0 Лекция № 10. ТОБ. Направленный синтез органических кислот и спиртов. План лекции 1. Биохимические закономерности гомоферментативного и гетероферментативного молочнокислого брожения. 2. Биохимизм спиртового брожения. Направленный синтез этанола. Особенности направленного синтеза глицерина. 3. Биохимические закономерности ацетоно-бутилового брожения. 4. Направленный синтез уксусной и пропионовой кислот. 5. Принципы реализации ьмосинтетических процессов через ЦТК на примере лимонной кислоты. В. 1. Биохимические закономерности гомоферментативного и гетероферментативного молочнокислого брожения. Молочнокислое распространенных брожение является одним из наиболее бродильных процессов. Данный вид брожения осуществляют микроорганизмы, Streptococcus, Leuconostoc. относящиеся Данные виды к родам Lactobacillus, объединены в группу молочнокислых микроорганизмов по способности утилизировать лактозу, глюкозу и галактозу с образованием молочной кислоты в качестве основного продукта метаболизма. По биохимическим закономерностям и составу продуктов метаболизма различают гомоферментативное и гетероферментативное молочнокислое брожение. Гомоферментативное брожение характерно тем, что основным и практически, единственным продуктом является молочная кислота. Суммарное уравнение процесса: С6Н12О6 + 2Н3РО4 + 2АДФ У гомоферментативных 2СН3СНОНСООН + 2АТФ + 2Н20 бактерий лишь около 3% субстрата превращается в клеточную массу, а выход молочной кислоты может составлять до 98%. 0 1 2 Промежуточные реакции катаболизма глюкозы протекают по гликолитическому пути. Микроорганизмы, способные ассимилировать лактозу, характеризуются наличием фермента -галактозидазы. Ключевая реакция процесса – восстановление ПВК до молочной катализируется двумя стереоспецифичными лактатдегидрогеназами. Коферментами L- и O-лактатдегидрогеназ является НАД, аллостерическим эффектором, повышающим активность фермента – фруктозо-1,6-дифосфат. Снижение концентрации субстрата приводит к подавлению активности лактатдегидрогеназ, в результате чего бактерии трансформируют ПВК в муравьиную, уксусную кислоты, этанол и другие продукты метаболизма, накапливая дополнительный запас энергии. Аналогичные процессы имеют место при смещении рН питательной среды в слабощелочную сторону. Таким образом, деление на гомо- и гетероферментативные культуры является весьма условным. Гетероферментативное брожение характеризуется образованием значительных количеств СО2; уксусной, пропионовой и других органических кислот; этанола и других метаболитов, являющихся производными ПВК. Данный тип молочнокислого брожения подразделяют на брожение идущее с выделением СО2 и без выделения СО2. Суммарные уравнения имеют вид: -в первом случае: С6Н12О6 + Н3РО4 + АДФ СН3СНОНСООН + СН3СН2ОН + СО2 + АТФ - во втором случае: С6Н12О6 + 5Н3РО4 + 5АДФ В обоих случаях 2СН3СНОНСООН + 3СН3СООН + 5АТФ расщепление глюкозы осуществляется по гексозомонофосфатному пути до стадии образования ксилулозо-5-фосфата. Последний под действием фермента фосфокетолазы расщепляется до 3фосфоглицеринового альдегида и макроэргического ацетилфосфата: 1 2 3 СН2ОН С=О СНО Н3РО4 НО-СН НС-ОН НС-ОН СН2О Ф СН3 СОО Ф Н2 О СН2О Ф Фосфоглицериновый альдегид включается в цепь превращений по механизму гомоферментативного брожения, а ацетилфосфат дает продукты гетероферментативного брожения. В. 2. Биохимизм спиртового брожения. Направленный синтез этанола. Особенности направленного синтеза глицерина. Процесс спиртового брожения используется в биотехнологии для получения этанола и, в меньших масштабах, глицерина. Суммарное уравнение процесса имеет вид: С6Н12О6 + 2Н3РО4 + 2АДФ 2С2Н5ОН + 2СО2 + 2АТФ Помимо основных продуктов брожения – этанола и СО2, всегда образуется некоторое количество побочных продуктов: глицерина, уксусной кислоты и др. Основные группы продуцентов этанола и условия, оптимальные для его биосинтеза, приведены в таблице: Группа продуцентов t, 0C рН Дрожжи Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia 30-35 4,5-5,5 Мезофильные бактерии Zymomonas mobilis 30-35 6,0-7,0 Термофильные бактерии Сlostridium thermosaccharolyticum; Thermoanaerobacter ethanolicus; Bacillus stearothermophiles Мицелиальные грибы Paecylomyces 71; Asp.niger 55-70 6,0-7,0 30-37 2,2-7,0 2 3 4 Субстраты, ассимилируемые различными возбудителями спиртового брожения, весьма разнообразны. Дрожжи рода Saccharomyces сбраживают глюкозу, фруктозу, маннозу, мальтозу; дрожжи рода Kluyveromyces – лактозу и галактозу; отдельные виды Candida и Pichia способны ассимилировать пентозы, в первую очередь, D-ксилозу; мицелиальные грибы утилизируют широкий спектр гексоз и пентоз. В зависимости от механизма утилизации углеродного субстрата возбудители спиртового брожения делят на три группы: 1-ая группа. Микроорганизмы, расщепляющие сахара по пути гликолиза до ПВК с последующим восстановлением до этанола. Ключевыми реакциями процесса являются декарбоксилирование ПВК и восстановление ацетальдегида до этанола. Первая из названных реакций катализируется ТПФ-зависимым ферментом пируватдекарбоксилазой, активируемым ионами Mg2+ : СООН С=О СН3 Реакция ТПФ, Mg2+ СНО СН3 СО2 образования этанола катализируется НАД-зависимой алкогольдегидрогеназой и является обратимой: СНО НАД НАД С2Н5-ОН СН3 К данной группе микроорганизмов относятся все перечисленные выше роды дрожжей, а также бактерии рода Сlostridium , Thermoanaerobacter и др. термофилы, вызывающие спиртовое брожение. 2-ая группа. Микроорганизмы, способные расщеплять углеводы до ПВК по пути Энтнера-Дудорова. К этой группе относятся Zymomonas mobilis, некоторые виды Pseudomonas. Дальнейшие превращения ПВК протекают по описанной выше схеме. 3 4 5 3-я группа. Микроорганизмы, гексозомонофосфатному пути до расщепляющие углеводы ксилулозо-5-фосфата. Это по гетеро- ферментативные молочнокислые микроорганизмы. Метаболические особенности биосинтеза глицерина связаны с обратимостью реакции образования этанола из ацетальдегида. В клетках многих микроорганизмов, в первую очередь, дрожжей в слабокислой среде (рН 5-6) равновесие данной реакции смещено вправо; в слабокислой среде (рН 8), влево. Данные эффект связан со способностью щелочных реагентов, например шидросульфита натрия, связывать альдегидную группу: H СН3 _ С =О OH + CH3 – C – SO3Na NaHSO3 H В следствие этого восстановленный НАД, образующийся в начале гликолиза «переключается» с реакции восстановления ацетальдегида на восстановление диоксиацетонфосфата с образованием глицерина: Глюкоза Фруктоза – 1,6- Ф СОН СН2ОН НС-ОН С =О СН2О Ф СН2О Ф НАД НАДН2 СОО Ф СН2ОН НСОН НС-ОН СН2О Ф СН3СОН С2Н5ОН АДФ АТФ + NaHSO3 СН2О Ф СН2ОН СН3СНОНSO3Na СНОН СН2ОН 4 5 6 Выход глицерина по данной реакции может достигать 30% от концентрации сброженного сахара. Наиболее активными продуцентами являются осмофильные дрожжи Pichia farinose; а также отдельные штаммы Sacchoromyces ronxii; Torulopsis magnolia; Kluyveromyces fragilis; Candida pseudotropicalis. В. 3. Биохимические закономерности ацетоно-бутилового брожения. Бактерии рода Clostridium вызывают брожения смешанного характера, протекающие в строго анаэробных условиях. Токсическое действие кислорода связано с отсутствием в клетках клостридий цитохромов и каталазы, а также с высоким содержанием флавиновых ферментов. Продуктами брожения, вызываемых клострилиями, в разных соотношениях могут быть кислоты (масляная, уксусная, молочная); спирты (бутанол, изопропанол,этанол); ацетон и газы (Н2 и СО2). Процессы продуктам. брожения Наиболее принято называть распространенным по основным является конечным бутанол-ацетон- изопропиловое брожение, чаще называемое ацетоно-бутиловым брожением. Этот тип брожения в обычных условиях вызывает большинство видов клостридий, в первую очередь, Cl.acetobutylicum. Бактерии Cl.butylicum вызывают бутанол-изопропиловое брожение, Cl.butyricum – масляноуксусное брожение. Биохимические процессы, протекающие при брожении, вызываемом клостридиями, представлены на обобщенной схеме. 