Практическое использование ферментов в пищевой

Практическое использование ферментов в пищевой промышленности и других отраслях
Применение ферментных препаратов в отраслях пищевой промышленности позволяет
интенсифицировать технологические процессы, улучшать качество готовой продукции, увеличивать ее
выход, а также сэкономить ценное пищевое сырье. Особое внимание технологов и других специалистов,
перерабатывающих биологическое сырьё, привлекают ферменты первого класса – оксидоредуктазы и
третьего – гидролазы. При переработке пищевого сырья происходит разрушение клеток биологического
материала, повышается доступ кислорода к измельчённым тканям и создаются благоприятные условия
для действия оксидоредуктаз, а высвобождающиеся гидролазы расщепляют основные структурные
компоненты клетки - белки, липиды, полисахариды и гетерополисахариды.
Оксидоредуктазы
1. Полифенолоксидаза. Этот фермент известен под различными тривиальными названиями: одифенолоксидаза, тирозиназа, фенолаза, катехолаза и др. Фермент может катализировать окисление
моно-, ди-, и полифенолов. Типичная реакция, катализируемая полифенолоксидазой, имеет вид:
В зависимости от того, из какого источника выделен фермент, способность его к окислению
различных фенолов различна. С действием этого фермента связано образование темноокрашенных
соединений — меланинов при окислении кислородом воздуха аминокислоты тирозина. Потемнение
срезов картофеля, яблок, грибов, персиков и других растительных тканей в большей степени или
полностью зависит от действия полифенолоксидазы. В пищевой промышленности основной интерес к
этому ферменту сосредоточен на предотвращении рассмотренного нами ферментативного потемнения,
которое имеет место при сушке плодов и овощей, а также при производстве макаронных изделий из
муки с повышенной активностью полифенолоксидазы. Эта цель может быть достигнута путем тепловой
инактивации фермента (бланшировка) или добавлением ингибиторов (NaHSO3, SO2, NaCl).
Положительная роль фермента проявляется при некоторых ферментативных процессах: например, при
ферментации чая. Окисление дубильных веществ чая под действием полифенолоксидазы приводит к
образованию темноокрашенных и ароматических соединений, которые определяют цвет и аромат
черного чая.
2. Каталаза. Этот фермент катализирует разложение пероксида водорода по реакции:
2Н2О2 → О2 + 2Н2О
Каталаза относится к группе гемопротеиновых ферментов. Содержит 4 атома железа на одну
молекулу фермента. Функцией каталазы в живом организме является защита клетки от губительного
действия перекиси водорода. Хорошим источником для получения промышленных препаратов каталазы
являются культуры микроорганизмов и печень крупного рогатого скота. Каталаза находит свое
применение в пищевой промышленности при удалении избытка Н2О2 при обработке молока в
сыроделии, где пероксид водорода используется в качестве консерванта; а также совместно с
глюкозооксидазой применяется для удаления кислорода и следов глюкозы.
3. Глюкозооксидаза. Этот фермент представляет собой флавопротеид, в котором белок соединен с
двумя молекулами ФАД (активная форма витамина В2). Он окисляет глюкозу с образованием в
конечном счете глюконовой кислоты и обладает практически абсолютной специфичностью по
отношению к глюкозе. Суммарное уравнение имеет следующий вид:
Глюкоза + Н2О + О2 = глюконовая кислота + Н2О2
Высокоочищенные препараты глюкозооксидазы получают из плесневых грибов рода Aspergillus и
Penicillium. Препараты глюкозооксидазы нашли применение в пищевой промышленности как для
удаления следов глюкозы, так и для удаления следов кислорода. Первое необходимо при обработке
пищевых продуктов, качество и аромат которых ухудшаются из-за того, что в них содержатся
восстанавливающие сахара; например, при получении из яиц сухого яичного порошка. Глюкоза при
сушке и хранении яичного порошка, особенно при повышенной температуре, легко вступает в реакцию
с аминными группами аминокислот и белков. Порошок темнеет, и образуется ряд веществ с
неприятным вкусом и запахом. Второе — необходимо при обработке продуктов, в которых длительное
присутствие небольших количеств кислорода приводит к изменению аромата и цвета (пиво, вино,
фруктовые соки, майонез). Во всех подобных случаях в ферментную систему включают каталазу,
разлагающую Н2О2, которая образуется при реакции глюкозы с кислородом.
