ПРОХОРОВИЧ МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА Генетика – 03.00.15 диссертации на соискание ученой степени
реклама
На правах рукописи ПРОХОРОВИЧ МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ХРОМОСОМНЫЕ АНОМАЛИИ В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА hESM01-04 Генетика – 03.00.15 АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2009 1 Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук Рубцов Николай Борисович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Серов Олег Леонидович кандидат биологических наук Лебедев Игорь Николаевич Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва Защита диссертации состоится ______________ 2009 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)33312-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан « __ » __________ 2009 г. Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время возможности практического использования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека привлекают все более пристальное внимание. Все существующие линии ЭСК человека имеют такие общие характеристики как способность к самовоспроизведению, экспрессия специфических маркёров, способность к дифференцировке. В то же время появляется всё больше работ, в которых выявляются различия между разными линиями ЭСК. Несомненно, что генетическая нестабильность и связанное с ней изменение паттерна экспрессии генов могут давать вклад как в потенциал дифференцировки линий ЭСК человека, так и в процесс формирования клетками опухолевого фенотипа (Enver et al., 2005). Это существенно ограничивает возможности практического применения клеточных технологий на основе ЭСК. В то же время, при условии детального описания перестроенных хромосом, сублинии ЭСК с аномальным кариотипом могут оказаться мощным инструментом для изучения роли конкретных хромосомных районов в поддержании плюрипотентности ЭСК и определении спектра их возможной дифференцировки, а также механизмов формирования ряда патологий, сопровождающих раннее развитие эмбрионов, клетки которых отягощены аналогичными аномалиями. Несмотря на интенсивные исследования в этой области информация в отношении ограниченной стабильности и кариотипа противоречивой. В ЭСК человека литературе остается наряду с весьма данными, свидетельствующими о стабильности кариотипа ЭСК человека при их культивировании in vitro, представлены факты появления в кариотипе ЭСК хромосомных аномалий и описаны примеры изменения ряда свойств ЭСК, сопутствующие таким аномалиям. В настоящее время актуальным является не только детальный анализ хромосомных перестроек и сопутствующих им изменений экспрессии генов, но также и выяснение влияния хромосомных перестроек на общую архитектонику интерфазных ядер ЭСК человека. Результаты исследований, проведенных в последние годы, показали, что трёхмерная организация интерфазного ядра является одним из факторов регуляции генной экспрессии (Cremer, Cremer, 3 2001). Однако пока опубликована всего одна работа, посвящённая исследованию трёхмерной организации интерфазных ядер ЭСК человека (Wiblin et al., 2005). Полученные в этой работе результаты указывают на то, что архитектоника ядер ЭСК имеет ряд особенностей в сравнении с организацией ядер других типов клеток. В связи с этим исследования локализации и пространственной организации хромосом в ядрах ЭСК человека представляют особый интерес. Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является определение закономерностей реорганизации кариотипа эмбриональных стволовых клеток человека серии hESM и сопутствующих им изменений в процессе культивирования in vitro. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1) провести на разных пассажах кариотипирование четырёх независимо полученных линий ЭСК человека (hESM01, hESM02, hESM03 и hESM04) при культивировании их в виде набора индивидуальных сублиний; 2) при выявлении аномальных хромосом провести их детальный молекулярноцитогенетический анализ; 3) провести сравнительный анализ характеристик ЭСК исходных линий hESM01-04 и сублиний с выявленными хромосомными перестройками; 4) разработать метод визуализации и идентификации хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога в трёхмерном пространстве интерфазного ядра ЭСК; 5) провести оценку влияния хромосомных перестроек на положение хромосом в интерфазных ядрах ЭСК. Научная новизна и практическая ценность работы. Показана возможность