гистологически
исследованы
биоптаты
кожи
крыс
всех
экспериментальных групп после 24 часов после криовоздействия, а также на 3,
5, 7 и 10 сутки после него. После фиксации в течение 3 суток при температуре
+4°С в 10 % нейтральном растворе формалина фрагменты кожи заливались в
парафин по стандартной методике. Использовались серийные парафиновые
срезы толщиной 5-7 мкм, приготовленные на роторном микротоме модели 820
«Histocut» (фирма «Reichert-Jung»), которые окрашивались гематоксилином
Караци - эозином и подвергались компьютерной морфометрии на
автоматизированном морфометрическом комплексе «Морфолог».
Комплекс состоит из светового микроскопа Axioskop 20 (Zeiss),
устройства считывания макроизображений, цветной высокоразрешающей
телекамеры VC-C370 (Hitachi), платы ввода видеосигнала в компьютер «Aver
2000», компьютера Pentiun IV, струйного принтера C80SX (Epson) и пакета
программ двух- и трехмерной морфометрии.
Площадь раневой поверхности в ходе эксперимента определяли по
методике, разработанной В.Я.Васюковым, Н.В.Проценко в 1993 году.
Повторное измерение площади раны осуществляли через каждые 2 дня
проводимой локальной терапии.
Площадь раневой поверхности равна площади окружности
S = πR2
где R-расстояние от центра раны до периферии.
Процентное уменьшение площади раны (∆S) или скорость эпителизации в
процессе лечения определяли по формуле Л.Н.Поповой (1942):
,
где: S – величина площади раны при первом измерении (см2); Sn – величина
площади раны в день последующего измерения (см2); t – число суток между
измерениями.
Диагностику и прогнозирование течения раневого процесса ожоговых ран
проводили, изучая цитологическую картину по данным микроскопии мазковотпечатков по методу М.П. Покровской и М.С.Макарова (1942).
Изучали изменения основных клинико-лабораторных показателей крови
крыс (общий анализ крови: количество эритроцитов, уровень гемоглобина),
степень
перекисной
резистентности
эритроцитов
и
уровень
ацилгидроперекисей в плазме крови крыс сразу после забоя.
Кровь на исследование брали у крыс при декапитации, забой происходил
под этаминал натриевым наркозом (4 мг. на 100 гр. массы животного,
внутрибрюшинно). Плазму получали путём центрифугирования в течении 15
минут.
Для определения концентрации гидроперекисей липидов (ГПЛ) в
периферической крови крыс измеряли УФ-поглощение липидных зкстрактов
8
крови.
Принцип
метода
основан
на
интенсивном
поглощении
коньюгированных диеновых структур ГПЛ в области 232-234 нм.
Для оценки уровня свободнорадикального окисления (СРО) и
выраженности в связи с этим липолитических процессов в крови проводили
измерение перекисной резистентности эритроцитов, используя методику
определения перекисного гемолиза эритроцитов (Покровский А.А., Образцов
А.А. 1964).
Состояние перекисного окисления липидов в печени оценивали по
содержанию в ней малонового диальдегида, которое определялось по методике
Ю.А.Владимирова и А.И.Арчакова (1972) в модификации И.Д.Стальной и
Т.Т.Гаришвили (1977), Т.А.Кочетова (1980).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Отработка методики применения пуповинной крови человека для лечения
ожогов кожи
В ходе исследования было выявлено, что на количественное соотношение
биологически активных (живых) и неактивных (мертвых) клеток пуповинной
крови человека влияют время хранения и объем собранной крови.
Как показано в Табл.1, после 10 часов хранения при - 4оС количество
живых клеточных элементов достоверно снижается. В столбце «Р»
представлены достоверности различий средних арифметических количества
живых клеток предыдущего и последующего сроков хранения.
Таблица 1
Снижение количества живых клеток пуповинной крови человека в зависимости от
сроков хранения
Срок хранения (ч)
Доля живых клеток (%, M±m)
Р
2-6
6-10
10-18
88,58±1,23
86,37±1,32
82,25±1,48
<0,05
>0,05
>24
78,44±1,28
>0,01
Таким образом, максимально только до 10 часов хранения убыль
биологически активных клеточных элементов нативной пуповинной крови
человека является статистически недостоверной и ею можно пренебречь.
