БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ В МЕДИЦИНЕ И ЭКОЛОГИИ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ В МЕДИЦИНЕ И
ЭКОЛОГИИ
И.С. Захаров, А.В. Пожаров, Т.В. Гурская, А.Д. Финогенов
УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ
Министерство Российской Федерации по связи и информатизации
Санкт-Петербургский государственный университет телекоммуникаций
им. проф. М.А. Бонч-Бруевича
Содержание:
Введение
1. Свойства живого вещества, используемые в биосенсорных системах (БСС)
1.1. Единство организации.
1.1.1. Физико-химическое единство.
1.1.2. Единство биохимического строения.
1.1.3. Единство механизма обмена веществ.
1.2. Механизмы питания, дыхания и передачи наследственной информации.
1.2.1. Типы питания.
1.2.2. Типы дыхания.
1.2.3. Типы передачи наследственной информации.
1.2.4. Защитная система организмов.
1.3. Особенности восприятия стимулов (раздражителей)
1.3.1. Организация рецепторных систем.
1.3.2. Особенности клеточной сигнализации.
1.3.3. Особенности воздействия стимулов на организм.
1.4. Этологические реакции организмов.
1.4.1. Локомоции.
1.4.2. Таксисы, кинезы, реакции прикрепления.
1.5. Рост, размножение и гибель.
1.6. Живой организм как система.
1.7. Проблемы использования живого.
2. Подготовка биохимических преобразователей для биосенсорных систем.
2.1. Биологические объекты для биохимических преобразователей.
2.2. Методы отбора и подготовки живых организмов.
2.2.1. Первичный отбор.
2.2.2. Культивирование.
2.2.3. Оборудование для культивирования.
2.2.4. Идентификация организмов.
2.2.5. Коллекции организмов.
2.2.6. Модификация организмов.
2.2.7. Понятие о генной инженерии.
2.3. Организмы как биохимические преобразователи (БХП)
2.3.1. БПХ с подвижными организмами.
2.3.2. БХП с модифицированными организмами.
2.4. Методы подготовки структур организмов.
2.4.1. Выделение веществ из тканей и клеток.
2.4.3. Модификация.
2.5. Биологические вещества и структуры, применяющиеся для биохимических
преобразователей.
2.5.1. Ферменты.
2.5.2. Ткани организмов.
2.5.3. Фотосинтезирующиепигменты.
2.5.4. Носители генетической информации.
2.5.5. Комплекс антиген-антитело.
2.5.6. Комплекс антиген–антитело–фермент
3. Измерительные преобразователи биосенсорных систем
3.1. Оптические
3.1.1 Денситометрические
3.1.2. Колометрические
3.1.3. Спектрометрические
3.1.4. Турбидиметрические и нефелометрические
3.1.5. Рефлектрометрические
3.1.6. Рефрактометрические
3.1.7. Флуктуационные
3.1.8. Флуктуационно - корреляционные
3.1.9. Биолюминометрические
3.1.10. Жидкокристаллические
3.2. Электрохимические
3.2.1. Кондуктометрические
3.2.2. Потенциометрические
3.2.3. Амперометрические
3.3. Гравиметрические
3.4. Калориметрические
3.5. Радиоактивные
3.6. Микроаналитические
3.7. Миктромеханические
4. Особенности конструирования и эксплуатации биосенсорных систем
4.1. Обобщенная структура биосенсорной системы
4.2. Факторы, влияющие на результат работы системы
4.3. Комплекс для иммуноферментного анализа
Заключение
Приложение
Литература
1. Свойства живого вещества, используемые в
биосенсорных системах (БСС)
1.1. Единство организации
1.1.1. Физико-химическое единство
Применение БСС в медицине и экологии возможно в первую очередь благодаря тому, что
разные формы живого обладают единством структурного строения, обмена веществ,
систем жизнеобеспечения и приспособления к окружающей среде.
Согласно закону физико-химического единства живого вещества (совокупности
организмов на планете), открытому В. И. Вернадским в результате спектрального анализа
вещества многих организмов, живое вещество Земли состоит из одной довольно узкой
группы химических элементов.
Элементы, необходимые живому в большем количестве, чем остальные, называют
макроэлементами (С, H, O, N, S, P, K, Na, Mg, Ca, Cl). Они обычно в форме ионов
выполняют сходную роль в процессах регуляции различных форм жизни. Например, Na+ и
K+ влияют на функции проводимости мембран клеток, а Ca2+ является элементом строения
оболочек и “несущих конструкций” (костей, эмали, раковин, межклеточных стенок у
растений).
Ионы макроэлементов необходимы для обеспечения жизнедеятельности любых видов
организмов, применяемых в биосенсорах и при их искусственном размножении.
Важное следствие закона физико-химического единства живого вещества было
сформулировано в 80-е гг. XX в. Н. Ф. Реймерсом: всякий фактор, оказывающий вредное
воздействие на одну форму живого вещества, может быть вредным и для других его
форм. Это, с одной стороны, объясняет возможность использования различных видов
живого для прогноза воздействия вредных факторов на человека, с другой – побуждает
осторожно относиться к применению веществ и излучений биоцидного действия:
ультрафиолетовой радиации, мыла с антибиотиками, моющих средств с бактерицидным
эффектом, сельскохозяйственных ядов, бытовых инсектицидов.
1.1.2. Единство биохимического строения
В большинстве видов живого обнаруживаются простые органические соединения такие,
как аминокислоты, моносахариды, пептиды и жирные кислоты, из которых строятся более
крупные полимеры: белки, углеводы, нуклеиновые кислоты и липиды соответственно.
Строение белков. Вещества, называемые аминокислотами, содержат аминогруппу (NH2)
и углеродную группу (COOH). Заменимые аминокислоты синтезируются организмом,
незаменимые – поступают с пищей. Белки являются полимерами аминокислот и
характеризуются относительной пищевой ценностью (ОПЦ), зависящей от состава
аминокислот. ОПЦ является важным показателем качества пищи и кормов, который
ухудшается при воздействии загрязнителей [8].
Сложная компактно образованная пространственная структура белков обладает зарядом,
препятствующим “слипанию” цепей из аминокислот, и гидрофобными свойствами,
защищающими ее от растворения в водной среде. Трехмерная структура белка обычно
размещается в оболочке – глобуле.
Белки – важный компонент пищи организмов. Они выполняют структурные функции,
составляя свыше 50% общей сухой массы клеток, и функции обмена веществ. Некоторые
белки являются биологическими катализаторами – ферментами (п. 1.1.3). Свойства
ферментов сохраняют только глобулярные (с ненарушенной пространственной
структурой) белки.
Денатурацией белков называется утрата трехмерной структуры, присущей белковой
молекуле. При этом она теряет возможность выполнять свои биологические функции. К
денатурации могут привести различные факторы окружающей среды: нагрев,
ионизирующие излучения, сильные кислоты и щелочи, разрывающие различные связи
между аминокислотами, тяжелые металлы, снижающие электрический заряд молекулы,
органические растворители и дезинфицирующие вещества, уменьшающие гидрофобность
белка, после чего он выпадает в виде осадка.
БСС используют для выявления денатурирующих свойств веществ и излучений, оценки
качества переработки белков различными организмами, определения показателя ОПЦ. В
свою очередь для БСС опасны любые факторы, способные вызвать денатурацию белка.
Обычно денатурация белка происходит при 45  С. Биологами выделены термофильные
(теплолюбивые) микроорганизмы, которые сохраняют жизнеспособность при 55...60  C и
даже при более высокой температуре.
Строение углеводов. Углеводы являются полимерами простых сахаров, например
глюкозы. К подобным полисахаридам относятся: крахмал – главный продукт фотосинтеза,
энергетический компонент клеток растений; гликоген – эквивалент крахмала,
синтезируемый животными и грибами; целлюлоза – строительный материал клеток
растений; хитин – компонент наружного скелета насекомых, близкий по строению к
целлюлозе.
Загрязнители, ухудшающие синтез глюкозы, могут одновременно повреждать растения и
грибы; наносить вред человеку, животным и насекомым.
Строение нуклеиновых кислот. Первичный элемент строения этих соединений –
нуклеотиды, которые состоят из пятиуглеродного сахара, азотистого основания и
фосфорной кислоты. Их полимеры – нуклеиновые кислоты (ДНК –
дезоксирибонуклеиновая кислота, РНК – рибонуклеиновая кислота), подобно белкам,
характеризуются последовательностью видов нуклеотидов и трехмерной структурой.
Макромолекула ДНК является первичной единицей жизни. На ее структуру могут
воздействовать ионизирующие излучения и химические вещества, разрывающие связи
ДНК и приводящие к образованию другой объемной конфигурации.
Строение липидов. Жирные кислоты – важные биологические мономеры,
характеризующиеся гидрофобностью и высокой энергетической ценностью, что
определяет их роль в организме. Липиды являются полимерами жирных кислот. К
важнейшим липидам относятся: жиры, масла, виды воска (основного водоотталкивающего
покрытия листьев, плодов, семян, шерсти, перьев, хитина), компоненты клеточных
мембран, ароматизирующие соединения, фотосинтетические пигменты и вещества,
ускоряющие рост растений и входящие в состав гормонов, витаминов, желчи. Жиры более
энергоемкое соединение, чем углеводы, поэтому в семенах часть энергии запасается в
липидах.
Липиды могут разрушаться при попадании в окружающую среду различных органических
растворителей бытового или промышленного назначения.
1.1.3. Единство механизма обмена веществ
Метаболизм. Основной механизм обмена веществ у различных форм живого –
ферментативные реакции, подразделяющиеся на реакции синтеза и распада,
совокупность которых называется метаболизмом клетки или организма.
Ферменты или энзимы (соответственно с лат. и греч. “закваски”) были впервые
обнаружены в результате изучения дрожжевых грибов (дрожжей), использовавшихся в
процессах брожения. Долгое время ферментами назывались катализаторы, работающие
внутри клеток, а энзимами – выделенные после их распада белки, ускоряющие
биохимические реакции. Сегодня более распространено обобщенное понятие “фермент”
[18, 51].
Ферменты являются биологическими катализаторами, т.е. ускоряют биохимические
реакции в тысячи и более раз за счет понижения уровня энергии, необходимой для начала
реакции, но почти не расходуются
Ферменты обладают свойством специфичности, т. е. один фермент катализирует обычно
только одну реакцию, которая записывается в виде
S + F = P + F,
(1)
где S – субстрат, F – фермент, P – продукт. Субстратом называется любое исходное
вещество, на которое действует фермент. Продуктом – полученные в результате
биохимической реакции соединения или излучения.
Считается, что ферментов в организме существует столько, сколько в нем происходит
разного типа реакций распада, синтеза, трансформации, транспорта веществ. Каждому
открытому ферменту (в настоящее время их известно более трех тысяч) присваивается
полное систематическое и краткое рабочее наименование, состоящее из следующих
частей:



названия катализируемого субстрата (в тексте выделено курсивом);
указания на тип реакции (выделено жирным курсивом). Наиболее
распространенные сокращения: “синт” – синтез, “оксид” – окисление, “катал” –
катализ, “гидро” – гидролиз (разложение водой), “редукт” – перенос атомов,
“трансфер” – перенос групп, “кин” – ускорения реакции переноса групп, “фосфо” –
присоединение фосфорной группы, “карбоксил” – присоединение СO2, “эстер” –
перевод в форму эфира, “лиг” – соединение двух молекул. Приставка “де” означает
обратный тип реакции;
общего окончания “-аза” (приведено без курсива).
Например, “сахараза” – фермент, который расщепляет сахарозу (углеводный субстрат) на
глюкозу и мальтозу. Ацетилхолинэстераза, катализирует преобразование ацетилхолина в
форму сложного эфира.
Ферменты играют важнейшую роль в функционировании всех систем человека, их
недостаток может приводить к различным заболеваниям.
Действие фермента можно наблюдать, если залить перекисью водорода (пероксидом)
растолченную горошину из стручка [12]. Субстрат S (перекись) с помощью фермента
(каталазы) F будет на глазах распадаться на воду и выделяемый в виде пены кислород –
продукты P ферментативной реакции. При этом фермент каталаза “обнаруживает” лишь
свой субстрат – перекись водорода, реакцию распада которой ускоряет в миллион раз.
Для понимания принципа БСС важно отметить, что субстрат и продукт обладают
различными физико-химическими свойствами (перекись водорода и вода с кислородом).
Свечение насекомых, рыб обусловливает реакция окисления субстрата люциферина в
присутствии фермента люциферазы (п. 2.5.1).
Чтобы превратить данное исходное вещество (субстрат) в требуемый продукт, часто
необходима сложная последовательность реакций, предполагающая катализ ряда
промежуточных соединений (метаболический путь). При этом соблюдается принцип
“конвейера”: предыдущие реакции создают продукты, которые становятся субстратами
для последующих.
Если количество субстрата велико, то количество продукта и скорость реакции будет
линейно зависеть от количества фермента, участвующего в реакции. Это свойство
позволяет измерять концентрацию фермента по количеству продукта биохимической
реакции в единицу времени и оценивать недостаток ферментов в организме человека для
диагностики нарушений обмена веществ.
При постоянной концентрации фермента зависимость количества продукта от
концентрации субстрата будет нелинейной, так как реакционные возможности фермента
ограничены..
Регуляция активности ферментов. Активность ферментов может изменяться в
зависимости от условий окружающей среды.
При повышении температуры (не доходя до температуры денатурации, п. 1.1.2) скорость
реакций удваивается через каждые 10 C, а после достижения температурного
максимума – уменьшается. При температурах среды выше 45 C ферментный белок
подвергается денатурации.
Для каждой реакции существует свой диапазон кислотности среды, в границах которого
скорость катализа максимальна. Окружающей средой для ферментов может быть как
внешняя среда, так и внутренняя среда живых организмов.
Неорганические ионы могут либо инициировать реакции, выступая в качестве
кофакторов, или, наоборот, подавлять, действуя как ингибиторы. Например, цинк или
магний являются кофакторами, а тяжелые металлы (Hg, Ag) ингибиторами для ряда
ферментов.
Некоторые нуклеотиды выполняют функции коферментов, т. е. связующего звена между
двумя ферментными системами.
Схема в прил. 1 наглядно отражает уровни регуляции активности ферментов.
В современных стиральных машинах используют порошки с биодобавками – ферментами
(прил. 2), а для обеспечения максимума активности ферментов задают автоматический
подогрев воды до необходимой температуры.
Ферменты нашли широчайшее применение в БСС. Их специфичность позволяет
обнаруживать в среде органические загрязнители, являющиеся субстратами для
специально подобранных ферментативных реакций, и оценивать их концентрацию по
количеству образующегося продукта. Влияние на скорость реакций групп кофакторов и
ингибиторов дает возможность оценивать по изменению выхода продукта интегральное
загрязнение окружающей среды неорганическими ионами.
В области биоочистки ферментативные реакции являются основным путем переработки
органических веществ. Например, большинство теплокровных животных и человек не
могут усваивать целлюлозу (п. 1.2.1), что создает проблемы при утилизации отходов
целлюлозно-бумажных комбинатов (ЦБК). Для катализа переработки целлюлозы
используют бактерий вида Trichodorma с ферментами целлюлазами, которые
катализируют ее распад на глюкозу и другие виды сахаров.
Регуляция обмена веществ. Витамины и микроэлементы – это содержащиеся в пище в
очень малых количествах сложные органические соединения и химические элементы (Mn,
Fe, Co, Cu, Zn, Mo, F, J, B, Se), которые не обладают пищевой ценностью, но необходимы
для протекания нормального обмена веществ, при этом они расходуются, в связи с чем
необходимо их восполнение. Недостаток витаминов в пище приводит к гиповитаминозу,
симптомом которого, например при недостатке витамина К, является замедление
свертываемости крови. Некоторые болезни связаны с нехваткой в организме
микроэлемента цинка.
Витамины и микроэлементы позволяют интенсифицировать не только обмен веществ у
человека, но и у растений, животных и микроорганизмов.
Поэтому ферменты, помогающие усваивать витамины, существуют у организмов разных
уровней (разд. 2).
Эффект аккумуляции. Если вещество или элемент из внешней среды способны замещать
другое вещество в обменных процессах, то возникает эффект аккумуляции. Например,
ионы алюминия могут замещать кальций в составе костной ткани, что приводит к
хрупкости костей. Поэтому в современных химических методиках определения
элементного состава среды микроорганизмы используются для концентрирования и
выделения микроэлементов из разбавленных растворов. Плесневые грибы применяют для
избирательного поглощения золота из хлоридных растворов, а также для очистки
растворов от ионов меди, цинка, железа [52].
1.2. Механизмы питания, дыхания и передачи наследственной
информации
1.2.1. Типы питания
Все процессы питания управляются ферментативными реакциями. По типу питания
организмы разделяются на автотрофные, вырабатывающие органические вещества из
простых неорганических соединений при воздействии солнечной или химической энергии
(растения и некоторые бактерии) и гетеротрофные, использующие для питания готовую
органику (в основном животные, а также ряд микроорганизмов и грибов).
Особенности автотрофного питания. К основным процессам автотрофного питания
относятся фотосинтез и хемосинтез.
а) Фотоавтотрофы. Это организмы, содержащие пигменты, избирательно поглощающие
видимый свет. Пигментами называются высокомолекулярные природно-окрашенные
соединения (хлорофиллы и каротиноиды), свойства которых более подробно описаны в п.
2. 5.3.
В клетках растений они вместе с ферментами, катализирующими фотосинтез, находятся
в мембранах хлоропластов – органеллах цитоплазмы. Общее уравнение фотосинтеза
можно записать в виде:
cвет
6CO2 + 6H2O + F = C6H12O6 + 6O2 + F,
(2)
где F – фермент карбоксилаза.
Данное уравнение отражает следующие особенности фотосинтеза: вода за счет солнечной
энергии распадается внутри клетки на кислород и водород. К водороду присоединяется
СО2 в процессе ферментативной реакции карбоксилирования, результатом которой
является образование углеводов (глюкозы – C6H12O6), а кислород выделяется в
окружающую среду. Эта реакция необычайно важна для поддержания жизни на Земле, так
как она является основным источником кислорода.
Скорость фотосинтеза у растений уменьшают различные ингибиторы промышленного и
антропогенного происхождения. Для их контроля в БСС используют фотосинтезирующие
пигменты растений (п. 2.5.3).
Другим примером фотосинтезирующей реакции, перерабатывающей вредный для
млекопитающих сероводород, является реакция его разложения фотосинтезирующими
серобактериями (зелеными или пурпурными по окраске). Солнечное излучение
поглощается пигментом бактериохлорофиллом, и обусловливает протекание следующей
реакции:
свет
СO2 + H2S + F ––> Углеводы + 2S + H2O + F,
(3)
где F– фермент дегидрогеназа, катализирующий отщепление водорода от H2S, в
результате чего сероводород распадается на водород и серу. Часть водорода расходуется
на синтез углеводов, часть – на синтез воды. Вместо кислорода, выделяющегося при
фотосинтезе у растений, при реакции поглощения СО2 образуются вода и сера.
Свойство ферментов таких бактерий отщеплять водород от химических соединений
ученые сегодня пытаются использовать для биофотолиза воды, т. е. разложения ее на
водород и кислород в целях создания солнечных водородных топливных элементов.
б) Хемоавтотрофы. Эти организмы используют СО2 как источник углерода, но получают
энергию не от Солнца, а с помощью окислительных реакций.
Например, нитрифицирующие бактерии получают энергию за счет окисления соединений
азота: аммиака до нитритов
растениями.
(4), а затем до нитратов
, которые поглощаются
2NH3 + 3O2 + F = 2HNO2 + 2H2O+ F + энергия,
(4)
где F– фермент нитрогеназа.
Азот очень важен для плодородия почвы, но внесенный в виде химических веществ, он
плохо усваивается растениями. Нитрифицирующие бактерии являются природными
преобразователями азота из неорганической формы в органическую. Бактериинитрификаторы также выполняют в природе важную роль переработчиков аммиака,
образующегося при разложении отмершей органики и различных выделений животных.
Активность фермента данной реакции может подавляться загрязнениями окружающей
среды. Поэтому очень важно иметь возможность биосенсорной оценки его активности (п.
2.5.1).
Железобактерии получают энергию в результате окисления соединений железа (Fe2+ 
Fe3+ + энергия), а бесцветные серобактерии – серы до сульфатов (S 
усваиваемых растениями.
+ энергия),
Хемотрофы выживают в условиях отсутствия солнечного освещения за счет переработки
неорганических веществ. Поэтому их используют при утилизации бытовых и
промышленных отходов.
Типы гетеротрофного питания. Голозойный тип питания свойственен человеку и
большинству животных. Пища в виде сложных органических соединений вводится внутрь
тела, где она подвергается расщеплению на небольшие молекулы, которые могут
усваиваться организмом или выводиться из него. Особенностью подобного питания
является наличие цепей ферментативных реакций для расщепления пищи и
промежуточных продуктов. Реакции регулируются кислотностью внутренней среды
организма.
Общая схема (по Грину и др. [12]) переваривания пищи (углеводов,
белков и жиров)
* Включают ферменты, отщепляющие аминокислоты от полипептидов:
Аминопептидазы – со стороны аминогруппы;
Карбоксипептидазы - со стороны углеродной группы.
Элементы ферментативных реакций пищеварения и условия их протекания приведены в
табл. 1. Многие из этих ферментов сегодня производятся промышленным способом
(прил. 2) для создания различных товаров. Амилазы выделяют из термофильных бактерий
(п. 1.1.2) и используют в моющих средствах в целях расщепления углеводных загрязнений
в теплой воде. Липазы применяют для обнаружения и удаления жиров. Для медицины и
экологии представляют также интерес ферменты, расщепляющие продукты выделения
теплокровных организмов. Например, уреааза разлагает мочу на водные соединения и
азот. Подобные ферменты могут применяться в искусственной почке для удаления
мочевины из крови, в технологиях очистки хозбытовых стоков [3].
У низших организмов выделяют три типа питания продуктами в основном растительного
происхождения: симбиотический, паразитический и сапрофитный.
Таблица 1
Пищеварительные ферменты и их действие
Секрет
Фермент
Место
действи
я
Оптиму
м
Субстрат
Продукт
рН
Слюна (из
слюнных
желез)
Амилаза
слюны
Ротовая
полость
6,5–7,5
Амилоза
крахмала
Мальтоза
Желудочный
сок (из
слизистой
желудка)
(Про)реннин
(у молодых)
Желудок
2,0
Желудок
2,0
Пепсин(оген)
Казеиноген
молока
Пептиды
Белки
Желудок
Пепсин
Соляная
кислота (не
фермент)
Кишечный сок
(из слизистой
кишечника)
Амилаза
Казеин
Пепсиноген
Нуклеопротеи
ны
Нуклеинов
ая кислота
и белок
Тонкий
кишечни
к
8,5
Амилоза
Мальтоза
”
Мальтоза
Глюкоза
Лактаза
”
”
Лактоза
Глюкоза +
галактоза
Сахараза
”
Мальтаза
Сахароза
Глюкоза +
Нуклеотиазы
”
Нуклеотиды
фруктоза
Эрепсин
”
Энтерокиназа
Пептиды и
дипептиды
”
Нуклеозид
ы
Трипсиноген
”
Аминокислоты
”
”
Трипсин
”
”
Панкреатическ
ий сок (из
поджелудочно
й железы)
Амилаза
”
7,0
Трипсин(оген)
”
”
Химотрипсин(оге
н)
”
Амилоза
Мальтоза
Белки
Пептиды
Химотрипсиноген
Химотипси
н
Белки
Аминокислоты
”
Карбоксипептида
за
Пептиды
Жиры
Липаза
”
”
Нуклеазы
”
Аминокислоты
”
Нуклеиновые
кислоты
Жирные
кислоты
+глицерол
Нуклеотид
ы
”
Желчь (из
печени)
Соли желчных
кислот (не
ферменты)
”
”
”
Жиры
Жировые
капли
При симбиотическом питании один организм питается отходами другого, не причиняя
ему вреда. Например, нитрифицирующие бактерии, живущие на бобовых растениях
снабжают их азотом. В кишечнике млекопитающих находятся бактерии, помогающие
расщеплять питательные вещества, например кишечная палочка E.coli. Благодаря
безвредности данной бактерии для человека она широко используется при создании БСС.
При паразитическом питании организм-паразит разрушает системы жизнедеятельности
организма-хозяина.
При сапрофитном питании организмы выделяют ферменты на мертвый или
разлагающийся органический материал. К ним относятся грибы, ряд бактерий и
насекомых. Некоторые сапрофиты выделяют ферменты протеазы, способные разлагать
белки, растворять оболочки других клеток, в том числе болезнетворных. Поэтому
протеазы широко применяют в качестве объектов биотехнологии (п. 2.1.1) в моющих
средствах, а также в БСС для обнаружения с помощью ферментативных реакций
различных специфичных для них белков-субстратов.
1.2.2. Типы дыхания
Дыханием можно назвать процессы получения химической энергии за счет окисления
органических веществ. К ним относят не только внешнее дыхание, для которого
необходимы специализированные органы (легкие, жабры), но и дыхание, происходящее в
клетках организма.
Клеточное дыхание. При этом виде дыхания выделенная энергия запасается организмом
в виде универсального энергетического носителя – АТФ (аденозинтрифосфата), а
частично рассеивается в виде тепла. Все остальные процессы организма получают
энергию от АТФ, который транспортируется в структуры клетки.
При разложении АТФ в клетке путем гидролиза выделяется энергия. АТФ состоит из
углеродной, азотной и трех фосфатных групп. При гидролизе этого соединения в клетке
происходит отщепление одной или двух фосфатных групп и образование АДФ –
аденозиндифосфата и АМФ – аденозинмонофосфата. При этом выделяется энергия для
жизнедеятельности клетки.
Для образования АТФ необходима энергия  G , выделяемая при различных
ферментативных окислительных реакциях:
1) химического окисления молекулярным кислородом:
А + O2 + F  AO2 + F +  G,
(5)
где F– ферменты – оксидазы;
2) биологического окисления (отщепления водорода):
AH2 + B + F  A + BH2 + F+  G,
(6)
где F – ферменты – дегидрогеназы;
3) бескислородного разложения углеводов (гликолиза):
C6H12O6 + F Молочная кислота + F +  G,
(7)
где F – ферменты процесса гликолиза;
4) окисления ионных форм:
Fe 2+ + F  Fe 3++ F + e +  G,
(8)
где F – ферменты, катализирующие реакцию получения электронов e.
Аэробное дыхание. Это дыхание, для которого требуется кислород. Оно является
механизмом долговременного получения энергии для организма человека и высших форм
живого.
Углеводы являются основными соединениями для процессов дыхания.
При бескислородном гликолизе углеводов в цитоплазме клеток происходят реакции
фосфорилирования при участии ферментов фосфорилаз и образования глюкозофосфата, а
затем распада его в несколько этапов до молочной кислоты.
При этом на одну молекулу углеводов образуется 2 молекулы АТФ.
Дальнейшие этапы аэробного дыхания происходят в клеточных органеллах
митохондриях. Здесь осуществляется получение энергии путем дегидрирования с
образованием CO2 (цикл Кребса), окисления ионных форм и, наконец, окисления
отщепленных в результате дегидрирования атомов водорода молекулярным кислородом
до воды. Последний этап катализируется медьсодержащим белком-ферментом
цитохромоксидазой.
Перенос электронов и атомов водорода в митохондрии осуществляется коферментами,
образующимися в цитоплазме при гликолизе. Это положительно заряженные молекулы
НАД и НАДФ на основе производного от витамина группы В. Катализ реакции переноса
ими водорода осуществляется коферментом ФАД на основе производного от витамина В2.
Окончательно реакцию аэробного дыхания можно записать:
C6H12O6 + 6O2  6CO2+ 6 H20 + G (38 АТФ).
(9)
Жиры в качестве дыхательного субстрата при участии ферментов – липаз
гидролизируются до жирных кислот и глицерола. Затем эти соединения дегидрируются и
окисляются в митохондриях, при этом образуется 100–150 молекул АТФ на одну
молекулу жиров. Семена растений, а также печень человека, его сердечная мышца, почки,
мышцы (в состоянии покоя) покрывают значительную часть своих энергозатрат за счет
жирных кислот.
Белки используются для дыхания, когда исчерпаны все запасы углеводов и жиров.
Сначала белки гидролизируются до аминокислот, а затем от последних отщепляются
аминогруппы с выделением энергии. В зависимости от природы “углеродных скелетов”
аминокислот дальнейшее окисление происходит по схеме расщепления углеводов или
жирных кислот.
В БСС очень часто используют ферменты митохондрий. Эти органеллы длиной в единицы
мкм, а шириной в десятые доли мкм были обнаружены в клетках еще в конце XIX в., их
удалось выделить из клеток и обнаружить протекание в них окислительновосстановительных реакций. Внутри митохондрий под электронным микроскопом
обнаруживаются гребневидные складки, на которых размещены мультиферментные
системы цикла Кребса и железо- и медьсодержащие белковые соединения. Проницаемость
АДФ и АТФ через мембраны осуществляют ферменты транслоказы.
В БСС применяют различные ферменты дегидрогеназы, выделенные из митохондрий,
которые катализируют преобразование промежуточных субстратов дыхательного цикла,
АТФ, а также коферменты процессов аэробного дыхания (пп. 2.5.1, 2.5.2).
В БСС также используют организмы с аэробным дыханием, например бактерии E. coli (п.
2.2.7) или ферменты, катализирующие реакции аэробного дыхания, такие как фермент
глюкозооксидаза (пп. 2.5.1, 3.2.3).
Анаэробное дыхание. При этом типе дыхания процесс окисления идет в отсутствии
кислорода. Процесс включает гликолиз и спиртовое брожение:
C6H12O6 + F  2C2H5OH + 2CO2 + F +  G (2 АТФ),
(10)
или молочнокислое:
C6H12O6 + F  2 CH3CHOHCOOH + F +  G (2 АТФ),
(11)
где F – ферменты брожения.
В БСС нередко используют дрожжевые клетки, получаемые промышленным способом,
которые обладают способностью к анаэробному дыханию (п. 2.3.1).
Внешнее дыхание (газообмен). При аэробном и анаэробном дыхании между организмом
и внешней средой должен происходить обмен газами.
У мелких организмов диффузионный газообмен может происходить через тонкие ткани
или дыхательные трубочки (трахеи) длиной не больше 1 см. У крупных организмов
развиваются специализированные органы газообмена с большой площадью дыхательной
поверхности (легкие у человека), а роль переносчика газов выполняет дыхательный
пигмент крови. Оптические спектры поглощения дыхательных пигментов изменяются при
насыщении крови кислородом.
Загрязнения среды могут действовать на систему диффузионного газообмена и уменьшать
кислородную емкость пигментов крови.
1.2.3. Типы передачи наследственной информации
Все организмы делятся на два надцарства – прокариотов (не имеющих ядра), к которым
относятся бактерии и сине-зеленые водоросли, и эукариотов (имеющих ядро) – к ним
относятся все организмы, начиная с одноклеточных (например, водоросли, простейшие) и
кончая человеком.
У прокариотов наследственная информация заключена в ДНК, а у эукариотов – в одном
ядре или нескольких, при делении которых после окрашивания можно выделить
носителей наследственных признаков – хромосомы (“окрашиваемые тела”). Хромосомы
состоят из локусов, в которых локализованы блоки генов с ДНК. При делении ядра может
происходить обмен близко расположенными локусами. Генами называются факторы,
определяющие признаки организма и соответствующие определенным участкам
хромосом.
Изменение генотипа (набора генов) воздействует на фенотип (внешний вид организма),
который изменяется за счет дискретного набора наследственных признаков,
определяемого составом хромосом. Мутации организмов – внезапные изменения генотипа
организмов (структуры ДНК), обеспечивающие передачу мутантного признака
последующим поколениям.
Модификации – изменения организма, не затрагивающие его генотипных структур и
поэтому не передающихся по наследству.
Для выявления мутаций подбирают организмы с хорошо различимыми фенотипическими
изменениями (например, окраски цветка или тычинок у растений, длины или формы
хвостового плавника у рыб, цвета глаз у мухи-дрозофиллы, пигментации или формы тела
у бактерий).
Свойства ДНК и ее синтез. В 60-е гг. из клеток бактерий E.coli был выделен фермент
ДНК-полимераза, позволяющий размножать ДНК, в результате действия которого из
двойной спирали родительской ДНК можно получить пару идентичных спиралей ДНК
[11]. Однако эти цепи нельзя было использовать для синтеза белков, так как двойные
спирали не были связаны между собой. Такое связывание катализирует другой фермент
ДНК-лигаза, обеспечивающий биологическую активность ДНК и возможность синтеза
белков.
Для получения участков исходных цепей ДНК, выделенных из бактерий, применяют
фермент ДНК-рестриктазу (restrict – ограничение), который “узнает” участок ДНК и
катализирует расщепление последовательности нуклеотидов.
Этапы синтеза белка. Белки синтезируются под прямым контролем генетического кода.
Синтез белка происходит в цитоплазме, тогда как генетический носитель (ДНК)
находится в ядре клетки.
а) Транскрипция. Согласно современным представлениям перенос информации из ядра в
цитоплазму осуществляет матричная РНК (мРНК), одноцепочечная молекула,
нуклеотиды которой присоединяются к ДНК при участии фермента РНК-полимеразы в
соответствии с правилами формирования оснований.
Основания ДНК

