Экзаменационные вопросы по основам БТ возникновения, основные направления.
реклама
Экзаменационные вопросы по основам БТ 1. Биотехнология, цели и задачи, история возникновения, основные направления. 2. Биологические объекты, используемые в биотехнологических процессах (микробные технологии). 3. Значение асептических условий для биопроизводств. Защита биотехнологических процессов от микроорганизмов-контаминантов. 4. Системы GLP , GMP и GCP производства и контроля качества биотехнологических продуктов. 5. Технология ферментационных процессов. Стадии, преимущества и недостатки биотехнологических процессов. 6. Условия культивирования растительных клеток. 7. Факторы, влияющие на рост и развитие суспензионной культуры клеток. 8. Клональное микроразмножение растений и его преимущества. 9. Влияние ауксинов на процессы морфогенеза в культуре клеток растений. 10. Дифференцировка, морфогенез и регенерация в культуре растительных клеток. 11. Предмет и методы биотехнологии животных. Место биотехнологии животных в системе биологических наук. 12. Основные объекты биотехнологии животных. Правила содержания и разведения животных объектов в лабораторных условиях. 13. Вопросы биоэтики в биотехнологии животных. 14. Основные этапы развития биотехнологии животных. 15. Тотипотентность, мультипотентность, плюропотентность клеток животных. 16. Сырье и среды, применяемые в биотехнологии. 17. Периодическое культивирование микроорганизмов. Стадии развития популяции в аппарате периодического культивирования. 18. Непрерывный процесс культивирования микроорганизмов, преимущества перед периодическим, системы непрерывной ферментации, способы управления. 19. Стерилизация воздуха, характеристика фильтрующихся материалов. 20. Биореакторы, используемые в биотехнологическом производстве, их классификация, принцип работы. 21. Применение микроклонального размножения растений и его перспективы. 22. Влияние цитокининов на процессы морфогенеза в культуре клеток растений. 23. Этапы развития биотехнологии. Отрасли биотехнологии. 24. Клетки и ткани растений как объекты биотехнологии. 25. Основные методы экспериментальной гаплоидии. 26. Морфологические и функциональные особенности половых клеток – яйцеклеток и сперматозоидов. Гаметогенез у животных. 27. Эмбриологические основы биотехнологии животных. 28. Аллофенные животные (генетические химеры). Методы получения химер. 29. Сущность генетического клонирования. Развитие методов клонирования с помощью пересадки ядер. 30. Известные осложнения применения метода клонирования. 31. Перечислите, по каким показателям оценивается ферментационный процесс. 32. Объясните процесс выращивания посевного материала, из каких стадий он состоит? 33. В чем разница между глубинной и поверхностной ферментацией, какие объекты используются в каждом конкретном случае и почему. 34. Как определяется выход продукта в биотехнологическом производстве? Какое значение имеет этот показатель в производстве. 35. Какой показатель используется для оценки количества продукта, получаемого на единицу объема реактора в единицу времени и от каких факторов он зависит? 36. При непрерывном культивировании характерно: A) Полная замена питательной среды; B) Контроль химического состава среды; C) Отвод биомассы в конце культивирования; D) Высокая плотность бактериальной суспензии; E) Отмирание культуры со временем нарастает. Какой системе непрерывного культивирования данный признак характерен: хемостату, турбидостату, рН-стату, оксистату. Дайте объяснение. 37. Сосуд для выращивания представлен в виде трубки, в которую втекает и вытекает среда и посевной материал - это A) Термостат; B) Колба; C) Трубчатый ферментер полного вытеснения; D) Ферментер полного смещения; E) Стерилизатор. Дайте объяснение. 38. Сосуд для выращивания представлен в виде емкости с системой продувания воздуха или с мешалкой – это A) Термостат; B) Колба; C) Трубчатый ферментер полного вытеснения; D) Ферментер полного смещения; E) Анаэростат. Дайте объяснение. 39. Какие количественные характеристики используются для производственных штаммов A) Число генерации за определенное время; B) Скорость роста; C) Увеличение биомассы ; D) Количество клеток в конце культивирования; E) Число делений клетки за определенное время. Дайте объяснение и напишите уравнение. 40. Составьте примерный перечень контролируемых параметров при выращивании микроорганизмов в биореакторах. 