Установлено, что объем получаемой пуповинной крови прямо
пропорционально зависит от массы новорожденного.
Зафиксировано наличие врожденной стерильности нативной пуповинной
крови человека, т.к. в 87% случаев забора крови отсутствал рост колоний в
чашках Петри с 5% кровяным агаром при +37оС через 24 часа.
Установлено, что в криоконсервированной пуповинной крови человека на
7 сутки хранения содержится в 2,7 раза меньше жизнеспособных клеточных
элементов по сравнению с нативной пуповинной кровью (0,42±0,57х10 9 и
1,13±0,57×109 соответственно, Р<0,01).
9
Морфологическая характеристика используемых методов лечения ожогов
кожи
У крыс, получавших лечение ожогов препаратом «10% линимент
синтомицина» (Рис.1) по сравнению с животными, не получавшими никакого
лечения (контрольными) (Рис.2), через 3 суток после ожоговой травмы на
поверхности ран имелись остатки струпа в виде фиброзно-лейкоцитарного
слоя, под которым располагалась грануляционная ткань с упорядоченным
ходом слабофуксинофильных коллагеновых волокон.
Рис.1. Ожоговая рана крысы, получавшей лечение 10% линиментом синтомицина, через 3
суток после термического воздействия
Рис.2. Ожоговая рана крысы, не получавшей лечения, через 3 суток после термического
воздействия
У животных, которым проводились аппликации криоконсервированной
пуповинной кровью человека (Рис.3), через 3 суток после ожога наблюдалась
слабовыраженная диффузная инфильтрация грануляционной ткани раны
лимфоидными и гистиоцитарными элементами. Грануляционная ткань
заживающей ожоговой раны характеризовалась преобладанием клеточных
элементов над коллагеновыми волокнами.
Рис.3. Ожоговая рана крысы, получавшей лечение криоконсервированной пуповинной
кровью, через 3 суток после термического воздействия
У крыс, получавших аппликации нативной пуповинной кровью человека
(Рис.4), уже через 3 суток после ожога было отмечено, что лучше сохранялись
10
жизнеспособные эпителиальные элементы кожи на фоне высокой плотности
новообразованных сосудов и появления коллагеновых волокон; эпидермис был
более сформирован за счет регенерирующих клеток базального слоя, отмечалось
увеличение количества клеток шиповатого слоя.
Рис.4. Ожоговая рана крысы, получавшей лечение нативной пуповинной кровью, через 3
суток после термического воздействия
В участках без базальной мембраны также отмечался рост эпидермального
слоя различной степени выраженности.
Применение нативной пуповинной крови статистически достоверно
(Р<0,05) сократило размер раны уже на второй день эксперимента.
Примененный
противовоспалительный
препарат
«10%
линимент
синтомицина» в дозе 1 мл достоверно не влиял на величину ожога у крыс в
начальный период (1-2 сутки) ожоговой травмы.
На протяжении следующего за 5 сутками времени после нанесения ожога
его площадь у животных подопытных групп, получавших лечение
криоконсервированной пуповинной кровью человека, была достоверно меньше,
чем у контрольных крыс, не получавших никакого лечения.
Следует отметить, что наибольшие различия с контролем при этом были
зарегистрированы у крыс, получавших аппликации нативной пуповинной крови
(Рис.5, Табл.2).
4,5
4
3,5
кв.см
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1
2
5
время после ожога (сут.)
Контроль
криоконсерв. пуповинная кровь
7
10
10% линимент синтомицина
пуповинная кровь
Рис.5. Временная динамика площадей ожоговых ран
11
Таблица 2
Динамика изменений площади ожоговых ран крыс при лечении различными
препаратами (M±m, см2)
Срок наблюдения (сут.)
