Направленный синтез органических кислот и спиртов.

реклама
0
Лекция № 10. ТОБ.
Направленный синтез органических кислот и спиртов.
План лекции
1. Биохимические
закономерности
гомоферментативного
и
гетероферментативного молочнокислого брожения.
2. Биохимизм спиртового брожения. Направленный синтез этанола.
Особенности направленного синтеза глицерина.
3. Биохимические закономерности ацетоно-бутилового брожения.
4. Направленный синтез уксусной и пропионовой кислот.
5. Принципы реализации ьмосинтетических процессов через ЦТК на
примере лимонной кислоты.
В. 1. Биохимические закономерности гомоферментативного и
гетероферментативного молочнокислого брожения.
Молочнокислое
распространенных
брожение
является
одним
из
наиболее
бродильных
процессов.
Данный
вид
брожения
осуществляют
микроорганизмы,
Streptococcus,
Leuconostoc.
относящиеся
Данные
виды
к
родам
Lactobacillus,
объединены
в
группу
молочнокислых микроорганизмов по способности утилизировать лактозу,
глюкозу и галактозу с образованием молочной кислоты в качестве основного
продукта метаболизма.
По биохимическим закономерностям и составу продуктов метаболизма
различают гомоферментативное и гетероферментативное молочнокислое
брожение.
Гомоферментативное брожение характерно тем, что основным и
практически,
единственным
продуктом
является
молочная
кислота.
Суммарное уравнение процесса:
С6Н12О6 + 2Н3РО4 + 2АДФ
У
гомоферментативных
2СН3СНОНСООН + 2АТФ + 2Н20
бактерий
лишь
около
3%
субстрата
превращается в клеточную массу, а выход молочной кислоты может
составлять до 98%.
0
1
2
Промежуточные
реакции
катаболизма
глюкозы
протекают
по
гликолитическому пути. Микроорганизмы, способные ассимилировать
лактозу, характеризуются наличием фермента -галактозидазы.
Ключевая реакция процесса – восстановление ПВК до молочной
катализируется
двумя
стереоспецифичными
лактатдегидрогеназами.
Коферментами L- и O-лактатдегидрогеназ является НАД, аллостерическим
эффектором, повышающим активность фермента – фруктозо-1,6-дифосфат.
Снижение концентрации субстрата приводит к подавлению активности
лактатдегидрогеназ, в результате чего бактерии трансформируют ПВК в
муравьиную, уксусную кислоты, этанол и другие продукты метаболизма,
накапливая дополнительный запас энергии.
Аналогичные процессы имеют место при смещении рН питательной
среды в слабощелочную сторону. Таким образом, деление на гомо- и
гетероферментативные культуры является весьма условным.
Гетероферментативное брожение характеризуется образованием
значительных количеств СО2; уксусной, пропионовой и других органических
кислот; этанола и других метаболитов, являющихся производными ПВК.
Данный тип молочнокислого брожения подразделяют на брожение
идущее с выделением СО2 и без выделения СО2.
Суммарные уравнения имеют вид:
-в первом случае:
С6Н12О6 + Н3РО4 + АДФ
СН3СНОНСООН + СН3СН2ОН + СО2 + АТФ
- во втором случае:
С6Н12О6 + 5Н3РО4 + 5АДФ
В
обоих
случаях
2СН3СНОНСООН + 3СН3СООН + 5АТФ
расщепление
глюкозы
осуществляется
по
гексозомонофосфатному пути до стадии образования ксилулозо-5-фосфата.
Последний под действием фермента фосфокетолазы расщепляется до 3фосфоглицеринового альдегида и макроэргического ацетилфосфата:
1
2
3
СН2ОН
С=О
СНО
Н3РО4
НО-СН
НС-ОН
НС-ОН
СН2О Ф
СН3
СОО Ф
Н2 О
СН2О Ф
Фосфоглицериновый альдегид включается в цепь превращений по
механизму гомоферментативного брожения, а ацетилфосфат дает продукты
гетероферментативного брожения.