41. По какой формуле рассчитывают прирост сырой биомассы каллусной ткани растений? Рассчитайте прирост сырой биомассы каллусной ткани, если известно, что сырой вес каллуса моркови, пассируемого и культивируемого в течение одного месяца составлял 2400 мг, при этом начальный вес сырой каллусной ткани моркови составлял 200 мг, в последующие 7, 10, 14, 18, 21, 25 дней культивирования вес каллуса был равен 650 мг, 840 мг, 1050 мг, 1 630 мг, 1960 мг, 2100 мг, соответственно. 42. Использование клеточной культуры для промышленного получения биомассы и БАВ. 43. Рассчитайте, какое количество (в мл) 5% маточного-раствора витамина В6 (5% ампула, растворенная в 100 мл бидист.воды) необходимо взять для приготовления 1 л питательной среды Уайта для культивирования клеток томата, если учесть, что по прописи концентрация витамина составляет 1 мг/л. 44. Способы культивирования протопластов in vitro (изобразите в виде схемы). 45. Технология криосохранения клеток, тканей, органов растений (изобразите схематично этапы технологии). 46. Рассчитайте какое количество (в мл) 1% стокрастворов ИУК (индолилуксусной кислоты) и кинетина необходимо взять для приготовления 2 л питательной среды Гамборга Эвелега (В5) с целью индукции гемморизогенеза в каллусной культуре карто-феля, если учесть, что модификация среды с ИУК 1 мг/л и 3 мг/л кинетина стимулирует процесс морфогенеза. 47. Генная инженерия. Современное состояние и перспективы генной инженерии. 48. Методы селекции соматических гибридов (изобразите в виде схемы). 49. Практическое применение соматической гибридизации (покажите в виде схемы). 50. Применение плазмид бактерий в качестве векторов в генной инженерии растений. Требования, предъявляемые к векторным системам. 51. Методы разделения Xи Yсодержащих сперматозоидов. 52. Методы определения жизнеспособности яйцеклеток, сперматозоидов и эмбрионов. 53. Доклинические испытания: эксперименты, проводимые in vitro и на лабораторных животных. 54. Схематически представить получение химер путем слияния 8-ми-клеточных эмбрионов. 55. Микрохирургия эмбриональных клеток (морула, бластоциста) для создания аллофенных животных. Представьте схематически. 56. Представьте схему клонирования мышей. 57. Стимуляция суперовуляции у самок млекопитающих. Вымывание яйцеклеток. Представьте основные методологические подходы. 58. Вазектомия у самцов. Отразите этапы операции. 59. Представьте схему получения химер. 60. Схематически отобразите основные подходы к клонированию генов: клонирование методом «дробовика» и «прогулка по хромосоме» и создание к-ДНК-овых библиотек 1.Биотехнология, цели и задачи, история возникновения, основные направления. Биотехнология — это производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов, культивируемых клеток и биологических процессов. Впервые термин «биотехнология» применил венгерский инженер Карл Эреки в 1917 году. В начале XX века активно развивалась бродильная и микробиологическая промышленность. В эти же годы были предприняты первые попытки наладить производство антибиотиков, пищевых концентратов, полученных из дрожжей, осуществить контроль ферментации продуктов растительного и животного происхождения. Первый антибиотик — пенициллин — удалось выделить и очистить до приемлемого уровня в 1940 году, что дало новые задачи: поиск и налаживание промышленного производства лекарственных веществ, продуцируемых микроорганизмами, работа над удешевлением и повышением уровня биобезопасности новых лекарственных препаратов. Клетки микроорганизмов, а также растительные и животные клетки в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают вещества, владеющие различными свойствами, называются эти вещества – метаболиты. Выделяют четыре группы продуктов жизнедеятельности одноклеточных микроорганизмов: • Непосредственно сами клетки, как то: выращивание бактерий для выделения вакцины, дрожжи в качестве основы гидролизатов, либо просто в качестве кормового белка; • Продукты синтеза клеток в процессе развития – крупные молекулы: токсины, антитела, ферменты и пр.; • Первичные метаболиты – крайне важны в процессе роста клеток: витамины, органические кислоты и т.