На правах рукописи ВАРИВОДА Анна Сергеевна РЕЦЕПТОРЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА:
реклама
На правах рукописи ВАРИВОДА Анна Сергеевна РЕЦЕПТОРЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА: АССОЦИИРОВАННЫЕ С TOLL-ПОДОБНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В НОРМЕ И ПРИ ПЕРВИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТАХ 14.00.36 – аллергология и иммунология Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2008 1 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Леонид Васильевич Ковальчук Научный консультант: кандидат медицинских наук Марина Викторовна Хорева Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Марина Александровна Стенина Российский Государственный Медицинский Университет доктор медицинских наук, профессор Леонид Петрович Алексеев Институт иммунологии ФМБА России Ведущая организация: Московская медицинская академия И.М. Сеченова Защита диссертации состоится «22» сентября 2008 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университета по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1 Автореферат разослан «14» июля 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова 2 АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем фундаментальной и клинической иммунологии является изучение врожденного иммунитета. Врожденный иммунитет является первой линией защиты организма от патогенов. Он реализуется через клеточные и гуморальные факторы. Факторы врожденного иммунного ответа предсуществуют или индуцируются быстро (минуты, часы) после инфекции. Компоненты врожденного иммунного ответа не изменяются в процессе жизни организма, контролируются генами зародышевой линии и передаются по наследству. Важным компонентом системы врожденного иммунитета являются паттернраспознающие рецепторы (ПРР), участвующие в распознавании консервативных молекулярных структур микроорганизмов, так называемых PAMP (паттерны, ассоциированные с микроорганизмами). Реализация специфичности врожденной иммунной системы ложится, в большей степени, на семейство эволюционно консервативных рецепторов, известных как Toll-подобные рецепторы (TLR), которые играют решающую роль в ранней защите организма от патогенов. TLR являются сигнальными ПРР и рассматриваются исследователями, как ключевые рецепторы врожденного иммунитета [R.Medzhitov, CJ Janeway, 1997]. Изучение TLR выявило связь между врожденным и приобретенным иммунитетом. Распознавание микробных компонентов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов (ФНОα, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН/ и других), костимуляторных молекул и некоторых других генов. Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и, в дальнейшем, направляют развитие адаптивного иммунного ответа [T.Kawai, S.Akira, 2007, L.C. Parker et al, 2007, F. Sandor et M. Buc, 2005]. Характер и интенсивность ответа, опосредуемого TLR, определяется несколькими компонентами, составляющими систему TLR. Система TLR включает лиганды TLR, сами рецепторы (гены, кодирующие TLR, мРНК, белок), молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала – адаптерные белки, а также 3 эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации TLR и опосредуют их дальнейшие эффекты. В последние годы накапливается все больше сведений о патологиях, связанных с Toll-подобными рецепторами. Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на большинстве клеток организма способствуют вовлечению TLR в патогенез многих заболеваний. Дефекты в системе TLR: нарушения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекционных заболеваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и др. Выявленные дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR, лежат в основе повышенной восприимчивости к инфекциям, как, например, у больных с дефектом гена, кодирующего IRAK4 киназу. Для выявления состояний, связанных с нарушением функционирования системы TLR необходимы адекватные и надежные методы оценки компонентов системы TLR, которые могут быть воспроизведены в условиях стандартной клинической лаборатории. Первичные иммунодефициты с дефектами антителообразования (ОВИН и ХАГГ) характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. Иммунопатогенез ОВИН до конца не ясен. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [Bayry J. et al, 2004, Cunningham-Rundles C., Radigan L., 2005, Yong P.F. et al, 2008]. Изучение механизмов нарушений функционирования врожденной иммунной системы у этих больных позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН. 4 На кафедре иммунологии РГМУ (зав. кафедрой – профессор Л.В. Ковальчук) с 2005 года проводится работа по оценке системы TLR в норме и при различных иммунопатологических состояниях. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить функциональное состояние экспрессирующих TLR мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1) Отработать оптимальные условия оценки функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR in vitro. 2) Оценить эффективность действия различных лигандов TLR на цитокинсинтезирующую функцию МНК периферической крови здоровых доноров. 3) Изучить влияние лигандов Toll-подобных рецепторов на выработку ФНО МНК периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ). 4) Оценить экспрессию TLR на поверхности моноцитов периферической крови здоровых доноров и больных ОВИН и Х-АГГ методом проточной цитофлуорометрии. НАУЧНАЯ НОВИЗНА Работа содержит новые данные о дефектах в системе Toll-подобных рецепторов у больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и ХАГГ). Показано, что при данных ПИД нарушена выработка ФНО в ответ на стимуляцию лигандами TLR2 и TLR4. Выявлен дисбаланс индуцированной лигандом TLR4 ЛПС выработки ФНО, ИЛ-12 и ИФН- МНК больных ОВИН. Показаны различия в экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови здоровых доноров и больных ПИД с дефектами антителообразования. Обнаружены различия количества моноцитов, несущих 5 на своей поверхности исследуемые TLR, у здоровых доноров и больных ПИД и плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на одной клетке. Полученные данные позволяют предположить, что дефекты созревания антигенпрезентирующих клеток, выявляемые у больных ОВИН, могут быть связаны с нарушениями в системе TLR. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ В данной работе определены оптимальные условия оценки цитокинсинтезирующей функции активированных лигандами TLR МНК периферической крови здоровых доноров и больных с иммунопатологией. Оценена выработка ФНО и ИФН- МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых доноров. Выявлено, что максимальным стимулирующим влиянием на выработку ФНО МНК обладают лиганды TLR2 и TLR4, а на выработку ИФН лиганды TLR4, TLR3 и TLR9. Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у больных с иммунопатологией. У больных ПИД с дефектами антителообразования в ходе настоящего исследования выявлено снижение выработки ФНО в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 и нарушение экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН, что свидетельствует о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета у больных ОВИН и позволяет уточнить иммунопатогенез ОВИН. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, используются в практике лечебнодиагностической работы в отделении клинической иммунологии РДКБ. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в 2005 году на Конференции молодых ученых Института иммунологии, в 2006 году на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 6 2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007 и 2008 году в Москве на XIII, XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» и на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008). ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы. машинописного текста, Работа содержит изложена 23 таблицы на и 125 cтраницах 40 рисунков. Библиографический указатель включает 11 отечественных и 149 иностранных источников. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ходе исследования проведено обследование 31 больного с ПИД и 37 здоровых доноров. Критерием отбора доноров было отсутствие инфекционных и аллергических заболеваний. Всем больным первичными иммунодефицитами диагноз был поставлен в соответствии с диагностическими критериями, разработанными Европейским обществом иммунодефицитов (ESID). Методы исследования. Источником МНК служила гепаринизированная венозная кровь обследованных доноров и больных. Фракция мононуклеарных клеток выделялась на градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/мл. После выделения оценивалась жизнеспособность клеток окрашиванием 0,1% раствором трипанового синего. Для культивирования мононуклеарных клеток использовали 24-луночные планшеты «Costar». Культивирование проводили при t 370С в атмосфере 5% CO2 в термостате. В качестве питательной среды использовали RPMI 1640 с добавлением инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки, 300 мкг/мл L-глутамина и 0,02 M HEPES-буфера и 100 мкг/мл гентамицина. 7 Рабочая концентрация клеток составляла 1х106/мл. В качестве лигандов TLR использовали следующие стимуляторы: ЛПС, зимозан, пептидогликан, Флагеллин, P(I:C) и ОДН CpG. Контролем служили МНК, культивируемые только в среде RPMI 1640 или в присутствии ОДН, не содержащего CpG последовательности. По окончании культивирования МНК осаждали центрифугированием. Полученные супернатанты хранили в течение 2-3 месяцев при -700С. Концентрацию цитокинов в полученных супернатантах определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Экспрессию молекул на поверхности клеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием МкАТ. Для определения экспрессии антигенов на поверхности моноцитов периферической крови МНК инкубировали с мечеными МкАТ в течение 30 мин при 4 оС, отмывали при 1200 об/мин при 4оС и фиксировали раствором BD Cell Fix. Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Facscan (Becton Dickinson, США). В каждом образце выявляли процент двойных позитивных (CD14+TLR2+ или CD14+TLR4+) клеток и количество ФИТЦ-меченых и ФЭ-меченых антител, оценивая интенсивность флуоресценции (ИФ). Статистическую обработку данных проводили в программном пакете StatSoft Statistica. Результаты выражали как среднее арифметическое для анализируемой группы показателей ± стандартное отклонение. Для сравнения групп по количественным признакам использовали непараметрические критерии: U-критерий Манна-Уитни и критерий Вилкоксона. Различие групп полагали статистически значимым при P0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Активация TLR запускает сигнальный каскад, приводящий к активации NF-κB, что, в свою очередь, приводит к синтезу ФНО и других провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-6 и др. ФНОα – один из 8 основных эффекторных цитокинов, обеспечивающих развитие воспалительной реакции. На первом этапе работы мы оценивали спонтанную и стимулированную выработку ФНОα МНК периферической крови здоровых доноров. В качестве стимуляторов продукции ФНО были выбраны пептидогликан, зимозан, ЛПС, флагеллин, P(I:C) и CpG, действующие через TLR1/2, TLR2/6, TLR4, TLR5, TLR3 и TLR9, соответственно. При анализе спонтанной выработки ФНОα МНК здоровых доноров нами были выявлены 2 группы: с нормальным и повышенным исходным уровнем секреции цитокина. Средняя спонтанная продукция ФНОα в I группе доноров составила 46,74±26,53 пг/мл, а во II группе – 261,86±111,08 пг/мл (рис. 1). Группа I включает 30 человек, группа II – 7 человек. Гетерогенность исходного уровня продукции цитокина известна также по литературным данным [Дьяконова В.