Старостина Надежда Сергеевна, кандидат биологических наук

Организация экологической лаборатории в школе. Методики исследований
Старостина Надежда Сергеевна, кандидат биологических наук
МОУ гимназия «Дмитров» г. Дмитров Московская обл., Россия
Экологические аспекты в воспитании современного поколения имеют большое значение, так как позволяют сформировать у подрастающего
поколения адекватное отношение к окружающей среде, а также знать каким воздухом мы дышим, какую воду мы пьем и какие продукты употребляем в пищу. Эко-лаборатория позволит школьникам заниматься исследовательской работой с использованием не сложных методик, направленных
на оценку экологического состояния окружающей среды и биологического
материала.
Развитие у учащихся исследовательских навыков, введение их в
практическую экологию, необходимо для создания условий более эффективного изучения базовых курсов биологии и экологии. Приобщение
школьников к методам экологических, биохимических исследований позволит им яснее понять сущность изучаемых биологических и экологических явлений, будет способствовать развитию самостоятельного мышления, формированию умения делать практические выводы при решении
учебных задач и проблем окружающей среды.
Разработанная и внедренная в образовательное пространство лаборатория позволит создать внеурочную форму организации учебноисследовательской деятельности, откроет новые возможности проведения
уроков по общеобразовательным программам.
Работа эко-лаборатории - это групповые и индивидуальные занятия,
подготовка к олимпиадам разного уровня, проектная и исследовательская
деятельность учащихся, мониторинговые наблюдения, участие в Интернетпроектах.
Организация лаборатории начинается с выбора помещения, это
должна быть просторная светлая комната с удобным расположением имеющая все необходимые коммуникации (водопровод, вентиляция, электричество и т.д.), при отсутствии естественного освещения наличие ламп
дневного освещения.
Следующим этапом является подбор лабораторного оборудования,
кроме рабочих столов в лаборатории должны быть, шкафы и тумбочки для
хранения посуды и реактивов, а так же приборные столы для установки
приборов. Приблизительный перечень необходимых школьных приборов:
весы учебные лабораторные электронные, пипетки, камера Горяева, мик-
роскопы, дистиллятор для приготовления воды, термостат, водяная баня,
электронагревательный прибор, холодильник. Лабораторная посуда и принадлежности для опытов: стаканы, колбы, мерные цилиндры, кюветы,
пробирки, поставки для пробирок, термостойкая посуда, предметные стекла, покровные стекла, чашки Петри, набор для препарирования и т.д
При работе необходимо соблюдать следующие правила:
1.
Школьникам запрещается работать в лаборатории без присутствия учителя или лаборанта, а также в неустановленное время без разрешения преподавателя.
2.
Работать в лаборатории необходимо в халате, защищая одежду
и кожу от попадания и разъедания реактивами и обсемененности микроорганизмами.
3.
Каждый должен работать на закрепленном за ним рабочем месте. Переход на другое место без разрешения преподавателя не допускается.
4.
Рабочее место следует поддерживать в чистоте, не загромождать его посудой и побочными вещами.
5.
Приступая к работе, необходимо: осознать методику работы,
правила ее безопасного выполнения; проверить соответствие взятых веществ тем веществам, которые указаны в методике работы.
6.
Опыт необходимо проводить в точном соответствии с его описанием в методических указаниях, особенно придерживаться очередности
добавления реактивов.
7.
Для выполнения опыта пользоваться только чистой, сухой лабораторной посудой; для отмеривания каждого реактива нужно иметь
мерную посуду (пипетки, бюретки, мензурку, мерный цилиндр или мерный стакан); не следует выливать избыток налитого в пробирку реактива
обратно в емкость, чтобы не испортить реактив.
8.
Если в ходе опыта требуется нагревание реакционной смеси,
надо следовать предусмотренным методическим указаниям способа нагрева: на водяной бане, на электроплитке или на газовой горелке и др. Сильно
летучие горючие вещества опасно нагревать на открытом огне.
9.
Пролитые на пол и стол химические вещества обезвреживают
и убирают под руководством лаборанта (преподавателя) в соответствии с
правилами.
10. По окончании работы следует привести в порядок свое рабочее
место: помыть посуду, протереть поверхность рабочего лабораторного
стола, закрыть водопроводные краны, выключить электрические приборы.