3. Липоксигеназа. Этот фермент катализирует окисление полиненасыщенных высокомолекулярных
жирных кислот (линолевой и линоленовой) кислородом воздуха с образованием высокотоксичных
гидроперекисей. Ниже приведена реакция, катализируемая этим ферментом:
R ....... СН2-СН=СН-СН2-СН=СН-СН2 ....... СООН
↓ + О2
R ....... СН2-СН=СН-СН=СН-С(ООН)Н-СН2 ....... СООН
Возможно образование и циклических гидроперекисей по следующей схеме:
Однако основное количество жирных кислот превращается в гидроперекиси, обладающие сильными
окислительными свойствами, и именно на этом основано использование липоксигеназы в пищевой
промышленности.
Липоксигеназа широко распространена в сое, пшенице и других злаках, в семенах масличных и
бобовых культур, в картофеле, баклажанах и т. д. Липоксигеназе принадлежит важная роль в процессах
созревания пшеничной муки, связанных с улучшением ее хлебопекарных достоинств. Образующиеся
под действием фермента продукты окисления жирных кислот способны вызывать сопряженное
окисление ряда других компонентов муки (пигментов, SH-групп клейковинных белков, ферментов и
др.). При этом происходит осветление муки, укрепление клейковины, снижение активности
протеолитических ферментов и другие положительные изменения. В разных странах разработаны и
запатентованы способы улучшения качества хлеба, основанные на использовании препаратов
липоксигеназы (главным образом, липоксигеназы соевой муки). Все они требуют очень точного
дозирования фермента, так как даже небольшая передозировка приводит к резко отрицательному
эффекту и вместо улучшения качества хлеба происходит его ухудшение. Интенсивное окисление
липоксигеназой свободных жирных кислот может сопровождаться вторичными процессами
образования веществ различной химической природы с неприятным вкусом и запахом, характерным
для прогорклого продукта. Более мягкий способ воздействия на компоненты муки и теста связан с
активацией собственной липоксигеназы муки путем некоторого варьирования технологического
процесса. При этом исключается эффект передозировки фермента со всем комплексом нежелательных
последствий.
Гидролитические ферменты
1. Липазы, или триацилглицероллипазы широко распространена в природе и играет важную роль в
процессах, протекающих при переработке и хранении пищевых продуктов. Обычно липазы
катализируют реакцию расщепления триглицеридов согласно приведенному ниже суммарному
уравнению:
Липазы различного происхождения сильно отличаются друг от друга по специфичности действия,
сродству к различным субстратам, растворимости, оптимуму рН и другим свойствам. Так, например,
липаза семян клещевины нерастворима в воде, имеет оптимум рН 4,7 — 5,0; панкреатическая липаза
растворима, и оптимум рН ее действия лежит в слабощелочной среде.
Зерновая липаза участвует в процессе порчи зерновых продуктов при хранении. Особенно это
касается продуктов, содержащих повышенное количество жира, например, овсяной муки или крупы,
пшена. Накопление свободных жирных кислот под действием липазы (рост кислотного числа жира) —
признак ухудшения качества продукта. Свободные жирные кислоты, особенно ненасыщенные, легко
подвергаются окислению под воздействием разных факторов: липоксигеназы, тепловой обработки,
кислорода воздуха, солнечного света и др. Таким образом, липазы могут инициировать процесс
прогоркания и ограничивать сроки хранения пищевых продуктов.
Одна из особенностей липаз связана с тем, что эти ферменты способны катализировать и обратную
реакцию, осуществлять синтез сложных эфиров, а также производить переэтерефикацию
триглицеридов, т. е. изменять их жирнокислотный состав. На этом основании разрабатываются способы
получения новых форм жировых продуктов с использованием специфических липаз. Так, например,
путем реакции переэтерификации делаются попытки получения жира — аналога масла какао из
дешевого исходного сырья.
Липазы используются в кондитерском производстве. Молочные ингредиенты широко применяются
при производстве кондитерских изделий, они в значительной мере обуславливают их аромат, вкус и
питательную ценность. В усилении аромата молочного шоколада, карамели, ириса, сливочного крема
наряду с другими компонентами принимают участие и свободные жирные кислоты, образующиеся под
действием липаз. При низких уровнях свободных жирных кислот аромат изделий усиливается, но новые
ароматы не образуются; при средних — появляется аромат масла; при высоких — аромат сыра.