А. и др., 2004, Deering RP,Orange JS, 2006]. Высокая спонтанная продукция ФНО может быть связана с предстимуляцией клеток in vivo, а также с физиологической гетерогенностью в группе здоровых доноров. При исследовании влияния различных лигандов TLR на продукцию ФНОα МНК принимали спонтанную выработку ФНОα за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию ФНОα оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС). КС рассчитывали как отношение концентрации ФНОα в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации ФНОα в супернатантах нестимулированных МНК. Относительные единицы вводились для выявления прироста уровня цитокинов под действием лигандов по отношению к спонтанной выработке цитокинов, а также для повышения стандартизации метода. На основании проведенных исследований, данных литературы и рекомендаций фирм производителей в дальнейшем для оценки функциональ- 9 400 350 300 пг/мл 250 200 150 100 50 Cреднее ±SE ±SD 0 Группа I Группа II Рисунок 1. Спонтанная продукция ФНОα МНК периферической крови здоровых доноров. ной активности клеток, экспрессирующих TLR, нами были отобраны оптимальные концентрации лигандов TLR: пептидогликан – 2,5 мкг/мл; зимозан – 10 мкг/мл; ЛПС – 0,1 мкг/мл; флагеллин – 0,5 мкг/мл; P(I:C) – 10 мкг/мл; ОДН CpG – 1,0 мкг/мл. Средние значения по выработке ФНО МНК здоровых доноров I и II групп под действием лигандов TLR представлены в табл. 1. Все использованные лиганды оказывали стимулирующее влияние на выработку ФНО МНК здоровых доноров I и II групп. Проанализировав КС в обеих группах, мы не обнаружили статистически значимых различий в КС различных лигандов TLR в двух группах здоровых доноров. Учитывая также, что высокая спонтанная выработка ФНО может быть следствием вирусной инфекции, стрессовых воздействий и др, в качестве контрольной группы в дальнейшем мы рассматривали здоровых доноров I группы (рис. 2). Максимальным стимулирующим эффектом обладают лиганды TLR1/2 и TLR2/6 – пептидогликан и зимозан, соответственно, а также лиганд TLR4 – 10 ЛПС. Меньшей стимулирующей активностью на выработку ФНО обладают лиганды TLR5 и TLR9. В группе здоровых людей выявлены индивидуальные особенности профиля стимулированной лигандами TLR выработки ФНОα. У одних доноров максимальное количество ФНОα вырабатывается при стимуляции МНК зимозаном и пептидогликаном, в то время как показатели, полученные при стимуляции ЛПС, флагеллином и CpG сравнимы с контролем. Максимальная выработка ФНОα МНК других доноров выявляется под влиянием ЛПС или в ответ на флагеллин и CpG. Индивидуальные различия выработки ФНО среди здоровых доноров могут определяться несколькими причинами: различной экспрессией TLR на МНК, полиморфизмом генов как TLR, так и ФНО, исходным функциональным состоянием клеток, участвующих в синтезе ФНО и других цитокинов. Рисунок 2. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНО 10 8 КС 6 4 2 C pG 1, 0 0 P( I:C )1 0, 5 Ф ла ге лл и н 0, 1 ЛП С 10 за н мо Зи еп ти д П C по н ог ли та н ка н на я 2, 5 0 МНК здоровых доноров в ответ на оптимальные дозы лигандов TLR. Для оценки действия исследуемых нами лигандов TLR на индукцию ИФН I типа МНК здоровых доноров мы исследовали влияние лигандов TLR на 11 выработку ИФН-, который вместе с ИФН-β принадлежит к интерферонам I типа. В основном синтез ИФН- индуцируется под действием паттернов вирусного происхождения, таких как одно- и двухцепочечная РНК, вирусная или бактериальная ДНК, а также лигандами TLR4. Спонтанная выработка ИФН- в группе здоровых доноров (n=10) составила 29,94±9,78 пг/мл. Стимулированную лигандами TLR выработку ИФН- оценивали также как и для ФНО, в КС. Выработка ИФН- стимулировалась под действием ЛПС, P(I:C) и CpG, причем воздействие CpG оказывало наибольший стимулирующий эффект (рис. 3). Зимозан и флагеллин не оказывали существенного влияния на выработку ИФН-. Индивидуальных особенностей в выработке ИФН- МНК здоровых доноров нами выявлено не было. 3 2,5 КС 2 1,5 1 0,5 0 Спонтанная P(I:C) 20 ЛПС 0,1 Зимозан 10 Флагеллин 0,5 CpG 10,0 Рисунок 3. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФН- МНК здоровых доноров под действием оптимальных доз лигандов TLR. 12 Таблица 1. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНО МНК здоровых доноров в ответ на оптимальные дозы лигандов TLR. Концентрация лиганда, Пептидогликан Зимозан ЛПС Флагеллин P(I:C) 2,5 10,0 0,1 0,5 10 ОДН CpG Спонтанная 1,0 мкг/мл Группа I выработка, пг/мл 5,33±1,39* 5,86±2,33* 4,02±1,99* 1,89±0,52* 3,82±0,53* 1,83±0,58* 46,74±26,5 3 Группа II 2,13±1,19 5,22±2,77* 3,47±1,29* 1,98±0,66* 2,24±0,18* 1,83±1,09* 261,86±11 1,08 Данные в таблице представлены в КС. * - сравнение стимулированной и спонтанной выработки ФНО в каждой группе доноров по критерию Вилкоксона, р<0,05. 