сохранения нормального кариотипа эмбриональными стволовыми клетками человека серии hESM при длительном культивировании, что является необходимым условием для получения большого количества этих клеток и их практического использования. Выявлены и детально охарактеризованы аномальные хромосомы, являющиеся производными хромосом 9 и 18, аналогичные ранее описанным аномалиям у пациентов с рядом патологий. Выделенные сублинии ЭСК с соответствующими хромосомными перестройками 4 могут способствовать созданию экспериментальной модели для изучения механизмов развития таких патологий и способов их профилактики. Разработаны одновременную методы, визуализацию которые впервые хромосомных позволили территорий провести перестроенных хромосом и их нормальных гомологов в трёхмерном пространстве интерфазных ядер ЭСК. Впервые для визуализации целых хромосомных территорий были использованы микродиссекционные ДНК-пробы. Впервые проведено сравнение положения отдельных хромосом и их перестроенных гомологов в интерфазных ядрах ЭСК человека, а также расположения гомологичных районов в составе хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога. Апробация работы. Результаты работы были представлены: на конференции "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты", Москва, 17-18 ноября 2005; на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток, Звенигород, 12-16 декабря 2005; на первом конгрессе Германского общества исследователей стволовых клеток, Cologne, Германия, июль 2006; на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», СанктПетербург, 17 - 19 октября 2006; на отчётной сессии ИЦиГ, Новосибирск, февраль 2007; на Британско-Российском совещании “Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации”, Москва, март 2007; на XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научнотехнический прогресс», Новосибирск, апрель 2007; на II Региональной конференции молодых учёных им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 27 апреля 2007; на Международной молодёжной научно-методической конференции, Томск, 9-12 мая 2007; на II съезде Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007. Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 в рецензируемых журналах из списка ВАК. Ещё одна работа принята в печать в журнал “Cell cycle”. Вклад автора. Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, по результатам которых написана данная 5 работа. Культивирование ЭСК проводилось совместно с к.б.н. М.А. Лагарьковой (ИОГен РАН). Получение микродиссекционных проб и визуализация хромосомных территорий в трёхмерном пространстве интерфазного ядра проводилось совместно с д.б.н. Н.Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В. Карамышевой. Большая часть экспериментов была проведена автором самостоятельно. Личный вклад автора в работу является определяющим. Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (133 ссылки). Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 4 таблицы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы четыре исходные линии ЭСК человека: hESM01, hESM02, hESM03 и hESM04, полученные в Институте биологии гена РАН (Киселёв и др., 2006; Lagarkova et al., 2006). К моменту начала настоящей работы было показано, что клетки hESM01-04 в ходе длительного культивирования (десятки пассажей) сохраняют маркёры, типичные для плюрипотентных клеток (Oct4, Nanog, Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4, щелочная фосфатаза); способны формировать эмбриоидные тельца; при введении бестимусным мышам формируют опухоли, в состав которых входят тканеподобые структуры, аналогичные производным трёх зародышевых листков (Киселёв и др., 2006; Lagarkova et al., 2006). Получение эмбриоидных телец и иммуноокрашивание на специфические маркёры проводилось по общепринятым методикам с некоторыми модификациями (Киселёв и др., 2006; Lagarkova et al., 2006). Дифференциальное окрашивание хромосом также проводили по общепринятым методикам с некоторыми модификациями (Seabright, 1971; Samner, 1972; Bayani, Squire, 2004). Микродиссекцию хромосом проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном микроманипулятором IR (Zeiss) (Rubtsov et al., 2000). Амплификацию ДНК диссектированного материала проводили в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером MW6 (Karamysheva et al., 2001). Супрессионную гибридизацию in situ проводили, как описано в работе 6 Пинкеля с соавторами (Pinkel et al., 1986), с модификациями. Изображения метафазных пластинок регистрировали и обрабатывали с помощью программы ISIS5 фирмы METASystems GmbH. 3D FISH и иммуноокрашивание проводили так, как описано в работе Соловей с соавторами (Solovei et al., 2002). Микроскопию в светлом поле, флуоресцентную и лазерную сканирующую микроскопию проводили на микроскопе AXIOPlan2 Imaging (ZEISS), оборудованном Paco CCD-камерой и системой фильтров CHROMA, микроскопе AXIOSKOPE 2 Plus (ZEISS) c охлаждаемой CCD-камерой AXIOCAM HRc. Лазерную сканирующую микроскопию проводили на конфокальном микроскопе LSM510META (ZEISS). В работе было использовано оборудование Центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Кариотипирование линий hESM01-04 и полученных из них фибробластоподобных производных С помощью GTG- и DAPI-дифференциального окрашивания хромосом был проведён анализ кариотипа четырех линий клеток hESM01-04, каждая из этих линий была представлена серией сублиний, выделенных на разных пассажах. Для каждой линии анализ кариотипа был проведен на нескольких пассажах, разнесённых во времени. Было показано, что в ходе культивирования в большинстве сублиний сохранялся нормальный кариотип. На основе клеток hESM01, hESM03 и hESM04, сохранивших нормальный кариотип, был получен ряд культур дифференцированных фибробластоподобных клеток. Цитогенетический анализ таких клеток не выявил хромосомных аномалий. В одной из сублиний hESM01 (сублиния hESM01r18) после 20-го пассажа были выявлены клетки, несущие аномальную хромосому r(18) (рис. 1а), которые уже через несколько пассажей составляли подавляющее большинство клеток этой сублинии. В одной из сублиний hESM03 после 30-го пассажа была выделена сублиния hESM03der9, отягощённая перестроенными хромосомами del(4) и der(9) (рис. 1б). С помощью иммуноокрашивания было показано, что в клетках hESM01r18 и hESM03der9 присутствует тот же набор «маркёров плюрипотентности», который был выявлен ранее в клетках исходных линий 7 hESM01 и hESM03 с нормальным кариотипом (Oct4, Nanog, Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4, щелочная фосфатаза). Как было показано в результате анализа эмбриоидных телец, несмотря на сохранение этих маркёров, способности к дифференцировке клеток hESM01r18 оказались существенно снижены, а пролиферативные свойства повышены по сравнению с аналогичными свойствами клеток исходной линии. Это указывает на то, что данных по изучению экспрессии только перечисленных выше «маркёров плюрипотентности» может оказаться недостаточно для полной характеристики свойств ЭСК. Рисунок 1. Метафазные пластинки клеток сублиний hESM01r18 и hESM03der9. а – Сублиния hESM01r18. Кариотип 46,ХХ,r(18). GTG-дифференциальное окрашивание. Объектив х63. Стрелки указывают на хромосомы 18 и r(18). б – Сублиния hESM03der9. Кариотип 46,XX,del(4),der(9). Окраска DAPI (инвертированный бэндинг). Объектив х100. Стрелки указывают на хромосомы 4, del(4), 9 и der(9). Молекулярно-цитогенетический анализ хромосомных аномалий в клетках hESM01r18 и hESM03der9 Молекулярно-цитогенетический анализ аномальной хромосомы в клетках hESM01r18 Для детального описания хромосомы r(18) была получена микродиссекционная ДНК-проба (r18) из материала этой хромосомы. FISH полученной пробы с метафазными хромосомами клеток линии hESM01r18 (рис. 2) и метафазными хромосомами здорового донора показала, что аномальная хромосома представляет собой r(18)(::p11.31→q21.2::q21.2→p11.31::). В литературе представлены данные о многочисленных аномалиях развития пациентов с врождённой хромосомной патологией r(18). В нескольких случаях 8 точки разрывов, сопровождавших формирование перестроенных хромосом в клетках пациента, произошли в районах 18р11.3 и 18q21. В связи с этим, клетки hESM01r18 представляют особый интерес при изучении механизмов развития аномалий, ассоциированных с дериватами хромосомы 18. Рисунок 2. FISH ДНК-пробы r18 (зелёный) с хромосомами клеток линии hESM01r18 (окраcка DAPI). Стрелки указывают на хромосомы 18 и r(18). Молекулярно-цитогенетический анализ аномальных хромосом в клетках hESM03der9 На основании анализа GTG-дифференциальной исчерченности хромосом (рис. 1б) во всех клетках сублинии hESM03der9 было выявлено по две аномальные хромосомы. Одна из них была идентифицирована как del(4), вторая - dup(9). Для уточнения точек разрывов и воссоединений, которые имели место при реорганизации хромосом, были получены специальные микродиссекционные ДНК-пробы и проведена FISH. Рисунок 3. Определение границ района делеции в хромосоме der(4): а – FISH ДНКпробы del4 (зелёный сигнал), с хромосомами лимфоцитов взрослого человека (синий – окраска DAPI); б – инвертированный DAPI-бэндинг тех же хромосом. Стрелки указывают на точки разрывов, имевших место при возникновении делеции. 