Способ лечения
1
2
5
7
10
Контроль
4,0±0,3 3,8±0,3 3,3±0,3
3,2±0,2
2,8±02
Нативная пуповинная кровь
4,0±0,3
3,3±0,3
2,0±0,1
1,3±0,2
1,0±0,2
«10% линимент синтомицина»
4,0±0,3
3,7±0,2
2,7±0,2
2,4±0,3
2,2±0,2
Криоконсервированная
пуповинная кровь
4,0±0,3
3,5±0,3
2,3±0,2
2,1±0,2
1,5±0,4
Установлено, что скорость репаративной регенерации ожоговой раны
прямо пропорционально зависит от её площади, то есть чем меньше площадь
раны, тем быстрее скорость эпителизации (Табл.3).
Таблица 3
Скорости эпителизации ожоговых ран при различном лечении (%)
Срок наблюдения (сут.)
Способ лечения
1
2
5
7
10
Контроль
0
2
8
10
16
Нативная пуповинная кровь
0
8
25
33
37
«10% линимент синтомицина»
0
3
16
20
22
Криоконсервированная пуповинная кровь
0
6
21
23
43
В отдаленные периоды наблюдения — на 7-10 сутки отмечалось
ускоренное по сравнению с контролем заживление ожогов у крыс, получавших
лечение нативной пуповинной кровью. Медленнее всего протекала регенерация
ожоговой раны у крыс, получавших лечение препаратом сравнения – «10%
линимент синтомицина».
При микроскопическом исследовании кожи в месте ожога у контрольных
крыс на 7 сутки после нанесения ожоговой травмы отмечался выраженный отек
всех слоев дермы, воспалительная клеточная инфильтрация, распространенный
очаговый некроз всех слоев кожи, спазм мелких сосудов и их сдавливание
экссудатом. Выявлялись места отторжения струпа и нагноения, отсутствие
верхних слоев кожи (Рис.6 а, б, в)
а
б
в
Рис.6. Микрофотографии препаратов кожи в месте ожоговой раны у крыс, не получавших
лечения, на 7 сутки после термического воздействия. Гематоксилин-эозин. Ув.об.20, ок.10.
12
На 7 сутки после термической травмы на фоне терапии препаратом «10%
синтомициновая эмульсия» ожоговая рана покрыта кровяным струпом.
Отмечается местная воспалительная инфильтрация, развитие молодой
грануляционной ткани и новообразование капилляров. Наблюдалось
повреждение шиповидного и базального слоев покровного эпителия.
Отмечались признаки повреждения луковиц волосяных фолликулов,
экзокринных и апокринных желез (Рис.7, а, б, в, г).
а
б
в
г
Рис.7. Микрофотографии препаратов кожи в месте ожоговой раны у крыс, получавших
лечении 10% линиментом синтомицина, на 7 сутки после термического воздействия.
Гематоксилин-эозин. Ув.об.20, ок.10.
После терапии ожоговой раны аппликациями нативной пуповинной
кровью на 7 сутки идет новообразование сосудов, рана приобретает розовый
цвет, наблюдается значительное уменьшение воспалительной инфильтрации.
Морфологическая картина заживления раневых дефектов у крыс при
лечении нативной пуповинной кровью на 10 сутки после нанесения ожога
существенно отличалась от картины, описанной выше в контрольной группе
крыс. У многих крыс отмечалась эпителизация ран. В грануляционной ткани
выявлялось умеренное количество тонкостенных сосудов. Отмечалось
достаточное число пикринофильных коллагеновых волокон. Наблюдалась
диффузная и слабовыраженная инфильтрация грануляционной ткани (Рис.8, а,
б, в, г).
а
б
в
г
Рис.8. Микрофотографии препаратов кожи в месте ожоговой раны у крыс, получавших
лечении нативной пуповинной кровью человека, на 7 сутки после термического воздействия.
Гематоксилин-эозин. Ув.об.20, ок.10.
13
Морфологическая
картина
при
лечении
аппликациями
криоконсервированной пуповинной кровью человека сходна с предыдущим
случаем. Однако, выраженность благоприятных для репарации ожоговой раны
структурных признаков заметно слабее. В частности, количество
новообразованных сосудов заметно меньше (Рис.9, а, б, в, г).
а
б
в
г
Рис.9. Микрофотографии препаратов кожи в месте ожоговой раны у крыс, получавших
лечение криоконсервированной пуповинной кровью человека, на 7 сутки после термического
воздействия. Гематоксилин-эозин. Ув.об.20, ок.10.