В. 2. Биохимизм спиртового брожения. Направленный синтез
этанола. Особенности направленного синтеза глицерина.
Процесс спиртового брожения используется в биотехнологии для
получения этанола и, в меньших масштабах, глицерина. Суммарное
уравнение процесса имеет вид:
С6Н12О6 + 2Н3РО4 + 2АДФ
2С2Н5ОН + 2СО2 + 2АТФ
Помимо основных продуктов брожения – этанола и СО2, всегда
образуется некоторое количество побочных продуктов: глицерина, уксусной
кислоты и др.
Основные группы продуцентов этанола и условия, оптимальные для
его биосинтеза, приведены в таблице:
Группа продуцентов
t, 0C
рН
Дрожжи Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida,
Pichia
30-35
4,5-5,5
Мезофильные бактерии Zymomonas mobilis
30-35
6,0-7,0
Термофильные бактерии Сlostridium thermosaccharolyticum; Thermoanaerobacter ethanolicus; Bacillus
stearothermophiles
Мицелиальные грибы Paecylomyces 71; Asp.niger
55-70
6,0-7,0
30-37
2,2-7,0
2
3
4
Субстраты, ассимилируемые различными возбудителями спиртового
брожения, весьма разнообразны. Дрожжи рода Saccharomyces сбраживают
глюкозу, фруктозу, маннозу, мальтозу; дрожжи рода Kluyveromyces – лактозу
и галактозу; отдельные виды Candida и Pichia способны ассимилировать
пентозы, в первую очередь, D-ксилозу; мицелиальные грибы утилизируют
широкий спектр гексоз и пентоз.
В зависимости от механизма утилизации углеродного субстрата
возбудители спиртового брожения делят на три группы:
1-ая группа. Микроорганизмы, расщепляющие сахара по пути
гликолиза до ПВК с последующим восстановлением до этанола. Ключевыми
реакциями процесса являются декарбоксилирование ПВК и восстановление
ацетальдегида до этанола. Первая из названных реакций катализируется
ТПФ-зависимым ферментом пируватдекарбоксилазой, активируемым ионами
Mg2+ :
СООН
С=О
СН3
Реакция
ТПФ, Mg2+
СНО
СН3
СО2
образования
этанола
катализируется
НАД-зависимой
алкогольдегидрогеназой и является обратимой:
СНО
НАД
НАД
С2Н5-ОН
СН3
К данной группе микроорганизмов относятся все перечисленные выше
роды дрожжей, а также бактерии рода Сlostridium , Thermoanaerobacter и др.
термофилы, вызывающие спиртовое брожение.
2-ая группа. Микроорганизмы, способные расщеплять углеводы до ПВК
по пути Энтнера-Дудорова. К этой группе относятся Zymomonas mobilis,
некоторые виды Pseudomonas. Дальнейшие превращения ПВК протекают по
описанной выше схеме.
3
4
5
3-я
группа.
Микроорганизмы,
гексозомонофосфатному
пути
до
расщепляющие
углеводы
ксилулозо-5-фосфата.
Это
по
гетеро-
ферментативные молочнокислые микроорганизмы.
Метаболические
особенности
биосинтеза
глицерина
связаны
с
обратимостью реакции образования этанола из ацетальдегида. В клетках
многих микроорганизмов, в первую очередь, дрожжей в слабокислой среде
(рН 5-6) равновесие данной реакции смещено вправо; в слабокислой среде
(рН 8), влево. Данные эффект связан со способностью щелочных реагентов,
например шидросульфита натрия, связывать альдегидную группу:
H
СН3 _ С =О
OH
+
CH3 – C – SO3Na
NaHSO3
H
В следствие этого восстановленный НАД, образующийся в начале
гликолиза «переключается» с реакции восстановления ацетальдегида на
восстановление диоксиацетонфосфата с образованием глицерина:
Глюкоза
Фруктоза – 1,6- Ф
СОН
СН2ОН
НС-ОН
С =О
СН2О Ф
СН2О Ф
НАД
НАДН2
СОО Ф
СН2ОН
НСОН
НС-ОН
СН2О Ф
СН3СОН
С2Н5ОН
АДФ
АТФ
+ NaHSO3
СН2О Ф
СН2ОН
СН3СНОНSO3Na
СНОН
СН2ОН
4
5
6
Выход глицерина по данной реакции может достигать 30% от
концентрации сброженного сахара. Наиболее активными продуцентами
являются осмофильные дрожжи Pichia farinose; а также отдельные штаммы
Sacchoromyces ronxii; Torulopsis magnolia; Kluyveromyces fragilis; Candida
pseudotropicalis.