13 Таким образом, определение выработки ИФН- под влиянием лигандов TLR не дает возможности провести полную оценку стимулирующей активности всех используемых нами основных лигандов TLR, но проведение данного исследования параллельно с изучением выработки ФНО позволяет получить дополнительную информацию о функциональной активности клеток, экспрессирующих TLR. На следующем этапе работы оценивали спонтанную и стимулированную продукцию ФНО и ИФН- у больных ПИД с дефектами антителообразования: Группа I больных ОВИН – состояла из 9 человек (4 женщины и 5 мужчин) в возрасте от 20 до 45 лет; Группа II больных ОВИН – состояла из 14 детей (3 девочки и 11 мальчиков) в возрасте от 6 до 17 лет. Группа III больных Х-АГГ – состояла из 13 мальчиков в возрасте от 5 до 17 лет. ОВИН и Х-АГГ характеризуются низким содержанием сывороточных иммуноглобулинов и основными осложнениями данных ПИД являются хронические бактериальные инфекции, преимущественно респираторного и желудочно-кишечного тракта. ОВИН является гетерогенной группой, отличающейся многообразием клинических проявлений. Патогенез ОВИН обусловлен множественными дефектами и адаптивного, и врожденного иммунитета [Schaffer et al, 2007; Kopecky, Lukesova, 2007; Amoras et al, 2007; Bayry et al, 2005]. В основе патогенеза Х-АГГ лежит нарушение дифференцировки В-лимфоцитов, вызываемое мутацией гена btk, кодирующего В-клеточную тирозинкиназу. Во всех группах больных ПИД выявлена повышенная спонтанная продукция ФНО по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 2). Все использованные нами лиганды TLR оказывали стимулирующее влияние на продукцию ФНО МНК больных ОВИН I и II групп. Однако при анализе КС 14 лигандов TLR мы выявили нарушения в обеих группах больных ОВИН. Данные представлены в табл. 3. Таблица 2. Спонтанная выработка ФНО МНК больных ОВИН, Х-АГГ и здоровых доноров. Больные Х-АГГ Больные ОВИН, группа I Концентрация 298,54±153,09 581,19±271,74* ФНО, пг/мл Больные ОВИН, группа II 209,74±124,01 Здоровые доноры, группа I 46,74±26,53* * - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой больных Х-АГГ, р<0,05. Выявленные нарушения выработки ФНО МНК больных в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 могут лежать в основе повышенной чувствительности больных ОВИН и Х-АГГ к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам. Известно, что наиболее частыми возбудителями инфекции у больных ОВИН и Х-АГГ являются Наemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae. Дефекты гуморального звена приобретенного иммунитета больных ОВИН приводят к развитию хронических бактериальных инфекций. Тогда как развитие клеточного иммунного ответа у данных больных считается сохранным и, по всей видимости, лежит в основе устойчивости к вирусным инфекциям. ИФН- является одним из основных факторов противовирусной защиты организма, поэтому мы проанализировали спонтанную и стимулированную лигандами TLR выработку цитокина МНК периферической крови больных ОВИН. Спонтанная продукция ИФН- МНК периферической крови больных ОВИН оказалась значительно ниже по сравнению с группой здоровых доноров и составила 5,41±0,87 пг/мл в группе I, и в группе II – 6,45±3,1 пг/мл. Поскольку стимулирующей активностью на выработку ИФН- МНК периферической крови здоровых доноров в наших экспериментах обладают 15 Таблица 3. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ФНО МНК больных ПИД в ответ на оптимальные дозы лигандов TLR. Концентрация Пептидогликан Зимозан ЛПС Флагеллин ОДН CpG Спонтанная лиганда, мкг/мл 2,5 10,0 0,1 0,5 1,0 выработка ФНО, пг/мл 2,61±1,17# 1,01±0,39# 1,61±0,47# 1,63±0,89 1,81±1,00 298,54±153,09 ОВИН, 2,44±0,69# Н.о. 1,78±0,65* 1,45±0,36 1,49±0,51 581,19±271,74* ОВИН, 2,27±0,61# 2,33±1,1# 1,92±0,47* 1,56±0,69 1,54±0,69 209,17±124,01* 5,86±2,33 4,02±1,99 1,82±0,64 1,83±0,58 46,74±26,53 Больные Х-АГГ Больные группа I Больные группа II Здоровые 5,33±1,39 доноры, группа I КС – коэффициенты стимуляции. Н.