В мазках-отпечатках с поверхности ожоговой раны на 7 сутки обнаруживали уменьшение количества нейтрофилов, но относительное увеличение
лимфоцитов, юных фибробластов и полибластов. Содержание макрофагов в
ране и их фагоцитарная активность у крыс с терапией нативной пуповинной
кровью человека был достоверно выше, чем в контрольной группе.
На Рис.10 представлен клеточный состав на 7 сутки эксперимента
мазков отпечатков из ожоговых ран без лечения (розовые столбики) и в
условиях местной терапии нативной пуповинной кровью человека. На
данном рисунке цифрами обозначены: 1-эндотелиоциты, 2-нейтрофилы, 3эозинофилы, 4-большие лимфоциты, 5-лимфоциты, 6-гемопоэтические
стволовые клетки, 7-юные фибробласты и 8-плазмоциты.
120
Кол-во клеток (х10^9)
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
Контроль
5
6
7
8
Пупов инная кров ь
Рис.10.Содержание клеток в мазках-отпечатках из ран на 7 сутки при ожогах без терапии и c
лечением нативной пуповинной кровью человека
14
Одной из причин более быстрого заживления ожоговых ран при
использовании аппликаций нативной пуповинной крови человека является ее
стимулирующее влияние на клеточную пролиферацию в эпителии кожи, на что
косвенно указывают результаты измерения толщины росткового слоя
эпидермиса в краях эпителизации ожоговых ран крыс, которые отражены в
таблице 4. Вероятность различий с показателями в контрольных группах
животных составила 99,95%.
Таблица 4
Средняя толщина росткового слоя эпидермиса в краях эпителизации ожоговых ран крыс
через 7 суток после начала эксперимента (M±m, мкм)
Средняя толщина росткового
Способ лечения
слоя
Контроль
23,3 ± 0,2
Нативная пуповинная кровь
36,9 ± 0,3
«10% линимент синтомицина»
30,6 ±0,2
Криоконсервированная пуповинная кровь
33,8 ± 0,4
Так, уже через неделю после начала эксперимента у животных без
воздействия и при аппликациях нативной пуповинной крови этот показатель
составил соответственно 23,3±0,2 мкм и 36,9±0,3 мкм. Толщина росткового
слоя эпидермиса после использования мази «10% линимент синтомицина» в
этот же период наблюдения составила 30,6±0,2 мкм, а после лечения
аппликациями криоконсервированной пуповинной кровью - 33,8±0,4 мкм.
Вероятность различий с показателями в контрольных группах животных
составила 99,5%.
Результаты анализа клеточного состава дермы под раневой поверхностью
через неделю после нанесения ран коррелируют с указанными выше
особенностями течения раневого процесса при использовании разных
аппликаций.
Так, в сравнении с животными контрольных групп, суммарное число
клеточных элементов в дерме, подсчитанное на поле зрения микроскопа,
значимо снижается при аппликации пуповинной крови. При этом наблюдается
отчетливо выраженный сдвиг в сторону клеток фибробластического ряда, что в
совокупности свидетельствует о более быстром разрешении в этих условиях
воспалительного процесса, развивающегося в месте ожога.
Примечательно, что у животных контрольной группы в течение первых
10 суток имелись клинические признаки интоксикации: снижение аппетита,
веса и двигательной активности. При терапии и нативной, и
криоконсервированной пуповинной кровью человека даже в течение первых
суток клинические признаки интоксикации были умеренными и исчезали
полностью к 6-8 суткам наблюдения.
Морфо-функциональная характеристика используемых методов лечения
ожогов кожи
15
Анализ гематологических исследований экспериментальных животных
показал, что наиболее высокий и статистически достоверно отличающийся от
контроля уровень гемоглобина периферической крови наблюдается у крыс,
лечившихся аппликациями пуповинной крови человека. В остальных
экспериментальных группах данный показатель незначительно и статистически
недостоверно отличается от значений у животных, не получавших лечения
(Табл. 5, * - Р<0,05 по сравнению с контролем).
