Referat_Asanova_LDG - Институт фундаментальной биологии и

Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт фундаментальной биологии и биотехнологий
Кафедра биохимической физики
РЕФЕРАТ
По дисциплине:
«Информационно- коммуникационные технологии в естественнонаучных исследованиях»
011200.68.01 Магистерская программа Биофизика
«Преобразование Фурье в исследовании распределения триплетов в
геномах организмов»
Преподаватель
Студент
________
__________________
подпись, дата
должность, ученая степень
________
подпись, дата
Красноярск 2013
И.Е. Суковатая
А.А. Асанова
инициалы, фамилия
Оглавление
Введение ................................................................................................................... 1
Лактатдегидрогеназа ............................................................................................... 4
Методы определения активности лактатдегидрогеназы..................................... 4
Методы определения активности изоферментов лактатдегидрогеназы ........... 6
Список литературы: ................................................................................................ 7
Введение
Пищевые добавки во все возрастающих масштабах появляются в
современных продуктах питания, тем самым обрекая их потребителей на
ежедневное и бессознательное потребление. Ни одно из существующих
веществ не является универсальным, поэтому их разнообразие быстро растет.
В настоящее время объединенным комитетом ФАО/ВОЗ и ведущими
институтами питания всех стран активно ведутся работы по разработке
универсальной системы биомаркеров для определения степени воздействия
пищевых добавок на организм человека и четкого фиксирования верхнего
уровня потребления.
В настоящие время о токсичности пищевых добавок судят по
изменению внутренней морфологии мышей12 . Хотя в экспериментальной
токсикологии фактически нет данных, которые можно было бы легко
экстраполировать с животных на человека и ввиду большого количества
встречающихся эффектов можно дать лишь приблизительную оценку.
Эпидемиологические исследования, предпринимаемые для оценки
безопасности пищевых добавок, как правило, не достигали поставленных
целей из-за недостатка чувствительности этих исследований и проблем
идентификации контрольных популяций.3
Ферментативные методы биотестирования проявляют большую
чувствительность к исследуемым токсикантам, что говорит о том, что
исследование токсичности необходимо проводить на молекулярном уровне.
Представление о том, что в основе нормальной жизни лежит сложно
организованная сопряженная деятельность многих ферментных систем,
естественно позволяет предполагать, что проявления дезорганизации
отдельных звеньев этой деятельности может привести к различным
патологиям. Таким образом, по изменению активности ферментов под
действием исследуемых веществ можно судить о биохимических механизмах
воздействия этих веществ на организм человека. Действительно, включив в
систему ферменты, являющиеся представителями различных классов, или
ключевые ферменты метаболических процессов человеческого организма,
можно определить какая из функций жизнедеятельности будет угнетаться
тем или иным токсикантом, либо смесью токсических веществ4.
Лактатдегидрогеназа
Лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27; L-лактат: НАД-оксидоредуктаза;
ЛДГ) это предохранительный клапан в механизме производства энергии.
Большую часть времени, наши клетки используют глюкозу, синтезируя при
этом двуокись углерода и воду. Этот процесс требует много кислорода. Если
же кислорода недостаточно, механизм останавливает гликолиз.
Лактатдегидрогеназа это решение этой проблемы, по крайней мере,
временное5.
Лактатдегидрогеназа — фермент, катализирующий окисление Lмолочной кислоты (МК) до пировиноградной кислоты (ПВК) при участии
НАД. Реакция обратима, и равновесие реакции сдвинуто в сторону
образования молочной кислоты из пировиноградной (ПВК —> МК).
Оптимальная величина рН для образования молочной кислоты из
пировиноградной (МК —> ПВК) колеблется от 8,8 до 9,8, для превращения
пировиноградной кислоты в молочную при 37 °С — 7,4–7,8. Фермент
использует только L-молочную кислоту и НАД в качестве кофермента.