Подобные ароматические вещества могут быть получены путем модификации масел или жиров с
применением препаратов липаз различного происхождения (животных, растительных, микробных).
2. α-Амилаза. α-Амилазы обнаружены у животных (в слюне и поджелудочной железе), в растениях
(проросшее зерно пшеницы, ржи, ячменя), они вырабатываются плесневыми грибами и бактериями. Все
эти ферменты гидролизуют крахмал, гликоген и родственные α-1,4-глюканы с образованием, главным
образом, декстринов и небольшого количества дисахарида — мальтозы. α-Амилазы гидролизуют α-1,4связи внутри молекулы крахмала, разрывая связь между первым углеродным атомом и кислородом,
связывающим этот углерод с соседней молекулой глюкозы. Это наглядно демонстрирует следующая
схема (стрелками показано действие фермента):
Характерной особенностью всех α-амилаз является наличие одного атома кальция на молекулу
фермента. Роль кальция состоит в том, что он стабилизирует вторичную и третичную структуру
молекулы α-амилазы, обеспечивая таким образом ее каталитическую активность и вместе с тем
предохраняя фермент от действия протеолитических ферментов и тепловой денатурации.
Большое практическое значение имеет влияние температуры и рН на стабильность амилаз. Быстрое
разрушение зерновой α-амилазы при рН 3,3 — 4,0, например, дает возможность выпекать ржаной хлеб
из муки, которая содержит избыток α-амилазы, при низких значениях рН, чтобы предотвратить
излишнее декстринирование крахмала и образование клейких веществ в мякише хлеба.
Мощным механизмом регуляции скорости расщепления крахмальных гранул является система
белковых ингибиторов амилаз, широко представленных в растениях. Ингибиторы белковой природы
избирательно взаимодействуют с амилазами и образуют неактивные комплексы "амилаза —
ингибитор". Высокой активностью обладают ингибиторы амилаз картофельного сока.
3. β-Амилаза. β-Амилаза отщепляет мальтозу от молекулы амилозы и амилопектина, разрывая
гликозидные связи через одну. Название " β-амилаза" было выбрано для того, чтобы показать, что
мальтоза образуется в β-аномерной форме. На представленной ниже схеме действие β-амилазы на
амилозу и амилопектин показано стрелками.
β-Амилазы — это ферменты в основном растительного происхождения. Хорошо известными
источниками являются зерно пшеницы, а также пшеничный и ячменный солод, соевые бобы, клубни
картофеля. В отличие от α-амилазы, β-Амилаза менее термостабильна, но проявляет большую
устойчивость к кислым значениям рН, сохраняя свою активность при рН 3,3.
4. Глюкоамилаза (γ-амилаза). Глюкоамилаза продуцируется
различными видами плесневых грибов рода Aspergillus: A. oryzae, A.
niger, A. awamory и некоторыми другими, например, Rhizopusdelamarn
Rhizopus niveus. Эти ферменты расщепляют как амилозу, так и
амилопектин
до
глюкозы,
последовательно
действуя
с
нередуцирующего конца цепи крахмала. Они способны гидролизовать
α-1,4 и α-1,6 гликозидные связи.
Различные глюкоамилазы отличаются друг от друга скоростью
гидролиза крахмала, отношением к температуре и рН, и некоторыми
другими показателями. На использовании препаратов грибной
глюкоамилазы разработан ферментативный метод получения глюкозы,
который получил широкое распространение в Японии.
Амилазы нашли широкое применение в хлебопекарной промышленности, производстве
кондитерских изделий и крахмалопродуктов, пивоварении и спиртовом производстве.
Основным препаратом, широко внедренным в хлебопекарную промышленность, является
амилоризин П10Х. Он обладает амилолитической и протеолитической активностью. Получить хлеб с
надлежащей пористостью, объемом и окраской корки можно только в том случае, если на всех стадиях
технологического процесса достаточно сахаров, обеспечивающих интенсивность газообразования.