д; • Вторичные метаболиты – соединения, по природе своей низкомолекулярные, не играют роли в процессе развития клеток: токсины, алкалоиды, гормоны. Биотехнология является механизмом, который, используя вышеназванные продукты жизнедеятельности в качестве сырья, помогает получать огромное количество очень важных веществ. Целью биотехнологии является разработка и производство лечебный, профилактических и диагностических препаратов. Кроме того, важными задачами выступают такие, как: обеспечение всевозможных технологических механизмов в разных отраслях промышленности; возрастающее участие в экологических мероприятиях; решение различных вопросов продовольствия. Исходя из множества выполняемых биотехнологией функций, её подразделяют на несколько направлений: медицинское (фармацевтическая, иммунобиологическая), сельскохозяйственное (ветеринарная, растительная) и промышленное (легкая промышленность, энергетическая, пищевая и т.п.). Основными направлениями биотехнологии являются: 1) производство с помощью микроорганизмов и культивируемых эукариотических клеток биологически активных соединений (ферментов, витаминов, гормонов), лекарственных препаратов (антибиотиков, вакцин, сывороток, высокоспецифичных антител и др.), а также ценных соединений (кормовых добавок, например незаменимых аминокислот, кормовых белков; 2) использование биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод, загрязнений почвы) и защита растений от вредителей и болезней; 3) создание новых полезных штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород животных и т.п. 2. Биологические объекты, используемые в биотехнологических процессах (микробные технологии). Главным объектом биотехнологического процесса является клетка. В ней синтезируется целевой продукт. Основа современного биотехнологического производства - синтез различных веществ с помощью клеток микроорганизмов. Клетки высших растений и животных еще не нашли широкого применения, ввиду их высокой требовательности к условиям культивирования. Начальным этапом биотехнологической разработки является получение чистых культур клеток и тканей. Дальнейшие манипуляции с этими культурами характеризуется единообразием подходов, основанных на классических методах микробиологии. При этом культуры клеток и тканей высших растений и животных уподобляются культурам микроорганизмов. Эукариоты и прокариоты. Большинство микроорганизмов - одноклеточные существа. Микробная клетка отделена от внешней среды клеточной стенкой, а иногда лишь цитоплазматической мембраной и содержит различные субклеточные структуры. Существует два основных типа клеточного строения, которые отличаются друг от друга рядом фундаментальных признаков. Это эукариотические и прокариотические клетки. Микроорганизмов, имеющих истинное ядро, называют эукариотами. Микроорганизмы с примитивным ядерным аппаратом относятся к прокариотам. Среди микроорганизмов к прокариотам относятся бактерии, актиномицеты и сине-зеленые водоросли (цианобактерии), к эукариотам - прочие водоросли (зеленые, бурые, красные), микомицеты (слизевики), низшие грибы - микромицеты (включая дрожжи), простейшие (жгутиконосцы, инфузории и др.). Их общее свойство - малые размеры, они видны лишь в микроскоп. У прокариот не происходят процессы митоза и мейоза. Они размножаются чаще простым делением клетки. В эукариотической клетке имеется ядро, отделенное от окружающей его цитоплазмы двухслойной ядерной мембраной с порами. В ядре находятся 1-2 ядрышка центры синтеза рибосомальной РНК и хромосомы - основные носители наследственной информации, состоящие из ДНК и белка. При делении хромосомы распределяются между дочерними клетками в результате сложных процессов - митоза и мейоза. Цитоплазма эукариот содержит митохондрии, а у фотосинтезирующих организмов и хлоропласта. Цитоплазматическая мембрана, окружающая клетку, переходит внутри цитоплазмы в эндоплазматическую сеть; имеется также мембранная органелла - аппарат Гольджи. Прокариотические клетки устроены проще. В них нет четкой границы между ядром и цитоплазмой, отсутствует ядерная мембрана. ДНК в этих клетках не образует структур, похожих на хромосомы эукариот. У прокариот не происходят процессы митоза и мейоза. Большинство прокариот не образует внутриклеточных органелл, ограниченных мембранами, нет митохондрий и хлоропластов. 