В. 3. Биохимические закономерности ацетоно-бутилового брожения.
Бактерии рода Clostridium вызывают брожения смешанного характера,
протекающие в строго анаэробных условиях. Токсическое действие
кислорода связано с отсутствием в клетках клостридий цитохромов и
каталазы, а также с высоким содержанием флавиновых ферментов.
Продуктами
брожения,
вызываемых
клострилиями,
в
разных
соотношениях могут быть кислоты (масляная, уксусная, молочная); спирты
(бутанол, изопропанол,этанол); ацетон и газы (Н2 и СО2).
Процессы
продуктам.
брожения
Наиболее
принято
называть
распространенным
по
основным
является
конечным
бутанол-ацетон-
изопропиловое брожение, чаще называемое ацетоно-бутиловым брожением.
Этот тип брожения в обычных условиях вызывает большинство видов
клостридий, в первую очередь, Cl.acetobutylicum. Бактерии Cl.butylicum
вызывают бутанол-изопропиловое брожение, Cl.butyricum – масляноуксусное
брожение.
Биохимические процессы, протекающие при брожении, вызываемом
клостридиями, представлены на обобщенной схеме.
5
6
7
ГЛЮКОЗА
2 ПВК
2SHKoA
2SHKoA
2 СН3-СОН
2 СН3СО~SKoA
4[H]
4[H] 2SHKoA
2 CH3COOH
1
H2O
H2O
СН3СOCH2CО~SKoA
C2H5OH
2[H]
CH3COCH2COOH
SHKoA
2
8 ацетоуксусная к-та
9
CH3CHOHCH2CО~SKoA
CH3-CO-CH3
β-оксибутирил-КоА
Н2О
3
CH3CH2CH2CH2OH
2[H]
10
CH3CH=CH-CО~SKoA
Кротонил-КоА
2[H]
2[H]
4
6
CH3CH2CH2C=O
СО2
2[H]
CH3CHOHCH3
Н2О
CH3CH2CH2CО~SKoA
5
CH3CH2CH2CОOH
7
SHKoA
SHKoA
Ферменты: 1 - тиолаза; 2 - β-оксибутирил-КоА-дегидрогеназа;
3 - кротоназа;
4 - бутирил-КоА-дегидрогеназа; 5 - бутиральдегиддегидрогеназа; 6 - бутанолдегидрогеназа; 7 - бутираткиназа; 8 - ацетоацетил-КоФ-трансфераза; 9
- ацетоацетатдекарбоксилаза; 10 - изопропанолдегидрогеназа.
Изучение
кинетики
накопления
продуктов
ацетоно-бутилового
брожения позволяет разделить процесс на две фазы. В первую фазу идет
активное образование кислот и быстрый рост клеток. По мере снижения рН и
увеличения концентрации масляной кислоты повышается активность
ферментов 5 , 6 , 8 , 9 . В результате чего брожение переходит во вторую фазу – накопление нейтральных продуктов. Кроме того, наличие в среде
масляной кислоты индуцирует синтез фермента бутират-дегидрогеназы,
6
7
8
катализирующего непосредственную трансформацию масляной кислоты в
бутанол:
НАДН
СН3СН2СН2СООН
НАД
СН3СН2СН2СН2ОН + Н2О
Наиболее практическое знаяение из рассмотренных выше процессов
имеет ацетоно-бутиловое брожение. Clostridium acetobutylicum имеет
температурный оптимум развития в области 35-37оС; оптимальная область
рН для образования нейтральных продуктов брожения – (4,2-5,5) ед.