Таблица 5
Гематологические показатели через 7 суток после ожоговой травмы
Эритроциты ПГЭ Гемоглобин
Способ лечения
(шт./мкл.)
(%) (г/л)
6
Контроль
7,8х10
10
23,7
6
Нативная пуповинная кровь
8,8х10 *
6*
32,2 *
«10% линимент синтомицина»
Криоконсервированная пуповинная кровь
8,2х106
8,5х106
8
7*
25,3
26,7
Изучение перекисного гемолиза эритроцитов в эксперименте показало,
что чувствительность последних к перекисной провокации зависит от метода
лечения. Нелеченный термический ожог способствует наиболее полному
гемолизу эритроцитов (степень гемолиза в среднем 10 %).
Лечение ожогов «синтомициновой эмульсией» вызывает средний гемолиз
(степень гемолиза в среднем 8%, Р>0,05), при терапии нативной пуповинной
кровью и криоконсервированной пуповинной кровью наблюдался частичный
гемолиз (степень гемолиза в среднем 6% и 7% соответственно, Р<0,05).
Термический ожог кожи вызывает уменьшение количества эритроцитов
периферической крови крыс. Установлено, что при лечении ожогов этот
показатель увеличивается, но в различной степени в зависимости от способа
лечения.
Только лечение ожогов аппликациями нативной пуповинной крови
человека делает разницу средних арифметических содержания гемоглобина в
периферической крови нелеченных и леченных животных статистически
достоверной (Р<0,05).
Содержание ацилгидроперекисей в плазме крови экспериментальных
животных через 7 суток после ожога при различных способах лечения
представлено в Табл.6 и Рис.11.
Таблица 6
Содержание ацилгидроперекисей в плазме крови экспериментальных животных при
различных способах лечения ожогов (ед./мл плазмы, М±m)
Способ лечения
М±m
Контроль
5,3±0,06
Нативная пуповинная кровь
4,2±0,08
«10% линимент синтомицина»
5,0±0,09
Криоконсервированная пуповинная кровь
4,8±0,07
16
Отмечено, что только лишь при лечении ожоговых ран аппликациями
нативной пуповинной крови и криоконсервированной пуповинной крови
человека отмечается статистически достоверное (Р<0,05) снижение уровня
ацилгидроперекисей в плазме крови по сравнению со случаем отсуствия
терапии ожога кожи.
6
5
ед/мл.
4
3
2
1
0
Контроль
пуповинная кровь
10% ленимент синтомицина
Криоконсерв.пуповинная кровь
Рис.13. Содержание ацилгидроперекисей в плазме крови белых крыс при различных
способах лечения ожогов
Результаты изучения ПОЛ по содержанию в печени крыс малонового
диальдегида на 7 сутки после ожоговой травмы и использования изучаемых
препаратов показали (Табл.7), что локальный ожог кожи вызывает
значительную, статистически высокодостоверную (Р<0,01) интенсификацию
перекисного окисления липидов в печени экспериментальных животных. Как и
в вышеизложенных исследованиях, местное применение нативной и
криоконсервированной пуповинной крови человека способствует достоверной
нормализации этого процесса (Р<0,01 и P<0,05 соответственно). В случае
использования 10% линимента синтомицина подобного статистически
достоверного эффекта не наблюдается (P>0,05).
Таблица 7
Содержание малонового диальдегида в печени животных различных
экспериментальных групп (нМоль/мг.)
Пуповинная
кровь
спонтанное
аскорбатзависимое
исходное
спонтанное
аскорбатзависимое
исходное
спонтанное
аскорбатзависимое
исходное
Криоконсерв.
пуповинная кровь
исходное
«10% линимент
синтомицина»
аскорбатзависимое
Контроль
спонтанное
Виды ПОЛ
Способ
лечения
8,1
35,1
1,6
7,7
50,3
1,3
13,2
56,6
1,8
8,7
24,3
1,6
17
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Ожог, а если говорить более точно, ожоговая болезнь, представляет собой
не только, да и не столько местный патологический процесс, а страдание,
несомненно, захватывающее организм в целом. Поэтому наше исследование
было направлено и на изучение локальных изменений структуры кожи после
воздействия термического фактора, и на исследование в этом случае некоторых
гомеостатических механизмов. Данная работа преследовала также цель дать
сравнительную оценку эффективности новых методов лечения ожогов кожи
нативной, а также криоконсервированной пуповинной кровью человека по
сравнению с классическим методом лечения таких травм 10% линиментом
синтомицина.