9 ДНК-проба для анализа района делеции в хромосоме 4 (del4) была получена сбором из одной метафазной пластинки пяти хромосом, по морфологии совпадающих с del(4), и последующей амплификацией ДНК собранного материала. Такой подход обеспечил наличие в ДНК-пробе материала хромосомы del(4) и исключил попадание в него ДНК из района делеции хромосомы 4. FISH этой ДНК-пробы с метафазными хромосомами клеток hESM03der9 и хромосомами здорового донора позволил описать аномальную хромосому как del(4)(q25q31.1) (рис. 3). Молекулярно-цитогенетический анализ хромосомы der(9) включал получение четырех районоспецифичных ДНК-проб (одна - из нормальной хромосомы 9 здорового донора, три - из der(9) клеток hESM03der9) и двух хромосомоспецифичных ДНК-проб: из нормальной хромосомы 9 и из хромосомы der(9). Схема микродиссекций для получения этих ДНК-проб приведена на рисунке 4. Результаты проведённой серии FISH c использованием полученных ДНК-проб позволили описать кариотип клеток hESM03der9 как 46,XX,del(4)(q25q31.1),dup(9)(q12q33). Рисунок 4. Схема микродиссекций при получении ДНК-проб из хромосом 9 и der(9). На рисунке приведены наименования ДНКпроб, и скобками обозначены районы хромосом, из материала которых были получены ДНК-пробы. Сравнительный анализ положения в интерфазном ядре нормальных хромосом и их дериватов В настоящее время получены многочисленные и разнообразные данные о наличии связи между положением хромосом и хромосомных районов относительно оболочки ядра, ядрышка, межхроматинового пространства с уровнем транскрипционной активности входящих в хромосомные районы генов (Gasser, 2002; Parada, Misteli, 2002; Mateos-Langerak et al., 2007). В этом отношении выявленные в hESM01r18 и hESM03der9 перестроенные хромосомы 10 представляют особый интерес: хромосома r(18), сохранив исходное общее соотношение числа GC и AT пар и размер, потеряла теломеры и приобрела форму кольца; der(9) в результате перестройки не только значительно увеличилась в размере, но также приобрела дополнительный С-позитивный район. В большинстве типов клеток человека центромерные районы располагаются на периферии интерфазного ядра (Gilbert et al., 2005). В единственной работе, посвящённой трёхмерной характеристике интерфазного ядра ЭСК человека (Wiblin et al., 2005), приведены данные о том, что в клетках H1, 7 и 9 наблюдается более часто расположение центромер во внутреннем компартменте ядра. Остаётся неизвестным, какие факторы обуславливают тот или иной тип локализации центромер. Рисунок 5. FISH ДНК-пробы, приготовленной на основе клонированного фрагмента ДНК из района делеции, (красный сигнал) с хромосомами клеток линии hESM01r18 (окраска DAPI). Стрелки указывают на хромосому r(18) и её нормальный гомолог. Разработка методов Рисунок 6. Ортогональная проекция результатов микроскопии 3D FISH с ядрами клеток линии hESM01r18: хромосомы 18 и r(18) (зелёный сигнал). Ядра окрашены DAPI, красный сигнал маркирует нормальный гомолог хромосомы 18. Аксиальный оптический срез – в центре, фронтальный – сверху, сагиттальный – справа. идентификации хромосомных территорий нормальных гомологов и дериватов хромосом При выполнении этой работы впервые микродиссекционные пробы были использованы для визуализации целых хромосомных территорий в интерфазных ядрах, сохранивших свою трехмерную организацию. 11 ДНК-проба для идентификации хромосомной территории нормальной хромосомы 18 и её деривата была получена на основе BACа, содержащего фрагмент ДНК, отсутствующий в хромосоме r(18). FISH этой ДНК-пробы с метафазными хромосомами клеток hESM01r18 давал интенсивный сигнал на хромосоме 18 и не давал сигнала на хромосоме r(18) (рис. 5). Использование этой ДНК-пробы совместно с ДНК-пробой, окрашивающей всю хромосому 18, позволило визуализировать и различать территории хромосомы 18 и её деривата (рис. 6). Для визуализации и идентификации в интерфазном ядре хромосомных территорий хромосом 9 и её деривата были использованы ДНК-пробы WCP9 и РСР9С, одна из которых (РСР9С) окрашивала С-позитивные районы хромосом 9 и её деривата, а другая (WCP9) – обе хромосомы полностью (рис. 7). FISH РСР9С с сохранившими трехмерную организацию интерфазными ядрами давала на территории der(9), в отличии от хромосомы 9, два сигнала (рис. 8). Рисунок 7. FISH проб WCP9 (красный) и РСР9С (зелёный) с хромосомами клеток линии hESM03der9 (окраcка DAPI). Жёлтый цвет - результат совмещения красного и зелёного сигналов близкой интенсивности. Рисунок 8. 