11. Для приготовления растворов серной, азотной и других кислот
необходимо их приливать к воде тонкой струей при непрерывном перемешивании, а не наоборот. Приливать воду в кислоту запрещается!
12. Не ходить по лаборатории с концентрированными кислотами и
щелочами, а наливать их только в отведенном для этого месте.
13. Запрещается набирать реактивы, кислоты и щелочи в пипетку
ртом. Для этого следует применять резиновую грушу и прочее оборудование для отбора проб.
14. Нагревание реакционных смесей в пробирках и других стеклянных сосудах нужно проводить осторожно, предварительно насухо вытереть внешние стенки сосуда и, не допуская разбрызгивания смеси из сосуда. Горловина сосуда должна быть направлена в сторону, как от себя, так
и от тех, кто работает рядом. Пробирку следует держать под наклоном.
Нельзя наклоняться над жидкостью, которая нагревается, так как иногда ее
может выкипать из сосуда. При нагревании пробирки над спиртовкой
необходимо использовать специальный держатель для пробирок.
15. В опытах с нагревом необходимо пользоваться посудой, которая имеет соответствующую маркировку.
16. Размешивать реакционную смесь в сосуде стеклянной палочкой или шпателем надо осторожно, не допуская разлома сосуда. Держать
сосуд при этом необходимо за ее горловину.
17. Химические лаборатории (включая биохимические и микробиологические) согласно степени опасности поражения электрическим током относятся к помещениям с повышенной или особой опасностью, которая обусловлена возможностью воздействия на электрооборудование химически активных сред.
18. Все работы, связанные с применением электроприборов должны проходить под наблюдением преподавателя (лаборанта).
19. При работе с биообъектами запрещается принимать пищу, пить
воду.
20. Работу с биологическим материалом проводить только инструментами.
21. При случайном попадании биологического материала (особенно микроорганизмов) на стол, руки, нужно провести обработку дезинфекционным раствором (например, хлорамином).
22. После работы необходимо тщательно вымыть руки с использованием дезинфекционных средств (детергентов).
Прежде чем начать работу проводят подготовку лабораторной посуды ее моют, ополаскивают сначала водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают. Пробирки, колбы, бутылки, флаконы закрывают
силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и колпачками (силиконовые, металлические, из фольги или плотной бумаги). Пипетки со вставленными тампонами из ваты укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу. Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или
заворачивают в бумагу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации. Подготовленную
посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 2 ч или 180 °С 1 ч, считая с момента достижения указанной температу-
ры. Стерильную посуду вынимают из стерилизационного шкафа после его
охлаждения ниже 60 °С. Срок хранения стерильной посуды - не более 10
дней.
Приготовление питательных сред для анализов:
Удачный выбор питательной среды и благоприятных условий для
размножения и роста исследуемого микроба является основой работы,
обеспечивающей успешность исследований. Показателем качества питательной среды является успешность роста на ней исследуемого микроба с
сохранением всех присущих этому штамму свойств.
Мясопептонный агар (МПА) – среда искусственная, твёрдая, общего назначения. Представляет собой плотную студнеобразную массу. Эта
питательная среда широко применяется в лабораторной практике для выращивания микроорганизмов. Для её приготовления используют сухой
агар-агар (по малайски агар-агар – желе) – полисахарид с низким содержанием азотистых веществ и не представляющий питательной ценности для
микроорганизмов. Агар-агар имеет вид серых листовидных пластинок. Добывается он из морских водорослей багрянок. Это отличное гелеобразующее вещество – обладает способностью набухать и растворяться при
нагревании, а после застывания образовывать плотную студенистую массу.
Для приготовления этой среды к 1 л МПБ добавляют 15-20 г агар-агара.
Замачивают несколько часов для набухания агара, кипятят на слабом огне
до полного его растворения, после этого доводят объём жидкости до первоначального дистиллированной водой, фильтруют через марлевый
фильтр, смоченный предварительно горячей водой. Среду в горячем виде
разливают в стеклянные колбы и стерилизуют в автоклаве. Готовый МПА
имеет точку плавления 96-100 ºС и температуру застывания около 40 ºС, т.