Мы исходили из представления о главенствующей роли в репаративном
послеожоговом процессе биологически активных клеточных элементов
пуповинной крови по сравнению с неактивными. Было выявлено, что на
количественное соотношение биологически активных (живых) и неактивных
(мертвых) клеток пуповинной крови человека влияют время хранения и объем
собранной крови.
Одним из побочных, но практически важных результатов нашей работы
является установление того факта, что объем получаемой пуповинной крови
находится в прямопропорциональной зависимости от массы новорожденного.
Также весьма интересным является выявление феномена, впрочем,
требующего
дальнейших
исследований,
свидетельствующего
о
прямопропорциональной зависимости количества биологически активных
(живых) клеточных элементов нативной пуповинной крови человека от её
получаемого объема.
Продемонстрировано наличие врожденной стерильности нативной
пуповинной крови человека, что весьма практически важно, т.к. избавляет от
необходимости проводить её стерилизацию, которая неизбежно ухудшила бы
репаративные свойства. Наблюдаемую в незначительном числе случаев
микробную обсемененность нативной пуповинной крови вполне можно
объяснить недостатками техники её забора.
Включение в задачи нашего исследования изучения метода лечения
ожогов кожи криоконсервированной пуповинной кровью человека объясняется
чрезвычайной практической значимостью его в условиях возможного дефицита
нативной пуповинной крови. Было установлено, что, хотя на 7 сутки
криоконсервации содержание жизнеспособных клеточных элементов в крови
уменьшается почти в 3 раза, терапевтический эффект остается на приемлемом
уровне и превосходит классический метод.
Гистологическое исследование срезов кожи межлопаточной области спины
в месте ожоговой травмы подтверждает правильность суждений в отношении
большего терапевтического эффекта со стороны пуповинной крови по
сравнению с лечением классическим препаратом сравнения. В частности,
толщина росткового слоя эпидермиса в зоне эпителизации раневой поверхности
18
достоверно выше при лечении нативной и криоконсервированной пуповинной
кровью.
Ускорение темпов заживления ожоговых ран под влиянием терапии
пуповинной кровью достигается за счет ослабления выраженности
деструктивно-воспалительной фазы раневого процесса и активизации
пролиферативно-репаративной фазы.
Тяжелая термическая травма сопровождается развитием интоксикации и
кровь, в первую очередь, подвергается действию токсических веществ,
возникших в очаге поражения.
Исследование таких основополагающих гематологических показателей,
как содержание эритроцитов, гемоглобина и перекисной резистентности
эритроцитов свидетельствует, во-первых, о значительном поражении системы
крови под воздействием местного действия термического фактора и, во-вторых,
о наибольшем нормализующем влиянии на данные параметры гомеостаза
противоожогового применения нативной пуповинной крови человека.
Использование криоконсервированной крови в этом плане также эффективно и
превосходит по действенности классический метод.
В патогенезе ожоговой токсемии исключительно важным звеном является
нарушение функций печени, поскольку печень является главным
детоксицирующим органом. Известно, что сразу после термической травмы
печень подвергается влиянию токсических веществ на фоне резко сниженной
ее антитоксической функции.
Обращает на себя внимание влияние местного ожога кожи, а затем его
терапии или её отсуствия на окислительно-восстановительный баланс
организма, который мы оценивали по содержанию ацилгидроперекисей в
плазме крови экспериментальных животных и концентрации малонового
диальдегида в их печени.