3. Значение асептических условий для биопроизводств. Защита биотехнологических процессов от микроорганизмовконтаминантов. Биотехнологические процессы в основном проводят в асептических условиях. Асептика это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду посторонних веществ. Использование асептики в биотехнологии предполагает использование биообъекта и полное исключение попадания других микроорганизмов. Асептика включает в себя: влажную уборку помещений; обработку антисептическими веществами, ультрафиолетовое облучение, использование стерильных инструментов; подача стерильного воздуха в ферментаторы и др. Существует механическая, физическая и химическая защита биообъекгов. К механической защите относятся: удаление механических примесей (например, из воздуха культиваторов с помощью фильтров). К физической - обработка воздуха и поверхностей приборов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация, обработка ультразвуком. К химической обработка поверхностей химическими антисептиками. В производстве источниками микробов - контаминантов могут быть почва, вода, воздух, человек. Из почвы микробы контаминтанты такие как актиномиценты, палочки - бациллы попадают в биотехнологические процессы. С пылью они могут попасть в воздух. Люди, которые заняты в биотехнологическом производстве, могут быть источником контаминирующей микрофлоры. Наиболее загрязненными являются кисти рук, подошвы, локти, шея. Многочислена микрофлора ротовой полости: бактериальные коковые формы, вибрионы. Источником микробов контамининтов могут быть и компоненты питательных сред (фаги, дрожжи). Микробы контаминанты не только могут подавать развитие и функции биообъекта, но и дезорганизовать какую-либо ткань. Они способны продуцировать токсические вещества. Борьба с микробами - контаминантами в биотехнологических производствах. Виды защиты биотехнологических, процессов от микробов-загрязнителей. 1. Защита с помощью различных фильтров (мембранных фильтров). Распространенными процессами фильтрации являются: обычная фильтрация; микрофильтрация; диализ. При стерилизации растворов фильтрованием они должны содержатся перед разливом и при последующем разливе в антисептических условиях. И время между началом приготовления раствора и его стерилизацией должно быть минимальным. 2. Метод защиты - стерилизация. Питательная среда перед засевом каким-то биообъектом должна быть стерильной. В биотехнологии используют методы периодической и непрерывной стерилизации. Периодическая стерилизация осуществляется в аппаратах малой емкости непосредственно в ферментаторах или паром под давлением в течение 30-40 мин при температуре 134°С после удаления воздуха из аппарата при нагреве до 100°С. Затем среду охлаждают водой через змеевик и засевают биообъектами. Метод непрерывной стерилизации основан на том, что концентрат питательной среды подают насосом через систему конструкций (который включает нагреватель, выдерживатель (соо6ственно стерилизатор) и теплообменник (где происходит охлаждение). В некоторых условиях стерилизацию питательных сред осуществляют в автоклавах. Стерилизацию проводят паром под давлением. Кроме тепловой стерилизации используют еще холодную химическую стерилизацию, (это когда материалы не могут подвергаться тепловой стерилизации) или газовую стерилизацию этиленоксидом (температура кипения +12, +12,5С). 4. Системы GLP , GMP и GCP производства и контроля качества биотехнологических продуктов. На современном этапе развития биотехнологии большое внимание уделяется внедрению новых требований к качеству и стандартов научных исследований и биотехнологического производства – GMP, GLP, GCP, которые дают возможность получать высококачественные продукты, в том числе лекарственные препараты, т.е потребительские свойства лекарственных препаратов - эффективность, безопасность и фармацевтические аспекты качества обеспечиваются благодаря соблюдению важнейших международных стандартов GMP надлежащей производственной практики, GLP доклинической оценки безопасности фармакологических средств, GCP - проведения клинических испытаний. Правила GLP формально определяются как система качества проведения неклинических исследований. Они распространяются на работу фармакологических, токсикологических и других лабораторий биологического профиля и направлены на обеспечение приемлемости результатов научных исследований на этапе экспериментального изучения новых лекарственных препаратов. Под правилами GCP понимается стандарт проведения клинического испытания, разработанный для того, чтобы предотвратить ошибки в процессе испытания лекарственного препарата и защитить права субъекта испытания. Если препарат проходит все необходимые доклинические испытания по системе GLP и клиническую проверку, то он разрешатся к промышленному выпуску. На стадии производства действуют правила GMP, для обеспечения высокого качества фармацевтической продукции. С целью обеспечения защиты жизни и здоровья граждан, животных, растений, а также охраны окружающей среды были созданы и утверждены стандарты GLP, GCP, GMP, регламентирующие деятельность предприятий фармацевтического профиля, в т.