Несмотря на присутствие в муке собственных сахаров, хлеб, полученный за счет сбраживания только
собственных сахаров муки, не будет отвечать требованиям стандарта. При газообразовании только за
счет собственных сахаров муки максимум выделения диоксида углерода приходится на первые 1 — 2
часа брожения. Между тем в процессе хлебопечения газообразование в тесте должно оставаться
достаточно высоким и на последней стадии (расстойка и первые 10 — 15 минут выпечки). При наличии
в муке активной β-Амилазы газообразование в процессе брожения теста идет по возрастающей и
максимум приходится на 4 часа брожения. В противном случае для получения дополнительного
количества сбраживаемых сахаров и интенсификации процесса брожения необходимо применение
амилолитических ферментных препаратов.
При производстве мучных кондитерских изделий с использованием дрожжей (галеты, крекеры,
кексы и др.) также используют комплексные ферментные препараты, содержащие α-амилазу.
Ферментные препараты амилаз нашли широкое применение в технологиях получения различных
паток и глюкозы. Первой технологической операцией производства крахмальных гидролизатов
является гидролиз крахмала, который включает стадии клейстеризации крахмала, разжижения
крахмального клейстера и его осахаривания. С целью разжижения используют ферментный препарат
амилосубтилин Г10Х, содержащий в основном α-амилазу и β-глюконазу. Осахаривание полученного
гидролизата также проводят с использованием ферментов. Для этой цели наиболее широко применяют
порошкообразный ферментный препарат глюкавомарин Г20Х, который содержит в основном
глюкоамилазу. В спиртовом производстве и пивоварении также применяются амилолитические
ферменты, разжижающие и осахаривающие крахмал.
5. β-Фруктофуранозидаза. Другие названия этого фермента — инвертаза или сахараза. βФруктофуранозидазу выделяют из дрожжей путем автолиза. Этот фермент гидролизует сахарозу по βфруктозидной связи согласно уравнению:
В результате действия фермента на сахарозу получается смесь α-глюкозы и β-фруктозы, получившая
название "инвертного сахара". Термин "инверсия" обозначает изменения, происходящие в способности
сахара вращать плоскость поляризованного света.
Инвертаза
находит
широкое
применение
в
пищевой
промышленности. Гидролиз
концентрированных растворов сахарозы с использованием инвертазы приводит к образованию более
сладких сиропов. Точка кипения инвертированных сиропов выше, а точка замерзания ниже, т. к. при
инверсии повышается осмотическое давление. Образовавшиеся при действии инвертазы моносахариды
более растворимы, не так легко выкристаллизовываются из высококонцентрированных сиропов.
Инвертаза применяется в кондитерской промышленности для производства отливных помадных
корпусов конфет, круглых помадных корпусов и жидких фруктовых начинок, таких как вишневый
ликер. В каждом случае ее применение обусловлено необходимостью получить полумягкую или
жидкую консистенцию при высоких концентрациях сахара (78%), предотвращающих брожение. В
случае производства помадной массы из кокосовых орехов применение инвертазы обусловлено и
повышенной влагоудерживающей способностью фруктозы, образующейся под действием этого
фермента.
6. Пектинэстераза. Пектинэстеразы синтезируются высшими растениями, микроскопическими
грибами, дрожжами и бактериями. Пектинэстераза катализирует гидролиз сложноэфирных связей в
молекуле растворимого пектина, в результате чего образуется метиловый спирт и полигалактуроновая
кислота. Процесс протекает согласно следующей схеме (стрелками показано действие фермента):
Таким образом, пектинэстераза отщепляет метоксильные группы от метоксилированной
полигалактуроновой кислоты. Желирующая способность пектина зависит от степени метоксилирования
или степени этерификации, поэтому действие пектинэстеразы по отщеплению метоксильных групп
приводит к снижению желирующей способности и сопровождается падением вязкости. На этом,
очевидно, и основывается применение этого фермента для осветления плодовых соков и вина. Обычно
комплексные препараты пектинэстеразы, применяемые для этих целей, получают из различных
плесневых грибов, и прежде всего из A. niger. Пектинэстераза входит в состав пектолитических
ферментов (пектинэстераза, эндо-, экзополигалактуроназа и др.), применяемых для гидролиза
пектиновых веществ в плодово-ягодной мезге и соке.