е. при комнатной температуре он всегда представляет собой твердую питательную среду. Используют для количественного анализа микрофлоры
воздуха и почвы.
Мясопептонный желатин (МПЖ) - среда искусственная, твёрдая,
общего назначения. Это плотная питательная среда, для приготовления которой используют сухой желатин. Желатин - вещество белковой природы,
кислый азотсодержащий продукт, добываемый путём вываривания костей,
хрящей. Для приготовления МПЖ к 1 л МПБ добавляют 100- 150 г желатина, настаивают несколько часов для набухания желатина и затем нагревают до его полного растворения. Используют щелочь для доведения реакции среды до слабощелочной. Фильтруют горячую среду через складчатый бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют дробно текучим
паром в аппарате Коха. Применение МПЖ ограничено в связи с тем, что
он разжижается под действием протеолитических ферментов, выделяемых
многими микроорганизмами. Кроме того, образуемый желатином гель
плавится уже при 23-25 ºС и застывает при 20 ºС и ниже, а большинство
микробов развивается при 30-37 ºС. Используют для выявления культу-
ральных и биохимических признаков идентифицируемых микроорганизмов.
Крахмало-аммиачный агар (КАА) – среда синтетическая, твёр-дая,
элективная. Имеет следующий состав, г: крахмал – 10, (NH4)2SO4 –
2, K2HPO4 – 1, MgSO4 – 1, CaCO3 – 3, агар-агар – 20, водадистиллированная – 1000 мл. Агар растворяют в 300 мл воды. Отдельно растворяют крахмал в 100 мл воды. В остальных 600 мл воды растворяют соли,
нагревают до кипения и в кипящий раствор при непрерывном помешивании вливают крахмал, затем добавляют воду с агаром и стерилизуют в автоклаве. Используют для выращивания актиномицетов.
Среда Чапека - среда синтетическая, твёрдая, элективная. Имеет
следующий состав, г: глюкоза – 14,0; CaCO3 – 0,7; KNO3 – 0,7; MgSO4 –
0,35; NaCl – 0,35; K2HPO4 – 0,35; FeSO4– следы; агар-агар – 20,0; вода дистиллированная – 1000 мл. Агар отдельно растворяют в 300 мл воды. Затем
всю смесь кипятят, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве. Используют для выращивания актиномицетов.
Среда Эндо - среда синтетическая, твердая, элективная. Имеет следующий состав, г: пептон – 10, лактоза – 10, K2HPO4 – 3,5, NaHSO3 – 2,5,
агар-агар – 15,0, вода дистиллированная – 1000 мл. К среде добавляют 4 мл
10 %-ного спиртового раствора основного фуксина, поэтому она окрашивается в розово-кремовый цвет. Среду стерилизуют в автоклаве и сохраняют в темноте. Используют для выращивания кишечной палочки. Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют малиновые колонии с металлическим блеском.
Пептонная вода - среда искусственная, жидкая, элективная. Для ее
приготовления к 1 л воды добавляют 40 г пептона и 5 г NaCl, растворяют
при нагревании, фильтруют, разливают в колбы и автоклавируют. Используют для выращивания аммонифицирующих (гнилостных) бактерий.
Полужидкий агар – среда синтетическая, полужидкая, общего
назначения. Для её приготовления 0,1 г агар-агара растворяют в 100 мл воды при кипячении, фильтруют и автоклавируют. Используют для прямого
подсчета числа микроорганизмов в почве по Виноградскому.
Многие питательные среды (среда Эндо, сухой питательный агар,
питательный бульон и др.) изготавливаются промышленным способом в
виде сухих порошков. В лаборатории их доводят до готовности по рецепту, указанному на этикетке.