Основания
РНК
А (аденин)

У (урацил)
Г (гуамин)

Ц (цитозин)
Т (тимин)

А (аденин)
Ц (цитозин)

Г (гуамин)
Время существования мРНК различно у разных клеток: у бактерий – минуты, в
эритроцитах во время синтеза гемоглобина до нескольких дней.
б) Трансляция. Механизм перевода кода мРНК в последовательность аминокислот белка
осуществляется в рибосомах – органеллах цитоплазмы, в которых находится рибосомная
РНК (рРНК). Она кодируется генами, находящимися в ядре клетки.
Структура рРНК сходна у всех организмов от бактерий до растений и животных. Для
подтверждения этого сходства в бесклеточный экстракт бактерий E.coli, содержащий
наборы аминокислот, вносили рибосомы из клеток крысиной печени и наблюдали синтез
белков E.coli на “чужих” рибосомах.
Транспортные РНК (тРНК) доставляют содержащиеся в цитоплазме аминокислоты к
рибосомам. Каждая аминокислота присоединяется к тРНК при участии фермента тРНКсинтетазы. Рибосома “считывает”, перемещаясь вдоль мРНК, код аминокислот,
присоединяет их, забирая от тРНК до появления стоп-кодонов. После этого
полипептидная цепь покидает рибосому, трансляция завершается, а мРНК распадается.
Отделяющиеся от рибосомы цепи аминокислот могут сразу приобретать
пространственную структуру белков.
Возможен обратный перенос информации – от РНК к ДНК [3]. Фермент обратная
транскриптаза позволяет из мРНК получить одноцепочечную молекулу ДНК с
комплементарной молекуле мРНК нуклеотидной последовательностью.
Значение ферментов состоит в том, что они образуют набор инструментов для получения
новых ДНК, так как появляются возможности разрезать цепи ДНК, включать новые
фрагменты, присоединять их и копировать.
Передача информации для синтеза естественного белка:
ДНК (ядро)  мРНК(цитоплазма)  белок
Передача информации в целях воспроизводства искусственного белка:
белок  мРНК(цитоплазма)  ДНК для нового белка(ядро)
Возможность обратимости передачи наследственной информации используется в генной
инженерии (п. 2.2.7).
Гены и ферменты. Еще в начале XX в. высказывалось предположение, что отсутствие
необходимых генов определяет врожденные ошибки метаболизма [11]. Сегодня
установлено, что синтез ферментного белка определяется структурными генами, а его
полипептида – участком ДНК (цистроном).
Гены-регуляторы могут управлять процессом запуска нового фермента (прил. 1).
Например, так объясняется способность бактерий E.coli усваивать кроме глюкозы другой
вид углевода -– лактозу (находится в молоке млекопитающих), вырабатывая
соответственно новый фермент –  -галактоз-оксидазу.
Типы размножения. У организмов встречаются два типа размножения – бесполый
(митоз) и половой (мейоз).
При митозе в результате деления ядра клетки образуются два дочерних ядра с набором
хромосом, идентичным родительским.
К видам бесполого размножения относятся следующие:





деление одноклеточных организмов;
образование спор – одноклеточных репродуктивных единиц, обычно
микроскопических размеров, состоящих из небольшого количества цитоплазмы и
ядра);
почкование – образование новой особи в виде выроста на родительском теле,
отделение от него и превращение в самостоятельный организм, совершенно
идентичный родительскому);
размножение фрагментами – разделение особей на несколько частей, каждая из
которых образует новую особь;
клонирование – перенос ядра зрелых клеток, закончивших свое развитие, в новую
клетку, ядро которой перед этим искусственно разрушают.
Потомство одной особи, полученное путем митоза, называется клоном. Организмы клона
могут иметь заметные генетические различия только в результате мутаций. Это явление
применяется для исследования мутагенности загрязнителей.
При мейозе (соединении двух половых клеток) набор хромосом не идентичен
родительским. Половое размножение осуществляется у высших организмов с помощью
половых клеток – гамет, носителей генетического материала. На их состояние
воздействуют мутагенные факторы – вещества химической природы или ионизирующие
излучения. При исследовании половых клеток млекопитающих, пыльцы растений, семян
плодов, икры рыб можно обнаружить эффект накопления вредных веществ. Яйца
водоплавающих птиц часто характеризуются наивысшей аккумуляцией загрязнений.
У прокариотов процессы полового размножения происходят в форме обмена фрагментами
ДНК при соприкосновении клеток или при трансформации ДНК под действием внешних
факторов. У эукариотов половое размножение происходит в форме распада макроядер и
обмена образующимися при этом микроядрами. Переход к половому размножению иногда
совершается через некоторое время после начала бесполого размножения (при недостатке
корма, наличии мутагенов).
При изменении температуры тип размножения может меняться. Поэтому невозможно
получить множество идентичных организмов: изменчивость – фундаментальное свойство
живого, обусловливающее приспособление к среде, возникает как при мейозе, так и при
митозе.
1.2.4. Защитная система организмов
Виды иммунитета. Млекопитающие обладают иммунитетом, т. е. способностью
распознавать вторжение в организм живого вещества, несущего генетически чужеродную
информацию, мобилизовывать клетки и образуемые ими вещества на более быстрое и
эффективное удаление чужеродного вещества.
У млекопитающих сформировались два вида иммунитета – клеточный и гуморальный.
Клеточный иммунитет основан на окружении инородного тела специализированными
клетками крови (лимфоцитами и фагоцитами), в результате чего чужеродные вещества
уничтожаются или отторгаются.
Гуморальный иммунитет инактивирует чужеродный материал за счет реакции “антигенантитело”. Антиген – чужеродное вещество, вызывающее образование антител. Обычно
он является белковой или полисахаридной молекулой, находящейся на поверхности
микроорганизма или в свободном виде. Антитело – макромолекула, обладающая высоким
сродством к чужеродному веществу, синтезируемая организмом в ответ на его
присутствие. По структуре антитело представляет собой белок иммуноглобулин,
содержащийся в плазме крови [31].
Антитело обладает свойством специфичности, т. е. оно образует комплекс только с
определенным антигеном. Образование комплекса антиген-антитело называется
преципитацией (с лат. “быстрое падение вниз”). При этом клетки с антигенами слипаются
и оседают.
Если анализируемый компонент обладает свойствами антигена, т. е. способностью
вызывать в организме человека или животного синтез антител, то взаимодействие
антиген-антитело дает возможность количественно определять этот компонент в
сыворотке крови, растительном соке, в почве и других средах, содержащих сотни и
тысячи различных веществ (п. 2.5.6).
Иммунная память. При естественном врожденном иммунитете антитела передаются от
одного организма другому при рождении. Естественный приобретенный иммунитет
возникает в результате инфицирования каким-либо новым агентом, когда организм
вырабатывает новые антитела, а иммунная память сохраняет информацию об ответе на
антиген. При его проникновении она снова быстро вырабатывает нужные средства
защиты. Загрязнение окружающей среды может ослаблять иммунитет людей и животных,
что способствует росту числа заболеваний.
При искусственном активном иммунитете в организм вводятся ослабленные антигены, на
которые он вырабатывает антитела и запоминает этот ответ иногда на всю жизнь. При
искусственном пассивном иммунитете сам организм не участвует в борьбе с антигеном, а
в него вводится сыворотка с готовыми антителами. При этом лечебное действие
достигается в более короткое время, но без запоминания ответа иммунной памятью.
Антибиотики. Это вещества, продуцируемые различными организмами: грибами,
бактериями, а также клетками растительного и животного организмов, обладающие
способностью препятствовать размножению микробов или вызывать их гибель.
Антибиотические свойства были сначала обнаружены в слезах человека, но основные
формы антибиотиков получают из почвенных бактерий, особенно рода Streptomyces, из
которых выделены антибиотики стрептомицинового и тетрациклинового ряда.
Антибиотики отличаются друг от друга как по своим физико-химическим свойствам, так
и по способности действовать на тех или иных патогенных микробов. Для оценки
активности антибиотиков используются микроорганизмы и построенные на их основе
БСС.
Вирусы. Это мельчайшие живые организмы размерами от 20 до 300 нм, по химической
природе представляющие собой фрагменты ДНК, либо РНК в белковой оболочке. Попав
внутрь клетки, вирусы “отключают” ее ДНК и дают клетке команду синтезировать новые
копии ДНК вируса.
Плазмиды. Так называют фрагменты ДНК, которые присоединяются к ДНК хозяина и
размножаются с ней, но не нужны для выживания клетки. В последние годы их считают
клеточными паразитами, устроенными проще, чем вирусы. Плазмиды придают клеткам
хозяина целый ряд новых свойств. Например, есть плазмиды, которые кодируют
выработку фермента пенициллиназы, разрушающей пенициллин и создающий
устойчивость к нему бактерий. Плазмиды используются для синтеза новых ДНК (п. 2.2.7).
Свертывание крови. На свертывание крови влияет наличие фермента тромбопластина,
который, выделяясь из поврежденных тканей, катализирует превращение белка плазмы
протромбина в фермент тромбин, расщепляющий белок фибриноген для образования
нитей фибрина. В сети из нитей задерживаются форменные элементы крови и образуется
защитный сгусток. Ингибитором свертывания является полисахарид гепарин.
На процесс заживления ран влияет активность коллагеназы (фермента, активизирующего
синтез волокон коллагена). Коллагеназу можно получить из почвенных бактерий рода
Streptomyces. На основе коллагеназы микробного происхождения разрабатываются
нетоксичные, неалллергенные фармацевтические композиции для заживления и очищения
раневых, ожоговых и других повреждений кожи [38].
Активные формы веществ [9]. На поверхности свежей раны выделяется жидкость,
называемая раневым эксудатом. В ней содержится каталаза, фермент, разлагающий
перекись водорода. В присутствии гемсодержащих белков (с группой гемоглобина) и
ионов железа, находящихся также в эксудате, такое разложение перекиси водорода
проходит с образованием активных форм кислорода (АФК), токсичных для чужеродных
клеток. Некоторые клетки крови (гранулоциты и моноциты) также в целях борьбы с
чужеродными клетками, такими как болезнетворные бактерии и грибы, выделяют АФК и
радикалы гидроксила OH–.
1.3. Особенности восприятия стимулов (раздражителей)
Характерная черта всего живого – раздражимость, или чувствительность. Всем
организмам нужна определенная степень внутренней координации и регуляции;
надлежащая взаимосвязь между стимулом и реакцией необходима для поддержания
жизнеспособности и выживания организма.
У организмов сегодня выделяют два уровня координации – восприятия и передачи
сигналов:


уровень целого организма, который получает информацию из окружающей среды с
помощью органов чувств;
уровень “общения” клеток в пределах многоклеточного организма [50].
1.3.1. Организация рецепторных систем
Общая последовательность обработки стимулов сенсорными рецепторами включает:
1) восприятие значения стимула,
2) первичную дифференциацию (различение стимулов различных интенсивностей),
3) преобразование информации в электрический сигнал и передачу его по нервным
волокнам.
Рецепторы и анализатор. Восприятие стимулов организмом осуществляется с помощью
специальных клеток или органов, которые называются рецепторами. Они действуют как
биологические преобразователи внешних воздействий в электрический сигнал. В
зависимости от природы стимула выделяют фоторецепторы (воспринимающие свет),
хеморецепторы (воспринимающие влажность, запах, вкус), терморецепторы
(воспринимающие изменения температуры) и др.
Выделяют статические и динамические рецепторы. Статические непрерывно и с
постоянной частотой посылают в мозг информацию о значении некой физической
величины, например кровяного давления. Динамические реагируют лишь на изменение
величины сигнала, например зрительные клетки – на колебания интенсивности светового
потока, тактильные – на колебания силы давления на кожу.
Различение стимулов осуществляется анализатором. Анализатор – это не отдельный
орган, а система, которая по мере повышения уровня своей организации может включать в
себя рецепторы, нервные клетки, нервы, группы клеток головного мозга. Рецептор с
анализатором и системами управления реакций на стимулы называется сенсором.
Нелинейность восприятия стимулов. Живые организмы характеризуются пороговой
нелинейной зависимостью чувствительности S от интенсивности стимула I, часто
описываемой законом Вебера–Фехнера:
S = N (log I – log b) = N log (I / b),
(12)
где N – разностная чувствительность; b – абсолютный порог чувствительности сенсора к
стимулу.
Это означает, что живое реагирует на стимул, если его значение превосходит пороговое.
Организмы различают один стимул от другого, если интенсивность одного изменяется не
меньше, чем на определенную долю по отношению к другому: dIi /Ii. В соответствии с
законом Вебера – Фехнера зависимости реакций организмов, как правило, отображаются
графиками с логарифмической шкалой величин стимулов.
Логарифмическая функция чувствительности позволяет живым организмам воспринимать
широкий диапазон интенсивностей стимулов. Например, зрительный анализатор человека
может различать яркости от 10–6 до 104 нит (нит – единица яркости в фотометрии).
В то же время информация о чувствительности организмов является достоверной, если
величина стимула в опыте была объективно измерена. При ее оценке расчетным методом,
например по числу разбавлений исходного раствора химического вещества, могут
возникать ошибки.
Так, в литературе указываются в качестве нижнего порога чувствительности БСС
значения 10–12–10–20 моль/л, или, например, 1011–10–19 мг/л, которые принципиально
неизмеримы техническими методами.
Нелинейность восприятия стимула выражается в том, что для сенсорных систем при
увеличении интенсивности стимула снижается способность обнаружения изменений этой
интенсивности, что обусловливает невысокую точность определения стимулов. При
изменении чувствительности на величину dS погрешность определения интенсивности
стимула увеличивается как xdS , где x – основание логарифма. Биологический контроль
целесообразно применять там, где высокая чувствительность живого искупает меньшую
точность измерения стимулов.
У пурпурных серобактерий выделен сходный по строению с родопсином пигмент,
названный бактериальным родопсином. Он меняет свою структуру (конформацию) и
заряд при поглощении излучения. Этот биоэффект открывает возможности для создания
биологических носителей информации (“0” – молекула родопсина без воздействия
лазерного импульса, “1” – после воздействия).
Первичная дифференциация. Специализация рецепторных клеток позволяет организмам
распознавать сложные вкусы и запахи за счет разложения состава веществ или аэрозолей
на составляющие. Уже у бактерий обнаруживается избирательная чувствительность к
определенным видам сахаров и других органических веществ. Вкусовые анализаторы
пчел, рыб, млекопитающих обладают способностью различать четыре основных вкусовых
качества (сладкое, горькое, кислое, соленое) и нейтральные вещества. Сенсорные системы
первичной дифференциации стимулов у высших организмов выделяют пищевые сигналы
на фоне множества других сильных шумов. Например, хорьки различают запах сырого
мяса, даже если оно залито скипидаром.
Слуховой сенсор внутреннего уха человека осуществляет дифференциацию частот и
интенсивностей звуков с помощью примерно 3500 слуховых клеток, на каждой из
которых имеется пучок волосков (стереоцилий).
Стереоцилии размещены на каждой клетке плотными рядами разной высоты, подобно
трубам в музыкальном инструменте – органе. К тому же они связаны в пучок тонкими
поперечными нитями. Такая изящная микромеханическая система обеспечивает при
наклоне одной стереоцилии одновременное смещение всех остальных, в которых
открываются встроенные в их мембрану ионные каналы. Около 4 млн ионных каналов –
молекулярных преобразователей механического смещения в электрический потенциал –
обеспечивают нашу способность слышать. Минимальное время ионной реакции 100–500
мкс.
Интегрирование стимулов. Важнейшим свойством форм живого, даже низкого уровня
организации, является способность к суммированию или интегрированию воздействий
стимулов разных полярностей, причем живой организм предпочитает избегать вредного
стимула даже в присутствии полезных пищевых стимулов. Когда суммарный эффект двух
стимулов намного выше результата сложения индивидуальных эффектов, говорят о
синергизме, проявляющемся при восприятии этих стимулов организмом. Если же
суммирование стимулов оказывает противоположное воздействие, то такой эффект
называется антагонизмом. Выявление синергизма и антагонизма факторов различной
природы возможно только с помощью реакции живого. Обнаружение этих явлений
привело к пересмотру всей прежней системы нормирования смесей вредных веществ,
которая предполагала простое сложение эффектов от каждого загрязнителя.
Передача электрического импульса. Воспринимаемая рецепторами информация
передается в конце концов эффекторным клеткам и вызывает в них реакцию,
определенным образом связанную со стимулом. Эффекторными (т. е. связанными с
рецепторами) могут быть не только клетки, но и белки, которые называются иначе Gбелками. Связь между рецепторами и эффекторами осуществляют проводящие клетки
нервной системы – нейроны. Их разветвленные отростки аксоны пронизывают весь
организм, образуя сложную систему связей.
Механизм возникновения и распространения импульсов был выявлен только в последние
40 лет, после того как у кальмара были открыты гигантские аксоны толщиной около
миллиметра, что позволило провести на них электрофизиологические исследования.
Мембрана аксона с внутренней стороны заряжена отрицательно (–70 мВ) по отношению к
наружной поверхности. Эту разность потенциалов называют потенциалом покоя
(зависящим от электрохимического градиента ионов К+), который у сенсорных клеток
остается постоянным при отсутствии стимула.
Стимуляция сенсорных клеток приводит к кратковременному повышению проницаемости
мембраны аксона для ионов Na+. В результате потенциал мембраны повышается до
некоторой пороговой величины, после которой возникает потенциал действия – импульс,
называемый спайком (+4 ... +40 мВ). Амплитуда импульса постоянна. Сила стимула
кодируется частотой импульсов-спайков.
Передача информации от одной клетки к другой происходит в синапсах – местах контакта
окончания аксона одного нейрона с отростком (дендритом) другого. Нервный сигнал
передается через синапс с помощью вещества-посредника, названного медиатором. В
результате возникновения потенциала действия медиатор на 0,5 мс выделяется и замыкает
контакт между клетками, передавая потенциал другому нейрону, после чего разлагается
ферментом, и импульс прерывается. Мембрана аксона деполяризуется. Этот механизм
позволяет обеспечить задержку для пропускания нового импульса.
Нервно-мышечное соединение представляет собой специализированный вид синапса
между окончаниями двигательного нейрона (мотонейрона) и рецептором мышечных
волокон. Прерывание импульса в нем необходимо, чтобы не держать мышцу в
напряжении.
Основной медиатор нервной системы позвоночных – ацетилхолин. Ферментом,
разлагающим медиатор до холина, является ацетилхолинэстераза, (локализованная на
мембране синапса). Ее значение огромно. Если она ингибирована, то медиатор
накапливается, нервные импульсы следуют один за другим, мышца не расслабляется,
наступают паралич и смерть.
Некоторые из применяемых боевых отравляющих веществ и инсектицидов (паратион) на
основе фосфорорганических соединений способны подавлять действие фермента. Для
обнаружения подобных веществ используют БСС, контролирующие активность
ацетилхолинэстеразы. Фермент выделяют, например, из мембран эритроцитов.
Помимо ацетилхолина обнаружены другие вещества, возбуждающе воздействующие на
нервно-мышечные соединения: норадреналин, серотонин, дофамин, столбнячный токсин,
ботулинический токсин. Для их обнаружения разрабатывают различные БСС (пп. 2.5.1,
2.5.2).
1.3.2. Особенности клеточной сигнализации
Рецепторы клеток и клеточные мишени. Хотя оболочка бактерий и тем более
плазматическая мембрана клеток многоклеточных организмов представляют собой лишь
тонкий слой, они, тем не менее, служат достаточно надежным препятствием для многих
молекул, в том числе для выступающих в качестве первичных сигналов. Так что
сигнальные молекулы, включая большинство гормонов, как правило, не проникают
внутрь клетки, а специфически взаимодействуют с ее рецепторами, локализованными
внутри внешней клеточной мембраны и представляющими собой мембранные белки,
полипептидная цепь которых пронизывает толщу мембраны.
Активированный рецептор передает сигнал к внутриклеточным мишеням, т. е. белковым
механизмам клетки или белкам, управляющим какой-либо функцией клетки, которые
называются эффекторными, или G–белками.
Помимо белковых посредников в передачу сигнала внутри клетки во многих случаях
вовлекаются и относительно небольшие молекулы (мессенджеры, англ. “посыльные”),
которые могут проходить через мембрану в обе стороны.
Модуляция мишеней. Если мишень представлена ферментом, то сигнал модулирует
(увеличивает или уменьшает) его каталитическую активность; если мишенью служит
ионный канал, то модулируется проводимость этого канала.
Поведение клеток может зависеть от присутствия соседей и регулироваться путем
межклеточных взаимодействий, подобные эффекты также управляются
интегрированными во внешнюю клеточную мембрану рецепторами. Значение клеточной
сигнализации заключается в том, чтобы работа отдельных клеток многоклеточного
организма согласовывалась с функционированием всего клеточного сообщества.
1.3.3. Особенности воздействия стимулов на организм
Пороги регуляции обмена веществ. Советским экологом В.В. Ковальским установлено
наличие двух порогов воздействия макро- и микроэлементов на живое – верхнего и
нижнего, между которыми находится диапазон нормального функционирования организма
[18]. Если концентрация элемента в среде не укладывается в его границы, она вызывает
нарушения регуляции организма. Важно отметить, что пороговые концентрации
различаются не более чем в 10–50 раз. Например, при уменьшении содержания меди в
почве ниже 6 мг/кг у млекопитающих наблюдаются болезни крови и костной системы, а
при превышении значения 60 мг/кг – болезни крови и печени.
Условия изменения чувствительности рецепторов. Чувствительность организмов к
определенным стимулам может усиливаться или ослабляться. Эти явления называются
соответственно “сенсибилизация” и “адаптация”. В данном случае речь идет о
физиологической трактовке термина “адаптация”, обозначающего привыкание к стимулу.
Сенсибилизацию можно вызвать многократным воздействием на сенсор очень слабых
предпороговых раздражений. Это явление имеет и полезные, и вредные стороны.
Специальная тренировка чутья на определенные запахи розыскных собак позволяет им
обнаруживать наркотики и боеприпасы. Тот же эффект сенсибилизации способствует
возникновению аллергии у человека и болезни “множественной химической
чувствительности”.
Не случайно при исследовании влияния разных факторов на живое сегодня выделяют
диапазон сверхслабых взаимодействий. Уменьшение величины стимула до границ этого
диапазона может вызвать не ослабление, а усиление реакции организма на такие факторы.
Адаптация возникает при сохранении постоянства величины или интенсивности стимула,
а также при медленном его изменении. Чувствительность сенсора может изменяться
(адаптироваться) в зависимости от значения измеряемой величины. Поэтому для
организмов опасны, как правило, быстрые скачки температуры, кислотности, солености
сред. Напротив, если вредные отходы поступают достаточно равномерно и медленно,
микроорганизмы, поедающие эти вещества, в дальнейшем способны перерабатывать их в
условиях высоких концентраций токсикантов.
Примеры видов рецепторов. В процессе эволюции у организмов усложнялась структура
рецепторов.
Хеморецепторы. У низших организмов (бактерий, простейших) эти рецепторы
представляет собой нитеобразный орган (ресничку, жгутик), окончание которого выходит
в жидкую среду. У насекомых рецепторные отростки также погружены в жидкость, а
рецепторная клетка защищена футляром (кутикулой) и окружена обслуживающими
клетками. У позвоночных рецептор состоит из множества микроворсинок, сходящихся в
порах, через которые проникает раздражитель, а окончания ворсинок выходят в жидкую
слизь ткани. Рецепторные и обслуживающие клетки у высших форм объединены в группы
(вкусовые почки). Они воспринимают химические стимулы и запахи.
Фоторецепторы. Процесс преобразования фоторецептором человека света в
электрический сигнал включает несколько стадий. Зрительную клетку (палочку)
стимулирует свет, чувствительность к которому достигает единиц фотонов. Энергия света
поглощается пигментом родопсином. В результате образуется продукт (метародопсин),
который после каскада усиливающих ферментативных реакций вызывает изменение
проводимости ионных каналов. Один поглощенный клеткой квант вызывает блокирование
250 ионных каналов. После этого с небольшой задержкой запускается ферментативный
каскад реакций восстановления темнового состояния.
Двухпороговая регуляция характерна для лекарств, микроэлементов, витаминов и
излучений.
В среде нет веществ, которые для организма могут считаться безусловно вредными или
полезными. Все зависит от их концентраций. В конце 90-х гг. XX в. были пересмотрены
взгляды на роль оксида азота (NO), прежде считавшегося только вредным загрязнителем.
Работы Р. Форчготта и соавторов показали, что NO играет важную роль в регуляции
сердечной деятельности и терапевтическое действие нитроглицерина обусловлено тем,
что это лекарство является генератором оксида азота. В организме NO вырабатывается с
помощью фермента NO-синтазы.
Реакция на обстановочную информацию. Казалось бы, высокоорганизованные
млекопитающие должны быть лучшим видом “биологического прибора” для определения
веществ, влияющих на метаболизм и для контроля загрязнения окружающей среды.
Проблема в том, что по мере усложнения анализатора стимулов увеличивается степень
непредсказуемости реакций.
Советский физиолог П.К. Анохин, развивая теорию условных рефлексов И.П. Павлова,
установил в 60-е гг. XX в., что высокоорганизованное живое помимо стимульной
воспринимает как сигнальную, так и обстановочную информацию [4]. Выявлено, что
высокоразвитые формы живого реагируют на сложную целенаправленную
последовательность операций, так как их центральная нервная система включает особый
отдел, названный Анохиным “акцептором (собирателем) действий”.
Например, собака при вырабатывании у нее условного рефлекса выделения желудочного
сока на звуковой стимул, реагирует не только на звонок, но и на то, поставлена ли чашка с
мясом в качестве подкрепляющего стимула, закрыта ли клетка, удалены ли посторонние.
При исключении какого-либо звена последовательности рефлекс мог не проявляться.
Поэтому бывает необычайно сложно установить, на какой элемент данной
последовательности наблюдается ответная реакция. Центральная нервная система высших
организмов способна перестраивать управление органами низшего уровня иерархии для
адаптации к дисфункциям какого-либо из органов, например, при повреждении
конечностей. Этот механизм еще более затрудняет анализ путей воздействия вредных
веществ на живое.
Высокоорганизованные формы живого рационально применять для исследования
воздействия веществ на высшие системные уровни функционирования организма
(центральную нервную систему, головной мозг и пр.). При контроле процессов питания,
дыхания, выявлении нарушений метаболизма методологически оправдана замена высших
организмов низшими.
1.4. Этологические реакции организмов
Этологией называется раздел биологии, исследующий поведенческие стимулы и реакции
на них организмов. На поведение организмов оказывают влияние различные системы
организма, поэтому этологические реакции интегрально отражают воздействие стимулов
разной природы.
Одна из важнейших поведенческих реакций живого – подвижность – свойство
организмов, позволяющее избегать опасности и отыскивать источники корма, а также
наиболее чувствительная и быстрая их реакция на загрязнение среды. Помимо этой
реакции для разработки БСС также важна реакция прикрепления микроорганизмов к
субстрату или поверхностям.
1.4.1. Локомоции
Локомоции – это перемещения всего организма в пространстве.
Локомоции микроорганизмов. Бактерии, сперматозоиды и некоторые микроскопические
водоросли передвигаются с помощью жгутиков, простейшие (одноклеточные животные,
например инфузории) – с помощью ресничек. Оба движителя представляют собой
нитеобразные структуры, называемые фибриллами.
Движение фибрилл происходит за счет энергии, выделяемой при гидролизе АТФ (1.2.2).
Не случайно жгутики сперматозоидов окружены большим числом митохондрий. Важную
роль в регуляции активности движения фибрилл играют мембранные процессы, связанные
с проницаемостью оболочек для ионов Na+, K+, Ca2+, Mg2+. Жгутики и реснички также
являются рецепторами, воспринимающими стимулы из внешней среды (п. 1.3.1). В
отличие от человека, у которого рецепторы находятся в слизистой оболочке, у инфузорий
ими покрыто все тело, что обусловливает высокую хемочувствительность. При
воздействии радиационного излучения на инфузорий они теряют подвижность в
результате выпадения ресничек (аналогично потере волосяного покрова человеком).
Ферментные процессы также оказывают воздействие на характер движения
микроорганизмов. Однако у бактерий и простейших не сформировалась нервная система,
поэтому они могут не реагировать на опасные нервные токсины.
Локомоции клеток [31]. Клетки тканей могут перемещаться, подобно амебам, с
помощью выступов. Установлено, что клетки могут ориентироваться вдоль бороздок на
поверхности глубиной в мкм и даже нм. Например, на поверхности раны нити фибрина
(белка свертывающей системы крови) образуют микрорельеф, ориентирующий движение
клеток. Ведутся исследования, насколько различные заболевания изменяют свойства
передвижения клеток.
Локомоции червей [12]. У червей локомоции управляются кольцевыми и продольными
мышцами, вызывающими волнообразное сокращение и перемещение. Работа мышц
контролируется сетью нейронов, в брюшной нервной цепочке имеется аксон, который
тянется от головы червя к хвосту. Микроскопических червей используют в БСС (п. 2.3.1)
для обнаружения нервно-паралитических соединений.
Локомоции насекомых. Они включают два типа движений: ходьбу и полет. Движение
ног при ходьбе и крыльев при полете управляется нервными импульсами, что позволяет
обнаруживать по изменению полета различные наркотические вещества и нейротоксины
(п. 2.3.1).
Локомоции ракообразных. Водяные рачки – дафнии передвигаются скачками за счет
быстрого сжатия и разжатия ног, при этом фильтруя через свой организм с
прокачиваемую воду с пищей. Поэтому даже небольшие концентрации вредных веществ,
регулярно пропускаемые ими через организм, могут привести дафний к обездвиживанию
и гибели уже через несколько недель. Этот эффект лежит в основе международного теста
на качество воды [62].
1.4.2. Таксисы, кинезы, реакции прикрепления
Таксисы. Это направленные передвижения организма или популяции (группы особей) под
влиянием градиента внешнего стимула. Химические вещества, вызывающие движение к
источнику стимуляции или от него, называются, соответственно, аттрактантами и
репеллентами. Таксисы в зависимости от направления движения делятся на
положительные и отрицательные, их можно также классифицировать в соответствии с
природой раздражителя.
Например, положительный фототаксис – движение водорослей к свету; положительный
аэротаксис – передвижение аэробных бактерий в слои воды, насыщенные кислородом;
отрицательный геотаксис – всплытие инфузорий в верхние слои жидкости в сторону,
противоположную силе земного притяжения; отрицательный реотаксис – полет бабочек
против потока воздуха; гальванотаксис – перемещение инфузорий к катоду.
Половые гормоны самок насекомых – ферромоны являются аттрактантами,
привлекающими самцов с очень дальних расстояний. Эти гормоны исследуют с помощью
БСС (п. 2.5.2).
Особый интерес для оценки качества воды представляет эффект отрицательного
хемотаксиса, т. е. уход живых организмов или клеток из водных сред, содержащих
вредные химические вещества (п. 2.3.1). Для диагностических целей необычайно важен
эффект хемотаксиса лейкоцитов – белых кровяных клеток, участвующих в механизме
клеточной защитной системы организма.
Кинезы. Это ненаправленная двигательная реакция, при которой скорость движения
зависит от интенсивности стимула. Например, при добавлении антибиотика
стрептомицина инфузории P.caudatum начинают двигаться быстрее. Можно предполагать,
что при кинезах стимул усиливает выделение энергии в клетке за счет дополнительного
гидролиза АТФ.
Реакции прикрепления [31]. Возникают при наличии любых шероховатостей. На
идеально гладкие поверхности микроорганизмы и клетки не садятся. Это свойство
позволяет оригинально решать задачи защиты металлов от биологического обрастания, а
также локализации микроорганизмов, когда на участке гладкой поверхности создается
шероховатая зона различной формы.
Чем выше уровень развития организма, тем больше систем и органов оказывают влияние
на его поведенческие реакции, но тем хуже воспроизводимость реакций.
1.5. Рост, размножение и гибель
Данные процессы являются обобщенными показателями действия стимула на организмы
и отражают влияние стимулов на последующие поколения.
Рост – размножение. С биохимической точки зрения рост можно определить как
необратимое увеличение сухой массы протоплазмы и белка, на которое влияет множество
как внутренних, так и внешних факторов. Например: электромагнитное излучение
вызывает мутации; температура воздействует на ферменты, обусловливает
термопериодизм; свет влияет на фотосинтез и фотопериодизм, макро- и микроэлементы
регулируют метаболизм. Поэтому рост является реакцией, отражающей качество среды. В
БСС наиболее широко применяется оценка роста микроорганизмов для выявления
эффекта влияния вредных загрязнителей или антибиотиков различных типов (п. 2.3.1).
Для жизнедеятельности – роста, размножения и функционирования живых существ
необходима среда строго определенного химического состава.
Все вещества по отношению к живым организмам можно условно разделить на жизненно
необходимые, токсичные и физиологически неактивные. При исключении из питательной
среды какого-либо компонента или введении дополнительного (определяемого)
соединения организмы подают соответствующий ответный сигнал разного вида. У них
могут изменяться или нарушаться: поведение, цвет за счет разложения пигмента, состав
крови, функции пищеварения, дыхания, размножения, размеры органов, частота биений
сердца.
Ответный сигнал организма на одно и то же вещество зависит от концентрации
последнего: малые концентрации обычно стимулируют процессы жизнедеятельности
организма, высокие – угнетают [53].
У многоклеточных организмов рост связан с размножением клеток и
дифференцированием тканей и изменением чувствительности организмов. Поэтому для
БСС стремятся отобрать многоклеточные организмы одинакового возраста, так как у
юных и зрелых организмов проявляется разная чувствительность к токсикантам. С этой
целью, например, рачков – дафний просеивают через специальные сита для сортировки по
размерам и соответственно – по возрасту. Для опытов отбирают наиболее юных рачков,
которые способны реагировать на незначительные концентрации загрязнителей.
Гибель. Этот процесс может быть как естественным, так и вызванным высокими
концентрациями вредных веществ. Смерть, деградация или гибель включает многие
трудноуловимые этапы последовательной деструкции отдельных систем и структур и до
определенного момента имеет обратимый характер. При контроле смертности
организмов-сенсоров можно зафиксировать лишь наглядные симптомы предлетальных
состояний – обездвиживание организма, потерю важнейших функций.
1.6. Живой организм как система
Системы, сложные системы. Системой называется множество элементов, объединенных
связями, свойства которого не сводятся к сумме свойств элементов. Эти новые свойства
называются эмерджентными или системными.
К сложным принято относить системы с числом элементов более 1011. Структура самой
малой единицы жизни – макромолекулы уже соответствует критериям сложной системы.
Подобные системы проявляют новые свойства, не присущие простым (например
техническим), такие как уникальность, непредсказуемость, способность к саморазвитию.
Свойством уникальности сложной системы объясняется биологическая изменчивость,
характеризующая живое. Свойство непредсказуемости обусловливает оценку
биологических реакций как событий, т. е. явлений, которые могут происходить или не
происходить.
Способность к саморазвитию у живого проявляется в виде иерархичности организации,
его эволюции (переходе с течением времени от простых форм к сложным). Иерархия
проявляется как в описании структуры организма (атомы, молекулы, макромолекулы,
органеллы, клетки, ткани, органы, системы органов), так и в общей классификации
живого (вид, род, семейство, отряд, класс, подтип, тип, царство, надцарство).
Систематизация важна для того, чтобы представлять, свойства каких крупных
иерархических групп может отражать используемый организм-биосенсор. Например
инфузория, может считаться представителем эукариотов (п. 1.2.3). С позиций создания
новых БСС необходимы методы и системы, которые моделировали бы воздействие
вредных факторов на различные иерархические уровни живого.
Значение системных свойств. Именно эти свойства являются наиболее стабильными при
вариации биологических параметров элементов. Например, в организме поддерживается
гомеостаз – постоянство состава внутренней среды организма и устойчивость его
основных физиологических функций. Гомеостаз обусловлен сложными регуляторными
взаимодействиями элементов молекулярного, клеточного, органного и организменного
уровней. Таким образом возникает надежность обеспечения функций организма при
ненадежных (гибнущих и вновь размножающихся) элементах с параметрами,
нестабильными за счет биологической изменчивости.
Популяции организмов, получающих органическое вещество из неорганического путем
фотосинтеза или хемосинтеза, потребляющих его и разлагающих отмершую органику,
образуют экосистему, которая стабилизирует состав окружающей среды.
С методической точки зрения контроль системных свойств обеспечивает
воспроизводимость результатов измерения с помощью БСС.
Эффекты в открытых системах. Открытой системой называется система,
обменивающаяся со средой веществом, энергией или информацией. Если система состоит
из множества элементов, находящихся в неравновесном состоянии, и через нее извне
проходит поток энергии, то в такой системе могут возникать явления упорядоченности
элементов, получившие название “диссипативные структуры” (ДС). Иногда процессы
образования ДС называют синергетическими эффектами, т. е. обусловленными
взаимодействием многих элементов.
Моделью ДС в физике являются ячейки Рэлея – Бенара, проявляющиеся в виде “рыбьей
чешуи” при нагреве в чашке масла с частицами порошка за счет взаимодействия
множества конвекционных возмущений в придонном слое.
Такие структуры обладают особыми свойствами, характерными для живых организмов:
регенерацией, памятью структуры, вариабельностью параметров элементов. Важно, что
для создания сложных трехмерных ДС и управления ими требуются малые объемы
информации.
Синергетика изучает качественно новый – средний уровень организации живого –
поведение и развитие групп объектов (в том числе клеток или популяций организмов).
При этом ДС можно обнаружить при росте и размножении живого, его ориентации в
среде, развитии структур кодирования наследственной информации.
Например, при увеличении объемной концентрации микроорганизмов могут возникать
структурные неоднородности в виде скоплений. При увеличении концентрации микробов
также происходит, как полагают, структурная перестройка популяции, изменяющая их
активность и вызывающая массовые заболевания или эпидемии.
Сама популяция организмов с позиций синергетики представляет собой систему,
находящуюся в неравновесном состоянии. При этом на каждый биообъект воздействует
множество информационных потоков различной природы. Эта интерпретация позволяет
объяснить высокую чувствительность живого к малым воздействиям физических или
химических факторов и появление кооперативных эффектов взаимодействия организмов,
например, массовых миграций.
Для передачи наследственной информации с позиций синергетики не требуется, чтобы
хромосомы, например растений, заключали в себе всю информацию о форме, цветовых
оттенках стебля, листьев, клеток, что предполагало бы гигантскую информационную
емкость носителя информации. На нем достаточно хранить информационные коды для
управления ДС, которые образуются за счет самоорганизации элементов живого. На эти
коды и могут воздействовать повреждающие факторы различной природы.
1.7. Проблемы использования живого
С помощью БСС сегодня в клиниках врачи ставят диагнозы пациентам, экологи в
лабораториях делают заключения о вредности новых синтезированных химических
веществ. При этом следует учитывать, что “живой датчик” существенно отличается от
привычного для инженера измерительного прибора.
В традиционной технической аппаратуре разработчики, как правило, обеспечивают
линейность шкалы измерительного преобразователя, воспроизводимость измерений в
заданном диапазоне температур, минимально возможную погрешность. Прибор в
большинстве случаев может многократно использоваться, не требуя затрат на новые
материалы.
Вместе с тем, традиционный аналитический прибор обычно предназначен для выявления
лишь массовой доли вещества или концентрации элемента вне зависимости от
воздействия других элементов. Большинство приборов не позволяет разделить различные
химические формы одного элемента.
“Живой датчик” меняет чувствительность при адаптации или сенсибилизации. При его
нагреве может денатурироваться клеточный белок или произойти переход к другому типу
размножения, при воздействии излучений может возникнуть мутация организма. Его
реакция зависит от взаимодействия целой группы факторов, отражая множество тонких и
важных изменений в окружающей среде или среде организма.
Для большинства целостных организмов характерна нелинейность реакции на величину
стимула, обусловленная необходимостью воспринимать широкий диапазон стимулов.
Поэтому для обеспечения линейной зависимости реакции “живого датчика” от величины
стимула требуется выделить из организма биологические структуры и определить для них
рабочий диапазон концентраций определяемых веществ. Для работы живого в составе
БСС необходимы корм и источники макроэлементов.
Однако все эти усложнения БСС по сравнению с обычной технической аппаратурой
искупаются тем, что только биологический организм может “отыскивать” необходимое
вещество в сложнейшей смеси, выделять стимулы среди шумов, превосходящих сигнал в
миллионы раз; оценивать интегральную вредность различных факторов; сигнализировать
о наличии источников мутаций или веществ, подавляющих фотосинтез, синтез белков,
метаболизм.
2. Подготовка биохимических преобразователей для
биосенсорных систем
2.1. Биологические объекты для биохимических преобразователей
Типы БО для БХП. Биохимические преобразователи (БХП) воспринимают вещества,
поля, излучения из внешней среды и изменяют свои физико-химические свойства или
поведение за счет биохимических процессов. БХП создаются на основе биологических
объектов (БО). Понятие БО включает в себя как живые организмы растительного или
животного мира, так и их ткани, клетки и клеточные структуры: ферменты, ДНК, РНК и
т. п. (табл. 2).
В биологии эксперименты с живыми организмами называются in vivo (“в живом”), а
эксперименты с выделенными из организма веществами (ферментами и др.) – in vitro (“в
стекле”). В БСС может применяться техника, созданная на базе этих двух видов
экспериментов.
Понятие о тест-реакциях. Современные БСС в медицине и экологии основаны на методе
измерения тест-реакций БО – наиболее чувствительных, воспроизводимых и
количественно-измеряемых реакций на стимул [18].
В экологии подобный подход используется в биотестировании, при котором реакция
измеряется у лабораторно выращенного БО (тест-объекта), или в биоиндикации, когда
БО забирают из естественной среды (индикаторный объект) [27]. Медицинские БХП
создаются также на основе контроля тест-реакции к веществу, определяемому в
организме человека или в пробе биологического вещества. Поэтому БХП – это
искусственно организованный преобразователь с БО, проявляющий тест-реакцию к
стимулу.
В данном пособии сосредоточено внимание на БХП, получаемых лабораторным
способом. Вопросы биоиндикации подробно рассмотрены в [2, 27], биоиндикационным
методам также посвящены статьи журнала “Экология”.
Учет биологической изменчивости. Живое обладает свойством биологической
изменчивости. Она зависит от типа размножения и от условий внешней среды (п. 1.2.3).
Слабее изменчивость проявляется при бесполом размножении (митозе) клеток, сильнее –
при половом (мейозе). При искусственном культивировании биообъектов их можно
стандартизировать по какому-то одному параметру, например чувствительности к
антибиотикам. Влияние биологической изменчивости проявляется в разбросе
чувствительности отдельных клеток или популяций, различий активностей ферментов,
скоростей реакций и др.
Необходимость биологического контроля. Учет влияния на живое различных факторов
обусловливает необходимость сравнения результатов эксперимента после воздействия
какого-либо стимула на биообъекты (опыта) с результатом при отсутствии воздействия
стимула (контролем). Эта схема проведения эксперимента предполагает, например,
измерение реакции биообъекта на вредное и безвредное вещество, измерение активности
фермента, катализирующего разложение крови с превышением содержания глюкозы и без
превышения. С методической точки зрения контрольных проб должно быть столько,
сколько факторов изменяется в эксперименте.
Например, если необходимо измерять токсичность ионов ртути для инфузорий в соленой
воде с содержанием ионов кальция, то требуется поставить следующие виды контролей:
К1 в соленой, К2 в кальцинированной, К3 в чистой воде.
Особенно важна организация подобных контролей, если на ферментативную реакцию
влияют несколько кофакторов и ингибиторов (пп. 1.1.3, 2.5.1) вместе или по отдельности.
Задача осложняется еще и тем, что многие вещества, запускающие ферментативную
реакцию или подавляющие ее, действуют в микроколичествах, в том числе попадая из
воздуха. Поэтому некоторые реакции, на которые оказывают действие кислород или азот,
проводят в среде инертных газов.
Требование стандартизации БО. Разработка БХП должна проводиться с учетом
основных принципов создания аналитической техники:



постоянства условий проведения анализа;
многократной повторяемости;
воспроизводимости результатов в разных клиниках и лабораториях.
В то же время реакция организмов на внешние воздействия характеризуется изначально
присущей им изменчивостью, наиболее проявляющейся у различных видов организмов
при разных режимах их содержания.
Для улучшения воспроизводимости результатов экспериментов необходимо соблюдать
правила организации биологических испытаний:


использовать организмы одного вида и потомство с одним исходным набором
хромосом (“чистую линию”);
применять при их выращивании стандартные оборудование, корма и режим
содержания организмов.
При этом в качестве корма следует использовать или органические вещества строго
определенного состава или организмы, выращенные по определенным методикам.
Таблица 2
Биологические объекты для БХП
Биологические
объекты
для БСС
Назначение
Микроскопические
водоросли
Источники (in vivo, in vitro)
фотосинтезирующих пигментов,
ферментов, макромолекул, корм (in
vivo, in vitro), сенсоры токсичности
(in vivo)
Бактерии,
Источники (in vivo, in vitro)
ферментов, пигментов,
антибиотиков, макромолекул, корм
(in vivo, in vitro), сенсоры
токсичности (in vivo)
Микрокопические
грибы
Простейшие
(одноклеточные
животные)
То же
Ткани
То же
Клетки
То же
Органеллы
(митохондрии, ядра
клеток и др.)
Источники (in vivo, vitro)
фотосинтезирующих пигментов,
ферментов (п. 1.2.1)
Ферменты
Детекторы (обнаружители) in vitro
макромолекул субстратов,
игибиторов, кофакторов (п. 1.1.3)
Субстратыметаболиты
Детекторы ферментов (п. 1.1.3)
Цитохромы
(биологические
переносчики
электронов)
Биоэлектрические преобразователи
(in vitro) энергии (п. 1.2.1)
Фотопигменты
Преобразователи воды (in vitro)
путем биофотолиза, биотопливные
элементы, оптические элементы
компьютерной памяти (п. 1.2.1)
G – белки (связанные Искусственные рецепторные
с рецепторами)
структуры in vitro (п. 1.3.2)
Ионные каналы
(белки,
регулирующие
проводимость)
Биорегуляторы ионной
проводимости in vitro (п. 1.3.2)
Месседжеры
(переносчики
информации в
клетку)
Искусственные рецепторы и
биорегуляторы ионной
проводимости in vitro (п. 1.3.2)
Нуклеиновые
кислоты
ДНК-зонды, ослабленные вирусы,
матрицы для синтеза белков in vitro
(п. 1.2.3)
Антитела
Детекторы антигенов различной
природы in vitro, in vivo (1.2.4)
Антигены
Детекторы антител различной
природы in vitro, in vivo (1.2.4)
Понятие о биотехнологии [5]. Биотехнология – это промышленное использование
биологических процессов на основе получения высокоэффективных форм с заданными
свойствами микроорганизмов, культур клеток растительных или животных тканей.
Методами биотехнологии искусственно получают стандартизированные виды организмов,
в том числе предназначенные для БХП. Поскольку организмы полностью стандартными
вырастить невозможно, выделяют одну или несколько их стабильных характеристик:
активность переработки субстрата, активность выделяемых антибиотиков и т. п.
При получении БО следует четко различать, будет ли в качестве БХП использован живой
организм или его составная часть, продолжительность активности которой значительно
ниже, чем организма. В зависимости от этого изменяется и сложность подготовки БО.
Некоторые из технологий получения БО уже отработаны, другие еще находятся на стадии
эксперимента. Приведенный в табл. 2 перечень показывает, что биотехнологии
разрабатывают для решения как прямой, так и обратной задач: выявления как ферментов,
так и субстратов, как антигенов, так и антител.
2.2. Методы отбора и подготовки живых организмов
2.2.1. Первичный отбор
Производится из всех форм живого вещества планеты (п. 1.1.1). Микроорганизмы
отбирают, например, из почвы, пресной и морской воды, воздуха, содержимого желудка и
его слизистой оболочки, из горячих источников. Растения собирают на разных
континентах планеты.
Внутри организмов находятся ткани, органы, клетки, органеллы, содержащие важные
ферменты. Эволюция организмов приводит к тому, что вещества, ранее считавшиеся
“пищевым тупиком”, перерабатываются новыми видами живого.
Таблица 3
Некоторые примеры отбора биообъектов
Биообъект
Источник отбора
Фермент урокиназа или уриказа
(разлагает мочевую кислоту на
соединения азота)
Ткань почек человека
Фермент люцифераза
катализирует
люминесенцию
Ткани насекомых –
светлячков
Фермент рестриктаза
расщепляет цепочки
нуклеотидов
Почвенные бактерии
Овечий пепсин
(пищеварительный фермент,
табл. 1)
Органы овец
Бактерии E.coli
Желудок человека
Инфузории P.calkinsi (морской
вид)
Воды Каспийского моря
Ползающая инфузория С.shteini
Мхи болот
Инфузория-туфелька (P.
Caudatum)
Вода прудов
Мембраны хлоропластов
Листья бобов
Первичный отбор осуществляют или для новых объектов биотехнологии или при
возобновлении биотехнологии получения известного БО.
В дальнейшем БО получают лабораторными или промышленными способами.
2.2.2. Культивирование
Культивирование – это процесс искусственного размножения отобранных организмов
(обычно микроорганизмов) для получения их необходимого количества или заданной
концентрации. Для размножения в общем случае необходимы: химические вещества,
стерилизация посуды, питательная среда, которую потребляют организмы, и техническое
вспомогательное оборудование [24].
Стерилизация. Проводится для уничтожения посторонних микроорганизмов и их спор на
стенках лабораторной посуды, а также при подготовке питательных сред.
Перед стерилизацией стеклянную посуду тщательно моют, затем высушивают, пробирки
и колбы закрывают специально приготовленными ватными пробками, а чашки и пипетки
завертывают в бумагу, чтобы после стерилизации они как можно дольше оставались
стерильными.
Для достижения стерильности посторонние микроорганизмы, находящиеся в посуде,
убивают либо нагреванием, либо прокаливанием в печи Пастера, либо кипячением в
стерилизаторах с помощью химических стерилизующих средств. При кипячении к воде
добавляют 1% соды, действие которой ускоряет разрушение микробов.
Для стерилизации паром под давлением используется автоклав. Температура автоклава
120  С губительна не только для клеток, но и для спор бактерий (п. 2.2.6).
УФ-излучением обычно стерилизуют воздух помещения. При этом следует учесть, что
недостаточное по мощности излучение может не убивать микроорганизмы, а вызывать
мутации и способствовать размножению.
Для уменьшения расхода энергии и упрощения подготовки БО в последнее время
применяется одноразовая посуда из пластика.
Питательные среды. Делятся на два типа: универсальные, на которых можно выращивать
множество различных микроорганизмов, и дифференциально-диагностические, на
которых растут только определенные виды организмов. Универсальные питательные
среды должны обладать следующими свойствами:


содержать полный набор аминокислот (п. 1.1.2) и макроэлементы (п. 1.1.1);
иметь оптимальные кислотность и соленость.
При этом их свойства не должны меняться при оптимальной температуре выращивания
организмов.
а) Бактериальные среды. К таким универсальным питательным средам относятся мясопептонный бульон (МПБ), агар (МПА) и ГРМ-бульон.
МПБ готовится по следующей рецептуре. Мясо очищают от жира, костей и сухожилий,
разрезают на мелкие куски или пропускают через мясорубку. Фарш заливают водой
(водопроводной, но лучше дистиллированной в соотношении 1:2 и оставляют в
прохладном месте на
12–24 ч. Затем смесь нагревают до кипения, мясо отжимают через плотную ткань, а
жидкость фильтруют через вату и доливают до первоначального объема. В результате
получается мясная вода, содержащая экстрактивные вещества из мяса, растворимые
белковые вещества и соли. В нее добавляют 1 % пептона, 0,5 % поваренной соли и едкий
натр (NaOH). Так как мясная вода имеет кислую реакцию, щелочь нужна для появления
слабощелочной реакции. Все вещества доводят до растворения и кипятят 30 мин. МПБ
должен быть соломенно-желтого цвета, прозрачным.
МПА создается путем добавки в МПБ желатинового вещества агар-агар. МПА удобен тем,
что он не проливается, его легко дозировать для посева.
ГРМ-бульон является видом сухой стандартной среды промышленного производства,
приготовление которой производят по определённой схеме путём разведения. Для ГРМбульона берут высушенный белок (п. 2.4.3) полученный из МПБ. Способ приготовления:
20 г порошка размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 1–2 мин,
процеживают через бумажный фильтр, разливают в пробирки.
Подготовленные бульоны перед использованием стерилизуют кипячением. В последнее
время разработаны более упрощенные методики приготовления сред, но основные
принципы остаются теми же.
б) Среды для простейших. Среды для инфузорий представляют собой различные виды
отваров трав (наиболее распространен сенной отвар) или слабоминерализованную воду.
Недаром “инфузории” с лат. означают “наливные”, т. е. появляющиеся в зацветающей
воде. Кормом для инфузорий могут быть бактерии, выращенные на пекарских дрожжах.
Некоторые из простейших (инфузория-туфелька) хорошо растут при комнатной
температуре (18...25  С). Поэтому получение таких инфузорий возможно в условиях
неспециализированных лабораторий без сложных аппаратов для стерилизации, что
облегчает разработку БСС с использованием инфузорий.
в) Среды для микроводорослей. Это минерализованная вода с необходимыми макро- и
микроэлементами [63].
Посев организмов на среду. Посевы организмов на МПБ, МПА производят асептично
(так, чтобы в питательную среду не попали из воздуха посторонние микроорганизмы).
Посевы производятся петлей из пассивного металла, например платины, непосредственно
около зажжённой спиртовой горелки, в пламени которой обжигом стерилизуют петлю,
концы пипетки, края пробирки как перед посевом, так и после него. Каплю жидкого
бактериального материала петлей вводят в бульон и слегка размешивают в пробирке.
После посева петлю обязательно прокаливают в пламени горелки.
2.2.3. Оборудование для культивирования
Промышленные культиваторы. Это аппараты, выполняющие следующие функции:




поддержание наиболее важных параметров среды;
подачу корма;
предотвращение зарастания культуры другими организмами;
обеспечение возможности стерилизации.
В состав культиваторов обычно входят: термостат, барботеры, перистальтические насосы,
мешалки, система контроля за процессом.
Термостат представляет собой камеру, в которой поддерживается заданная температура.
Барботер – это воздушный насос с краном для подачи воздуха в питательную среду с
организмами. Он создает множество пузырьков, которые насыщают среду воздухом и
одновременно перемешивают ее. Перистальтический насос основан на принципе
перемещения жидкостей путем волнообразного сжатия стенок трубки. Подобное
устройство обеспечивает стерильную подачу корма, растворов для регулирования
кислотности, забор пробы выращенных организмов. Мешалка – устройство,
перемешивающее среду с организмами, что необходимо для равномерного распределения
питательных веществ и интенсификации процессов роста.
Система контроля включает измерительные преобразователи (датчики) кислотности,
температуры, мутности среды, отражающей размножение организмов.
В целом культиватор представляет собой автоматизированное устройство, управляемое по
программе с учетом показаний датчиков. Объемы культиваторов могут быть различны –
от сотен литров до полулитра.
Культиватор для бактерий иногда называют ферментером.
Выращивание микроводорослей осуществляется под лампами дневного света или в
автоматизитрованных устройствах – люминостатах.
Лабораторное оборудование. В небольших количествах бактерии часто культивируют на
чашках Петри с плоским стеклянным дном и с крышкой, предотвращающей попадание
посторонних бактерий из воздуха. Инфузории можно культивировать в лабораторных
условиях в чашках Петри, а также в пробирках или колбах.
2.2.4. Идентификация организмов
Убедиться, что получен нужный вид микроорганизма, весьма непросто. Выращенная
популяция (группа особей) микроорганизмов напоминает мутную взвесь в объеме
питательной среды или плесень на ее поверхности.
Существует целая группа методов идентификации видов:






по форме колонии (учитываются цвет, форма, складчатость и др.);
по потреблению добавляемых субстратов (анализируют, потребляет ли организм
типичные для него виды углеводов, белков);
по прорастанию на других средах (колонию пересевают на дифференциальнодиагностические среды, на которых растут только известные виды);
по устойчивости к известным антибиотикам;
по окраске колонии стандартным методом, например по Граму (после окраски
синим красителем и добавления затем этилового спирта грам-положительные
бактерии сохраняют окраску, грам-отрицательные не сохраняют, что обусловлено
разным составом их оболочек);
по форме микроорганизмов под микроскопом: кокки – круглые или гроздевидные
организмы, палочки–бациллы, бациллы со спорами (п.2.2.6), вибрионы – изогнутые
палочки, спирохеты или спириллы – спиралеобразные;


по характеру светорассеяния или поглощения излучения колониями (японскими
учеными в начале 90-х гг. XX в. выявлена специфичность инфракрасных спектров
многих бактерий);
по другим физическим свойствам.
2.2.5. Коллекции организмов
Выявленные диагностические признаки позволяют сделать вывод о культивировании
необходимого штамма. Так называется чистая культура микроорганизмов одного вида, у
которого изучены морфологические и физические особенности. Штаммам присваивается
идентификационный номер, они поддерживаются в коллекциях.
Коллекциями называются системы долговременного поддержания лабораторно
выращенных организмов. Коллекции поддерживают в крупных НИИ
микробиологического профиля, на микробиологических производствах и на
биологических факультетах университетов.
Обычно из них берут и хорошо изученные организмы в целях разработки БСС. При
описании экспериментов с БСС всегда должен быть указан источник, откуда взяты
организмы.
2.2.6. Модификация организмов
Живые белковые объекты весьма трудно хранить или фиксировать на поверхностях.
Поэтому многие организмы, полученные в чистом виде, затем подвергают модификации
(п. 2.2.6) для перевода в новую более удобную жизнеспособную форму. Для этих целей
разработана группа биотехнологических процессов.
Иммобилизация (обездвиживание). Это важнейший биотехнологический процесс,
позволяющий защитить организмы от вымывания при воздействии жидкостей. Для
иммобилизации микроорганизмов требуется или осадить их на поверхность, или встроить
организмы внутрь каких-то малорастворимых веществ. Процедура должна быть
технологичной, обеспечивать высокую адгезию (сцепление) и сохранять
жизнеспособность организмов, доступ к ним субстратов и кислорода [22, 53].
Осаждение живых организмов чаще всего производят методом центрифугирования. В
центрифугу под углом 30–40 закладываются закрытые пробирки, в которые заливается
питательная среда с организмами, а на дно кладется пористый фильтр. Пробирки
начинают вращаться с большой скоростью. В результате действия на вещество
центробежных сил более плотные слои опускаются вниз, а менее плотные всплывают
вверх. Мутная от бактерий или окрашенная в зеленый цвет от водорослей среда после
центрифугирования становится прозрачной, а на фильтре образуется пленка из
организмов.
В качестве физических веществ-носителей биообъектов часто используются желе, или
иначе, гели (лат. “застывающие вещества”) биологического происхождения (агар,
желатин, коллаген) или синтетические полимеры.
Микроорганизмы, включенные в гели, имеют меньшую чувствительность, чем
осажденные на фильтровальных материалах, но для создания аналитических систем с
высокой стабильностью и воспроизводимостью результатов предпочтение следует отдать
методу включения в гели.
Лиофилизация. Это обезвоживание при низких температурах (от –40 до –60 С) и
давлении, стимулирующих процессы испарения.
Лиофилизованные бактерии превращаются в порошкообразное вещество, которое затем
можно хранить в обычном морозильнике. При добавлении порошка в питательный
раствор жизнеспособность бактерий восстанавливается. Следует отметить, что не все
виды живого могут быть подвергнуты лиофилизации. Необходимо подбирать режим
изменения температуры и давления, чтобы внутри организмов не образовалось
кристалликов льда, повреждающих живое.
В России применяются установки для лиофилизации типа “Иней”.
Криоконсервация [15]. Ряд форм организмов, например сперматозоиды крупного
рогатого скота, сохраняет свою жизнеспособность при помещении в жидкий азот и
последующем размораживании.
Спорообразование. Бактерии рода Bacillus, Clostridium образуют эндоспоры,
находящиеся внутри клетки (п. 1.2.3). Это толстостенные долгоживущие образования,
устойчивые к нагреванию и коротковолновому облучению. Споры бактерий можно
держать в холодильнике или внутри порошков, например крахмала для B.subtilus. При
внесении спор в питательную среду они прорастают и возобновляют процесс ростаразмножения.
Инцистирование. Некоторые инфузории (например C. shteini) при неблагоприятных
условиях укрываются в оболочках – цистах [8]. Для стимуляции инцистирования
инфузории после выращивания подвергают охлаждению, а затем образовавшиеся цисты
собирают и прикрепляют на носитель (например картон), на котором их можно хранить
годами при комнатной температуре. При внесении цист в питательную среду из них
появляются инфузории.
2.2.7. Понятие о генной инженерии
Принцип генной инженерии. Генетическая инженерия предназначена для получения
вида организма с заданными свойствами, кодируемыми участками ДНК. Эти методы
позволяют, например, “встроить” в бактерию ген, обусловливающий ее свечение, создать
ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов. Достижения генной инженерии
связаны с изучением механизмов синтеза белка и передачи наследственной информации у
бактерий E.coli.
Общие представления о передаче наследственной информации были приведены в п. 1.2.3.
Основной механизм генетической инженерии осуществляется с помощью ферментов,
катализирующих трансформацию ДНК. Он включает [12] следующие этапы:
1) в цитоплазме синтезируется матричная РНК (носитель информации о строении
белков);
2) с помощью фермента (обратной транскриптазы) из мРНК в ядре клетки образуется
чужеродная ДНК, которая несет информацию о синтезе нового белка. К концам этой ДНК
могут прикрепляться нуклеотиды;
3) ДНК вируса или фрагмент ДНК (плазмида) (п. 1.2.3) “разрезается” ферментом
рестриктазой и к ее концам прикрепляется чужеродная ДНК, которая закрепляется
другим ферментом ДНК-лигазой;
4) вирус с чужеродной ДНК, попадая из среды в клетки бактерий, вызывает копирование
своей ДНК с новым геном уже самими клетками бактерий.
Плазмида с чужеродной ДНК попадает из среды в цитоплазму бактерии и становится
носителем новой генетической информации. За счет обмена участками с ДНК бактерий
клетка получает новый ген, который встраивается в ее ДНК. Организм с новыми
свойствами можно выращивать в ферментерах.
Существует предел получения массы белков обычными бактериями, которые гибнут
после достижения определенного числа поколений. Этого предела числа поколений от
одной клетки нет у раковых клеток. Скрещивая с ними организмы с новыми ДНК, можно
получить неограниченную массу новых белков.
Синтез белка используют для получения нужных ферментов или для передачи клеткам
бактерии гена выработки этих ферментов.
2.3. Организмы как биохимические преобразователи (БХП)
2.3.1. БПХ с подвижными организмами
Данный тип БХП [22, 53] позволяет:



использовать множество этологических реакций организмов (п. 1.4) и реакции
роста-размножения (п. 1.5), которые отражают интегральное влияние многих
факторов внешней среды на живое;
наиболее дешево и долговременно поддерживать жизнеспособность БХП;
применять в качестве БХП организмы, полученные методами генной инженерии (п.
2.2.7), что позволяет получать их с новыми, детерминированными свойствами.
Недостатком данного типа БХП является трудность оценки влияния на них отдельных
веществ в биологических или природных средах.
Для применения организмов в качестве БХП необходимо выбрать количественно
измеряемую характеристику их реакции, изменяющуюся при воздействии анализируемых
веществ.
Рост-размножение как БХП. Существует несколько разновидностей тест-реакций
данного БХП.
а) Прирост популяции. Для оценки тест-реакций размножения наиболее удобно
использовать характеристики процессов деления одноклеточных организмов.
Потребление ими субстрата S приводит к росту популяции, который обычно описывается
нелинейной кривой [5].
На ней выделяют следующие участки (рис.1):


лаг-фазу – стадию, когда организмы еще не приспособились к среде;
лог-фазу – экспоненциальный прирост концентрации С организмов
(13)
где  – удельная скорость роста;


фазу насыщения, когда сказывается влияние лимитирующих факторов среды,
например выделение продуктов метаболизма в среду;
фазу деградации – преобладание гибели над рождаемостью.
Рис. 1. Кривая роста - размножение одноклеточных организмов ( С - концетрация, t время ) [5]
При размножении микроорганизмов на жидких питательных средах увеличивается
мутность сред (п. 2.2.2). Степень мутности оценивается либо визуально (уменьшение,
сохранение прежней мутности, увеличение) в баллах, либо методами оптического
контроля (п. 3.1).
Микробиологические методы анализа в данном случае часто оказываются более
информативными, чем химические, так как позволяют определять не валовое содержание
элементов, а их физиологически активные формы. Продолжительность анализа с
использованием быстро растущих культур составляет не менее 3,5...4 ч [53].
БХП этого типа используют для выявления вредных веществ. По различию характеристик
прироста в опыте и контроле (п. 2.1) определяют предельную концентрацию вещества,
обнаруживаемую организмами ( рис. 2.). Для оценки токсичности в питательные среды с
микроорганизмами вводят не только растворы исследуемых химических веществ, но и
экстракты, извлекаемые с помощью растворителей из тканей, почв и т.п.
Рис. 2. Характеристики БХП с микроорганизмами [53]
Обнаружены виды инфузорий, позволяющие определять относительную пищевую
ценность белков – ОПЦ (п. 1.1.2). Если белок, которым питается инфузория T. Pyriformis,
содержит полный набор аминокислот, она растет быстро, если хотя бы одной
аминокислоты не хватает, то ее рост замедляется. В некоторых случаях для этой цели
применяют цистообразующие инфузории С.shteini [8].
б) Зоны подавления. Бактериальные клетки, растущие на агаризованных средах (п. 2.2.2),
образуют хорошо различимые колонии (по виду похожие на пятна плесени). Если в
питательный агар, на котором выросли колонии, добавляют антибиотик, токсикант или,
наоборот, биологический стимулятор, то возникает зона подавления роста или стимуляции
роста (уменьшение или расширение колонии). Диаметр этих зон является линейной
функцией концентрации определяемых веществ в некотором ее интервале [53].
При постоянном составе среды, оптимальных для данного организма рН и температуре
величина зон зависит от толщины питательного слоя: чем тоньше слой, тем больше зона.
Таким способом по изменению формы и размеров пятен плесени, образованных грибками
рода Aspergillus, на агаре, в который добавлен токсикант, выявляют малые концентрации
нитратов ртути (II), кадмия, таллия.
в) Химические свойства питательной среды. При размножении в водной среде дрожжи
или микроскопические грибы в процессе дыхания выделяют газы, которые изменяют
кислотность питательной среды.
Это свойство БХП используется в БСС для оценки токсичности воды и почвы. После
помещения сухих дрожжей (Sacharomyces cerevisae) в пробу воды защелачивание пробы
указывает на отсутствие в ней токсикантов [39]. При взаимодействии питательной среды с
токсикантом возникает ее закисление, что выявляется в результате измерения рН
(п. 3.2.4).
В НПО «Питательные среды» для обнаружения антибиотиков в моче разработана тестсистема, которая с помощью цветового рН-индикатора обнаруживает изменение
кислотности мочи, возникающее при размножении в ней бактерий B.subtillus. В качестве
питательной среды иcпользуется дыхательный субстрат (глюкоза). Данные бактерии
могут быть сохранены также в виде спор (п. 2.3.2). В табл. 4 указаны характеристики БХП
на основе субстратов и организмов, выделяющих газы, изменяющие pH водной среды.
Таблица 4
Характеристики бактериальных БХП [3]
Субстрат
БО
Газ
Углеводы
Организмы-аэробы
CO2
Белки, соединения азота
Бактерии-денитрификаторы
NH3
Сульфаты
Анаэробные серобактерии
H2S
Раствор
H2CO3
NH4OH
H2S
Этологические реакции организмов как БХП (п. 1.4). Можно выделить БХП данного
типа с несколькими тест-реакциями.
а) Таксисы. Для возникновения таксисов необходимо в среде создать градиент
(неоднородность распределения) химического вещества, чтобы организм мог выбрать
направление уменьшения вредного воздействия.
Существуют различные методы создания градиента:




применение камеры, разделенной на две части мембраной (камера Бойдена для
организации таксиса лейкоцитов);
нанесение капли отпугивающего вещества на студенистую среду (п. 2.2.2), на
которой растет колония микроорганизмов; вещество будет медленно
диффундировать, а бактерии уходить из этой зоны, образуя кольцо (метод
используемый для контроля активности антибиотиков). Эта реакция была
обнаружена в XIX в. Бейеринком, но стала исследоваться с 1970-х гг.;
погружение капилляра с микроорганизмами в жидкость с тестируемым веществом
и, наоборот, – капилляра с веществом в среду с микроорганизмами (используется
для оценки качества пресной и морской воды) [55];
контакт веществ с различными вязкостями [17, 29], которые можно либо
наслаивать сверху, либо вносить шприцем под слой другого вещества
(используется для оценки токсичности водных сред и активности антибиотиков,
рис. 3, 4).
Характеристиками таксиса могут быть концентрация организмов через определенное время,
которая измеряется оптическими приборами (пп. 3.1.4, 3.1.7), параметры распределения
концентрации по длине кюветы.
Среди перспективных организмов для БХП на основе таксисов можно назвать водоросль –
ряску. Она реагирует на химические вещества сразу за счет нескольких биологических
механизмов: как изменения цвета фотосинтетических пигментов (пп. 1.2.1, 2.5.4), так и
фототаксиса листьецов (маленьких листочков) – их схождения или расхождения на
поверхности воды. Это позволяет не только обнаруживать вредные вещества, но и
дифференцировать их по механизмам воздействия на живое.
б) Кинезы. Скорость движения инфузорий повышается при введении в среду их обитания
микроколичеств этанола, сахарозы, фурфурола, альдегидов, уксусной кислоты, хлоридов
кальция и аммония; при добавлении хлорида бария движение клеток, наоборот,
замедляется. Подвижность сперматозоидов крупного рогатого скота замедляется в
вытяжке полимеров, если в их составе находятся вредные вещества [15].
Рис. 3. Хемотаксис инфузорий туфелек [17]
Рис. 4. Хемотаксис бактерий,
где a - МПБ, содержащий культуру Bacillus subtilis;
b - исследуемая проба: с - кольцо бактерий;
h - высота подъема кольца бактерий в контроле и h1 в пробе с токсикантом
Для описания тест-реакций кинезов организмов в их движении выделяют прямолинейные
перемещения и «дрожание», т. е. колебания в пределах некоторой ограниченной зоны. В
зависимости от типа движений выбирается метод измерения (пп. 3.1.7, 3.1.8).
в) Движения органов. При оценке чистоты воды в качестве тест-реакции используют
некоторые физиологические показатели дафний, например, частоту сердечных
сокращений, движения их ножек. При добавлении токсиканта сначала наблюдается общее
возбуждение, переходящее в депрессию, а затем в результате нарушения деятельности
органов движения, дыхания, кровеносной и нервной систем наступают потеря
подвижности и летальный исход. Частоту как переменный сигнал удобно контролировать,
например, фотометрическим методом (п. 3.1).
г) Локомоции. В качестве тест-реакции могут использоваться локомоции (п. 1.4.1)
микроскопических червей – нематод. В разбавленных растворах токсикантов они быстро
изгибаются то в одну, то в другую сторону, совершая как бы S-образные движения. С
повышением концентрации движения становятся вялыми, замедляются [53].
Локомоции насекомых (например, жуков, комаров), описываемые скоростью и
траекторией ходьбы или полета, изменяются при воздействии малых концентраций
ядохимикатов или наркотических веществ и, следовательно, могут быть использованы в
качестве тест-реакции.
2.3.2. БХП с модифицированными организмами
Особенность БХП на основе иммобилизованных организмов (п. 2.2.6) состоит в том, что
они, помещенные в гель или в пористый материал, часто находятся в состоянии
субстратного голода.
В этом случае для уменьшения потребления энергии в клетках снижается уровень обмена
веществ, а основным путем воздействия стимула является его диффузия из внешней среды
через стенки клеток и их последующее ферментное преобразование. Поэтому реакция
БХП на основе иммобилизованных организмов более медленная, чем у подвижных клеток
в питательной среде [22].
Чувствительность иммобилизованных микроорганизмов понижена и проявляется или к
жизненно необходимым веществам, поддерживающим энергетику клетки, каталитическое
разложение которых требует минимума энергии, или к токсичным веществам,
вызывающим гибель организмов.
Основными тест-реакциями БХП являются метаболические, т. е. организм становится
живым биокатализатором для преобразования субстрата в продукт ферментативных
реакций. Поэтому иммобилизованные организмы часто используются в виде ферментного
преобразователя с увеличенным сроком действия за счет того, что организмы сохраняют
жизнеспособность дольше, чем ферменты. В прил 3. приведены продукты
ферментативных реакций, выделяемые клетками.
Способность лиофилизованных клеток достаточно быстро восстанавливать
жизнеспоособность и проявлять реакции метаболизма используется в методике
«Микротокс» (Microtox) для оценки загрязнений окружающей среды по люминесценции
бактерий (п. 2.5.1).
На биотехнологических предприятиях культивируют штаммы светящихся бактерий,
которые затем модифицируют в порошковую лиофилизованную форму. Полученный
бактериальный порошок хранят в морозильнике. При анализе этот порошок добавляют в
питательную среду. Для БХП необходимо обеспечить два температурных режима: один
для восстановления жизнеспособности бактерий, другой для протекания люминесцентной
тест-реакции [16,18].
Полученные методом криоконсервации БО применяют в БСС «Биотехническая система
для измерения индекса токсичности вытяжек полимеров» по изменениям кинезов
сперматозоидов крупного рогатого скота (п. 2.2.5). Отбор БО осуществляется из банков
станций осеменения, где они хранятся в жидком азоте. После размораживания
двигательная активность сперматозоидов восстанавливается. Их дозируют, выдерживают
в среде с вытяжкой из полимеров, а затем измеряют показатели скорости БО (п. 3.1.8).
При использовании данного вида модификации БО следует учитывать, что хотя
наибольшая их часть остается жизнеспособной, небольшая часть их может погибнуть. Это
обусловливает необходимость различения движения живых БО от движения мертвых,
переносимых в вытяжке конвекционными потоками.
Споры бацилл применяют в БСС – бактериальных тест-системах для выявления
антибиотиков (п. 2.3.1).
Цисты используют в БСС для оценки качества кормового белка (п. 2.3.1). Важным
преимуществом инцистирования инфузорий является то, что они покидают свои цисты на
одной и той же стадии развития, что улучшает воспроизводимость результатов
эксперимента [8].
2.4. Методы подготовки структур организмов
2.4.1. Выделение веществ из тканей и клеток
Чтобы выделить необходимые вещества из тканей и клеток, необходимо разрушить их
оболочки, в результате чего образуется смесь из макромолекул и органелл. При этом
требуется сохранить жизнеспособность биологических объектов [5].
Культивирование тканей. В подразд. 2.2 были рассмотрены проблемы культивирования
микроорганизмов. Ткани также выращиваются в специальных питательных средах, но их
жизнеспособность труднее поддерживать искусственно.
Некоторые клетки ткани, например лейкоциты периферической крови, приобретают
способность к делению и созданию клона вне организма при добавлении в питательную
среду белково-полисахаридного препарата ФГА.
Этот метод культивирования применяется для исследования хромосом.
Гомогенизация (с греч. «однородный»). Это метод образования однородного вещества из
тканей и клеток. В простейшем виде процесс представляет собой механическое
растирание клеток. Применяется также ультразвуковое разрушение оболочек клеток.
Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень
тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур:
митохондрий (п. 1.2.2), ядер и др., которые содержат в своем составе многие ферменты.
Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в
условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей
ферментативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии
защитных добавок и при температуре много ниже температуры денатурации (п. 1.1.2).
Осмотическое разрушение. Создается методом изменения осмотического давления,
которое возникает при диффузии солевого раствора через полупроницаемые мембраны
клетки. Если давление внутри клетки больше чем снаружи (концентрация соли во
внешней среде меньше, чем во внутренней), она распухает и взрывается, если наоборот –
сдавливается.
2.4.2. Очистка веществ
Процедура очистки включает разделение веществ (РВ) на фракции. Эти методы
необходимы для получения субклеточных структур, белков, нуклеиновых кислот. Из
смеси ферментов или белков требуется оставить только один. Задача выделения чистых
белков одна из самых сложных. Для ее решения применяется целая группа методов РВ.
РВ по растворимости. Процесс частичного разделения вещества с помощью
растворителя, в котором по-разному растворимы различные составляющие вещества,
называется экстракцией. Широко распространен метод РВ экстракцией глицерином или
спиртами, при котором сохраняются нативные, т. е. природные свойства ферментов.
РВ по устойчивости к рН и температуре. Смесь доводят до уровней pH и температур,
при которых одни органеллы и макромолекулы разлагаются, а другие сохраняют
жизнеспособность. Особенно удобно с этой точки зрения выделять из смеси белков
структуры термофильных бактерий (п. 1.1.2), которые не коагулируют при температуре
выше обычной. Это позволяет после нагрева до температуры 50…55 C легко выделить
белки только данных организмов.
РВ по плотности. Метод основан на центрифугировании (п. 2.2.6) клеточных структур.
Например, для разделения нуклеиновых кислот в их смесь добавляется хлористый цезий,
создающий при центрифугировании распределение плотности по высоте. После
окончания центрифугирования нуклеиновые кислоты в зависимости от плотности
образуют слои в пробирке, всплывшие на разную высоту. Освещая пробирку
ультрафиолетом, различные нуклеиновые кислоты выявляют за счет полосы поглощения
их азотистых оснований (п. 2.5.5).
РВ по заряду. Белки обладают зарядом (п. 1.1.2), величина и знак которого меняются в
зависимости от кислотности среды. Этот эффект лежит в основе электрофореза –
разделения белков по знаку заряда при приложении высокого постоянного напряжения к
среде с известным рН, содержащей белки. В этом случае разноименно заряженные белки
движутся к разным электрическим полюсам.
РВ по размерам молекул. При пропускании веществ через ультрафильтры с размерами
пор в десятки (сотни) мкм задерживаются более крупные, а проходят менее крупные
молекулы белков.
РВ по подвижности компонентов. На данном принципе основан метод хроматографии.
В первых хроматографах, разработанных А.Я. Данилевским, жидкое вещество
пропускалось сверху вниз через длинную трубку (колонку), заполненную пористым
сорбирующим веществом. Более подвижные компоненты из смеси проходили вниз, а
менее подвижные оставались наверху. В качестве пористого вещества часто используют
волокнистую бумагу или целлюлозу. Для выделения сорбированных белков их затем
вымывают из пористого материала веществом-растворителем (элюэнтом), не
повреждающим живое
РВ по видам ионов. Иногда в качестве хроматографического сорбента применяют
ионообменные смолы, которые позволяют задерживать вещества с определенными
ионами.
РВ белков по сродству с антигенами или антителами. Для очистки и стандартизации
антител используется аффинная (с греч. «сродство») хроматография [5, 32]. Она
основана на свойстве связывания антител антигенами (пп. 1.2.4, 2.5.6).
Антитела – это белки иммуноглобулины, вырабатывающиеся организмом в ответ на
иммунизацию организма – введение антигена (вирусов, чужеродных бактерий) в кровь,
мышцу лабораторных животных, птиц. Антитела появляются не только в крови у
животных, но и в желтках яиц, снесенных иммунизированными птицами.
Иммунный ответ на введение одного антигена сопровождается синтезом антител,
различающихся по структуре и функциям. Это иммуноглобулины (Ig) пяти классов (G, D,
E, A, M), которые связывают различное число молекул антигена. У молекулы или
бактерии существуют отдельные участки (антигенные детерминанты), которые и
вызывают образование антител.
Принцип аффинной хроматографии состоит в том, что смесь белков, например, капля
крови иммунизированного животного, в которой находятся белки-иммуноглобулины
(антитела) пропускается через колонку с полисахаридными шариками, к которым
прикреплены определенные антигены (п. 1.2.4). Они связывают из всех белков только
специфические антитела, т. е. иммуноглобулины, которые имеют наибольшее сродство к
данным антигенам. Связанные антитела затем вымывают из колонки кислым или
щелочным раствором. Один цикл аффинной хроматографии позволяет очистить белки в
1000 раз и более (выделить 1 вид белка из 1000).
Для расширения круга объектов аффинной хроматографии было изучено, какие объекты
могут являться антигенами. Оказалось, что антигенами могут быть клетки
микроорганизмов, вирусы, белки, полисахариды. Они называются полноценными, так как
вызывают выработку антител сами по себе. Были открыты неполноценные антигены
(гаптены), которые сами не вызывают появления антител, но если их осадить на белок
или биополимеры, то они становятся иммуногенными. Таким способом получают
антитела к антибиотикам, витаминам, гормонам, лекарственным препаратам. Для
выделения подобных антител их пропускают через колонку с гаптенами, осажденными на
гормонах и других веществах, превращенных в антигены.
Нуклеиновые кислоты не вызывают появления антител, однако антитела к ним
синтезируются, если они находятся в комплексе с белками. Антигенными детерминантами
нуклеиновых кислот являются их участки – три- и тетрануклеотиды.
Возможно, наоборот, осадить на сорбенте колонки антитела и выделять антибиотики,
гормоны, комплексы белков с нуклеотидами и др. антигены.
Биотехнологические методы очистки органических веществ постоянно обновляются и
модернизируются.
2.4.3. Модификация
Наиболее распространенный способ модификации субклеточных структур и веществ –
иммобилизация (п. 2.2.6).
Для защиты от вымывания часто применяют химические методы иммобилизации БО,
основанные на их «пришивании» к поверхности химическими связями. Подобными
методами производят иммобилизацию ферментов, антигенов или антител.
Немодифицированные субклеточные структуры в биотехнологии используются крайне
редко.
2.5. Биологические вещества и структуры, применяющиеся для
биохимических преобразователей
2.5.1. Ферменты
Несмотря на всю сложность получения ферментов и малый выход очищенного
ферментного белка (доли миллиграммов на грамм исходной биомассы – менее 0,1%) они
остаются наиболее распространенными БО для БХП, так как позволяют решать
аналитические задачи выделения веществ из смеси и определение их концентрации в
различных средах, тканях и органах живого. При этом следует учесть, что выделенный
чистый фермент работает иначе, чем в клетке, где он образует комплексы с ее
структурами. Поэтому его действие вне клетки не может полностью моделировать
метаболизм организма (п. 1.1.3).
Другое применение выделенных ферментов заключается в том, что они образуют
элементы алгоритма синтеза новых белков, реализуя набор операций по их сборке и
расчленению.
Ученые 70-х гг. XX в. относились к ферментам как к капризным, быстро разлагающимся
веществам, меняющим свою активность во времени. Позже чистые ферменты стали
хранить в глицерине и в смеси с белком альбумином, что увеличило продолжительность
их активности. Методы иммобилизации (пп. 2.2.6, 2.4.3) позволили существенно повысить
устойчивость ферментов. Поэтому всемирный рынок ферментов уже в 1993 г. оценивался
в сумму свыше $990 млн.
В прил. 2 приведена таблица, где указаны области применения ферментов сегодня – от
заквасок для молока и пива или осветлителей для соков до моющих средств, в которых
они выступают в качестве биодобавок.
Чувствительность и воспроизводимость реакции БХП зависит в основном от качества
гомогенизации клеток, выделения и очистки фермента (п. 2.4.2), т. е. от инфраструктуры,
которая должна обеспечивать работу БХП. Разработчик БСС при этом полагается на
поставщиков ферментов.
Ферменты можно наносить в виде простейшего БХП на бумагу, вносить в состав мембран
на гелевой или иной основе или применять в виде экстрактов [22, 46].
Применение ферментов в качестве аналитического инструмента предполагает
организацию метаболических реакций и измерение количества субстрата или продукта.
Можно выделить целую группу тест-реакций ферментных БХП.
Преобразование химических веществ. В БСС для оценки загрязнения окружающей
среды определяется активность ферментов дыхательного цикла аэробного дыхания (цикла
Кребса, п. 1.2.2):
янтарная кислота + F –––– фумаровая кислота + F,
(14)
где F – фермент сукцинатдегидрогеназа, выделяемый из митохондрий печени рыб.
Янтарная кислота в свою очередь образует с индикатором окрашенное соединение (п. 3.1),
что позволяет измерить потребление субстрата ферментативной реакции.
Активность липаз, катализирующих разложение жиров, часто определяют с помощью
простого теста, заключающегося во внесении фермента в каплю оливкового масла и
измерении скорости растекания капли за счет расщепления жиров.
Выделение газов [3]. Наиболее широкое распространение получили БСС для
определения глюкозы в крови с помощью ферментативной реакции:
глюкоза + O2 + F => глюконовая кислота + H2O2 + F,
(15)
где F – фермент глюкозоксидаза (п. 3.2.3).
Для оценки активности фермента нитрогеназы используется ее свойство преобразовывать
газ ацетилен в этилен.
Изменение кислотности. Газы, выделяемые в результате ферментативных реакций, при
пропускании через водную среду могут изменять ее кислотность (п. 2.3.1).
Выделение тепла. Многие ферментативные реакции идут с выделением тепла [3].
Некоторые типы подобных реакций были указаны в п. 1.2.2. Наиболее простой подход
использован в ферментных БХП, в которых фермент или иммобилизовали на поверхности
устройства для измерения температуры или помещали в мембрану, надетую на это
устройство.
Достоинством данных БХП было обеспечение возможности контроля тепловыделения в
течение длительного времени, а также в проточных системах. Методы измерения тепла
описаны в п. 3.4.
Электрокатализ. Некоторые ферменты проявляют активность в форме ускорения
обмена электронами между субстратом и электродом. Транспорт электронов может
происходить [7] несколькими путями:
а) за счет промежуточного низкомолекулярного переносчика электронов – медиатора,
который сначала окисляется ферментом, а затем восстанавливается на электроде;
б) за счет биоэлектрокатализа – прямого переноса электронов ферментами.
В качестве медиатора в раствор фермента добавляют вещество – переносчик электронов
(ферроцен) или белки – переносчики электронов (п. 3.2.5).
Биоэлектрокатализ был открыт в 1978 г. советскими учеными (И.В. Березин, В.А.
Богдановская, С.Д. Варфоломеев и др.). Прямой перенос электронов возникает у
ферментов: медьсодержащей оксидазы – лакказы, пероксидазы, гидрогеназы,
катализирующих соответственно окисление веществ кислородом (п. 1.2.1), распад H2O2,
присоединение групп водорода. Это свойство используется для преобразования продукта
H2O2 в электрический ток на электроде.
Многие ферменты катализируют окисление сахаров, аминокислот с выделением H2O2. В
этом случае фермент пероксидаза используется для трансформации концентрационного
сигнала в электрический:
AH2 (белок, углевод) + O2 – A + H2O2 (оксидаза),
(16)
H2O2 – H2O + 2 e– (пероксидаза).
(17)
Цепь реакций позволяет измерять концентрацию сахаров и белков, участвующих в обмене
веществ, по величине тока на электродах (п. 3.2.4, 3.2.5).
Биолюминесценция (БЛ). Способностью к БЛ обладают бактерии, грибы, моллюски,
насекомые [9, 10,16]. Механизм световых реакций у разных видов включает окисление
субстрата люциферина ферментом люциферазой (п. 1.1.3).
Выделено несколько типов ферментов FL, катализирующих реакции БЛ.
а) FL1 – люцифераза насекомых. Ее выделяют из светоизлучающих органов («лампочек»)
светляков. Реакция катализа проходит в присутствии АТФ – энергетического соединения,
необходимого для дыхания (п. 1.2.2).
АТФ при реакции преобразуется в АМФ:
люциферин+ АТФ +F 
окисленный люциферин +АМФ +фотон + F L1.
(18)
При отсутствии АТФ биолюминесценция не наблюдается. На этом принципе основан
самый чувствительный метод измерения АТФ, когда в изучаемый раствор добавляют
люциферин и люциферазу, измеряя свечение.
б) FL2 – ферменты медуз. Из этих организмов выделяется способный к свечению белок
фотопротеин. Он содержит связанный люциферин, который светится за счет окисления
ферментом в присутствии ионов Ca2+. Белок под названием экворин добавляют в
изучаемый объект и по свечению следят за динамикой свободного кальция.
в) FL3 – ферменты люминесцентных бактерий. Свечение бактерий катализируется
бактериальной люциферазой. Очищенный фермент обладает способностью к свечению
только в присутствии трех субстратов: кислорода (S1), альдегида (S2) и сложного белка
(S3), играющего важную роль в аэробном дыхании. Добавляя в раствор постоянные
концентрации двух субстратов и фермент – бактериальную люциферазу, по
возникающему свечению обнаруживают наличие и концентрацию третьего субстрата.
Если в раствор вносят S2+S3+FL3, можно определять концентрацию О2 (S1) по свечению,
интенсивность которого линейно зависит от концентрации О2 в диапазоне 10–8 – 10–6
моль/л.
Если внести в раствор S1+S3+F L3, то по возникновению люминесценции появляется
возможность определять альдегиды (S2), к которым, например, относятся половые
гормоны насекомых (ферромоны). Ими, например, самки ночных бабочек, привлекают к
себе самцов. По свечению раствора удается изучать метаболизм гормонов у одной особи
насекомого.
После внесения в раствор смеси S1+S2+FL3 образуется БХП для определения
необходимых для люминесценции сложных белков (S3). Ими являются компоненты
белков дыхательного цикла на основе витамина B2. Их концентрацию можно измерять по
интенсивности свечения.
В свою очередь сложный белок S3 образуется из биологического окисленного кофермента
дыхательного цикла (НАДН, п. 1.2.2), являющегося субcтратом S4 для ферментативных
реакций окисления с участием фермента F1 – оксидоредуктазы. Добавляя эти ферменты,
можно продолжить аналитическую цепочку, где место субстрата S3 займет S4:
S1+S2+S4  (при добавлении FL3, F1)  свечение
(19)
Биологическое окисление НАДН из исходного субстрата S5 (НАД) катализируется другим
ферментом – F2 дегидрогеназой, что позволяет измерять уже ее активность по тому же
свечению, а вместо S4 использовать S5:
S1 + S2+S5 (при добавлении FL3, F1, F2)  свечение.
(20)
При всех достоинствах подобных анализов цепочки реакций следует учитывать их
недостаток – на свечение будут влиять все нестабильности концентраций исходных
субстратов и ферментов.
В России производится набор КРАБ (комплекс реактивов для анализа биолюминесценции),
который применяется для биохимических измерений. Ферменты КРАБ выделены из
биомассы светящихся бактерий.
Приборы для измерения БЛ приведены в п. 3.1.9, а характеристики люминесцирующих БО
– в табл. 5.
Запуск и блокирование реакций. Эти тест-реакции наиболее широко используются в
ферментных тест-методах, предназначенных для обнаружения анализируемого вещества.
В основу ферментных тест-методов положено свойство ионов металлов или органических
токсикантов ингибировать (п. 1.1.3) процессы каталитического превращения веществ в
присутствии биологических катализаторов-ферментов [37]. Принцип их действия можно
рассмотреть на примере тест-полоски для определения фосфорорганических веществ [14].
Она представляет собой полоску фильтровальной бумаги, на одном из концов которой
иммобилизован фермент ацетилхолинэстераза, участвующий в проведении нервных
импульсов (п. 1.4.1). Другой конец этой полоски содержит субстрат (ацетилхолин),
скорость каталитического гидролиза которого подавляется в присутствии
фосфорорганических веществ. Вместе с субстратом наносится кислотно-основной
индикатор.
Наличие вещества-ингибитора выявляют по окраске зоны индикации тест-полоски после
того, как полоска складывается для совмещения пятен, содержащих субстрат и фермент, и
на нее, например, выжимают сок анализируемого продукта. Если продукт содержит
фосфорорганический пестицид, скорость ферментативной реакции понижается, приводя к
уменьшению количества выделившийся при этом кислоты, что вызывает изменение
окраски индикатора. По цветовой шкале на упаковке тест-полосок можно оценить
экологическую чистоту продукта питания. Аналогичная структура тест-наборов для
клинической химии [1, 14].
Таблица 5
Состав и свойства светящихся смесей некоторых организмов [16]
Положение
максимума
Груп Организм
Реагирующие
интенсивно
па
соединители
сти
излучения
(область)
I
Медуза
белок + Са++
синяя
(Aeguorera)
II
Усоногие
H2O2 + LH2 + E
голубая
рачки
(Balanoglossus
biminiensis)
III
Рыба
O2 + LH2 + E
460
(Apagon)
O2 + LH2 + E
синяя
Простейшие
(Gonyaulax)
IV
Многощетинк
овый червь
(Odontosylis)
O2 + LH2 + E
Ракообразные
(Cypridina)
Грибы
(Collibia и
Armillaria)
O2 + LH2 + E
510
460
O2 + LH2 + E+ДПН –
Н
или
ТПН – Н
V
Гриб
(Omphaly
flavida)
Морские
анютины
глазки
(Renilla
Reniformis)
O2 + LH2 + E+ ДПН
–Н
530
O2 + LH2 + E + АМФ
синяя
562
VI
Светящиеся
O2 + LH2 + E + АТФ
насекомые
Бактерии
O2 +LH2+E+ФМН–
(Ahromobacter
и другие)
О2 + ДПН – Н + Е +
+ ФМН – Н2
синяя
VII
Моллюск
фаллада
(Pholas
Dactylus)
Млекопитаю
щие
(приведены
результаты
первых
О2 + липиды
зеленая и
красная
синяя,
зеленая,
О2 + жиры или
жирные
405
исследований
)
кислоты
то же + адреналин
то же + эргостерин
то же + лецитин
красная
–
–
зеленая
зеленая
то же +
аминокислоты
LH2 – энергетический субстрат люминесцентной реакции, Е – катализатор
(люцифераза), ДПН – Н – восстановленный дифосфопириннуклеотид.
АТФ – аденозинтрифосфат, АТМ – аденозинмонофосфат, ФМН – Н2 –
восстановленный флавинмононуклеотид,
– альдегид.
Общий принцип большей части химических тест-методов заключается в использовании
ферментных реакций с так называемыми хромогенными (цветообразующими) реагентами
[38, 41]. Реакции проводят в таких условиях, чтобы можно было визуально зафиксировать
их результат. Этим результатом могут быть интенсивность окрашивания, цвет бумажной
полоски или длина окрашенной части индикаторной трубки с поглощающим веществом.
Большинство используемых тест-методов служат измерительной БСС однократного
применения.
Тест-системы являются одним из самых коммерчески выгодных товаров. Оборот фирм,
торгующих ими, составлял в 1994 г. около $100 млн.
Организация цепи тест-реакций. Метаболические ферментные процессы в организме
часто образуют цепи реакций (п. 1.1.3), которые могут использоваться в БХП как тестреакции.
Если записать формулу цепи метаболизма:
S + F1 + K + I = P1 + F1 = P2 + F1 +F2,
(21)
где S – субстрат, F1 – фермент, катализирующий реакцию образования продукта P1,
являющегося субстратом для ферментов до F2, катализирующего образование продукта
P2, K – кофактор, I – ингибитор (п. 1.1.3), то можно решать следующие задачи:





выявлять субстрат-метаболит S;
измерять активность ферментов по поглощению S или образованию P1 и P2;
выявлять кофакторы K, запускающие работу фермента;
выявлять ингибиторы I, подавляющие активность ферментов;
выявлять цепочки взаимодействия ферментов.
В качестве примера можно привести другой БХП [7] на основе ацетилхолинэстеразы (F1)
Для оценки активности этого важного фермента используется цепь реакций, приводящая к
образованию пероксида водорода:
ацетилхолин (S) + I + F1  холин(P1) + уксусная кислота.
(22)
На следующем этапе фермент F2 холиноксидаза катализирует окисление P1.
холин (P1) + O2 + F2  H2O2 (P2) + оксихолин + F2.
(23)
Образование H2О2 будет зависеть от наличия ингибитора исходного фермента.
Ингибиторами ацетилхолинэстеразы являются фосфорорганические или
хлорорганические пестициды.
2.5.2. Ткани организмов
Растительные и животные ткани содержат специфические наборы ферментов, которые
могут быть использованы как катализаторы соответствующих химических реакций [3, 33].
Каталитическими веществами богаты листья, цветки и плоды растений (структуры,
связанные с ростом, репродукцией и накоплением питательных веществ), ткани печени,
желудка, почек, слизистой оболочки животных.
Поэтому тканевые материалы успешно используют в качестве биокаталитических
компонентов БХП. Ткани создают естественное окружение для требуемого фермента, в
результате чего его активность стабилизируется. Во многих случаях тканевые БХП служат
намного дольше, чем БХП на основе чистых ферментов. Тканевые материалы сохраняют
специфичность фермента, в то время как выделенные ферменты в тех же условиях
разрушаются.
Селективность тканевых БХП иногда снижается за счет присутствия в тканях не одного, а
нескольких ферментов. Однако влияние «лишних» ферментов в каждом конкретном
случае можно исключить или значительно ослабить подбором рН, температуры среды
либо с помощью соответствующих ингибиторов, кофакторов. Наличие в ткани разных
ферментов позволяет в некоторых случаях использовать один БХП для измерения
концентрации нескольких субстратов.
Для БХП используют гомогенаты (измельченные ткани, п. 2.4.2) или срезы тканей в
питательной среде, фиксируя их в полупроницаемой пленке (например нейлоновой) на
поверхности измерительного преобразователя – ИП (разд. 3). Иногда измельченные
частицы включают в порошки, пасты, гели. В результате ферментативной реакции,
протекающей в ткани, выделяются вещества, концентрация которых определяет величину
выходного сигнала ИП, в качестве которого чаще всего используется газочувствительный
датчик (п. 3.2.4, 3.2.5). В гибридных БХП, кроме ткани, иммобилизованы еще и ферменты.
Тканевые БХП для отдельных веществ. В табл. 6 приведены примеры подобных БХП
для определения различных веществ.
Зависимость скорости образования продукта от концентрации субстрата нелинейна, если
количество фермента постоянно (п. 1.1.3). В табл. 6 приведен диапазон концентраций, при
котором сохраняется линейная зависимость между концентрацией измеряемого и
количеством выделяемого или потребляемого вещества в процессе ферментативной
реакции. Время работы БХП – это время сохранения им линейного отклика на
анализируемое вещество.
Таблица 6
Характеристика тканевых БХП [33]
Определяе Биокаталитическ Вещество: Диапазон
Время
мое
ий
концентрац анализа /
материал /
ий,
долговечно
выделение
фермент
сть БХП
вещество
–В,
Моль
потреблен
ие–П
Мочевина Мука из бобов
NH3
–
– /94 дн
канавалии
(аммиак,
мечевидной /
В)
уреаза
Кашица тычинок
NH3
–
210–5...
хризантемы /
(аммиак,
уреаза
В)
310–4
Пируват
Срез кукурузного
CO2, В
–
–
зерна /
пируватдекарбокс
илаза
Пероксид
Лист капусты
О2, В
2 ... 6 с/ –
4 10–5...
водорода
кольраби /
6  10–4
пероксидаза
Ткани корней
О2, В
3 мин / 2
2,510–5...
хрена /
мес.
–4
2,310
пероксидаза
Катехол
Срез ткани
О2 , П
3 мин / 3
2,510–5...
картофеля /
мес.
–4
2,310
полифенолоксидаза
Ткань шпината /
О2 , П
– / 18 дн
2,010–5...
катехолоксидаза
Катехолами Ткань печени
ны
крысы /
Аммоний,
В
моноаминоксидаза
Аскорбино Сок огурца /
О2 , П, вода
вая кислота
В
аскорбатоксидаза
Дофамин
Мякоть банана /
О2, П
полифенолоксидаза
810–4
–
2,510–4...
1,610–3
1,310–6...
910–5
– / 20...25
дн
Значение
определяемого
вещества
Болезни почек,
диабет, болезни
печени
отравления
фосфором,
мышьяком
Болезни
печени,
токсикозы,
травмы черепа
Контроль
действия
фармакологиче
ских
препаратов,
генетические
патологии
Вещество,
входящее в
состав
гормонов
мозгового слоя
надпочечников
(адреналина и
норадреналина)
3 ... 6 мин / Витамин
–
12 с /10 дн Вещество,
дейсвующее на
нервную
систему
Тирозин
Срез сахарной
свеклы /
тирозиназа
О2, В
– /8 дн
Аминокислота
гормонов
(инсулина и
др.)
Помимо приведенных примеров в литературе описан целый ряд биосенсоров на пероксид
водорода с применением кожуры кабачка и огурца, сенсоры на аминокислоты,
содержащие в качестве биокаталитического материала компоненты цветков растений
(кашицу тычинок хризантемы, ткани цветка магнолии, срезы пестика, ткани семян
петрушки). Тычинки, пестики, семена содержат ферменты, катализирующие
соответствующие реакции. Проведены опыты с применением в качестве БХП чешуи рыбы
для определения гормона норадреналина, ткани мочевого пузыря жабы для определения
антидиуретического гормона.
Биопотенциал нервной ткани (п. 1.3.1), измеряемой с помощью микроэлектрода,
позволяет индицировать воздействие на нее кислот, щелочей, некоторых тяжелых
металлов, фармакологических препаратов. По усилению либо угнетению
биоэлектрической активности нерва лягушки можно оценивать содержание хлорида
марганца. Высокой чувствительностью к микроэлементам обладают мозговые сосуды. На
основе метода измерения биоэлектрической импульсной активности антеннул
(рецепторов) краба были созданы БХП для обнаружения 20 аминокислот.
БХП для выделения веществ из смесей. Существенно, что с помощью тканевых БХП
возможно выделять вещество из смесей. БХП на основе тканей корней хрена позволяет по
разложению H2O2 определять концентрацию перекисей не только в водных растворах, но
и в органических растворителях. Аскорбиновую кислоту с помощью тканей растений
можно определять в смесях органических кислот, фенолов, аминокислот и глюкозы.
К недостаткам тканевых биосенсоров следует отнести трудность стандартизации БО, что
ухудшает воспроизводимость результатов анализа.
Активированная хемолюминесценция. Хемолюминесценцией называется свечение,
сопровождающее некоторые биохимические реакции. Клетки и ткани животных обычно
излучают свет в процессе жизнедеятельности, но такой слабый, что его долгое время не
удавалось обнаружить. Эффект активированной хемолюминесценции (АХЛ) заключется в
тысячекратном усилении свечения в присутствии некоторых веществ-активаторов –
физических факторов и химических веществ (п. 3.1.9).
Некоторые вещества-активаторы (кумарин и его соединения) усиливают
хемолюминисценцию, возникающую при окислении липидов (п. 1.1.2), при котором
образуются возбужденные молекулы. Активатор свечения люминол усиливает свечение
тканей в присутствии атомарного кислорода и радикалов OH–. Поэтому диагностика с
применением АХЛ связана с реакциями, приводящими к их образованию.
Атомарный кислород возникает при разложении пероксида водорода (H2O2 = H2O + O) в
присутствии металлов переменной валентности и гемсодержащих (железосодержащих)
веществ. В отличие от O2 атомарный кислород обладает значительно большей химической
активностью.
У больных инфарктом миокарда в моче могут появляться небольшие концентрации
гемсодрежащего белка – миоглобина, которые усиливают свечение люминола в
присутствии Н2О2 . Активные формы кислорода возникают при заживлении ран (п. 1.2.4),
что позволяет контролировать эти процессы по проявлению эффекта АХЛ. Клетки крови
выделяют активные формы кислорода при действии кратковременных электрических
импульсов или при добавлении к лейкоцитам суспензии бактерий, которые они
воспринимают как чужеродных агентов. Такой же эффект возникает при добавлении к
клеткам крови кристаллов кварца, сульфата бария и других химических веществ,
получивших название стимулов АХЛ. Способность клеток крови вырабатывать активные
формы кислорода отражает общую сопротивляемость организма.
2.5.3. Фотосинтезирующие пигменты
В тканях организмов-фотоавтотрофов (п. 1.2.1) содержатся пигменты, поглощающие
солнечное излучение и преобразующие его в химическую энергию. Фотосинтезирующие
пигменты делятся на две группы – хлорофиллы и каротиноиды. Они различаются по
строению и оптическим свойствам.
В БСС используются фотосинтетические пигменты, включенные в ткань листа, а также
находящиеся во взвеси микроводорослей, в осажденном после центрифугирования слое
водорослей, в гомогенате (измельченной ткани) листьев.
Можно выделить несколько тест-реакций пигментов.
а) Поглощение. Хлорофиллы поглощают главным образом красный и сине-фиолетовый
свет, отражая зеленый свет, что придает растениям зеленую окраску (рис. 5). При
загрязнении среды хлорофиллы распадаются первыми, при этом возникает явление
хлороза – пожелтение части растительной ткани.
Каротиноиды – желтые, оранжевые, красные и коричневые пигменты. Они имеют три
максимума поглощения в сине-фиолетовой области спектра (рис. 5,а). Каротиноиды
обычно не видны на фоне хлорофиллов, но обнаруживаются при их распаде. При полном
подавлении фотосинтеза вредными веществами возникает явление некроза (отмирания
ткани растений).
Рис. 5. а) спектры поглощения хлорофиллов a и b и каротиноимдов
б) кривая замедленного послесвечения (ЗПС) хлорофилла - 
б) Поглощение и рассеяние возникают за счет того, что пигменты включены в состав
хлоропластов, образующих рассеивающие и поглощающие частицы ткани листа.
в) Флуоресценция. Пигменты характеризуются спектром возбуждения – зависимостью
интенсивности флуоресценции (кратковременной люминесценции) пигментов от длины
волны в результате их возбуждения источниками излучения [43].
Например, при освещении хлорофиллов кратковременным, мощным импульсом синефиолетовых длин волн возникает эффект испускания пигментами излучения красных длин
волн. Интенсивность свечения за время, много меньшее мс, достигает пика, затем быстро
(за десятки мс) уменьшается в тысячи раз, после этого медленно спадает до нуля в течение
нескольких секунд (рис. 5,б). Вещества, подавляющие фотосинтез (п. 1.2.1), уменьшают
амплитуду быстрой составляющей послесвечения.
Измерение спектров поглощения и послесвечения позволяет определять концентрацию
пигментов для оценки степени загрязнения среды.
Спектр поглощения гомогената листьев или взвеси водорослей измеряют с помощью
спектрофотометра (п. 3.1.3). Поверхность ткани с поглощающими частицами пигментов
анализируется методами измерения отраженного потока (п. 3.1.5). Послесвечение
пигментов обычно исследуют путем нанесения однородного слоя носителей пигментов на
поверхность вещества, не обладающего свойством люминесценции (3.1.9).
2.5.4. Носители генетической информации
Свойства хромосом, используемые в БХП. Согласно международной классификации
хромосом человека они нумеруются попарно по мере уменьшения их длины от 1 до 22-й.
Их классифицируют по морфологическим признакам: форме, величине, положению
связки (центромеры) и по расположению локусов, окрашенных разными видами
красителей, в том числе флуоресцентными.
При рассмотрении структурной изменчивости хромосом под действием вредных факторов
выделяют три основных вида нарушений: разрывы хромосом, ведущие к образованию
фрагментов (делеций), перестановки локусов внутри хромосом и обмен локусами между
разными хромосомами. Последние два вида перестройки хромосом называются
аберрациями.
Исследование делеций и аберраций хромосом широко используется для оценки
мутагенности загрязнений окружающей среды, воздействующих на живое в течение
времени, за которое сменилось несколько десятков поколений клеток у животных или
растений.
Клетки лейкоцитов возможно получать лабораторным методом (п. 2.4.1), поэтому в 1971
г. Международная организация здравоохранения при ЮНЕСКО рекомендовала для
анализа мутагенных эффектов загрязнителей (в том числе сельскохозяйственных ядов)
метод изучения структурных мутаций хромосом с помощью клонов лейкоцитов.
Свойства ДНК, применяемые в БХП [3, 13]. Двойная цепь нуклеотидов, не свернутая в
трехмерную структуру, позволяет наблюдать и контролировать следующие тест-реакции:



поляризацию света оптически активным веществом ДНК;
поглощение излучения в ультрафиолетовой области за счет азотистых оснований
ДНК (хромофор, п. 1.2.3);
поглощение излучения в других областях спектра при взаимодейсвии с
различными химическими веществами, которые присоединяются к ДНК всегда в



фиксированном месте цепи, при этом поглощение будет пропорционально
концентрации вещества;
комплементарность, т. е. объединение цепей нуклеотидов ДНК;
удлинение и укорочение цепи ДНК при воздействии некоторых ферментов
мутагенных веществ;
образование множеством молекул ДНК структуры жидкого кристалла (п. 3.1.10).
Гибридизация, ДНК-зонды. Новая ДНК может возникать в результате обмена
фрагментами ДНК или их соединения. Этот процесс называется гибридизацией ДНК. Для
выявления наследственных болезней используют ДНК-зонды, т. е. ДНК, копирующие
участки генов. Их получают из мРНК (п. 2.2.7). Необходимые фрагменты помечают
изотопом. Если болезнь обусловлена отсутствием гена, то эффект гибридизации ДНК
пациента с ДНК-зондом понижается, т. е. не возникает эффекта его прикрепления. Так
диагносцируют наследственные мутации (отсутствие необходимых участков генов).
Из цепочек нуклеотидов путем ферментных перестроек возможно создавать геномные
последовательности для диагностических и терапевтических целей [11, 40].
Например, разработана искусственная нуклеиновая кислота (НК), соответствующая
области генома вируса гепатита С [11]. Искусственную НК помещают в условия,
способствующие ее скрещиванию (гибридизации) с геномом вируса гепатита С.
Обнаружение продукта гибридизации является показателем наличия генотипа вируса
гепатита С. Это способ создания вакцины и антител против вируса гепатита С.
2.5.5. Комплекс антиген-антитело
Свойства комплекса антиген-антитело. Образование комплекса антиген-антитело в
процессе преципитации (пп. 1.2.4, 2.4.2) изменяет физико-химические свойства исходных
белковых молекул.
При формировании БХП можно использовать следующие тест-реакции [32, 33] комплекса
антиген-антитело:





образование крупных клеточных агрегатов, если антиген расположен на
поверхности клеток (антитела «склеивают» клетки, и они оседают на дно);
образование отчетливых линий в густеющем геле (п. 2.2.6) с клеткамиантитигенами после того, как туда добавляют антитела за счет возникновения
клеточных агрегатов;
увеличение силы тяжести, действующей на поверхность, если на ней
иммобилизованы антитела, а клетки с антигенами находятся в питательной среде
(образование комплекса приводит к выпадению осадка), что используется в
гравиметрических датчиках (п. 3.3);
изменение электрических свойств (емкости) антигена и антитела при образовании
комплекса, суммарная емкость которого уменьшается за счет последовательного
соединения емкостей исходных биообъектов (п. 3.2.1);
изменение оптических и электрических характеристик приповерхностного слоя
электрических проводников при осаждении на них комплекса (п. 3.1.6).
Воздействие комплекса антиген-антитело на нервные клетки. Подобный комплекс
может воздействовать на проводимость нервных клеток (п. 1.3.1). Если рецепторный
белок (G-белок, п. 1.3.2) нервной клетки является антигеном для антител, то его
связывание в комплекс приводит к возникновению электрофизиологических эффектов:
уменьшению потенциала действия и изменению его полярности.
Перспективным направлением является создание БХП с использованием мембран
нервных клеток, в которые встроены антитела. Тогда образование комплекса антигенантитело изменяет электрический потенциал мембраны.
2.5.6. Комплекс антиген–антитело–фермент
В иммуно-ферментном анализе (ИФА) [21, 32] реакция фермента с субстратом
используется в качестве индикатора наличия антител к определенным антигенам
(пп. 1.2.4, 2.5.5). Реакцию субстрат-фермент используют для обнаружения комплексов
антиген-антитело вместо прежнего, радиоактивного метода, при котором антитела метили
изотопами.
Гетерогенный ИФА. Данный анализ включает подготовку веществ и материалов и
проведение собственно анализа.
Подготовительные этапы ИФА:
1) культивирование, очистка (п. 2.4.2) антигена Aг, например вирусного белка, который
должен иметь сродство не менее чем к двум классам антител;
2) иммобилизация антигена (обычно химическим путем, (п. 2.4.3) на дно и стенки
прозрачной ячейки Аг;
3) культивирование, очистка антител (Аг) – Aт;
4) культивирование носителей ферментов, выделение из них ферментов и очистка
(получение энзимов E);
5) прикрепление к анителам фермента-энзима в качестве метки (Ат+ E).
Для реализации последнего этапа необходимо подобрать фермент, который длительно
сохраняет свою активность, не теряет ее при связывании с анителом (или антигеном),
обладает высокой избирательностью к субстрату, катализирует реакцию с изменением
цвета субстрата.
Например: пероксидаза хрена (F) катализирует реакцию:
AH2 + H2O2 + F —— A + H2O + F
(24)
В качестве AH2 подбирается соединение, которое в пероксидазной реакции превращается
в окрашенную форму с максимумом оптического поглощения при длине волны 414 нм.
«Прикрепление» фермента к антителу осуществляется разными способами:



разъединением белковых антител ферментами нуклеазами (катализирующими
разложение молекул белка на компоненты) и соединением реакционно-способных
частей антител с ферментом;
связыванием антитела с промежуточным ферментным белком Ат–Б, а основного
фермента – с его ингибитором ИБ –E (п. 2.5.1), в результате чего ингибитор
соединяет цепь Ат–Б ИБ –E = Ат + E;
методами генной инженерии (п. 2.2.7).
На подготовительных этапах создают диагностикумы – наборы иммунохимических
реагентов для определения антигенов (или антител) и полистироловые многолуночные
планшеты, на которые нанесены антигены определенных вирусных или инфекционных
заболеваний.
Этапы выполнения гетерогенного ИФА:
1) взятие у пациента пробы крови для анализа на наличие антител
(АтП);
2) одновременное добавление в ячейку планшета с иммобилизованными на ее
поверхности антигенами раствора «меченых» антител и пробы крови пациента;
3) связывание антигенов с антителами «мечеными» энзимами
(Аг +Ат+ Е)
или антителами из пробы крови пациента
(Аг+ АтП);
4) отмывание ячейки от крови;
5) образование в ячейке прикрепленного к поверхности комплекса антиген-антитело,
меченого энзимом* (при связывании антигенов с антителами растворов диагностикума)
*(Аг + Ат + Е)
и не меченого (при связывании антигенов с антителами пробы),
(Аг+ АтП)
и добавление в ячейку субстрата (S) ферментативной реакции:
*(Аг + Ат + Е) + S = *(Аг + Ат + P) + E,
(25)
(Аг+ АтП) + S;
6) образование продукта ферментативной реакции, который полностью заполняет дно
ячейки, если в пробе не было антител
PPPPPPPPPP
или не полностью, если антитела в пробе крови были
PP P P
P P P;
7) отмывание ячейки от субстрата, антител и антигенов, фиксация слоя продукта на
дне ячейки в виде тонкого окрашенного слоя, поглощающего излучение источника света;
8) измерение прозрачности (оптической плотности слоя) специализированным
вертикальным фотометром – денситометром (п. 3.1.1).
Осаждая на поверхности планшета антитела и используя помеченные ферментом
антигены, аналогично можно обнаруживать антигены в пробе.
Гетерогенный ИФА называется сэндвич-метод (пластиковая подложка, антиген, антитело
с ферментом образуют своего рода «бутерброд»). В англоязычной литературе подобный
вид ИФА именуется ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) – реакция фермента,
связанного с иммуносорбентом.
Гомогенный ИФА. В нем используются антитела Ат и антигены, меченные ферментом
Аг+E. При образовании комплекса антигенантитело фермент инактивируется. Потеря
активности может быть связана с изменением активного центра фермента или с тем, что
антитело закрыло доступ к субстрату. Когда же появляются свободные антигены, то они,
конкурируя за антитела, восстанавливают активность фермента.
Иногда используют ферменты, катализирующие биолюминесценцию (п. 2.5.1), что
позволяет выявить наличие антител пациента по уменьшению свечения лунок планшета.
Ограничения ИФА. Возможности увеличения чувствительности ИФА ограничиваются
фоном анализируемого соединения, т. е. наличием его не только в анализируемом
образце, но и в используемых реактивах и растворителях. К ограничениям ИФА относится
также наличие в тестируемых образцах кофакторов, ингибиторов и стимуляторов
активности ферментов. Еще один недостаток — ИФА не позволяет различать нативные
белки и их биологически неактивные фрагменты, сохранившие антигенные детерминанты.
Ограничением ИФА является его применимость лишь к хорошо изученным системам, где
есть очищенные антигены и высокоспецифические антитела.
Чувствительность ИФА. Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа,
возможностью одновременного тестирования большого количества образцов, наличие
различных диагностикумов являются неоспоримыми достоинствами ИФА. Поэтому ИФА
находит широкое применение в здравоохранении, различных областях сельского
хозяйства, в экологии.
Реагенты для проведения ИФА сегодня стали коммерческими продуктами и могут быть
приобретены по каталогам известных фирм.
Применение ИФА. Любое заболевание можно быстро и точно диагностировать путем
идентификации возбудителя, его отдельных антигенных компонентов, антител к этим
компонентам или веществ, не свойственных здоровому организму и синтезируемых при
его патологических состояниях.
Диспансеризация населения, эпидемиологические обследования, выявление отравлений,
наличия наркотиков в крови, определение содержания лекарственных соединений в
тканях, вирусные заболевания растений, определение антибиотиков, витаминов и других
биологически активных соединений при отборе активных штаммов-продуцентов в
промышленной биотехнологии, контроль за качеством медицинских препаратов из
донорской крови на отсутствие вирусов-возбудителей СПИДа и гепатита В – это лишь
небольшой перечень практического применения ИФА. Современные фундаментальные
исследования в биохимии, клеточной физиологии и иммунологии, микробиологии,
вирусологии, онкологии трудно представить без ИФА.
Если протестировать пробу крови к набору антигенов, можно выявить Аг, к которым у
человека не вырабатывается Ат, и получить своеобразный «паспорт» защитной системы
организма, называемый «иммунным статусом». Его изменение у находящихся долгое
время в загрязненной среде людей и животных может стать объективным показателем
ослабления организма.
3. Измерительные преобразователи биосенсорных
систем.
При формировании БСС используются самые различные типы физико-химических
преобразователей – оптические, электрохимические, гравиметрические,
микроаналитические, механические.
Применение измерительных преобразователей (ИП) зависит от того, какие свойства БХП
изменяются при воздействии на них веществ или физических полей.
3.1. Оптические
3.1.1. Денситометрические
Денситометры измеряют оптическую плотность среды:
D = –lg(Фпр/Ф0),
(26)
где Ф0 и ФПР – падающие на среду и прошедшие через нее потоки.
Оптическая плотность определяется свойством вещества поглощать или рассеивать
излучение. Например, в случае образования окрашенного соединения в результате
ферментативной реакции.
Примером использования денситометрического ИП в сочетании с БХП антиген–антитело–
фермент (п. 2.5.6) является фотометр для иммуноферментного анализа ELISA [21]. Это
БСС, измеряющая малые значения ослабления проходящего потока. Обычно из спектра
мощного источника излучения (галогенной лампы) с помощью светофильтра выделяется
необходимый диапазон длин волн. Поток, прошедший через светофильтр, распределяется
с помощью световодов по восьми каналам измерительных фотометров. На выходе
световодов линзы формируют тонкий вертикальный луч, проходящий через лунки
планшета на фотоприемники. Измеренная оптическая плотность ячеек планшета зависит
от наличия антител в тестируемой пробе крови. Более подробное описание работы данной
БСС приведено в разд. 4.
3.1.2. Колориметрические
Колориметры – приборы, измеряющие концентрацию C оптически однородного вещества
по оптической плотности D окрашенного раствора.
Для этого в среду с БХП добавляют химическое вещество, которое, соединяясь с
субстратом или продуктом БХП, образует равномерно окрашенный раствор. Его
оптическая плотность, согласно закону Бэра:
D = C  b,
(27)
где  – коэффициент экстинкции (удельного пропускания) окрашенного раствора
(постоянная величина), b – толщина слоя раствора.
ИП этого типа применяют в БСС для оценки переработки углерода, в котором в качестве
БХП используются ферменты аэробных бактерий (п. 1.2.2), перерабатывающие
соединения углерода с выделением продукта СО2. Индикатор на основе раствора Ba(OH)2
образует с продуктом БХП цветной раствор соли.
В БСС для оценки активности биологического окисления аналогичный ИП используется с
другим БХП на основе фермента сукцинатдегидрогеназы, выделенного из митохондрий
разрушенных и гомогенизированных клеток печени (п. 1.2.2). Фермент катализирует
реакцию преобразования субстрата (янтарной кислоты) в продукт (фумаровую кислоту).
Индикатор на основе хлорфенольного соединения образует с субстратом цветную
растворимую соль, оптическая плотность которой уменьшается по мере разложения
субстрата.
3.1.3. Спектрофотометрические
Спектрофометры состоят из: источника излучения с широким диапазоном длин волн;
монохроматора с призмой, разлагающей излучение в спектр, из которого выделяется
необходимый участок с помощью регулируемой щели; фотоприемника, измеряющего
прошедший через щель поток в диапазоне длин волн .
Спектрофотометры позволяют обнаружить вещество по спектру поглощения, а также
идентифицировать штаммы бактерий по различию их спектров поглощения в
инфракрасной области длин волн, или нуклеиновые кислоты по спектру поглощения в
ультрафиолетовом диапазоне.
Эти ИП применяют в БСС для оценки воздействия загрязнений воды на фотосинтез (п.
1.2.1). В этом случае используется БХП на основе фотосинтезирующего пигмента
(хлорофилла-а), выделенного из тканей растений (п. 2.5.3). С помощью ИП измеряют
спектр поглощения пигментом видимого света [43].
ИП могут также применяться в БСС для оценки метаболизма (п. 1.1.3) с БХП на основе
ферментов (п. 2.5.1), когда различны спектры поглощения субстрата и продукта
ферментативной реакции.
3.1.4. Турбидиметрические и нефелометрические
БО в питательной среде при падении на них светового потока создают эффект рассеяния.
При прохождении через мутную среду с большой концентрацией БО световой поток
ослабляется. Чем более мутная среда (т. е. чем больше концентрация в ней БО), тем
меньше проходящий через нее поток излучения.
Рассеяние излучения БО зависит [23, 54] от следующих факторов:




соотношения радиуса а и длины волны  падающего на них излучения, т. е. от
коэффициента дифракции 0 =2a/;
площади оптического сечения SБО, пропорциональной a2
сотношения показателей преломления частицы nБО и среды nс (mБО= nБО/nс);
концентрации СБО в единице объема.
Концентрацию БО, образующих мутный слой толщиной b и ослабляющий излучение,
измеряют турбидиметрами (от лат. «турбид» – мутность). Полезный сигнал
турбидиметра пропорционален exp(– CSБО b).
Если БО не создают мутного слоя, то их концентрацию измеряют нефелометрами ( от
лат. «нефело» – облако), улавливая рассеянный ими поток под углом к падающему
излучению. При условии, что mБО  1, а плотность частиц в объеме невелика, полезный
сигнал нефелометра пропорционален kC, где k – константа прибора.
При увеличении размеров БО меняется распределение интенсивности рассеянного света
под разными углами. Вперед рассеивается больше, чем назад. Этот эффект позволяет
изучать изменение морфологии БО (размеров, формы).
Турбидиметры используют в БСС, разработанных фирмами «Abbott» и «ROSHE» для
контроля активности антибиотиков с БХП на основе роста-размножения бактерий.
Нефелометры для аналогичных целей с измерением разности рассеянных потоков на
малых и средних углах были разработаны фирмой «Science spectrum» [18].
3.1.5. Рефлектометрические
Метод рефлектометрии основан на измерении потока излучения, отраженного от
поверхности БО. Если эта поверхность одновременно рассеивает и поглощает излучение,
то отраженный поток будет отбрасываться в разные стороны. Чтобы собрать это
излучение, измерения проводят в шаре с отражающими шероховатыми стенками. Тогда
фотоприемник внутри шара будет улавливать рассеянный поток, интенсивность которого
определяется как
J = Ф0(БО /S)[1/(1 – ст)]
(28)
где Ф0 – поток, падающий на БО, S – площадь шара, БО, ст – коэффициенты отражения
БО и стенки соответственно.
В свою очередь коэффициент отражения рассеянного света определяется по эмпирической
формуле Кубелки-Мунка-Гуревича:
(1 – БО)2/ 2БО =  /,
(29)
где  – коэффициент поглощения слоя вещества,  – показатель рассеяния слоя. Более
подробно ИП описан в работах проф. А.П. Иванова.
Данный ИП используется в БСС для оценки загрязнений окружающей среды с БХП на
основе фотосинтезирующих пигментов, находящихся в тканях листьев. Для этой цели в
фотометрический шар помещают стопку листьев и измеряют отраженный поток. Листья
перекладывают в случайном порядке N раз, в результате получают множество величин
Фотр1 … ФотрN, характеризующих распределение фотосинтезирующих пигментов.
Подобный вид приборов начинает разрабатывать фирма «ЛОМО» (С-Петербург).
3.1.6. Рефрактометрические
Рефрактометры – приборы для измерения показателя преломления (ПП) среды. Методы
измерения, применяемые в БСС, получили общее название ИП нарушения полного
внутреннего отражения (НПВО). Этот эффект возникает как в оптических волокнах, так
и в призмах при падении света под углом.
Волоконно-оптические ИП. Основаны на нарушении прохождения светового потока
через оптическое волокно, изогнутое в форме петли. Эффект НПВО возникает, когда ПП
среды nс, окружающей стеклянное волокно, будет больше ПП этого волокна nв.
Уменьшение потока Ф за счет НПВО, обусловленного выходом части излучения в
оболочку:
Ф= k (nс – nв),
(30)
где k – коэффициент пропорциональности.
Данный ИП может применяться в БСС для оценки метаболизма с БХП на основе
ферментов, если ПП субстрата меньше ПП стекла, а ПП продукта, образованного в
результате ферментативной реакции, всего на 10–7 больше ПП стекла.
НПВО происходит, когда среда непосредственно контактирует с материалом оптической
нити. Поэтому эффект НПВО возникает также при осаждении на волоконную нить слоя
биомолекул (рис. 6), что позволяет контролировать реакции образования биологических
комплексов [69].
Волоконно-оптические ИК ИП. Полезным эффектом НПВО, связанным с применением
волоконной оптики в БСС, является выход излучения из световода в среду, поглощающую
инфракрасное излучение. Тогда оптическая плотность волоконного ИП:
D = вL + f (ИК с),
(31)
Рис. 6. Биосенсор на основе оптического волокна [3]
Рис. 7. Возбуждение излучательных плазмонов методом НПВО в призме Кречмана: угол падения света; n1, n2, 3 - показатели преломления призмы, слоя металла и
исследуемого образца соответственно [3]
Рис. 8. Схема образования комплексов биомолекул в измерителях поверхностного
плазмонного резонанса [59]
где L – длина световода, в – коэффициент поглощения волокна, ИК с – коэффициент
поглощения среды в ИК области излучения. Через волокно подается излучение различных
длин волн ИК-спектра. Учитывая, что многие микроорганизмы обладают специфичными
ИК-спектрами, волоконная ИК-спектроскопия может использоваться для выявления
изменений свойств биологических объектов.
Поверхностный плазмонный резонанс [3, 25, 56, 59, 60]. Эффект НПВО в треугольной
призме при падении инфракрасного излучения на ее основание проявляется, если оно
покрыто тонкой пленкой металла или полупроводника, на которой возникают плазмоны –
квантовые колебания поверхностных зарядов.
Их влияние приводит к тому, что интенсивность отраженного излучения спектра при
определенном угле падения резко падает. Значение данного угла зависит от ПП
приповерхностного слоя (рис. 7). Положение минимума отраженного потока смещается
даже при изменении ПП слоя всего на 10–10.
Эти сверхмалые изменения отражают, например, образование комплекса антигенантитело (п. 2.5.5) или трансформацию комплексов биомолекул на поверхности тонкой
пленки золота. Подобный метод (surface plasmon resonance) был разработан в 1970-е гг.
Лидбергом для выявления способности биологических организмов к образованию
комплексов.
На основе этого метода для иммуноанализа шведской фирмой Pharmacia Biosensor AB
создана [25,59] БСС «BIACORE» (рис. 8), а фирмой Аffinity Sensor для аналогичных целей
– БСС «IASys» [60] с БХП на основе реакции антиген–антитело.
Это фотометрические БСС либо с проточной подачей антител (BIACORE), либо с
нанесенными антителами на стенку стандартной кюветы (IASys). В них предусмотрена
система подготовки поверхностей пластинок для иммобилизации антител, антигенов,
микроорганизмов и клеток. В БСС входят системы перемешивания сред и
термостатирования кювет и проточных ячеек.
3.1.7. Флуктуационные
Пусть БО образуют равномерную концентрацию С в среде и движутся в ней, случайно
меняя направление. Если с помощью сфокусированного источника излучения
сформировать тонкий луч, улавливаемый фотоприемником, то каждое пересечение луча
БО, будет создавать флуктуацию оптического потока, которую можно полагать
случайным событием, а множество событий – случайным потоком с интенсивностью .
Среднее число mT таких пересечений БО за время
mT = T = kC,
(32)
где k – коэффициент, зависящий от вида БО и параметров просвечиваемого слоя.
Приемник преобразует изменения БО светового потока в амплитуду импульсов. На их
величину влияет поглощение излучения слоем БО с концентрацией С. Поэтому за время T
среднее значение случайного сигнала
Um(T) = КС exp(–C),
(33)
где коэффициент К зависит от параметров ИП и времени усреднения T, а =SБО b,
поскольку характер экспоненциальной зависимости такой же, как и при измерении
полезного сигнала турбидиметра (п. 3.1.4).
Многие плавающие инфузории обладают локомоциями (п. 1.4.1), характеризующимися
прямолинейными перемещениями со случайным изменением направления (п. 2.3.1).
Размеры инфузорий довольно велики (0,1 мм), поэтому «на просвет» можно обнаруживать
флуктуации от единичных подвижных инфузорий.
Данный метод применен [17] в БСС типа «БИОТЕСТЕР» для оценки токсичности водных
сред с БХП на основе хемотаксиса инфузорий P.caudatum (п. 2.3.1).
3.1.8. Флуктуационно-корреляционные
N движущихся БО, находящихся в лазерном луче, рассеивают свет, создавая случайные
флуктуации не только интенсивности излучения, но и его частоты (за счет эффекта
Доплера). Множество флуктуаций интенсивности, измеряемых с помощью
фотоприемника, образует случайный процесс I(t) .
На него влияют два источника флуктуаций: 1) пересечение БО луча лазера; 2)
перемещение БО внутри луча на расстояние, сравнимое с длиной волны лазера. Эти
факторы обусловливают [44]появление двух частотных компонент спектральной
плотности S() [44] случайного процесса:
S () = S1 () + S2 ().
(34)
Подвижность быстрых БО с небольшими концентрациями в объеме, например
сперматозоидов, анализируют по первой ее компонент
S1 ()= f (, v1, N ),
(35)
где N – изменение числа БО в объеме; v1 – множество скоростей поступательного
движения БО на расстояние, большее диаметра луча.
Подвижность малых БО с большой концентрацией и небольшими скоростями (например
бактерий с количеством 107 в объеме) исследуют с помощью второй компоненты
спектральной плотности:
S2 () = f (, v2, Q),
(36)
где v2 – множество скоростей смещения частиц на расстояние, большее длины волны
лазера; Q – коэффициент, характеризующий плотность размещения БО в объеме.
Подобный ИП применен [15] в разработанной во ВНИИМП (Москва) БСС для измерения
коэффициента токсичности вытяжек полимеров с БХП на основе локомоций
сперматозоидов крупного рогатого скота (п. 2.3.2).
Лазерный зонд с длиной волны 0,6328 мкм создает пучок излучения диаметром 25 мкм. В
результате подсчета числа флуктуаций за 10...60 с измеряется показатель подвижники
Мп = ACv1,
(37)
где С – концентрация подвижных клеток; А – коэффициент, зависящий от конструктивных
особенностей прибора и вида биообъекта.
3.1.9. Биолюминометрические
Применение в БХП биолюминесценции и активированной хемилюминесценции
рассмотрено в пп. 2.3.2, 2.5.1, 2.5.2. В данном подразделе речь идет лишь о физических
основах и средствах измерения люминесценции.
Энергия возбужденного атома (молекулы) может принимать лишь определенный и
характерный для данного атома дискретный ряд значений. При переходе с более высокого
энергетического уровня QM на более низкий QN атом (молекула) излучает квант с длиной
волны MN:
QM – QN = hc/MN,
(38)
где h – постоянная Планка = 6,626·10–34 Дж·с; с – скорость света = 3 ·108 м/c.
Если люминесценция возникает за счет поглощения атомами излучения, то количественно
ее характеризуют
энергетическим выходом:
эн = Фл/Фв,
(39)
где Фв – возбуждающий поток, Фл – поток люминесценции,
или квантовым выходом:
кв = Nл /Nв,
(40)
где Nл – число квантов люминесценции, Nв – число квантов возбуждающего излучения.
Спектр люминесценции не зависит от длины волны возбуждения, поэтому он
характеризует исследуемое вещество. Кратковременная люминесценция называется
флуоресценцией, долговременная – фосфоресценцией.
Сверхслабая люминесценция БО может усиливаться в присутствии физических или
химических веществ-активаторов. Химические активаторы вступают в реакции с
органическим веществом, способствуя образованию новых возбужденных молекул,
испускающих излучение. Физические активаторы увеличивают величину квантового
выхода возбужденной молекулы с сотых долей процентов до единиц процентов и более.
Интенсивность активированной хемилюминесценции:
Iхл = vхлмвкв л,
(41)
где vхл – скорость протекания химической реакции, мв – вероятность образования
молекулы в возбужденном состоянии, кв л – квантовый выход люминесценции.
Процесс замедленной флуоресценции пигментов фотосинтеза (п. 2.5.3) под действием
возбуждающего излучения описывается как сумма экспонент:
Ф(h) = А exp(–a1) + В exp(– b2),
(42)
где А, В, – амплитуды «быстрой» и «медленной» экспонент; 1, 2 – их постоянные
времени (1 = 10...50 мс, 2 = 1500...2500 мс), a и b – коэффициенты, зависящие от вида
пигментов [43].
ИП для контроля хемолюминесценции не требует возбуждения БО потоком энергии. Для
выделения длины волны люминесценции световой поток, излучаемый БО, пропускают
через светофильтр и измеряют чувствительными фотоприемниками малых потоков
(вакуумными фотоэлектронными умножителями, полупроводниковыми фотодиодами).
ИП для контроля фотолюминесценции включает источник возбуждающего излучения,
БО, светофильтр для пропускания люминесценции и фотоприемник. Под действием
возбуждающего излучения возникает свечение БО, которое выделяется светофильтром и
измеряется фотоприемником.
ИП для контроля замедленной флуоресценции включает: источник освещения с короткими
длинами волн; систему оптических затворов; блок для помещения БО; чувствительный
фотоприемник, улавливающий излучение в красной области спектра. БО возбуждается
источником освещения, поток которого отсекается затвором, после чего измеряется
свечение БО.
Следует учитывать, что помимо БО люминесценцией обладают многие вещества: стекло,
бумага, картон, текстолит, пластмассы, дерево и др., поэтому при измерениях следует
учитывать эффект фоновой люминесценции от вспомогательных материалов.
На основе люминесцентного ИП разработаны различные БСС медицинского и
экологического назначения.
а) Оптоды. Современные биотехнологии позволяют иммобилизовывать фермент с
активатором люминесценции на одном торце волоконно-оптического световода и
измерять свечение фотоприемником, присоединенным к другому торцу. Такие БСС с БХП
на основе ферментов получили название оптодов. Первые ферментные оптоды были
разработаны еще в 1975 г. для измерения O2 как фактора, вызывающего
биолюминесценцию люциферина (п. 2.5.1). В настоящее время созданы оптоды для
обнаружения, помимо О2, ботулиновых токсинов в пище, кофакторов ферментов (НАДФ,
п. 1.2.2), аминокислот, глюкозы, ионов тяжелых металлов, антител, производных бензина
[26, 61, 69].
б) Приборы для оценки токсичности воды и почвы. Фирмами Beckman и Microbics на базе
люминесцентного ИП спроектирована БСС «Microtox», в которой для оценки загрязнения
воды применен БХП со светящимися морскими бактериями. Их люминесценция
подавляется токсичными веществами.
В Германии фирмами Carl Ceiss и «DrLANGE» разработана близкая по принципу действия
БСС «LUMIStox» для контроля загрязнения почв с БХП на основе люминесцентных
морских бактерий.
В России для экологических целей на базе люминесцентного ИП были выпущены БСС:


«Аналитическая система для интегральной оценки состояния среды обитания
человека» с ферментным БХП на основе реакции люциферин-люцифераза (п. 2.3.1);
«Биолюм» с БХП на основе полученных методами генной инженерии (п. 2.2.6)
пресноводными светящимися бактериями.
в) Экологические биофлуориметры. В экологической практике для измерения с помощью
флуоресцентного ИП послесвечения хлорофилла-a используют компьютерноуправляемую БСС «Фотон-7-1» с БХП на основе фотосинтезирующих пигментов.
3.1.10. Жидкокристаллические
Жидкими кристаллами (ЖК) называются жидкости, обладающие, как и кристаллы,
анизотропией свойств.
Пусть, например, в жидкости молекулы имеют удлиненную палочкообразную форму.
Первоначально силы межмолекулярного взаимодействия выстраивают их параллельно
друг другу. При всех перемещениях молекул ЖК у них сохраняется направление длинных
осей. В результате у такой жидкости будут различные характеристики в разных
направлениях (анизотропия). Если участки длинных молекул, кроме того, повернуты по
спирали относительно друг друга, то такой кристалл называется холестерическим (ХЖК),
так как сходная структура была обнаружена у холестерина.
Повернутые участки молекул ХЖК отражают видимый свет только с определенной
длиной волны, что обусловливает целый ряд физических эффектов, связанных с
изменением окраски ХЖК, которая меняется при:




изменении угла наблюдения, когда, освещенный белым цветом, он при повороте
начинает переливаться всеми цветами радуги;
приложении электрического напряжения;
изменении температуры, меняющей шаг спирали;
воздействии паров различных химических веществ на структуру кристалла; с
помощью ХЖК можно обнаруживать миллионную объемную долю пара
химического вещества в воздухе.
Двухспиральные молекулы ДНК, выделенные в виде однородного вещества методом
центрифугирования (п 2.4.2), обладают свойствами ХЖК (п. 2.5.4), что позволяет
использовать ДНК как БХП и ИП одновременно [13].
Эти свойства в перспективе позволяют создать новые ДНК-зонды для обнаружения
причин наследственных болезней (п. 2.5.4). Оптический сигнал, получаемый при
взаимодействии ХЖК (ДНК) с излучением, можно передавать, например, по оптоволокну
и создавать на этом принципе ДНК-оптоды [3].
3.2. Электрохимические
Субстратом или продуктом ферментативной реакции часто является соединение,
распадающееся на ионы.
Для измерения концентраций, свойств и состава таких веществ в качестве ИП
используются электрохимические ячейки:
Э ЭД Э Э
л ли лл
е ес ее
к кс кк
тто тт
р рц рр
о ои оо
нли лн
н ир ин
ыт у т ы
й ю й
Вщ D
п е п
р е р
о в о
в е в
о щ о
д е д
н с н
и т и
к в к
о
А
E
C
В ячейках вещество С распадается в растворе на разнополярные ионы, образующие
электролиты B и D. Концентрация ионов пропорциональна концентрации вещества в
растворе. В ячейку погружены два электрода A и E из проводников с электронной
проводимостью.
В различных типах электрохимических ИП получают зависимость между электрическими
параметрами электродов и концентрацией анализируемого вещества (аналита) в ячейке.
При этом требуется учитывать основные электрохимические эффекты:







возникновение на границах разных фаз (металл – электролит, исходное вещество –
электролит) электрохимических потенциалов;
зависимость величины потенциалов от температуры;
возникновение на границах фаз двойных заряженных слоев, обладающих
емкостью, подобно плоскому конденсатору (поэтому ячейка с веществом и
электродами может быть описана эквивалентной схемой в виде резистивноемкостной цепи);
изменение величины потенциала между металлом и электролитом при протекании
тока через электроды (эффект поляризации электродов);
изменение величины тока, обусловленное разной шероховатостью электрода, т. е.
его площадью контакта с электролитом;
изменение потенциала электрода при окислении его электролитом;
возникновение эффекта электролиза (выделения ионов в виде вещества на
электроде) при протекании постоянного тока через раство, что уменьшает
концентрацию ионов в растворе.
Для уменьшения эффекта окисления вещества электродов электролитом их выполняют из
благородных металлов (платины, золота). Электроды всегда полируют, обеспечивая
максимально гладкую поверхность. Чтобы минимизировать влияние температуры, все
электрохимические измерения проводят в условиях термостатирования.
В данном разделе будет рассмотрен ряд электрохимических ИП, применяемых для
разработки БСС. Более подробный перечень электрохимических ИП приведен в [28].
3.2.1. Кондуктометрические
Полное электрическое сопротивление (импеданс) электролита на переменном токе
включает активную составляющую, обусловленную его проводимостью – величиной,
обратной электрическому сопротивлению, и реактивную – емкостную.
Метод кондуктометрии основан на измерении активной составляющей импеданса
аналита [28]. Обычно в одно плечо измерительного моста включают электрохимическую
ячейку, а в другое – регулируемое сопротивление и переменный конденсатор для
минимизации емкостного эффекта.
Сопротивление ячейки измеряется путем уравновешивания плеч моста Вина, когда ток в
диагонали моста равен нулю.
На плечи моста подают переменное напряжение небольшой амплитуды, чтобы не
произошло поляризации электродов.
Проводимость раствора электролита описывается как
G = f (z i С i  i ),
(43)
где zi – заряд i-го иона, С i – его концентрация, i – его подвижность. БО моделируются
частицами, удельная проводимость которых (БО) несколько ниже, чем культуральной
среды (с). Таким образом, микроорганизмы в электролите уменьшают его проводимость.
Проводимость взвеси Gв с БО в среде выражается формулой
GВ = f (CБО,БОi/с,  БО),
(44)
где CБО, БО – концентрация и подвижность БО i-го вида соответственно.
Кондуктометрические и импедансометрические ИП используют для контроля самых
разных биологических реакций [18].
а) Измерение концентрации БО. Фирмами разных стран разработана специализированная
аппаратура для измерения роста популяций БО (бактерий, мелких инфузорий,
микроскопических водорослей). Наиболее известной подобной системой
кондуктометрического типа является многоканальная БСС фирмы Malthus АТ для
определения качества воды и продуктов (фирма Malthus) с БХП на основе популяций
бактерий. Качество измерения обеспечивается мало окисляющимся материалом электрода
(керамика с золотым покрытием) и сложной системой термостабилизации.
Необходимо учитывать, что на проводимость взвесей бактерий могут оказывать влияние
солевой состав бульонов и выделение микроорганизмами продуктов метаболизма.
б) Контроль ферментативных реакций. В СССР для обнаружения фосфорорганических
соединений была разработана кондуктометрическая БСС «Фермент-1» с БХП на основе
фермента ацетилхолинэстэразы (пп. 1.3.1, 2.5.1).
в) Контроль иммунных реакций. Разработана экспериментальная кондуктометрическая
БСС для анализа иммунных реакций с БХП на основе комплекса биомолекул антиген–
антитело (п. 2.5.5). Каждый из элементов БХП моделируется эквивалентной
электрической емкостью. Емкость комплекса антиген–антитело за счет последовательного
их соединения меньше, чем емкости биомолекул. В результате иммунной реакции
возникает уменьшение величины тока во времени:
i(t) = (U/RS) exp(–t/RS CIC),
(45)
где U – разность потенциалов между электродами, RS – сопротивление раствора, CIC –
емкость двойного электрического слоя иммунокомплекса.
Идеально гладкие электроды помещаются в проточную ячейку с расстоянием между ними
всего 100 мкм. На электроды подается напряжение 50 мВ частотой 750 кГц.
Продолжительность измерения 2 мс.
Информативными характеристиками при кондуктометрии биологических веществ
являются не только значения проводимости или тока, но и частотный спектр колебаний
сигнала.
3.2.2. Потенциометрические
Потенциометрия основана на измерении разности электродных потенциалов,
возникающей на границе электрод–электролит [22, 28, 30]. При этом потенциал одного из
них (электрода сравнения) не зависит от измеряемого фактора, а потенциал второго
(рабочего электрода) изменяется при воздействии на него аналита.
Электрохимический потенциал Е имеет электрохимическую и термодинамическую
природу. Его зависимость от концентрации одного вида иона описывается законом
Нернста:
E = E0 – (RT/zF) lnQ,
(46)
где E0 – величина потенциала в стандартных условиях (при T=298 C и давлении 760 мм
рт. ст.); R – газовая постоянная; T – температура электролита; z – заряд (валентность)
иона; F – постоянная Фарадея (равная количеству электричества, которое приводит к
выделению на электроде 1 моля одновалентного иона); Q = aв/ aок, где aв и aок –
активности восстановленной и окисленной формы диссоциированного вещества
соответственно.
В разбавленных растворах величина Q пропорциональна концентрации С вещества.
В результате окисления и восстановления исходных веществ образуется свободная
энергия, которая расходуется на изменение потенциала рабочего электрода. Ионы
движутся (диффундируют) к электроду и восстанавливаются на нем или окисляются,
соответственно забирая или отдавая электроны. Стабильное значение потенциала
возникает при равновесной реакции, т. е. когда в ней поддерживается равновесие между
процессами выделения вещества на электроде и диффузии ионов. Ток через ячейку для
сведения к минимуму эффекта поляризации должен быть близок к нулю.
Измерительный электрод в БСС всегда предназначен для выделения из раствора только
необходимого иона из смеси, т. е. выполняется ион-селективным. Эти свойства
достигаются благодаря применению мембран, пропускающих одни элементы и
связывающие или задерживающие другие.
Наиболее часто в БСС используют в качестве ИП следующие типы ионоселективных
потенциометрических преобразователей: электроды и полевые транзисторы для анализа
ионов в жидкостях и газах.
a) Ион-селективные электроды. Логарифмическая зависимость между величиной
потенциала и активностью ионов (46) позволяет создавать аналитические приборы с
большим диапазоном измерения.
Наиболее распространен рН– электрод, селективный к ионам водорода (pH = –lg[H+], где
[H+] – активность ионов водорода). Если определяется только один вид иона и существует
электрохимическое равновесие между электродом и раствором, то при стандартных
условиях потенциал электрода (46)
E = E0 + 0,05915 lg[H+]
(47)
б) Ион-селективные полевые транзисторы (ИСПТ). Полевой транзистор управляется
напряжением, подаваемым на затвор. В ИСПТ затвор является ион-чувствительным [30] в
результате того, что на него нанесен дополнительный слой, селективный к ионам с
помощью таких соединений как Al2O3, Ta2O5, Si3N4 (рис. 9). Тогда выражение для тока
стока приобретает вид
iс = k(Uз – Uп – Uэ–д + const)2,
(48)
где Uз – потенциал затвора; k – коэффициент, определяемый параметрами ионселективного слоя,  – коэффициент, характеризующий химическую чувствительность
мембраны, Uп – пороговое напряжение затвора, Uэ–д – потенциал на границе электролит–
диэлектрик, который, подобно pH-электроду, линейно зависит от логарифма
концентрации ионов водорода:
Uэ–д = (RT/F) lg[H+].
(49)
в) Газочувствительные электроды. В этих электродах над газовой мембраной размещен
тонкий слой промежуточного раствора, изменяющего свои свойства в зависимости от
концентрации газа, что воспринимается ион-селективным электродом [3, 28].
г) Газочувствительные полевые транзисторы (ГЧПТ). Свойство металла палладия
поглощать водород и катализировать его расщепление было использовано [3] для
разработки газочувствительного полевого транзистора.
На границе затвора образуется слой ионов водорода, которые приводят к изменению тока
стока транзистора. В присутствии кислорода атомы водорода вступают в реакцию, что
уменьшает толщину их слоя, поэтому с помощью транзистора можно измерять
концентрацию как водорода, так и кислорода.
Показано [3], что ГЧПТ могут катализировать расщепление сероводорода, аммиака,
метана и бутана.
Рис. 9. Схематическое изображение pH - чувствительного полевого транзистора и БСС на
его основе:
Si - кремниевая подложка p - типа, И, С - зоны истока и стока;
1- изолирующее покрытие, 2 - диэлектрик из двуокиси кремния;
3 - химически чувствительная мембрана, 4 - иммобилизованный БО;
Ic, U3, Uc - ток стока, подаваемые потенциалы затвора и стока
Рис. 10. Схематическое изображение БСС на основе светочувствительного транзистора: 1
- электрод сравнения, 2 - фоточувствительная мембрана, содержащая фотохромный
краситель и ионофор, 3 - светозащитный экран.4 - внутренний электролит, 5 герметизирующее кольцо.6 - раствор, содержащий измеряемые соединения
д) Светоуправляемые полевые транзисторы (СУПТ). Мембрану затвора полевого
транзистора модифицируют фоточувствительными красителями, претерпевающими
обратимые фотопревращения, сопровождающиеся изменением их зарядов (рис. 10).
Существенной особенностью новых типов ИП является возможность изменять их
состояние внешними источниками излучения. Например, УФ-излучение вызывает
генерацию потенциала. Фотоиндуцированный потенциал может быть функцией состава
электролита, наличия субстратов ферментативных реакций. При освещении мембраны
импульсами УФ-излучения измеряют импульсный ток стока транзистора, который
зависит от концентрации ионов. Это позволяет простыми методами создавать
высокочувствительные миниатюрные БСС, а за счет быстрой замены мембраны с
биослоем и красителями настраивать ИП на анализ широкого спектра биологически
активных соединений.
Потенциометрические ИП используются в различных видах БСС.
а) Ион-селективные электроды с ферментными и клеточными БХП [45, 48–50, 65]. При
ферментативных реакциях дыхания в результате переработки субстратов выделяются газы
(пп. 2.3.1, 2.5.1). Пропускание некоторых газов через водный раствор приводит к
появлению кислот и понижению значения pH.
Ферментные pH – электроды обычно включают:





трубку с полупроницаемой мембраной;
ферменты или организмы, иммобилизованные на мембране;
полупроницаемую мембрану для измеряемого газа;
слой водной среды с буферным раствором (для минимизации колебаний pH);
ИП на основе pH-электрода.
Электрод погружают в аналит (п. 3.2) и через 30–60 мин фиксируют изменение pH. С
помощью таких электродов можно оценивать активность соответствующих ферментов и
воздействие на нее загрязнений среды. Недостатком их является малый срок службы –
около 100 ч.
Помимо электродов, селективных к ионам водорода, разработаны [28] электроды,
селективные к ионам Na+, K+, Cu+, Pb2+, Cd2+, F–, Cl–, Br–, J–.
б) Ион-селективные транзисторы с БХП на основе ферментов, организмов и комплекса
антиген-антитело [30, 67]. На ион-селективном слое, нанесенном на затвор,
иммобилизируют фермент или микроорганизмы и измеряют ток транзистора. На основе
pH-чувствительных ИСПТ созданы опытные модели БСС на ацетилхолинэстреразу (п.
1.3.1), хлороароматические уксусные кислоты, ионы Na+. ИСПТ позволяют создавать БСС
для определения пестицидов, иммуноглобулина, микробных клеток (в этом случае на
мембране ИСПТ иммобилизуют антитела или клетки бактерий, меченые антителами ). В
перспективе такиие БСС могут составить конкуренцию иммуно-ферментному анализу (п.
2.5.6).
ИСПТ выпускаются АО «Авангард» (РФ), фирмой IMT (Швейцария).
в) Газочувствительные электроды с ферментными БХП [3]. Эти ИП позволяют
упростить конструкцию рассмотренных выше ферментных электродов, и измерять
концентрацию таких газов, как CO2, NH3, Cl2.
Наиболее распространены при проектировании БСС электроды фирмы ORION RES.
CORP.
Таблица 7
БСС с газочувствительными и ион-селективными электродами [3]
Вид ИП
NH3
CO2
pH
J–
Определяемый субстрат/фермент
Мочевина, аминокислоты, глутамин, нитраты, нитриты, креатинин/ лиазы,
деаминазы
Мочевина, аминокислоты/ декарбоксилазы
Пенициллин, РНК, ДНК, глюкоза /ферменты, катализирующие реакции с
изменением pH
Глюкоза, аминокислоты, холестерин, спирты
г) Газочувствительные транзисторы (ГЧПТ) с ферментными БХП [3]. Этот тип БСС
применяют для измерения активности дегидрогеназ цикла Кребса (п. 1.2.2), отщепляющих
водород, для определения кислорода и метана и для оценки активности ферментов
анаэробного брожения.
д) Светоуправляемые транзисторы (СУПТ) с ферментными БХП. Данный тип ИП
используют для проектирования БСС, чувствительных к иону аммония. Подобные БСС
разработаны для оценки активности уреазы, фермента, катализирующего гидролиз
мочевины до аммиака и углекислоты [30].
Перспективность полевых транзисторов обусловлена в первую очередь их сравнительно
малыми размерами, возможностью смены биопленок, хорошей воспроизводимостью
результатов, исключительно высокой чувствительностью, низкой ценой при массовом
производстве.
3.2.3. Амперометрические
В ИП измеряют сверхмалый ток электрохимической ячейки, возникающий вследствие
окисления или восстановления электрохимически активных веществ на поверхности
рабочего электрода при подаче напряжения между рабочим электродом и электродом
сравнения [22, 28, 34]. Этот метод позволяет измерять не только концентрацию ионов, но
и растворенных газов, так как для амперометрии достаточно, чтобы на электроде мог
восстанавливаться или окисляться хотя бы один из реагентов или продукт реакции.
Считается, что концентрация реагента линейно уменьшается в приграничном к
поверхности электрода слое от значения С на расстоянии L от электрода до нуля на самом
электроде, где он восстанавливается или окисляется. Ионы движутся за счет диффузии,
характеризуемой коэффициентом диффузии D, и каждый ион переносит z электронов к
электроду.
Толщина слоя L считается постоянной. Для выделения одного вида иона применяют ионселективные мембраны.
Предельный ток диффузии определяется формулой Коттрела:
i Д = zF Aэ DC /L,
(50)
где Aэ – площадь электрода, F – константа Фарадея (п. 3.2.2). Таким образом,
диффузионный ток пропорционален концентрации вещества.
За счет одного процесса диффузии ток нарастает крайне медленно. Чтобы увеличить
скорость электрохимической реакции, перемешивают аналит или вращают электроды, в
результате чего уменьшается толщина диффузионного слоя L. Это особенно важно в
случае использования веществ с малыми скоростями диффузии. Диффузионный ток iд для
вязких органических соединений:
iд = k –5/6,
(51)
где k – константа ИП,  – коэффициент вязкости вещества:
Перенос электронов может быть ускорен за счет увеличения разности потенциалов между
электродами, но существенно повышать ее опасно, так как может произойти
электролитическое разложение самого аналита. Более эффективен метод использования
медиаторов (посредников в переносе электронов) (п. 2.5.1).
Для увеличения скорости диффузии также применяют микроэлектроды, в которых
диффузия происходит не через плоский слой (50), а радиально через сферу, центр которой
находится на электроде. В результате скорость реакции увеличивается и стабилизируется.
Поэтому данные модификации электродов открывают новые возможности в области
создания БСС.
Амперометрические ИП используют в БСС медицинского и экологического назначения.
а) Определение глюкозы в крови. Согласно статистике примерно 5% взрослого населения
развитых стран являются диабетиками. Для контроля глюкозы в крови все шире
применяют БСС (табл. 8, [25]) на основе ферментативной реакции окисления глюкозы
(2.5.1) с поглощением O2 или выделением H2O2.
ИП для этой цели (электрод Кларка, рис. 11, [6]) состоит из из следующих элементов:





стакана для тестируемого раствора;
погружной трубки;
полупроницаемой мембраны;
биослоя с ферментом;
ион-селективного амперометрического электрода, регистрирующего или
уменьшение концентрации О2, или увеличение H2O2.
Для измерения тока используются амперометрические приборы фирм «ORION» и Ingold,
имеющие диапазон измерений 10–8–10–11А [30].
Кислородный амперометрический ИП фирмы «ОRION» содержит небольшой объем
электролита, в который помещены измерительный микроэлектрод из платины и электрод
сравнения [28]. На микроэлектроде поддерживают постоянный потенциал приблизительно
0,8 В относительно электрода сравнения. При этом измеряется ток электрохимической
ячейки. Внешний аналит, в котором необходимо определять концентрацию кислорода, и
электролит ИП разделены мембраной, проницаемой для кислорода. Электродом
сравнения служит каломельный электрод (Hg2Cl2).
Отечественные БСС для амперометрического измерения концентрации глюкозы и
аминокислот описаны в [20, 35, 36, 46].
Возможно применение ион-селективного электрода для определения пероксида водорода.
Такой метод чувствительнее в 100–1000 раз.
Ток ячейки пропорционален концентрации иона C:
I =  C,
(52)
где  – коэффициент ИП, зависящий от площади рабочей поверхности измерительного
электрода, диффузии ионов, pH и температуры (см. введение к п. 3.2).
Задача построения глюкозоанализаторов не исчерпывается проектированием
чувствительных ИП. При измерении концентрации глюкозы в цельной крови возникает
ряд сложных проблем, для устранения которых требуется искать различные методические
и конструкторские решения.
Рис. 11. Схема работы электрода Кларка ( глюкозного биосенсора):
1 - исследуемый раствор, 2 - корпус биосенсора, 3 - внешняя мембрана, 4 - слой
глюкозооксида, 5 - внутренняя газопроницаемая мембрана, 6 - платиновый электрод
(проволока) для восстановления кислорода, 7 - усилитель сигнала, 8 - самописец (
дисплей, цифровой или световой указатель и т. д. ) [6]
Таблица 8
Глюкозоанализаторы [3]
Фи
рм
а,
пр
иб
Д
и
а
п
а
О Ч ПС
б а от
ъс а
е т гб
м о ри
ор з т е л
о п а шь
н р нн
о и оо
к б з сс
о ым т т
н , е ьь
ц р,
е ме
н кн%
- ли
т й
р ,
а п
ц р
и о
й б
,
/
ч
м
м
о
л
ь
/
л
Неавтоматиз
ированные
анализаторы
«Э 0 5 6 5
кса , 0 0
н
5
Г» .
Рос .
сия .
3
0
Yel 0 2 4 2 3
low , 5 0 0
Spr 5
0
ing .
s
.
и
Inst .
з
ru 5
м
me 0
е
nts
р
(С
е
Ш
н
А),
и
мо
й
дел
ь
23
А
Ser
es
(Ф
ран
ци
я),
En
zy
mat
Sol
eaTac
uss
el
(Ф
ран
ци
я),
1 26
. 00
. 0
.
2
2
5
0
0
и
з
м
е
р
е
н
и
й
21
0
0
0
0
,
0
0
0
1
и
.
з
.
м
.
е
1
р
е
гл ,
н
юк 0
и
озн
й
ый
эле
ктр
од
Ho 2 1 t 1 8
ffm , 0 и ,
an . 0 з 5 н
la 5 м е
Ro .
д
she .
6 .
(Ш .
0
вей 2
цар 7 с
ия) ,
5
Гл
юк
озо
ана
лиз
ато
р
541
0*
Fuj
i
Ele
ctri
c
(Я
по
ни
я),
0 2 2 35
. 00 0
.
0
.
2
и
7
з
м
е
р
е
н
Glu
и
co
й
20
A
An 0 2 1 2
alyt . 0 2 ,
ical . . 0 0
inst . . .
ru 5 . .
me 5 4 .
nts , 0 1
(Я 5 5
по
0
ни
я)
Glu
cor
der
-E
Автоматичес
кие
проточные
анализаторы
Dai 1 1 1
ichi . 0 .
(Я . 0 0
по . .
ни 4 .
я), 0 .
2
5
Aut
0
o&
Sta
t
GA
111
0
Ка 0 6 3 3
рло .
0, 0
в
0
5
ун 0
д
иве
рси
тет
(Че
хия
)
6
н
.
.
.
.
5
,
0
Приборы
непрерывног
о действия
Lif д 2 5 5
e
о
0
Sci
м
enc 2 и ч
e
7 н
Inst ,
r,
5
Div
.
Mil
es
(С
Ш
А,
Би
ост
ато
р
GC
IIS
Ун 2
3
иве ,
рси 8
д
тет 5
н
г. .
.
Ос .
ака .
,
2
ме 2
ди ,
ци 0
нск
ий
фа
кул
ьте
т
Во всех глюкозоанализаторах использован фермент глюкозоксидаза.
* Дополнительно используется медиатор для переноса электронов.
В биологических препаратах присутствуют вещества, которые влияют на выход продукта
реакции H2О2 (аскорбиновая кислота, мочевая кислота и т. п.). Для сведения к минимуму
этого эффекта иногда мембранам электродов сообщают заряд, отталкивающий мешающие
вещества.
Необходимо учитывать, что концентрация глюкозы в пробе крови за 2 ч понижается на
20 %. В целях стабилизации содержания глюкозы пробу крови подвергают гемолизу
(разрушению эритроцитов солевым раствором за счет осмотического давления).
б) Оценка действия целлюлозных ферментов. Для измерения активности целлюлаз,
катализирующих разложение целлюлозы применяются амперометрические ИП с
вращающимися платиновыми электродами, запаянными в стеклянную трубку (скорость
вращения около 600 об/мин). При понижении вязкости растворов целлюлозных
полимеров ток ИП увеличивается.
3.3. Гравиметрические
Гравиметрическими называют ИП, измеряющие силу тяжести. При многих
ферментативных реакциях масса исходного субстрата уменьшается за счет выделения
газов или происходит выпадение осадка.
Гравиметрические ИП могут быть основаны на различных способах измерения: частоты
маятника с массой m; массы продукта m, выделившегося в процессе электролиза на
электроде (электрогравиметрия); частоты колебаний акустической мембраны с массой m
(акустическая гравиметрия).
В БСС последний тип ИП с мембраной из пьезокристалла нашел наибольшее
распространение [22, 42, 57].
Пьезоэлектрические кристаллы обладают прямым пьезоэффектом (образование зарядов на
поверхности твердого тела под воздействием механических напряжений) и обратным
(изменение размеров кристалла при подаче напряжения). Поэтому такие кристаллы могут
быть использованы в качестве преобразователей в БСС благодаря их способности
генерировать и передавать акустические волны, изменение резонансной частоты которых
зависит от биомассы на поверхности кристала:
(53)
где fр – резонансная частота кристалла, m – масса кристаллического покрытия, А – площадь
кристалла, k – коэффициент пропорциональности.
Известны два класса акустических преобразователей: передающие акустическую волну с
одной стороны кристалла на другую (bulk-wave, объемноволновые устройства) и
передающие акустическую волну по одной грани кристала (surface acoustic wave,
поверхностные акустические волны – ПАВ).
В основе работы большинства приборов на ПАВ лежат три физических процесса: 1)
преобразование входного электрического сигнала в акустическую волну; 2)
распространение акустической волны вдоль поверхности кристалла; 3) обратное
преобразование ПАВ в электрический сигнал.
Чаще всего для измерения частоты используют подсчет периода колебаний с помощью
сверхбыстрых счетчиков. Информативным параметром является отличие распределения
частоты от нормального распределения.
В Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте разработан
способ детекции биологических макромолекул с помощью БСС. Способ включает
иммобилизацию слоев макромолекул на поверхности кварцевого резонатора,
помещенного в вакуум, и последовательную регистрацию резонансных частот после
нанесения каждого биослоя [42].
На основе акустических ИП разрабатываются иммуносенсоры [57]. На поверхности
кварцевого резонатора, покрытого золотой пленкой, иммобилизируют антитела
(иммуноглобулины), а в качестве источников антигенов – микробные клетки. Антитела
связывают белки клеток, при этом масса на поверхности увеличивается, а резонансная
частота уменьшается на тысячные доли процента, что и фиксирует ИП.
3.4. Калориметрические
При некоторых ферментативных реакциях [3] выделяется 25...100 кДж/моль тепла (п.
2.5.1) Обычно это величина зависит от типа реакции и достаточно стабильна. Выделенное
тепло расходуется на нагрев поверхности, на которой иммобилизован фермент, или на
нагрев среды, контактирующей с продуктами реакции.
Нагрев поверхности или среды контролируется с помощью измерительного прибора,
например полупроводникового терморезистора (термистора), сопротивление которого
выражается формулой:
RT = RT1 exp B [(1/T) – (1/T1)
(54)
где RT и RT1 – сопротивления термистора при температурах (K) T и Т1 соответственно, B –
константа (K) для данного типа термистора.
Термистором можно измерить температуру с точностью до 0,01–0,001, что обеспечивает
чувствительность обнаружения вещества на уровне 0,1 ммоль. Достоинствами
калориметрического ИП являются обеспечение возможности контроля тепловыделения
как в течение длительного времени, так и в проточных режимах. Обычно в зарубежных
разработках БСС используют термисторы фирмы Victory Engeneering Corp.
Типичная проточная БСС с калориметрическим ИП состоит из термостата для ферментного
анализа, проточной системы, омывающей фермент, измерительного блока с термистором для
контроля температуры жидкости.
Главной проблемой становится теплоизоляция реакции от окружающей среды, что
требует создания дорогостоящего оборудования для термостатирования и большого
расхода компонентов ферментативной реакции для обеспечения необходимого
тепловыделения.
Калориметрические ИП – одни из самых ранних видов ИП в экспериментальных БСС
после амперометрических. С их помощью проведены многочисленные эксперименты по
обнаружению различных видов веществ (табл. 9). Чувствительность систем повышают за
счет создания цепочек реакций, когда продукт, например H2O2, при окислении глюкозы
дополнительно разлагают каталазой, увеличивая тепловыделение или используя
многократное омывание фермента субстратом. Тем не менее пока БСС с
калориметрическими ИП не вышли на уровень серийных разработок.
Характеристики различных ИП для БСС приведены в прил. 4.
Таблица 9
Возможности БСС с калориметрическими ИП
Определяемое вещество
Имообилизованный
биокатализатор
Клинический анализ
Аскорбиновая кислота
Аскорбиноксидаза
Холестерин
Холестериноксидаза
Глюкоза
Глюкозoоксидаза +
Мочевина
Мочевая кислота
Мочевина
H2O2
Инсулин (антиген)
Альбумин (антиген)
Лактоза
Пенициллин
Этанол
каталаза
Уреаза
Уриказа
Определение растворимых ферментов
Уреаза (растворимая)
Каталаза (растворимая)
Иммунологический анализ
Иммобилизованные тела,
меченные ферментом
То же
Контроль ферментативных процессов
Лактаза+глюкозоксидаза +
каталаза
Пенициллиназа
Алкогольоксидаза
Диапазон
концентраций
0,05...0,6 ммоль/л
0,03...0,15 ммоль/л
0,002...0,8 ммоль/л
0,01...500 ммоль/л
0,05...4 ммоль/л
0,1...100 ед/мл
0,1...100 ед/мл
0,1...50 мкг/л
10–10 моль/л
0,05...10
0,05...500
0,01...1
3.5. Радиоактивные
Очень популярный метод исследования живого в 1960–70-е гг., основанный на внесении в
субстрат радиоактивного углерода С14. В результате при переработке углеводов
выделяется радиоактивный углекислый газ. Процесс выделения радиоактивного газового
потока С14O2 измеряется дозиметром. На этом принципе основано измерение
концентраций бактерий с помощью прибора «Bactometer».
В настоящее время радиоактивные методы используются в основном для мечения
нуклеотидов или пептидов в исследованиях по разработке БСС на основе ДНК. При этом
используют свойство избирательного поглощения какого-либо вещества белковыми
комплексами и вводят в вещество радиоактивные добавки. После выделения белковых
комплексов или ДНК с помощью дозиметра оценивают степень накопления в них данного
вещества.
Современной тенденцией в биотехнологии является вытеснение радиоактивных меток
флуоресцентными.
3.6. Микроаналитические
К ним относятся, например, БСС для анализа белкового состава веществ, включающие
устройства для микроэлектрофореза (п 2 4.2) и флуоресцентного анализа (пп. 2.5.1, 2.5.2,
3.1.9), выполненные на одном кристалле [64]
В кристалле литографическим способом с использованием технологий создания
кремниевых чипов формируют микроканавки, расположенные в виде «серпантина»
(соединенные в один капилляр длиной свыше 160 мм), и круглые лунки с двух сторон для
опущенных в анализируемое вещество электродов, на которые подается постоянное
высокое напряжение.
Этот серпантинно-уложенный капилляр пересекают микробороздки, по которым из лунок
путем микроинъекции подается люминесцирующее вещество и активатор люминесценции
(пп. 2.5.2, 3.1.9), которые при взаимодействии с белками избирательно поглощаются и
светятся. Таким образом биологическое вещество одновременно анализируется на
электрофоретическую подвижность белков и флуоресцентное поглощение, которое
фиксируется микротелекамерой.
3.7. Микромеханические
Это новейший тип технологий формирования механических систем с помощью
кремниевой литографии, управляемых полупроводниковыми элементами [66]. Например,
фирма Texas instruments разработала чипы, на которых размещены 4 млн подвижных
микрозеркал. На основе кремниевой литографии разрабатывают микродозаторы и
фильтры.
Подобно тому, как акселерометр для измерения ускорений в автомобиле уже
изготавливается в виде одного чипа, данный подход позволяет в перспективе выпускать
целую микроаналитическую лабораторию с ферментными ИП в одном технологическом
цикле.
4. Особенности конструирования и
эксплуатации биосенсорных систем
4.1. Обобщенная структура биосенсорной системы
Рис. 12. Биосенсорная система
На работоспособность БСС влияет целый комплекс биологических, химических,
технических факторов, которые удобно анализировать, если представить БСС в виде
обобщенной структурной схемы, приведенной на рис 12.
Для проведения анализа с помощью БСС требуется многие их узлы (подсистемы) и
элементы постоянно обновлять или заменять. Подсистемы с подобными функциями
обозначим термином «линии». Для построения БСС необходимы линии подготовки:
пробы (П), биообъекта (БО), принадлежностей методики (ПМ), вспомогательного
оборудования (ВО), а также линия утилизации материалов и оборудования (УТ).
В общем случае БСС строят на основе методологии организации биологического
эксперимента, предполагающей сравнение свойств биохимических преобразователей
контрольного и опытного стимула – БХПк и БХПоп. (п. 2.1).
Для получения численного значения реакции БХП требуется ИП, включающий:




первичный измерительный преобразователь (ПИП),
блок выделения информативного параметра (БВИП),
блок обработки данных (БОД),
систему отображения информации (СОИ).
Блок стабилизации параметров среды – БСПС поддерживает условия, необходимые для
культивации организмов и воспроизводимости реакции БХП на стимул.
4.2. Факторы, влияющие на результат работы системы
Рассмотрим лишь некоторые важные факторы, влияющие на результат эксперимента,
связанные с различными элементами структурной схемы БСС.
Линия подготовки пробы включает блоки забора пробы, дозирования, консервации.
На результаты БСС могут повлиять антисвертывающие консерванты типа гепарина,
добавляемые в кровь для увеличения сроков хранения. Требуется учитывать возможность
попадания в пробу антибактериальных или антипротозоальных антибиотиков, которые
могли вводиться больным. Все эти факторы могут оказывать влияние на
жизнеспособность ферментов и бактерий. Если проба разбавляется каким-либо
веществом, то разбавитель может оказывать действие на БХП или же в результате ошибки
разбавления может быть неверно определена концентрация вещества.
Пробы для экологических анализов отбирают из воды, донных осадков или воздуха
специализированными пробоотборниками и обычно хранят в емкостях из пластика или в
стеклянных сосудах. Следует учитывать, что не пищевой полиэтилен и пробки из
вулканизированной резины (с содержанием серы) выделяют вещества, токсичные для
организмов.
Линия подготовки биообъекта (БО) может существенно влиять на результаты БСС, если
не соблюдены правила культивации клеток или выделения и модификации клеточных
структур (пп. 2.2.2, 2.4).
Линия подготовки принадлежностей методики (ПМ) необходима, так как БХП
разрабатывается с применением стеклянных или пластиковых изделий, гелей,
полимерных мембран и растворов. Их влияние на БО требуется учитывать при
конструировании БХП. Для этой цели следует предварительно поставить опыты на
выживаемость и сохранение этологических реакций (например подвижности) организмов
при внесении в культуральную среду материалов БХП (п. 2.1).
Эта подсистема также выполняет операции подготовки и хранения таких
принадлежностей проведения эксперимента, как кювет, химических стаканов, колб, чашек
Петри (п. 2.2.2).
Линия стерилизации требуется для очистки, промывания, дезинфекции материалов и
вспомогательного оборудования (ВО). При этом нежелательно применять сильные
биоцидные моющие или дезинфицирующие вещества и обязательно следует тщательно
ополаскивать чистой водой посуду и оборудование для забора проб.
Линия утилизации непосредственно не влияет на результат, полученный с помощью БСС.
Разработчику необходимо выбрать, какое вспомогательное оборудование более
рационально утилизировать, а какое использовать многократно. При анализе биопроб
линия утилизации предотвращает опасность инфицирования окружающей среды
отработанным лабораторным материалом.
БХПк и БХПоп должны использоваться при одинаковых внешних условиях. Необходимо
учесть внешние факторы, которые могут оказывать влияние на тест-реакции БХП.
Блок ПИП может негативно воздействовать на БХП за счет вредного влияния как
основных конструкционных материалов ПИП – меди, латуни, бронзы, свинца, железа и
т. п., так и вспомогательны – клеев, лаков, красок, растворителей, гальванических
покрытий. Изменение реакции живого может возникнуть даже при кратковременном
контакте некоторой части БО с этими материалами. Излучения ПИП могут изменять
поведение или ухудшать жизнеспособность биообъектов (п. 1.4, 1.5).
БВИП позволяет выделять сигнал БХП на фоне помех. Полезный сигнал ИП обычно
представляет собой сверхмалые величины (разд. 3). Это требует применения современных
схем усилителей, детекторов, фильтров и др. Их качество существенно влияет на
результат измерения реакций живого.
БОД предназначен для получения результата статистической обработки массива
измеренных значений реакций. В блоке реализуется математический алгоритм,
позволяющий получить воспроизводимый результат на основе исходных данных БВИП.
Для обработки данных БСС как сложных систем (п. 1.6) используется математический
аппарат теории вероятностей: случайных событий, случайных величин, случайных
процессов. Для описания изменения случайных величин неслучайными функциями
применяются регрессионные модели, а выявление взаимосвязей между случайными
величинами оценивается с помощью коэффициентов корреляции.
СОИ предъявляет оператору (ОП) промежуточные и окончательные результаты обработки
данных. При построении СОИ должны учитываться профессиональные стереотипы врача
или исследователя, для того чтобы, не перегружая восприятие оператора
промежуточными данными, давать ему возможность отслеживать процесс измерения,
особенно если реакция происходит в течение десятков минут или часов.
БСПС требуется для работы БСС тогда, когда скорость роста организма, возникновение
реакции биообъекта или ее измерение зависят от различных внешних условий.
4.3. Комплекс для иммуноферментного анализа
БСС основана на принципе применения тест-реакции комплекса антиген-антителофермент (п. 2.5.6) и измерения оптической плотности продуктов ферментативной реакции
[21, 32].
В данной БСС линии подготовки БО, ПМ и БХП реализуются на базе
специализированных микробиологических предприятий, где производится приготовление
и очистка ферментов, антител, антигенов, осаждение их на оптически прозрачные
носители, т. е. создание диагностикумов.
БХП обычно осаждаются на планшеты разового пользования, рассчитанные на 96
микрокювет объемом 0,275–3 мл (12 рядов по 8 микрокювет). Планшеты и кюветы
изготавливаются из биологически пассивных материалов, обладающих хорошими
абсорбционными свойствами для иммобилизации антигенов или антител. К подобным
материалам относятся плексиглас, полиамид, полистирол. БХП могут вноситься в
пробирки на носителях антигенов или антител в виде шариков, дисков, гранул, колец из
полимерных материалов. Возможность изготовления калиброванных по размеру
носителей позволяет строго определить и стандартизировать поверхность связывания
антител, что улучшает воспроизводимость результатов ИФА. Однако при этом требуется
больший расход биологических материалов и реагента в связи с большей площадью
носителей. Известно также применение в качестве твердофазных носителей слайдов –
полосок из полимерного материала с углублениями объемом всего 25 мкл.
Для повышения достоверности результата анализа БХПоп и БХПк организуются на одном и
том же планшете и несколько раз дублируются.
Линия подготовки пробы (обычно крови пациента) включает блоки для взятия пробы
крови, заполнения и маркировки проб, что исключает опасность перепутать ячейки
планшета.
Вспомогательное оборудование при проведении ИФА в планшетах необходимо для
выполнения ряда многократно повторяющихся операций дозирования, титрования,
инкубации, перемешивания, промывки планшетов.
К таким видам оборудования относятся соответственно дозаторы, дилютеры,
термостаты, шейкеры и устройства промывки.
Одноканальные или многоканальные дозаторы предназначены для заполнения
микрокювет пробой.
Дилютеры предназначены для разбавления растворами реагентов или пробы.
Термостаты, входящие в БСПС, обеспечивают поддержание проб в планшетах обычно
при температуре 37С.
Шейкеры применяются для ускорения и повышения прочности связывания компонентов,
участвующих в иммуноферментной реакции путем встряхивания. Встряхивание
производится либо за счет воздействия вибрацией, либо за счет горизонтально-круговых
перемещений носителя проб.
Устройства промывки дозируют в лунки планшета промывочный раствор и затем
удаляют промежуточные продукты анализа из лунок.
В качестве ИП для ИФА используют многоканальные денситометры (п. 3.1.1) с
вертикальным ходом светового пучка. В данных типах фотометров на величину
поглощения мало влияет неточное дозирование жидкостей, приводящее к вариациям
толщины слоя жидкости. Кроме того, вертикальные фотометры компенсируют помехи в
результате небольшого расслоения поглощающих веществ.
ПИП денситометра обеспечивает бесконтактное измерение оптической плотности
продукта реакции на двух или нескольких длинах волн.
БВИП выделяет изменение сигнала постоянного тока за счет уменьшения проходящего
потока.
БОД обрабатывает данные от многоканального измерителя, вычисляет статистические
оценки, записывает их в память, сравнивает различие оптических характеристик проб:
опытных и контрольных.
СОИ отображает на экране для оператора результаты измерения по 96 пробам в виде
данных, а также графиков зависимости оптической плотности от времени вместе с
данными об анализируемых пробах.