Ожог, даже местный, смещает окислительно-восстановительный баланс
организма таким образом, что в крови и печени повышается содержание
гидроперекисей и интенсифицируются процессы перекисного окисления
липидов. Адекватная эффективная терапия ожогов, а в нашем случае это
применение пуповинной крови человека, способствует нормализации этих
механизмов
и
нейтрализует
нарушения
метаболизма.Анализируя
перечисленные методы лечения ожоговых поражений кожи, мы выявили
особую необходимость внедрения разработанного нами метода терапии
ожоговых поражений кожи. Суть способа лечения заключается в том, что на
сухую ожоговую поверхность наносится аппликация небольшого количества
пуповинной крови человека. Необходимо соблюдать стерильные условия и
режим ведения терапии.
Преимущества разработки в том, что новый метод местного и общего
лечения больных с ожоговой травмой путем трансплантации на раневую
поверхность компонентов пуповинной крови отменяет риски внутривенной и
внутримышечной
гемотранстплантации
и
способствует
улучшению
результатов лечения.
19
Терапию биологически активными компонентами пуповинной крови
человека можно осуществлять как самостоятельно в виде аппликаций или в
составе мягких лекарственных средств (линименты или мази), так и в
дополнение к основным традиционным методам лечения.Это объясняется
натуральностью состава и отсутствием побочных эффектов пуповинной крови,
а также стимулирующим ее влиянием на организм.
Методика лечения термических повреждений кожи пуповинной кровью
отличается дешевизной, доступностью получения, простотой выполнения и
отсутствием рискованных моментов.
Пуповинная кровь человека обладает целым рядом терапевтических
свойств, среди которых и восстановление кожи после различных повреждений
(Porrata L.F., 2001). Она имеет уникальный клеточный состав и биологически
активные компоненты, которые помогают применять такую кровь как
самостоятельно в виде аппликаций, так и совместно с другими лекарственными
средствами, как дополнение к лечению.
Особенно важно подчеркнуть, что пуповинную кровь человека можно
замораживать и хранить долгое время. При этом в большинстве случаев
экспериментов сохраняется ее ранозаживляющая способность.
Разработка условий и режима хранения пуповинной крови требует
дальнейших экспериментальных исследования.
Это объясняется особой актуальностью ее использования при массовых
случаях поражений кожи.
Таким образом, можно отметить явное преимущество нативной
пуповинной крови как стимулятора репарации термически поврежденной кожи,
что позволяет её считать эффективным альтернативным методом лечения
ожоговых травм.
ВЫВОДЫ
1. Разработана методика использования пуповинной крови человека, как
нативной, так и криоконсервированной, для лечения ожогов кожи,
отличающаяся безопасностью, эффективностью и простотой выполнения.
2. Местный ожог кожи крысы вызывает комплекс выраженных
морфологических и функциональных реакций, как локально, так и на
уровне целостного организма, которые значительно нарушают его
клеточный и гуморальный гомеостаз.
3. Сравнительная оценка процессов репарации ожогов кожи крыс при
различных видах лечения выявила значительные преимущества нативной
пуповинной крови человека, которые проявляются и непосредственно в
месте ожога и на уровне целостного организма.
4. Криоконсервация пуповинной крови в выбранных условиях снижает, но не
устраняет её противоожоговую активность.
5. Сравнительный анализ биохимических показателей периферической крови
и печени у крыс контрольной и опытных групп показал, что воздействие
20
пуповинной кровью способствует быстрой нормализации гемограммы в
целом, нормализует перекисное окисление липидов в печени, активизирует
иммунный ответ, что, несомненно, можно отнести к хорошим
прогностическим признакам при лечении кожных ожоговых ран.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ажикова, А.К. Технология выделения стволовых клеток пуповинной
крови и перспективы их криосохранения [Текст] // А.К.Имашева, М.В.Лазько
Естественные науки, Астрахань:
Издательский дом «Астраханский
университет». № 1-2, 2006.
2. Ажикова, А.К. Особенности регенераторных процессов кожи после
термических ожогов [Текст] // А.К.Имашева, М.В.Лазько Успехи современного
естествознания ISSN 1681-7494, Москва, № 7, 2008.