Определение микробного числа почвы:Стерильную расплавленную среду МПА (для выявления бактерий) и сусло-агар (для выявления
дрожжей и плесневых грибов) разливают каждую в 3 стерильные чашки
Петри (всего 6 чашек). Навеску почвы, взятую в асептических условиях,
суспендируют 2 мин в 100 мл стерильной водопроводной воды. Дают отстояться частичкам почвы в течение 5-10 мин. Из надосадочной жидкости
отбирают 1 мл и переносят в другую пробирку, заполненную 9мл стериль-
ной водопроводной воды (разведение 1:103). Встряхивают суспензию, отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в третью пробирку с 9 мл
воды (разведение 1:104). Посев производят из второй или третьей пробирки на выбор: 0,05 мл суспензии соответствующего разведения наносят на
поверхность питательного агара в чашке Петри и размазывают стерильным
шпателем Дригальского по поверхности плотной питательной среды
(МПА и СА). Чашки переворачивают вверх дном, и чашки с МПА инкубируют при 37° С 48 ч, а с СА выдерживают при 24° С 6-7 суток. Подсчет
выросших колоний проводится на следующем занятии.
Определение микробного числа воздуха:Методы микробиологического исследования воздуха подразделяют на седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седиментационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах
отбора проб воздуха и выдерживают в течение определенного времени (530 мин), после чего закрывают и термостатируют.По количеству выросших
колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом
Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная
клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и
время экспозиции, вычисляют количество микробов,содержащихсяв 1 м3
(1000 л) воздуха.Для определения микробной загрязненности воздуха расплавляют на водяной бане стерильные среды МПА и СА и разливают каждую в 3 стерильные чашки Петри (всего 6 чашек). Чашки ставят в месте
отбора проб и открывают на 5, 10 и 15 мин. Время выдержки отмечают на
крышке чашки.Затем чашки с МПА термостатируют при 37° С 48 ч, а с СА
- при 24° С 6-7 суток, перевернув их вверх дном. Подсчет колоний ведут на
следующем занятии.
Определение микробного числа воды:
Микробное число воды - это общее количество микроорганизмов,
содержащееся в 1 мл воды. Для санитарно-микробиологического исследования водопроводной воды пробы берут из уличных водоразборов и кранов внутренних водопроводов. Краны обжигают, затем полностью открывают и спускают воду 10 мин., а затем отбирают пробы воды с соблюдением требований асептики, не смачивая пробки, в количестве не менее 0,5 л.
Если вода подвергалась хлорированию, то ее собирают в колбы, содержащие 2 мл 1,5%-ого стерильного раствора тиосульфата натрия. При посеве в
агаризованную среду 1 мл воды вносят в пустую стерильную чашку Петри,
куда затем наливают 10-12 мл расплавленного МПА (45° С) и тщательно
перемешивают. После застывания агара посевы инкубируют при 37° С 24
ч. Из одной пробы воды засевают 3 параллельных чашки и не только на
МПА, но и на сусло-агар для выявления роста дрожжей и грибов, в этом
случае посевы инкубируют 2-Зсуток при температуре
Определение общего числа микроорганизмов в питьевой воде,
образующих колонии на питательном агаре:
Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение
24 ч, видимые с увеличением в 2 раза.
Выполнение анализа: Из каждой пробы делают посев не менее двух
объемов по 1 мл.
После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в
стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения
воды в каждую чашку вливают (8 - 12) мл (на чашку диаметром 90 - 100
мм) расплавленного и остуженного до (45 - 49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро
смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку
чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где
чашки оставляют до застывания агара.
Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие температуру (45 - 49) °С.
После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат
вверх дном и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.
Учет результатов:Подсчитывают все выросшие на чашке колонии,
наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.
Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.
Определение в почве общего количества бактерий:
Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, присущих на мясопептонном агаре
при 37°С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5% мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы для посева должно быть использовано не менее двух различных разведений. Берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки. Из каждого разведения посев производят
минимум на 2 параллельные чашки. После в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15—20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.
После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в
термостат при 37°С на 24 часа. После инкубации подсчитывают выросшие
колонии.
В перспективе на базе созданной лаборатории можно проводить исследования и по смежным направлениям таким как биотехнология (исследование грибов в качестве разрушителей отходов), биохимия молока и мяса и т.д.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
А.А.Воробьева Микробиология. - М., 1994.
В.А.Бухвалов, Л.В.Богданова, Л.З.Купер Методы экологических исследований. – М., ЛА «Варяг», 1995.
И.Д.Зверев Учебные исследования по экологии в школе. М., Центр «Экология и образование», 1993.
www.himlabo.ru
www.ucheba.ru