7. Эндополигалактуроназа и экзополигалактуроназа. Эти два фермента участвуют в
превращениях пектиновых веществ наряду с другими пектолитическими ферментами растительного и
микробного происхождения. Эндополигалактуроназа — фермент, который гидролизует α-1,4-связи в
молекуле растворимого пектина (метоксилированной полигалактуроновой кислоты), неупорядоченным,
произвольным образом. В гидролизе этого типа связи принимает участие и другой фермент —
экзополигалактуроназа, который последовательно отщепляет молекулу галактуроновой кислоты,
начиная с нередуцирующего конца. Эндополигалактуроназа синтезируется как грибами, так и
некоторыми видами бактерий. Применение препаратов пектолитических ферментов в промышленности
достаточно обширно. Они используются при производстве фруктовых соковых концентратов и
экстрактов, при осветлении соков и вин, при производстве фруктовых и овощных пюре и нектаров.
8. Папаин и химопапаин. Папаин является наиболее применяемым в производстве
протеолитическим ферментом. Основной реакцией, катализируемой протеолитическими ферментами,
является гидролиз пептидной связи в молекулах белков и пептидов. Папаин и химопапаин — ферменты
латекса плодов дынного дерева (Carica papaya). Эти ферменты относятся к группе тиоловых протеиназ,
которые содержат в активном центре SH-группу остатка цистеина. Характерной особенностью
тиоловых протеиназ является то, что они активируются сульфгидрильными соединениями —
восстановленным глутатионом, цистеином.
Химопапаин имеет большое сходство с папаином, однако можно выделить и некоторые отличия.
Например, активность химопапаина при гидролизе гемоглобина и казеина в два раза ниже, чем у
папаина; он более термоустойчив, чем папаин, и проявляет хорошую стабильность в кислой среде.
Папаин обладает довольно широкой специфичностью. Он преимущественно гидролизует вторую
пептидную связь, лежащую за карбоксильной группой фенилаланина.
Возможности использования ферментных препаратов на основе папаина обширны: кожевенная
промышленность (при обезволашивании и мягчении шкур); кинопроизводство (для растворения
желатинового слоя на пленках при их регенерации); парфюмерия (при создании добавок в кремы,
лосьоны, зубные пасты); производство синтетических моющих средств (для удаления загрязнений
белковой природы); медицина (при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов и др.);
пищевая промышленность (виноделие, пивоварение, производство спирта, хлебопечение, сыроделие).
9. Фицин и бромелайн. Фицин выделяют из млечного сока фикусовых растений, например, инжира
(Ficus carica). Так же, как и папаин, он относится к тиоловым протеиназам. Еще один тиоловый фермент
— бромелайн — получают из свежего сока ананаса (Bromeliacea). Оба эти фермента имеют сходство с
папаином, проявляют наибольшую активность в нейтральной зоне рН, обладают широкой
специфичностью, предпочтительно расщепляют пептидные связи, образованные положительно
заряженными аминокислотами.
Использование бромелайна и фицина аналогично использованию папаина; в последние годы их
производство возросло, и в настоящее время эти ферменты применяют для мягчения мяса и для
удаления белковой мути в пиве. К образованию холодной мути в бутылочном пиве приводит рост
микрорганизмов; такое биологическое помутнение предотвращается пастеризацией пива или
стерильной фильтрацией при заполнении бутылок в асептических условиях. Небиологическое
помутнение пива может происходить при его продолжительном хранении; этот процесс ускоряется при
действии света, тепла, кислорода, в присутствии следов железа или меди, а также при одновременном
воздействии этих факторов. Состав мути зависит от преобладающего действия того или иного из этих
факторов. Основными составляющими холодной мути являются: белки — 40 — 76%; танин — 17 —
55%; углеводы — 3 — 13%. Холодная муть состоит из очень тонкого осадка, который образуется при
выдержке пива при температурах ниже 10°С. Для борьбы с холодной мутью могут быть использованы
растительные ферменты — папаин, фицин, бромелайн, а также грибные (продуцируемая
микроскопическими грибами рода Aspergillus, Penicillium, Mucor, Amylomyces) и бактериальные
(продуцируемая В. subtilis) протеазы. Но наиболее широко для этой цели применяется лишь папаин или
комплексные препараты, включающие папаин и другие протеазы, что объясняется относительно
высокой термостабильностью препаратов папаина, сохраняющих свою активность после пастеризации.