5 6 7 ГЛЮКОЗА 2 ПВК 2SHKoA 2SHKoA 2 СН3-СОН 2 СН3СО~SKoA 4[H] 4[H] 2SHKoA 2 CH3COOH 1 H2O H2O СН3СOCH2CО~SKoA C2H5OH 2[H] CH3COCH2COOH SHKoA 2 8 ацетоуксусная к-та 9 CH3CHOHCH2CО~SKoA CH3-CO-CH3 β-оксибутирил-КоА Н2О 3 CH3CH2CH2CH2OH 2[H] 10 CH3CH=CH-CО~SKoA Кротонил-КоА 2[H] 2[H] 4 6 CH3CH2CH2C=O СО2 2[H] CH3CHOHCH3 Н2О CH3CH2CH2CО~SKoA 5 CH3CH2CH2CОOH 7 SHKoA SHKoA Ферменты: 1 - тиолаза; 2 - β-оксибутирил-КоА-дегидрогеназа; 3 - кротоназа; 4 - бутирил-КоА-дегидрогеназа; 5 - бутиральдегиддегидрогеназа; 6 - бутанолдегидрогеназа; 7 - бутираткиназа; 8 - ацетоацетил-КоФ-трансфераза; 9 - ацетоацетатдекарбоксилаза; 10 - изопропанолдегидрогеназа. Изучение кинетики накопления продуктов ацетоно-бутилового брожения позволяет разделить процесс на две фазы. В первую фазу идет активное образование кислот и быстрый рост клеток. По мере снижения рН и увеличения концентрации масляной кислоты повышается активность ферментов 5 , 6 , 8 , 9 . В результате чего брожение переходит во вторую фазу – накопление нейтральных продуктов. Кроме того, наличие в среде масляной кислоты индуцирует синтез фермента бутират-дегидрогеназы, 6 7 8 катализирующего непосредственную трансформацию масляной кислоты в бутанол: НАДН СН3СН2СН2СООН НАД СН3СН2СН2СН2ОН + Н2О Наиболее практическое знаяение из рассмотренных выше процессов имеет ацетоно-бутиловое брожение. Clostridium acetobutylicum имеет температурный оптимум развития в области 35-37оС; оптимальная область рН для образования нейтральных продуктов брожения – (4,2-5,5) ед. В случаях, когда целью является получение масляной кислоты, рН смещают в щелочную сторону, напримерЮ введением в среду мела. В. 4. Направленный синтез уксусной и пропионовой кислот. Уксусная кислота как продукт микробного синтеза может быть получена четырьмя способами. 1 способ. Окисление этанола уксуснокислыми бактериями. Бактерии родов Acetobacter (A.aceti; A.xylinum; A.peroxydans) и Gluconobacter (G.oxydans) способны ассимилировать углеводсодержащие и спиртосодержащие субстраты, накапливая в культуральной жидкости значительные количества ацетата. Они характеризуются специфическими культуральными и физиологическими свойствами: - высокая ацидофильность, растут при рН 4,0; оптимум 5,0-6,0; - бактерии – строгие анаэробы, повышенная чувствительность к недостатку кислорода связана с активностью фермента апиразы, под действием которого АТФ быстро гидролизуется и становится недоступной для метаболизма клеток; 7 8 - выраженная способность окислять органические вещества в частично окисленные продукты, наиболее характерна способность окислять этанол в уксусную кислоту. Схема биосинтеза уксусной кислоты: 9 НАД СН3СН2ОН НАДН Н2 О СН3СНО НАД НАДН СН3СН(ОН)2 ацетальдешидгидрат СН3СООН Н 2О На первом этапе этанол окисляется до ацетальдегида при участии НАД (НАДФ) – зависимой алкагольдегидрогеназы; далее происходит гидратация ацетальдегида и повторное окисление, катализируемое НАД (НАДФ) – зависимой ацетальдегидрогеназой. Оптимальными условиями биосинтеза уксусной кислоты бактериями Acetobacter aceti являются: температура 30оС; рН 5,0-6,0; интенсивная аэрация среды; состав исходного субстрата – этанол и уксусная кислота в соотношении 5,5% : 7,5%. 