В случаях, когда целью является получение масляной кислоты, рН
смещают в щелочную сторону, напримерЮ введением в среду мела.
В. 4. Направленный синтез уксусной и пропионовой кислот.
Уксусная кислота как продукт микробного синтеза может быть получена
четырьмя способами.
1 способ. Окисление этанола уксуснокислыми бактериями. Бактерии
родов Acetobacter (A.aceti; A.xylinum; A.peroxydans) и Gluconobacter
(G.oxydans)
способны
ассимилировать
углеводсодержащие
и
спиртосодержащие субстраты, накапливая в культуральной жидкости
значительные количества ацетата. Они характеризуются специфическими
культуральными и физиологическими свойствами:
- высокая ацидофильность, растут при рН 4,0; оптимум 5,0-6,0;
- бактерии – строгие анаэробы, повышенная чувствительность к
недостатку кислорода связана с активностью фермента апиразы, под
действием которого АТФ быстро гидролизуется и становится
недоступной для метаболизма клеток;
7
8
- выраженная способность окислять органические вещества в частично
окисленные продукты, наиболее характерна способность окислять
этанол в уксусную кислоту.
Схема биосинтеза уксусной кислоты:
9
НАД
СН3СН2ОН
НАДН
Н2 О
СН3СНО
НАД
НАДН
СН3СН(ОН)2
ацетальдешидгидрат
СН3СООН
Н 2О
На первом этапе этанол окисляется до ацетальдегида при участии НАД
(НАДФ) – зависимой алкагольдегидрогеназы; далее происходит гидратация
ацетальдегида и повторное окисление, катализируемое НАД (НАДФ) –
зависимой ацетальдегидрогеназой.
Оптимальными условиями биосинтеза уксусной кислоты бактериями
Acetobacter aceti являются: температура 30оС; рН 5,0-6,0; интенсивная
аэрация среды; состав исходного субстрата – этанол и уксусная кислота в
соотношении 5,5% : 7,5%.
2 способ Образование уксусной кислоты гомоацетогенными бактериями.
Бактерии Cl.aceticum; Cl.thermoautofrophicim; Eubacterium limosum и др. виды
способны в анаэробных условиях утилизировать гексозы, пентозы и
молочную кислоту, образуя ацетат в качестве единственного продукта
метаболизма. Некоторые виды этой группы, например Acetoanaerobicum
woodii, Cl.thermoaceticum и Cl.formiaceticum, способны синтезировать
уксусную кислоту в результате ассимиляции муравьиной кислоты и
фиксации СО2.
Оптимальные условия для биосинтеза уксусной кислоты бактериями
Cl.thermoaceticum: температура 60оС; рН 6,7-7,4; условия строго анаэробные.
Обобщенная схема процесса:
8
9
ГЛЮКОЗА
СН3-СО-СООН
SKoA
СН3-СО-СООН
НАД
Fd
СО2
FdH2
Н2 О
СО2
СН3-СО~SKoA
СН3СООН
НАДН2
НСООН
SKoA
Н3РО4
ТНF
НСОО~ТНF
CH3-COO-Ф
АДФ
НАДН
АТФ
НАД
СН3-СООН
Н2 О
СН2 = ТНF
НАДН
НАД
СН3 - ТНF
ТНF
В12
СН3 – В12
В12
СН3СООН
3 способ. Биосинтез уксусной кислоты молочнокислыми бактериями
помеханизму гетероферментативного молочнокислого брожения с фиксацией
СО2. Метод не перспективен для получения уксусной кислоты как целевого
продукта.
4
способ.
Биосинтез
уксусной
кислоты
по
механизму
пропионовокислого брожения. Возбудителями пропионовокислого брожения
являются бактерии рода Propionibacterium (P.shermanii; P.pentosaceum;
P.prendenreichii)
и
некоторые
виды
клостридий
(Cl.propionicum).
