аннотацияx - Медицинский университет Астана

АННОТАЦИЯ
диссертационной работы Абдрахмановой Ж.У. на тему «Профиль мажорных мутаций при
миодистрофии Дюшенна в популяционной выборке Казахстана» на соискание ученой степени
доктора философии PhD по специальности 6D110110-Медицина
Актуальность темы
Наиболее распространенным видом мышечных миопатии в Республике Казахстан является
миодистрофия Дюшенна (МДД).
МДД - это Х сцепленное тяжелое прогрессирующее
наследственное заболевание, характеризующееся полиморфизмом клинических проявлений. На
сегодняшний день основу терапии МДД составляет только симптоматическое лечение. Поэтому
актуальным является идентификация мутаций DMD гена, которая может помочь диагностировать
заболевание и обеспечить точное генетическое консультирование и раннюю пренатальную
диагностику пациентов. Поэтому актуальной задачей современной медицины Казахстана является
внедрение в клиническую практику современных методов, позволяющих выявлять доминирующие
мутации и носительство DMD гена, а также разработка способа выявления локализации мутаций.
Цель исследования: Разработка способа выявления локализации мутаций гена DMD при
миодистрофии Дюшенна в пре- и постнатальном периодах в популяционной выборке Казахстана.
Задачи исследования:
1. Выбрать оптимальный метод выявления мажорных мутаций гена дистрофина у больных с
миодистрофией Дюшенна и носителей в популяционной выборке Казахстана;
2. Провести анализ спектра мутаций в семейных и несвязанных случаях миодистрофии Дюшенна;
3. Разработать способ выявления мажорных мутаций в гене дистрофина;
4. Разработать алгоритм ранней диагностики миодистрофии Дюшенна с учетом генетического
полиморфизма DMD гена.
Объект и предмет исследования
Объектом исследования служили образцы ДНК от пациентов с подозрением на МДД и членов их
семей. Исследованию подверглись также образцы ДНК, выделенные из плодового материала
эмбрионов женщин с установленным диагнозом миодистрофии Дюшенна, состоящих на учете в
медико-генетической консультации АО «ННЦМД», районных и областных больницах Республики
Казахстан.
Предметом исследования являлись мутации DMD гена.
Методы исследования
В работе были использованы молекулярно-генетические и информационные методы.
Молекулярно-генетические методы: экстракция ДНК,
полимеразно-цепная реакция,
электрофоретический учет результатов ПЦР, полимеразно-цепная реакция в режиме реального
времени, мультиплексная амплификация лигазно-связанных зондов, капиллярный электрофорез
ДНК, прямое секвенирование нуклеотидной последовательности ДНК. Информационные методы:
работа с базами данных NCBI, OMIM, GenBank, работа с программным обеспечением для подбора
праймеров.
Научная новизна работы
- Разработан способ выявления точки разрыва при протяженных делециях гена DMD, основанный
на поэтапной разбивке длинных участков ДНК на короткие фрагменты с последующим выяснением
присутствия участка ДНК в образце методом ПЦР в режиме реального времени с интеркалирующим
красителем.
- Впервые получена прямая нуклеотидная последовательность точки разрыва при протяженной
делеции шести экзонов с 45 по 50 гена DMD в популяционной выборке Казахстана.
- Впервые изучен спектр мутаций гена DMD в популяционной выборке Казахстана.
- Разработан алгоритм ранней диагностики миодистрофии Дюшенна с учетом генетического
полиморфизма в гене дистрофина.
Практическая ценность работы
Разработанный способ выявления точки разрыва при протяженных делециях гена DMD позволяет
определять точную локализацию мутации, что имеет важное значение в диагностике, понимании
молекулярно-генетической этиологии заболевания, а также внедрения в перспективе средств генной
терапии миодистрофии Дюшена. Разработанный алгоритм позволяют поднять на принципиально
новый уровень диагностику миодистрофии Дюшена в Казахстане. Получен акт внедрения
«Мультиплексная лигазная проба-зависимая амплификация (MLPA) и поиск точек разрыва методом
ПЦР в реальном режиме у пациентов с миодистрофией Дюшенна».
Основные положения, выносимые на защиту
1. В диагностику миодистрофии Дюшенна внедрена мультиплексная амплификация лигазносвязанных зондов, позволяющая выявлять до 70% мутаций гена дистрофина, диагностическая
ценность которой превышает ранее используемые методы.
2. Спектр мутаций в семейных и несвязанных случаях миодистрофии Дюшена обусловлен за счет
превалирования делеций и коррелирует с клиническими проявлениями болезни.
3. Способ определения мажорных мутаций в гене дистрофина включает последовательность в
постановке молекулярно-генетических методов исследования: MLPA-ПЦР в режиме реального
времени-секвенирование.
4. Алгоритм выявления миодистрофии Дюшенна определяет все возможности сценария
диагностики заболевания, включая гетерозиготное носительство DMD гена в популяционной
выборке Казахстана.
Апробация работы
Основные результаты исследований были доложены на научно-практических конференциях:
Европейская конференция по медицинской генетике, г.Париж, Франция, июнь 2013 г.; VIII
Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, г.Москва, март 2014
г.; Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых, г.Астана,
Казахстан, апрель 2014 г.; Европейская конференция по медицинской генетике, г.Милан, Италия,
май 2014 г.; Международный научно-практический форум стран СНГ, г.Астана, Казахстан, июнь
2014 г. По результатам исследований опубликовано 6 статей и 4 тезисов, в том числе 1 статья в
издании Томсон Рейтер с ненулевым импакт-фактором.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав материалы и методы, результаты
собственных исследований, заключения, выводов,списка использованной литературы, приложения.
Материалы диссертации изложены на 116 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 32
рисунками и 10 таблицами. Список использованных источников включает 187 наименований.
Выводы:
1. Сравнительный анализ молекулярно-генетических исследований показал, что оптимальным
методом выявления мажорных мутаций DMD гена у больных с миодистрофией Дюшенна является
мультиплексная амплификация лигазно-связанных зондов, чувствительность которого достигает
38%. Преимуществом данного метода является не только определение делеций и дупликаций, но и
выявление гетерозиготного носительства на более протяженном участке DMD гена (79 экзонов).
2. В обследованной выборке больных с миопатией Дюшенна и носителей методом MLPA
установлено, что спектр мажорных мутаций в гене дистрофина был представлен в основном
делециями, которые в 4,25 раз выявлялись чаще, чем дупликации.
3. Разработанный способ выявления делеций и дупликаций в мажорных мутациях гена DMD
включает последовательную постановку мультилигазной реакции амплификации, ПЦР в режиме
реального времени и секвенирование. Данный способ позволяет определить точную границу
разрыва в гене дистрофина,
4. Разработанный алгоритм диагностики миодистрофии Дюшенна с учетом генетического
полиморфизма в гене дистрофина, клинических и лабораторных признаков заболевания, позволяет
диагностировать заболевание в раннем пре- и постнатальном периодах, а также гетерозиготное
носительство мутаций гена DMD у женщин.
Область применения: Медицинская генетика