о. – не определяли. * - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,01 # - сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,05 16 лиганды TLR3, TLR4 и TLR9, МНК периферической крови больных ОВИН активировали P(I:C), ЛПС и ОДН CpG. У больных ОВИН I и II группы КС ЛПС, P(I:C) и CpG статистически значимо отличаются от показателей в группе здоровых доноров. Причем у детей КСЛПС выше как по сравнению с взрослыми больными, так и со здоровыми донорами (рис. 4). Полученные результаты свидетельствуют о дисбалансе в продукции цитокинов (ФНО и ИФН-), с которым могут быть связаны особенности клинической картины больных ОВИН. КС 100 10 1 ЛПС 0,1 P(I:C) 20 CpG 1,0 мкг/мл Доноры Больные ОВИН I Больные ОВИН II Рисунок 4. Показатели коэффициентов стимуляции выработки ИФН- МНК здоровых доноров и больных ОВИН под действием оптимальных доз лигандов TLR. В литературе не описаны прямые молекулярные дефекты, свидетельствующие о нарушениях функционирования TLR в клетках больных ОВИН. На основании полученных нами данных о нарушенном ответе МНК периферической крови на стимуляцию лигандами TLR, мы можем предполагать о существовании дефекта системы TLR у больных ОВИН. Снижение стимуляции ФНО в ответ на лиганды у больных ОВИН и Х-АГГ может быть связано с нарушением экспрессии TLR. Следующим этапом нашей работы стало исследование экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови человека. 17 Процент моноцитов, несущих на своей поверхности CD14 антиген, у больных ОВИН статистически значимо не отличался от значения показателя в группе здоровых доноров, тогда как средняя интенсивность флуоресценции СD14 на моноцитах больных была ниже по сравнению с группой здоровых доноров. Также не было выявлено значимых отличий в проценте CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов. Однако средняя интенсивность флуоресценции TLR2 и TLR4 на поверхности СD14-положительных моноцитов была ниже у больных ОВИН в I и II группах по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 3 и 4). Анализируя экспрессию TLR2 и TLR4 на СD14-положительных моноцитах больных Х-АГГ, мы не выявили изменения содержания CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов, но средняя интенсивность флуоресценции TLR2, TLR4 и CD14 ниже по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 4 и 5). Выявленное нами снижение экспрессии TLR на моноцитах больных ПИД с дефектами антителообразования, в клинической картине которых наблюдаются рецидивирующие хронические бактериальные инфекции, что может быть обусловлено полиморфизмом или мутациями в генах TLR, нарушением процессов транскрипции и трансляции продуктов этих генов, а также нарушением регуляции поверхностной экспрессии молекул. Известно, что цитокины участвуют в регуляции экспрессии TLR. Возможно, различные лекарственные препараты также оказывают влияние на уровень экспрессии TLR и их корецепторов на поверхности клетки. Согласно литературным данным у больных с бактериальными и вирусными инфекциями экспрессия TLR2, TLR4 и корецепторных молекул на лейкоцитах периферической крови (моноцитах, дендритных клетках, нейтрофилах и др.) возрастает [Miyazaki et al, 2008; Sato et al, 2007; Orihara et al, 2007]. Таким образом, снижение плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН вносит свой вклад в развитие клинической картины, наблюдаемой у этих больных ОВИН. 18 Таблица 4. Экспрессия CD14 и TLR2 на поверхности моноцитов периферической крови больных ПИД и здоровых доноров. Здоровые доноры Больные % CD14+ % СD14+TLR2+ СИФ CD14 СИФ TLR2 66,87±9,28 55,45±10,84 272,17±37,43 99,45±31,93 39,08±20,13 186,71±43,68* 40,21±13,39* 64,66±15,84 35,03±25,22 168,03±50,55* 50,39±18,46* 65,24±14,02 33,43±13,36 222,56±28,69* 47,96±11,67* ОВИН, 63,55±18,57 группа I Больные ОВИН, группа II Больные Х-АГГ *- сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,01 19 Таблица 5. Экспрессия CD14 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови больных ПИД и здоровых доноров. Здоровые доноры Больные % CD14+ % СD14+TLR4+ СИФ CD14 СИФ TLR4 66,87±9,28 51,09±11,75 301,57±53,57 105,56±15,01 50,16±17,87 187,98±46,63* 23,04±17,97* 64,66±15,84 60,29±15,21 197,35±41,25* 