3. Ажикова, А.К. Использование пуповинной крови для восстановления
кожи после термической травмы [Текст]
// А.К.Имашева, М.В.Лазько
Естественные науки, Астрахань, № 4 (25). 2008, ВАК
4. Ажикова, А.К. Терапевтический эффект использования кедрового
масла при ожоговой травме [Текст] // А.К.Имашева, М.В.Лазько, А.С.Ажиков
Естественные науки, Астрахань, № 4 (25). 2008
5. Ажикова, А.К. Разработка биологического стимулятора на основе
пуповинной крови для интенсификации репарации кожи [Текст] //А.К.Ажикова,
А.С.Ажиков, М.В.Лазько Успехи современного естествознания, ISSN 16817494, Москва, № 2, 2009 г.
6. Ажикова, А.К. Перспективы создания банка пуповинной крови [Текст]
//А.К.Ажикова, А.С.Ажиков, М.В.Лазько. Материалы IV международной
конференции "Фундаментальные исследования", Доминиканская республика
12-22 марта 2009 г. Журналы РАЕ "Фундаментальные исследования" ISSN
1812-7339 или "Современные наукоемкие технологии" ISSN 1812-7320.
7. Ажикова, А.К. Study of white rats skin accorfing to their sex [Текст]
Материалы IV
научной международной конференции «Проблемы
международной интеграции национальных образовательных стандартов»,
Париж-Лондон, 20-28 апреля 2009 г. Журнал "European journal of natural
history"
8. Ажикова, А.К. Сбор и хранение пуповинной крови. Определение
условий и срока хранения. Изучение биологических свойств пуповинной крови
до и после хранения [Текст]: отчет о НИР (промежуточ.) / Фонд содействия
развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере; рук. Лазько
М.В.- Астрахань, 2009 – 9 с. – Исполн.: Ажикова А.К. – Библиогр.: с. 6-7. - №
ГР 01200956788. - Инв. №. 6550 гк/н.
9. Ажикова, А.К. Микробиологический и биохимический анализ
пуповинной крови. Определение наличия биологически активных клеток в
пуповинной крови [Текст]: отчет о НИР (промежуточ.) / Фонд содействия
развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере; рук. Лазько
21
М.В.- Астрахань, 2009 – 8 с. – Исполн.: Ажикова А.К. – Библиогр.: с. 5-7. - №
ГР 01200956788. - Инв. №. 6550 гк/н.
10.
Ажикова, А.К. Исследования по определению количества
эритроцитов, лейкоцитов, клеток-предшественников в пуповинной крови
[Текст]: отчет о НИР (промежуточ.) / Фонд содействия развитию малых форм
предприятий в научно-технической сфере; рук. Лазько М.В.- Астрахань, 2009 –
7 с. – Исполн.: Ажикова А.К. – Библиогр.: с. 4-6. - № ГР 01200956788. - Инв. №.
6550 гк/н.
11. Ажикова, А.К. Изучение биологической активности компонентов
пуповинной крови на экспериментальной модели повреждения кожи [Текст]:
отчет о НИР (промежуточ.) / Фонд содействия развитию малых форм
предприятий в научно-технической сфере; рук. Лазько М.В.- Астрахань, 2009 –
7 с. – Исполн.: Ажикова А.К. – Библиогр.: с. 6-7. - № ГР 01200956788. - Инв. №.
6550 гк/н.
12. Ажикова, А.К. Биохимическое исследование организма крыс в норме,
после термического ожога и лечения поврежденной кожи стимулятором
регенерации кожи, препаратом сравнения и концентратом пуповинной крови
[Текст]: отчет о НИР (промежуточ.) / Фонд содействия развитию малых форм
предприятий в научно-технической сфере; рук. Лазько М.В.- Астрахань, 2009 –
9 с. – Исполн.: Ажикова А.К. – Библиогр.: с. 6-9. - № ГР 01200956788. - Инв. №.
6550 гк/н.
13. Ажикова, А.К. Гистологическое исследование поврежденной кожи
после действия аппликаций концентрата пуповинной крови, препарата
сравнения и биостимулятора [Текст]: отчет о НИР (промежуточ.) / Фонд
содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере;
рук. Лазько М.В.- Астрахань, 2010 –11 с. – Исполн.: Ажикова А.К. – Библиогр.:
с. 9-11. - № ГР 01200956788. - Инв. №. 6550 гк/н.
22