10. Протеолитические ферменты семян растений. В семенах злаковых и бобовых культур
содержится целый комплекс протеолитических ферментов, участвующих в расщеплении запасных
белков до аминокислот в процессе прорастания семян. Так, например, из семян пшеницы были
выделены несколько типов протеолитических ферментов, различающихся по оптимуму рН: кислые
протеиназы с оптимумом рН 3,7 — 4,0; нейтральные протеиназы с оптимумом рН 6,5 — 7,0; щелочные
протеиназы с оптимумом рН > 8,0.
Ферментные препараты, содержащие протеиназы, применяют для регулирования биокаталитических
процессов, протекающих при приготовлении теста и выпечке хлеба. Исключительно важны для
хлебопечения те изменения, которые претерпевает при тестоведении и расстойке белковый комплекс
муки. Именно белковый комплекс и его ферментативные изменения определяют собой физические
свойства теста. От белкового комплекса зависит как поведение теста при его замесе и расстойке (в
частности, формоудержание), так и качество готового хлеба, его объем, пористость, структура мякиша.
Из трех групп протеиназ наибольшего внимания технологов заслуживают нейтральные протеиназы.
По активности они в несколько раз превосходят кислые и в условиях теста способны эффективно
расщеплять белки клейковины. Одна из особенностей нейтральных протеиназ состоит в том, что они не
растворяются в водных, солевых и буферных растворах. Они прочно связаны с белками клейковинного
комплекса и извлекаются при частичном растворении клейковины в щелочном растворе. Таким
образом, в созревших семенах пшеницы нейтральные протеиназы и их белковые ингибиторы образуют
единый неактивный комплекс, связанный с клейковиной. Соотношение активности протеиназ и их
ингибиторов в созревшем зерне определяет стабильность белкового комплекса, его устойчивость в
процессе тестоведения.
Нейтральные протеиназы ингибируются хлоридом натрия, фенольными соединениями,
ароматическими аминокислотами, продуктами сахаро-аминной реакции (меланоидинами). Хлорид
натрия является обязательным компонентом рецептуры и, внесенный в таком количестве, снижает
активность нейтральных протеиназ и соответственно интенсивность автолиза на 60 — 70%. В
зависимости от качества муки и состояния ее клейковинного комплекса технолог может варьировать
время внесения соли и тем самым регулировать интенсивность протеолиза.
Комплексные ферментные препараты, содержащие активные протеазы и α-амилазу (например,
амилоризин П10Х), применяют не только в хлебопечении, но также при производстве мучных
кондитерских изделий с целью ускорения процесса брожения и корректировки физических свойств
клейковины муки, изменения реологических свойств теста, ускорения его "созревания".
Протеолитические ферменты применяют и в производстве плодово-ягодных соков и вин. Некоторые
плодово-ягодные соки и вина трудно осветляются и часто мутнеют при хранении из-за наличия в них
белковых соединений. Поэтому в процессе осветления соков наряду с ферментами пектолитического
комплекса обязательно используют кислые протеиназы.
11. Протеолитические ферменты животного происхождения. Протеазам животного
происхождения принадлежит огромная роль в процессах пищеварения. К важнейшим протеазам
относятся трипсин, химотрипсин, пепсин, ренин. Трипсин и химотрипсин - протеазы поджелудочной
железы, которая в виде неочищенного панкреатина находит некоторое применение в пищевой
промышленности для производства гидролизатов. Высокоочищенный трипсин применяется для
медицинских целей. Пепсин, который вырабатывается слизистой желудка, входит в состав
лекарственных ферментных препаратов. В пищевой промышленности пепсин используют (в комплексе
с химозином в виде сычужного фермента) для свертывания казеина молока при производстве творога и
сыра и для растворения белковой мути в пиве. Реннин - фермент, имеющий много сходства с пепсином,
содержится в соке четвертого отдела желудка телят. Реннин представляет собой мощную протеазу,
осуществляющую свертывание молока; он является основным компонентом неочищенных экстрактов и
комплексных промышленных препаратов, используемых для этой цели. Казеин молока является
фосфопротеидом, он не осаждается ионами Са2+; действие реннина приводит к образованию
макрогликопептида и парα-χ-казеина. Последний осаждается в присутствии ионов Са2+ и способствует
осаждению других фракций казеина.