28,24±19,99* 65,24±14,02 49,69±23,81 221,93±35,08* 22,34±11,83* ОВИН, 63,55±18,57 группа I Больные ОВИН, группа II Больные Х-АГГ *- сравнение по непараметрическому критерию Манна-Уитни с группой здоровых доноров, р<0,01 20 Выявленные изменения в экспрессии TLR и опосредованной лигандами TLR цитокинсинтезирующей функции МНК у больных ПИД с дефектами антителообразования помогают уточнить патогенез ОВИН и могут служить новой терапевтической мишенью в лечении больных ОВИН и Х-АГГ. ВЫВОДЫ 1. Отработаны оптимальные условия для определения функциональной активности МНК периферической крови человека, экспрессирующих TLR, по продукции ФНО in vitro. Максимальным стимулирующим действием обладают пептидогликан, зимозан и ЛПС – лиганды TLR1/2, TLR2/6 и TLR4 рецепторов, соответственно. 2. Показатели выработки ФНО МНК периферической крови здоровых доноров в ответ на различные лиганды TLR, оцениваемые в коэффициентах стимуляции (отношение стимулированной лигандом TLR продукции ФНО к спонтанной продукции цитокина) варьируют у разных доноров. Вариабельность коэффициентов стимуляции выработки ФНО менее выражена у больных ПИД с дефектами антителообразования. 3. У взрослых и детей, больных ОВИН, и детей с Х-АГГ по сравнению с нормой нарушена выработка ФНО: спонтанная продукция цитокина повышена, а индуцированная лигандами TLR – снижена. 4. У больных ОВИН коэффициенты стимуляции лигандов TLR2 и TLR4 снижены по сравнению с теми же показателями в группе здоровых доноров и значимо не различаются между возрастными группами ОВИН. 5. У больных ОВИН характеризующийся обнаружен пониженной дисбаланс выработкой выработки ФНО и цитокинов, повышенной выработкой ИФН в ответ на стимуляцию лигандом TLR4 – ЛПС. 6. Процентное содержание CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов периферической крови сходно у больных ОВИН и здоровых доноров. Однако количественная экспрессия TLR2 и TLR4, оцениваемая по средней 21 интенсивности флуоресценции, статистически значимо снижена у больных ОВИН. 7. Выявленные нарушения TLR-зависимой выработки ФНО и экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах не отличаются достоверно между больными ОВИН и больными Х-АГГ. Практические рекомендации Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета (TLR) у здоровых людей и больных с иммунопатологией. Анализ профиля выработки цитокинов стимулированными лигандами TLR мононуклеарными клетками периферической крови человека и определение поверхностной экспрессии CD14 и TLR можно использовать в оценке функционального состояния клеток врожденного иммунитета и рассматривать как маркеры диагностики и прогноза течения иммунопатологий человека. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Хорева М.В., Долгина Е.Н., Пащенко О.Е., Лаврова Ю.В., Варивода А.С., Кондратенко И.В., Ковальчук Л.В. Спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-12 и ИНФ- МНК периферической крови у детей, больных ОВИН. Аллергология и иммунология. – 2004. – т.5, №1. – C. 153. 2. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С., Галухина Е.Р., Пащенко О.Е., Грачева Л.А., Кондратенко И.В., Бологов А.А. Особенности выработки ФНО-α под влиянием различных стимулов в норме и при первичных иммунодефицитах. Аллергология и иммунология. – 2005. – т. 6, № 2. – C. 159. 3. А.С.Варивода. Изучение функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагального звена больных первичными иммунодефицитами под влиянием стимуляции Toll-подобных рецепторов различными лигандами. Вестник РГМУ. – 2005. – спец. выпуск, №3 (42). – C. 159. 4. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. Врожденные компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в норме и при иммунопатологии. ЖМЭИ. – 2005. – № 4. – C. 96-104. 22 5. Kovalchuk L.V., Khoreva M.V., Varivoda A.S. Cytokine-secretory function of human leukocytes of peripheral blood expressing Toll-like receptors. The role of different ligands. Abstr. of the Congress “Immune-Mediated Diseases: from Theory to Therapy”, JAPAIR. – 2005. – v.6, suppl.1. – P. 91-92. 6. Николаева И.Н., Варивода А.С., Хорева М.