Лабораторная работа 2 ингибирование липазы

Лабораторная работа
Качественное изучение влияния соединений на липазу.
Для экспериментального определения влияния соединений на
активность ферментов необходимо первоначально определить условия для
оптимальной работы фермента. Для поддержания нужного значения рН
используют буферные растворы, причем ионная сила раствора («молярность»
буфера) также должна быть чересчур большой (0.1-0.01М). Также
используют активаторы ферментов (в случае липазы активатором являются
катионы кальция).
Вторым этапом работы является нахождение оптимальной
концентрации фермента и субстрата, чтобы скорость взаимодействия была
приемлемой с точки зрения экономии времени.
Контроль за ходом взаимодействия фермента и субстрата можно
проводить двумя способами, а именно по убыли субстрата и по увеличению
концентрации продукта реакции. Выбор того или иного способа
определяется аналитическими возможностями.
Липаза катализирует гидролиз сложноэфирной связи в сложных эфирах
алифатических жирных кислот и глицерина.
Также липаза действует и на другие сложные эфиры. Для выявления
липазной активности предложено применять стеариловый эфир 4нитрофенола (бесцветный). В результате гидролиза происходит
высвобождение 4-нитрофенола, что сопровождается появлением желтой
окраски.
Источником липазы является комплексный ферментный препарат
«Панзинорм», содержащий также другие ферменты, в частности амилазу и
протеазы.
Ввиду нерастворимости субстрата (стеароил-4-нитрофенол) в воде
используют его раствор в смеси ацетонитрила и изопропилового спирта (1:4).
Ход работы: в 4 лунки планшета добавляют 10 мкл 4мМ раствора
стеароил-4-нитрофенола , 10 мкл 0.5М водного раствора хлорида кальция и
затем в различные объемы раствора фермента 10, 20, 30, 50 мкл в буфере
(0.01М). После этого доводят до общего объема в 250 мкл путем добавления
соответствующего количества трис или триэтаноламинного буферных
растворов с рН 7.4-8 и концентрацией 0.01М (т.е. в первую лунку
необходимо добавить 220 мкл, во вторую – 210 мкл и т.д.). Измеряют
оптическую плотность на планшетном ридере при длине волны 415 нм. Через
промежутки времени 1, 3, 5, 10 минут (или другое время, что зависит от
активности фермента) вновь измеряют оптическую плотность. Делают вывод
о необходимом количестве фермента и времени инкубирования. Например:
вполне приемлемо время инкубирования 5 минут и оптическая плотность в
конце инкубирования около 1.
После нахождения приемлемых параметров проводится оценка
влияния различных соединений на работу липазы.
Ход работы: Предварительно готовят растворы тест-соединений в
максимальной концентрации на 0.01М буферном растворе (концентрации
должны быть выражены в милимоль на литр мМ).
Для повышения надежности результатов все измерения проводят в
дублях (т.е. две лунки на одно определение). Далее используется 8 лунок.
В восемь лунок добавляют по 10 мкл 4мМ раствора стеароил-4нитрофенола , 10 мкл 0.5М водного раствора хлорида кальция. После этого в
две лунки добавляют одинаковое количество тест-соединения и буферный
раствор в таком соотношении и количестве, чтобы суммарный объем, с
учетом необходимого объема раствора фермента был 230 мкл. В следующие
две пары лунок добавляют иное соотношение тест-соединения и буфера при
неизменном количестве фермента. Четвертая пара лунок является
контрольной. Туда добавляют только буферный раствор. После этого быстро
добавляют раствор фермента и измеряют начальную оптическую плотность.
По истечении приемлемого времени измеряют оптическую плотность
повторно. Общий объем инкубируемой смеси во всех восьми лунках должен
быть одинаковым (250 мкл).
Пример: По результатам предварительных проб было решено брать 30
мкл раствора фермента и инкубировать 4 минуты. Раствор тест-соединения
был приготовлен с концентрацией 100 мМ. Во все восемь лунок было
добавлено 10 мкл 4мМ раствора стеароил-4-нитрофенола и 10 мкл 0.5М
водного раствора хлорида кальция. (таким образом оставшийся объем 25010-10-30=200 мкл ). В 1 и 2 лунки добавлено 10 мкл тест-соединения и 190
мкл буфера; в 3и 4 50 мкл тест-соединения и 150 мкл буфера; в 5и 6 100 мкл
тест-соединения и 100 мкл буфера;7 и 8 только 200 мкл буфера. Далее
быстро добавляется во все восемь лунок по 30 мкл раствора фермента и
измеряется оптическая плотность. Через 4 минуты повторное определение
оптической плотности.
Расчеты: для всех лунок вычисляют разницу между конечным и
начальным значением оптической плотности. И для пар (дублей) 1 и 2, 3 и 4,
5 и 6, 7 и 8 находят средние значения. Допустим, они равны 0.90 (1и2) 0.70
(3и4) 0.01 (5и6) 0.99 (7и8). Рассчитывают концентрации тест-соединений в
инкубируемом объеме. В 1 и 2 лунках: 10 (объем взятого тест соединения)
×100 (концентрация тест-соединения в мМ) и деленное на 250 (общий объем
инкубационной смеси) = 4 мМ. 3 и 4 - 20 мМ; 5 и 6 – 40 мМ.
Вычисляют процент остаточной активности фермента по формуле:
Dэксп/Dконтр×100, где Dэксп – среднее значение прироста оптической
плотности для тест-соединений, а Dконтр - среднее значение прироста
оптической плотности для контрольного образца (лунки 7 и 8).
Таким образом, активность фермента при тест-соединении в
концентрации 4 мМ составила 91%, т.е. произошло ингибирование на 9
процентов (100-91%=9%).
С увеличением концентрации вещества увеличивается его
ингибирующая активность. Для сравнения ингибирующей активности
разных веществ используют показатель CI50, (концентрация веществаингибитора, при которой скорость ферментативной реакции равна половине
от возможной скорости при данных условиях инкубирования (50%
остаточной активности)).
Постройте графическую зависимость остаточной активности от
концентрации ингибитора.
Самостоятельная работа: протестируйте данное Вам соединение на
ингибирующую активность относительно панкреатической липазы.
Приведите CI50. Сделайте выводы.