3D-FISH проб WCP9 (зелёный) и РСР9С (красный) с интерфазным ядром клеток линии hESM03der9 (серый цвет окраcка DAPI). Реконструкция трехмерной организации ядра из серии оптических срезов. Сравнительный анализ локализации хромосом 18 и r(18) Данные многочисленных исследований (Croft et al., 1999; Cremer et al., 2001; Cremer, Cremer, 2001) указывают, что транскрипционо неактивный хроматин и хроматин с низкой транскрипционной активностью локализованы преимущественно в районах, прилежащих к ядерной мембране и ядрышку. В 12 связи с этим при выполнении данной работы был проведён анализ положения хромосомных территорий или их районов относительно периферической области ядра и ядрышек. Для определения границы ядра при проведении конфокальной микроскопии анализировали ядра, окрашенные DAPI. Периферическую область ядра определяли как границу окрашенного DAPI материала (Cremer et al., 2001). Иммуноокрашивание с использованием антител, специфичных к протеину B23, являющемуся белковым компонентом ядрышка, и последующая конфокальная микроскопия 45-ти ядер клеток hESM01r18 показали, что локализация протеина B23 совпадает с внутриядерными областями, неокрашивающимися DAPI. Аналогичные результаты были получены при анализе ядрышек в клетках hESM01, hESM03, hESM03der9 и их дифференцированных производных. Сравнение положения хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата в клетках hESM01r18 было выполнено на основании данных конфокальной микроскопии 90 диплоидных интерфазных ядер клеток «молодых» колоний, занимающих в колониях сходные позиции. Для каждой из 180-ти проанализированных хромосомных территорий был определён район локализации относительно границы ядра и ядрышек. Из всех теоретически возможных положений были обнаружены только пять вариантов, которые приведены на рисунке 9. Рисунок 9. Варианты локализации хромосомы 18 и её деривата. Хромосомная территория (ХТ) прилегает одновременно к верхней, нижней и боковой границе ядра (1); ХТ прилегает к верхней и нижней границе ядра (2); ХТ прилегает к границе ядра и граничит с ядрышком (3); ХТ прилегает к ядрышку (4); ХТ прилегает к двум ядрышкам (5). Чёрным цветом обозначены ядрышки (Я). Полученные данные сведены в таблицу 1. Сравнение представленных в таблице 1 результатов с помощью критерия χ2 позволяет утверждать, что положение хромосомных территорий нормального и перестроенного гомологов различаются с уровнем значимости менее 0,01. 13 Таблица 1. Локализация территорий хромосомы 18 и её деривата в ядрах клеток hESM01r18. Обозначения вариантов локализации приведены на рисунке 9. Число хромосом с соответствующим вариантом локализации Вариант локализации 1 2 3 4 5 хромосома 18 10 19 56 2 3 хромосома r(18) 16 35 34 5 0 Материал хромосомы r(18) чаще локализован в районах, прилежащих к границе ядра, чем материал нормального гомолога этой хромосомы. Причины таких различий остаются невыясненными. Возможно это связано с отсутствием в r(18) теломерных районов и (или) кольцевой организацией хромосомы. Так, кольцевая форма может способствовать более компактному расположению материала хромосомы в интерфазном ядре. Не ясна и роль теломерных районов хромосом в определении положения хромосомы в ядрах эмбриональных стволовых клеток человека. Однако можно с уверенностью утверждать, что сублинии hESM01 и hESM01r18 различаются не только наличием в hESM01r18 частичной трисомии и частичной моносомии по хромосоме 18, но и некоторыми характеристиками трёхмерной организации их интерфазных ядер. Сравнительный анализ положения хромосом 9 и der(9) Анализ положения хромосом 9 и der(9) показал, что в большинстве проанализированных ядер клеток hESM03der9 хромосома der(9) занимает такое положение, при котором один её район прилегает к верхней границе ядра, а другой – к нижней. Это, вероятно, обусловлено уплощенной формой ядер hESM03der9 и большим размером хромосомы der(9). При анализе особое внимание было уделено локализации С-позитивных районов хромосом 9 и der(9). Эти районы интенсивно окрашивались FISH