В., Ковальчук Л.В. Анализ поверхностной экспрессии СD14 и CD62L молекул и выработки ИЛ-8 нейтрофилами периферической крови пациентов с инфарктом миокарда под влиянием агонистов TLR2/6 и TLR4. Аллергология и иммунология. – 2006. – т. 7, №3. – C. 353. 7. Хорева М.В., Варивода А.С., Ковальчук Л.В., Константинова Е.В. Изучение функциональной активности Toll-подобных рецепторов у больных с инфарктом миокарда. Аллергология и иммунология. – 2006. – т. 7, №3. – C. 352. 8. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. Дефекты системы врожденного иммунитета у больных с первичными иммунодефицитами. Аллергология и иммунология в педиатрии. – 2006. – №2-3(9). – C. 75. 9. Хорева М.В., Ковальчук Л.В., Варивода А.С., Николаева И.Н., Грачева Л.А., Галухина Е.Р., Захаров М.В., Бологов А.А. Опосредованные через Toll-подобные рецепторы выработка цитокинов и экспрессия поверхностных маркеров лейкоцитами человека. Аллергология и иммунология. – 2006. – т.7, №2. – C. 199-206. 10. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С., Пащенко О.Е., Грачева Л.А., Быкова Л.П., Кондратенко И.В., Бологов А.А. Влияние лигандов Toll-подобных рецепторов (TLR) на выработку in vitro провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых людей и больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью. ЖМЭИ. – 2007. – № 1. – C. 38-42. 11. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С., Пащенко О.Е., Грачева Л.А., Быкова Л.П., Кондратенко И.В., Бологов А.А. Анализ зависимой от Toll-подобных рецепторов выработки провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека in vitro у здоровых доноров и больных первичными иммунодефицитами. БЭБИМ. – 2007. – т. 144, № 7. – C. 68-71. 23 12. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С., Пащенко О.Е., Кондратенко И.В., Грачева Л.А. Влияние лигандов TLR на выработку провоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных первичными иммунодефицитами. Сборник тезисов VIII конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (27-29 июня 2007). – 2007. – C.55. 13. Варивода А.С., Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Пащенко О.Е., Кондратенко И.В. Сборник материалов VI Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». – 2007. – C. 76-77. 14. Khoreva M.V., Varivoda A.S., Paschenko O.E. Expression and functional activity of TLR2 and TLR4 in patients with congenital disorders of antibody production. Abstr. of the 2nd Congress “Immune-Mediated Diseases: from Theory to Therapy”, JAPAIR. – 2007. – v.11, suppl.2. – P.30. 15. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С., Кондратенко И.В., Грачева Л.А., Николаева М.А. Анализ поверхностной экспрессии и TLR2 TLR4 на моноцитах периферической крови больных первичными иммунодефицитами. Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – 2008. – C. 161. 16. Хорева М.В., Ковальчук Л.В., Варивода А.С., Грачева Л.А. Подходы к оценке рецепторов врожденного иммунитета. Российский иммунологический журнал. – 2008. – т. 2 (11), № 2-3. – C. 151. 17. Варивода А.С., Хорева М.В., Ковальчук Л.В., Дерипапа Е.В., Кондратенко И.В., Грачева Л.А, Бологов А.А. Дефекты в системе Tollподобных рецепторов у детей с первичными иммунодефицитами. Российский иммунологический журнал. – 2008. – т. 2 (11), № 2-3. – C. 274. 18. Варивода А.С., Николаева М.А., Хорева М.В., Ковальчук Л.В., Сидоренко И.В. Экспрессия и функциональная активность TLR2 и TLR4 у больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью. Российский иммунологический журнал. – 2008. – т. 2 (11), № 2-3. – C. 274. 24 Список сокращений ИЛ – интерлейкин ИФН – интерферон КС – коэффициент стимуляции ЛПС – липополисахарид МкАТ – моноклональные антитела МНК – мононуклеарные клетки ОВИН – общая вариабельная иммунологическая недостаточность ОДН – олигодезоксинуклеотид ПИД – первичные иммунодефициты СИФ – средняя интенсивность флуоресценции Х-АГГ – Х-сцепленная агаммаглобулинемия ФИТЦ – флуоресцеинизотиоционат ФНО – фактор некроза опухолей ФЭ – фикоэритрин CpG – цитозин полигуанин P(I:C) – полиинозин-полицитидин TLR – Toll-подобные рецепторы 25