Специфическим свойством данной группы факультативно анаэробных
9
10
микроорганизмов является способность ассимилировать гексозы и, реже
пентозы с образованием пропионовой и уксусной кислот:
3С6Н12О6 + 8АДФ +8Н3РО4
4СН3СН2СООН + 2СН3СООН + 2СО2+ 8АТФ
Схема биосинтеза кислот пропионовокислыми бактериями:
С6Н12О6
(гликолиз)
2СН3СОСООН
СН3-СО-~SKoA
НООС-СН2-СО-СООН
НАДН
1
НООС-СН-СО~SKoA
HS-KoA
Н3РО4
СН3СОО-Ф
АТФ
НАД
НООС-СН2-СНОН-СООН
СН3
6
AДФ
2
СН3СН2СО~SKoA 3
5
HOOC-CH=CH-COOH
НООС-СН2СН2СО~SкoA
СН3-СООН
H2O
ФАДН
4
ФАД
СН3СН2СООН
НООС-СН2СН2-СООН
Пояснения к схеме. Ключевой реакцией биосинтеза пропионовой кислоты
является транскарбоксилирование одной молекулы ПВК с молекулой
метилмалонилКоА (фермент 1 - метилманонитлКоА-карбоксилтранфераза
кофермент – биотин) с образованием пропионилКоА и ЩУК. Последняя
трансформируется в янтарную кислоту через стадии образования яблочной и
фумаровой кислот (ферменты: 2 - НАД-зависимая малат-дегидрогеназа; 3
- фумарат-гидратаза; 4 - ФАД-зависимая сукцинатдегидрогеназа). Янтарная
кислота вступает в реакцию с пропионилкоферментом А (фермент 5 -транстиоэстераза) с образованием конечного продукта и сукцинилКоА. Последний
трансформируется в метилмалонилКоА под действием фермента
6 - L-
10
11
метилмалонилКоА-мутазы
(кофермент
В12).
Оптимальные
условия
биосинтеза кислот бактериями P.ghermanii – температура 30оС, рН 5,0-6,0.
в клетках клостридий действует другой механизм образования пропионовой
кислоты:
НАДН
СН3-СО-СООН
НАД
Н2О
СН3-СНОН-СООН
СН2=СН-СО~SKoA
НSKoA
акрил-КоА
НАДН
НАД
СН3СН2СООН
СН3 СН2-СО~SKoA
В. 5. Принципы реализации биосинтетических процессов через ЦТК на
примере лимонной кислоты.
Некоторые микроорганизмы, в основном относящиеся к группе
мицелиальных
накапливать
грибов,
в
характеризуются
культуральной
уникальной
жидкости
способностью
значительные
количества
промежуточных продуктов цикла Кребса, в первую очередь, лимонной
кислоты.
Такой способностью обладают грибы родов Penicillium, Mucor.Наиболее
широко применяются некоторые штаммы Asp.niger.
Грибы-продуценты
лимонной
кислоты
характеризуются
специфическими биохимическими свойствами:
1.
Введение
избыточного
количества
углеродсодержащих
соединений в цикл Кребса. Этот эффект обеспечивается благодаря
способности грибов к фиксации СО2 на ПВК с образованием оксалоацетата.
Другим механизмом восполнения промежуточных продуктов ЦТК является
глиоксилатный цикл.
11
12
2.
Активация фермента цитратсинтазы и ингибирование других
ферментов цикла, в первую очередь, изоцитратдегидрогеназы и αкетоглутаратдегидрогеназы.
3.
Повышенная
потребность
в
молекулярном
кислороде
на
реокисление образующихся в ЦТК восстановленных форм НАД и ФАД.
Оптимальные условия биосинтеза лимонной кислоты: температура
28-30оС; рН 2,0-4,0; интенсивная аэрация среды. Повышение температуры и
рН приводит к увеличению выхода других органических кислот, в первую
очередь, щавелевой и глюконовой.
Разработан альтернативный способ биосинтеза лимонной кислоты
дрожжами рода Candida (C.lipolytica) на н-алканах. Механизм биосинтеза в
данном случае аналогичен.
12
Скачать