ДНК-пробы PCP9C (рис. 7, 8). С помощью конфокальной микроскопии и двухцветной FISH ДНК-проб PCP9C и WCP9 была изучена локализация прицентромерных районов нормального гомолога и der(9), а также дополнительного С-позитивного района хромосомы der(9), который значительно уступал им по размеру. Положение этих районов относительно периферической области ядра и ядрышек было проанализировано в 97 ядрах клеток hESM03der9 и в 87 ядрах их дифференцированных фибробластоподобных производных. Было показано, что 14 в клетках обоих типов все они локализуются предпочтительно вблизи границы ядра (рис. 10, табл. 2). Рисунок 10. Локализация хромосом 9 и её деривата. Чёрным цветом обозначены ядрышки (Я). 0 – район не прилегает ни к границе ядра, ни к ядрышку; 1 – район прилегает к верхней, нижней или боковой границе ядра; 2 – район прилегает и к верхней, и к нижней границе ядра; 3 – район прилегает одновременно и к границе ядра, и к ядрышку; nu – район граничит с ядрышком. Таблица 2. Локализация С-позитивных районов хромосом 9 и der(9) в ядрах клеток hESM03der9 и их дифференцированных производных. Число районов с соответствующим вариантом локализации районы Дополнительный район der(9) Вариант локали- 0 зации* Дифные 0 клетки hESM 11 03der9 Прицентромерный район der(9) Прицентромерный район хромосомы 9 1 2 3 nu 0 1 2 3 nu 0 1 2 3 nu 72 0 13 2 0 50 15 21 0 0 54 12 20 0 52 0 16 18 4 40 4 32 17 1 60 2 21 13 Обозначения приведены на рисунке 10. Полученные данные свидетельствуют о том, что для всех С-позитивных районов наиболее характерным является положение в периферической области ядра. Однако, как и в исследовании, представленном Виблин с соавторами (Wiblin et al., 2005), в клетках hESM03der9 прицентромерные районы и дополнительный С-позитивный район оказывались локализованными во внутреннем компартменте несколько чаще, чем в случае полученных из hESM03der9 дифференцированных клеток. Связано ли это с неизвестными особенностями организации интерфазного ядра эмбриональных стволовых клеток или причиной являются различия в размере и форме ядер остается неясным. Тем не менее, полученные в настоящем исследовании результаты указывают на то, что при изучении эмбриональных стволовых клеток необходимо учитывать не только численные и структурные изменения хромосом, но и возможные изменения архитектоники интерфазных ядер. 15 ВЫВОДЫ 1. Показано, что возникновение аномальных хромосом в культурах hESM01-04 может сопровождаться их быстрой фиксацией в отдельных сублиниях, что однако не является следствием общей дестабилизации кариотипа исходной культуры. При культивировании, проводимом с регулярной криоконсервацией клеток и их хромосомным анализом, возможно длительное поддержание линий ЭСК hESM01-04 с сохранением нормального кариотипа. 2. Получены две сублинии ЭСК, отягощённые аномальными хромосомами, которые были детально охарактеризованы с помощью комплекта микродиссекционных ДНК-проб и флуоресцентной гибридизации in situ. Показано, что кариотип сублинии hESM01r18 46,ХХ,r(18)(::p11.31→q21.2::q21.2→p11.31::), а представляет сублинии собой hESM03der9 = 46,XX,del(4)(q25q31.1),dup(9)(q12q33). 3. Показано, что при сохранении «маркёров плюрипотентности» способности к прохождению дифференцировки ЭСК, отягощённых выявленными хромосомными аномалиями, снижены по сравнению с клетками исходных линий. 4. Создан набор ДНК-проб и разработан вариант проведения трёхмерной гибридизации in situ, позволяющие визуализировать и идентифицировать в интерфазных ядрах клеток hESM01r18 и hESM03der9 территории аномальных хромосом r(18) и der(9) и их нормальных гомологов. 5. Показано, что положение аномальной хромосомы r(18) относительно периферической области ядра и ядрышек в интерфазных ядрах клеток hESM01r18 отличается от положения нормального гомолога хромосомы 18 в этих же ядрах; дуплицированный район хромосомы der(9), содержащий ДНК, гомологичную ДНК прицентромерного С-позитивного района, локализуется предпочтительно в периферической области ядра, также как и С-позитивные прицентромерные районы хромосом 9 и der(9). 16 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1) М.А. Прохорович, А.Г. Шилов, Н.Б. Рубцов, С.Л. Киселев, М.А.Лагарькова «Метод быстрого и эффективного кариотипирования эмбриональных стволовых клеток человека». "КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ" Информационный бюллетень, С.-Петербург. 2006. Вып. 21. Стр 65-68; 2) С.Л. Киселев, П.