2 способ Образование уксусной кислоты гомоацетогенными бактериями. Бактерии Cl.aceticum; Cl.thermoautofrophicim; Eubacterium limosum и др. виды способны в анаэробных условиях утилизировать гексозы, пентозы и молочную кислоту, образуя ацетат в качестве единственного продукта метаболизма. Некоторые виды этой группы, например Acetoanaerobicum woodii, Cl.thermoaceticum и Cl.formiaceticum, способны синтезировать уксусную кислоту в результате ассимиляции муравьиной кислоты и фиксации СО2. Оптимальные условия для биосинтеза уксусной кислоты бактериями Cl.thermoaceticum: температура 60оС; рН 6,7-7,4; условия строго анаэробные. Обобщенная схема процесса: 8 9 ГЛЮКОЗА СН3-СО-СООН SKoA СН3-СО-СООН НАД Fd СО2 FdH2 Н2 О СО2 СН3-СО~SKoA СН3СООН НАДН2 НСООН SKoA Н3РО4 ТНF НСОО~ТНF CH3-COO-Ф АДФ НАДН АТФ НАД СН3-СООН Н2 О СН2 = ТНF НАДН НАД СН3 - ТНF ТНF В12 СН3 – В12 В12 СН3СООН 3 способ. Биосинтез уксусной кислоты молочнокислыми бактериями помеханизму гетероферментативного молочнокислого брожения с фиксацией СО2. Метод не перспективен для получения уксусной кислоты как целевого продукта. 4 способ. Биосинтез уксусной кислоты по механизму пропионовокислого брожения. Возбудителями пропионовокислого брожения являются бактерии рода Propionibacterium (P.shermanii; P.pentosaceum; P.prendenreichii) и некоторые виды клостридий (Cl.propionicum). Специфическим свойством данной группы факультативно анаэробных 9 10 микроорганизмов является способность ассимилировать гексозы и, реже пентозы с образованием пропионовой и уксусной кислот: 3С6Н12О6 + 8АДФ +8Н3РО4 4СН3СН2СООН + 2СН3СООН + 2СО2+ 8АТФ Схема биосинтеза кислот пропионовокислыми бактериями: С6Н12О6 (гликолиз) 2СН3СОСООН СН3-СО-~SKoA НООС-СН2-СО-СООН НАДН 1 НООС-СН-СО~SKoA HS-KoA Н3РО4 СН3СОО-Ф АТФ НАД НООС-СН2-СНОН-СООН СН3 6 AДФ 2 СН3СН2СО~SKoA 3 5 HOOC-CH=CH-COOH НООС-СН2СН2СО~SкoA СН3-СООН H2O ФАДН 4 ФАД СН3СН2СООН НООС-СН2СН2-СООН Пояснения к схеме. Ключевой реакцией биосинтеза пропионовой кислоты является транскарбоксилирование одной молекулы ПВК с молекулой метилмалонилКоА (фермент 1 - метилманонитлКоА-карбоксилтранфераза кофермент – биотин) с образованием пропионилКоА и ЩУК. Последняя трансформируется в янтарную кислоту через стадии образования яблочной и фумаровой кислот (ферменты: 2 - НАД-зависимая малат-дегидрогеназа; 3 - фумарат-гидратаза; 4 - ФАД-зависимая сукцинатдегидрогеназа). Янтарная кислота вступает в реакцию с пропионилкоферментом А (фермент 5 -транстиоэстераза) с образованием конечного продукта и сукцинилКоА. Последний трансформируется в метилмалонилКоА под действием фермента 6 - L- 10 11 метилмалонилКоА-мутазы (кофермент В12). Оптимальные условия биосинтеза кислот бактериями P.ghermanii – температура 30оС, рН 5,0-6,0. в клетках клостридий действует другой механизм образования пропионовой кислоты: НАДН СН3-СО-СООН НАД Н2О СН3-СНОН-СООН СН2=СН-СО~SKoA НSKoA акрил-КоА НАДН НАД СН3СН2СООН СН3 СН2-СО~SKoA В. 5. Принципы реализации биосинтетических процессов через ЦТК на примере лимонной кислоты. Некоторые микроорганизмы, в основном относящиеся к группе мицелиальных накапливать грибов, в характеризуются культуральной уникальной жидкости способностью значительные количества промежуточных продуктов цикла Кребса, в первую очередь, лимонной кислоты. Такой способностью обладают грибы родов Penicillium, Mucor.Наиболее широко применяются некоторые штаммы Asp.niger. Грибы-продуценты лимонной кислоты характеризуются специфическими биохимическими свойствами: 1. Введение избыточного количества углеродсодержащих соединений в цикл Кребса. Этот эффект обеспечивается благодаря способности грибов к фиксации СО2 на ПВК с образованием оксалоацетата. Другим механизмом восполнения промежуточных продуктов ЦТК является глиоксилатный цикл. 11 12 2. Активация фермента цитратсинтазы и ингибирование других ферментов цикла, в первую очередь, изоцитратдегидрогеназы и αкетоглутаратдегидрогеназы. 3. Повышенная потребность в молекулярном кислороде на реокисление образующихся в ЦТК восстановленных форм НАД и ФАД. Оптимальные условия биосинтеза лимонной кислоты: температура 28-30оС; рН 2,0-4,0; интенсивная аэрация среды. Повышение температуры и рН приводит к увеличению выхода других органических кислот, в первую очередь, щавелевой и глюконовой. Разработан альтернативный способ биосинтеза лимонной кислоты дрожжами рода Candida (C.lipolytica) на н-алканах. Механизм биосинтеза в данном случае аналогичен. 12