Оптимум рН реакции зависит от соотношения изоферментов в образце,
температуры реакции, концентрации субстрата и типа буферного раствора
Методы определения активности лактатдегидрогеназы
В настоящее время определение активности ЛДГ с помощью
оптического теста Варбурга является общепризнанной аналитической
процедурой, при этом в качестве субстрата может использоваться либо
молочная (МК), либо пировиноградная кислота (ПВК). Было предложено
множество методов определения активности ЛДГ, основанных на прямой
(МК —> ПВК) и обратной (ПВК —> МК) реакции. Прямая реакция обладает
рядом преимуществ: ингибирование фермента субстратом — лактатом —
меньшее, чем при использовании пирувата; НАД, используемый в прямой
реакции, содержит меньше ингибиторов ЛДГ, чем НАДН2, применяемый в
обратной реакции; линейная зависимость в прямой реакции сохраняется
дольше, чем при обратной. В связи с тем что большинство производителей
наладили выпуск коммерческих препаратов НАДН2, свободных от
ингибиторов ЛДГ, обратная реакция получает большее распространение.
Кроме того, преимущества обратной реакции определяются меньшей
стоимостью реактивов (из-за более низкой конечной концентрации в среде
измерения), высокой стабильностью рабочих растворов после разведения и
большей величиной изменения поглощения в единицу времени, что
обеспечивает более высокую точность определения.
В силу того, что в реакции, катализируемой ЛДГ:
равновесие смещено в сторону образования молочной кислоты,
использование пировиноградной кислоты в качестве субстрата более
предпочтительно. Как Германское, так и Скандинавское общества
клинической химии рекомендуют определять активность ЛДГ по
восстановлению пирувата: первый — в фосфатном буфере при рН 7,5 и 25
°С, второй — в трис-буфере при рН 7,4 и 37 °С .
Как имеющие исторический интерес следует сейчас рассматривать
колориметрические методы определения ЛДГ при участии 2,4-ДНФГ;
широко распространенные в 1970-х годах варианты методов с
использованием 2,6-дихлорфенолиндофенола или феназинметасульфата в
качестве промежуточного агента для переноса электронов от ДПН на соль
тетразолия. Несколько соединений были изучены на предмет их способности
действовать в качестве промежуточного переноса электрона реагентов, но
никто из них не превосходит феназинметасульфат по чувствительности и
простоте 67.
Кроме того в институте медпроблем народов Севера разработаны
методики количественного определения активности ферментов в лимфоцитах
крови биолюминесцентным методом с использованием бактериальной
люциферазы8.
Методы определения активности изоферментов лактатдегидрогеназы
Одним из методов определения активности изоферментов
лактатдегидрогеназы является энзимэлектрофорез. Разделение с
использованием электрофореза в гелях агарозы или мембранах ацетата
целлюлозы до сих пор остается наиболее часто используемой процедурой
определения изоферментов ЛДГ. Основу метода составляет разделение
образца сыворотки крови на носителе с последующим выявлением
активности фермента непосредственно на носителе. Носитель и
инкубационную среду инкубируют при 37 °С. НАДН2, образовавшийся в
зонах локализации ЛДГ, обнаруживают по флюоресценции в ультрафиолете
(365 нм) или по восстановлению солей тетразолия и образованию
окрашенного формазана (Рис.1)Error! Bookmark not defined..
Рисунок 1. Различные типы электрофореграмм изоферментов
лактатдегидрогензы
Список литературы:
Специальный технический регламент "О безопасности пищевых добавок":
постановление правительства. М., 2009.
1
Шаулина Л. П., Корсун Л.Н. Контроль качества и безопасности пищевых
продуктов и продовольственного сырья: уч. пособие. Ирк., 2011. с. 67-70
2
Принципы оценки безопасности пищевых добавок и контаминантов в
продуктах питания: Гигиенические критерии состояния окружающей среды/
Всемирная организация здравоохранения, Женева, 1991
3
4
Есимбекова Е.Н. Исследование чувствительности трехферментных систем с
бактериальной люциферазой при биотестировании водных экосистем/
Автореф.диссерт.соиск.к.б.н. Кр-ск, 2000.
5
Эл.ресурс http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=102
Берестовская В. С. Методы определения активности лактатдегидрогеназы /
Terra Medica Лабораторная диагностика, С-Пб, № 1 (17) 2008
6
7
Marvin M. Nachlas The determination of lactic dehydrogenase with a tetrazolium
salt/ Analytical Biochemistry, 1960, P. 317–326
8
Савченко А.А., Сунцова Л.Н.//Лабораторное дело.-1989.-№ 11.-С.23-25