Ю. Волчков, Е.С. Филоненко, М.А. Прохорович, И.А. Муфазалов, А.В. Лякишева, М.А. Лагарькова «Молекулярная и клеточная биология линий ЭСК человека». Молекулярная медицина. 2006. №2. Стр. 6-11; 3) П.Ю. Волчков, М.А. Лагарькова, М.А. Прохорович, С.Л. Киселев «Двойной негативный контроль генов, контролирующих направленную дифференцировку ЭСК человека в эндотеолий». Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. №2. Стр. 34-39; 4) М.А. Прохорович, М.А.Лагарькова, А.Г. Шилов, Т.В. Карамышева, С.Л. Киселёв, Н.Б. Рубцов «Культуры эмбриональных стволовых клеток человека: хромосомные перестройки и стабильность кариотипа». Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007. №3. Стр. 43-46; 5) Н.Б. Рубцов, М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, Т.В. Карамышева, С.Л. Киселёв «Цитогенетика стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека hESM0104». Медицинская генетика. 2007. Т. 6. №8(64). Стр. 11-16. 6) (In print.) M.A. Lagarkova, P. Y. Volchkov, E.S. Philonenko, K. Pfannkuche, M.A. Prokhorovich, T. Zabotina, J. Hescheler, S.L. Kiselev «CD 30 is a marker of undifferentiated human embryonic stem cells rather than a biomarker of transformed hESCs». Cell Cycle. 2008. V. 7(22) P. 3475-3480. 7) М.А. Прохорович, Т.В. Карамышева, М.А. Лагарькова, Н.Б. Рубцов «Структурная реорганизация хромосомы 18 и её положение в интерфазном ядре эмбриональной стволовой клетки человека» Международная молодёжная научно-методическая конференция. Сборник материалов Конференции, стр. 150. Томск 9-12 мая 2007; 8) Т.В. Карамышева, М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, С.Л. Киселёв, Н.Б. Рубцов «Получение микродиссекционных хромосомо- и районоспецифичных зондов для анализа хромосомных перестроек в эмбриональных стволовых клетках человека». II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвящённой 50-летию Института цитологии РАН. Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007. Цитология. 2007. Т. 49. №9. Стр. 752; 9) Н.Б. Рубцов, Т.В. Карамышева, М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, С.Л. Киселёв «Положение аномальных хромосом в интерфазных ядрах эмбриональных стволовых 17 клеток человека». II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвящённой 50-летию Института цитологии РАН. Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007. Цитология. 2007. Т. 49. №9. Стр. 789; 10) А.А. Болтенгаген, В.В. Дёмина, М.А. Прохорович «Сравнение особенностей роста и протяжённости контактирующих поверхностей стволовых клеток разных типов». XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научнотехнический прогресс». Сборник материалов Конференции, стр. 41. Новосибирск, 2007; 11) Т.В. Карамышева, М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, Н.Б. Рубцов «Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа в диагностике онкологических заболеваний». II Региональной конференции молодых учёных им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии». Сборник материалов Конференции, стр. 32. Томск, 27 апреля 2007; 12) М.А. Прохорович, А.Г. Шилов, Е.С. Филоненко, М.А. Лагарькова, С.Л. Киселёв «Разработка быстрого метода кариотипирования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека». Конференция "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты". Сборник материалов Конференции, стр. 23. Москва, 17-18 ноября 2005; 13) С.Л. Киселев, М.А. Лагарькова, Е.С. Филоненко, М.А. Прохорович, П.Ю. Волчков "Молекулярная генетика линий ЭСК человека и проблемы направленной дифференцировки". VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток. Сборник материалов Конференции, стр 72. Звенигород, 12-16 декабря 2005; 14) М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова, Т.В. Карамышева, А.И. Железова, А.Г. Шилов, Н.Б. Рубцов, С.Л. Киселев «Особенности культивирования, дифференцировки и цитогенетические характеристики линий эмбриональных стволовых клеток человека, имеющих хромосомные аберрации» Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре». Санкт-Петербург, 17 - 19 октября 2006. Цитология. 2006. Т. 48. №9. Стр. 794; 15) М.А. Лагарькова, М.А. Прохорович, А.Г. Шилов, С.Л. Киселев, С. М. Закиян «Создание коллекции сравнительные линий характеристики эмбриональных клеточных стволовых линий» клеток Всероссийский человека: симпозиум «Биология клетки в культуре». Санкт-Петербург, 17 - 19 октября 2006. Цитология. 2006. Т. 48. №9. Стр. 776. 18