ч. микробиологических и биотехнологических, по проведению исследований, производству, хранению, перевозке, использованию, утилизации и уничтожении их продукции. 5. Технология ферментационных процессов. Стадии, преимущества и недостатки биотехнологических процессов. В общем виде любой биотехнол. процесс включает три стадии: предферментационную, ферментационную и постферментационную. На предферментационной стадии осуществляют хранение и подготовку культуры продуцента (инокулята), получение и подготовку питательных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, технологической и рециркулируемой воды и воздуха. Стадия ферментации является основной стадией, т.к. в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопродуктов). Ферментация может проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил стерильности; на жидких и на твердых средах; анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация может протекать поверхностно или глубинно. Постферментационная стадия обеспечивает получение готовой товарной продукции, а также обезвреживание отходов и побочных продуктов. Процесс ферментации катализируется при помощи энзимов. Ферментация осуществляется в биохимическом реакторе. Культивирование биологических объектов осущся в 2 способа. 1. При периодическом способе культивирования ферментер заполняется исходной питательной средой и инокулятом микроорганизмов. В течение определенного периода времени в аппарате происходит взаимодействие микроорганизмов и субстрат сопровождающееся образованием в культуре продукта. Биохим. превращения в этом аппарате продолжаются от десятков часов до нескольких суток. В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания. При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды. Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные метаболиты – ферменты, аминокислоты, витамины) и стационарной (вторичные метаболиты – антибиотики) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют принцип дифференцированных режимов культивирования. В результате этого создаются условия для максимальной продукции того или иного целевого продукта. Периодически ферментер опорожняют, производят выделение и очистку продукта, и начинается новый цикл. 2. Непрерывный процесс обладает существенными преимуществами перед периодическим. Сам процесс осуществляется в длинной трубе, в которую с одного конца непрерывно поступают питательные компоненты и инокулят, а с другой с той же скоростью вытекает культуральная жидкость. Такая система является гетерогенной. При непрерывной ферментации в ферментах полного смешения (гомогенно-проточный способ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это накладывает существенные ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов. 6. Условия культивирования растительных клеток. Успешное культивирование растительных клеток и тканей требует соблюдения определенных условий культивирования. Влажность воздуха в комнате, где осуществляется культивирование, должна составлять 60-70 %. В том случае, если воздух суше, то это будет приводить к интенсивному испарению питательных сред, на которых культивируются клетки и ткани, что в свою очередь будет приводить к изменению концентрации солей в питательных растворах и условий культивирования. Оптимальной температурой для культивирования растительных тканей является 25-26 °С. В том случае, если осуществляют индукцию морфогенеза, то температуру понижают до 18-20 °С. Если осуществляют культивирование тропических растений, то температуру поддерживают на уровне 29-30 °С. Еще одним фактором, оказывающим влияние на процессы культивирования растительных тканей, является освещенность. Для культивирования изолированных меристем и их дальнейшего размножения необходима освещенность от 1 до 10 клк в зависимости от вида растения. Длительность фотопериода также устанавливается в зависимости от вида культивируемого растения. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как они питаются гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани (ткань мандрагоры). Необходимо учитывать, что если каллусные ткани в дальнейшем будут использоваться для индукции морфогенеза, то их культивируют при непрерывном освещении в 14 клк. Поддержание оптимального светового и температурного режима влажности обеспечивается с помощью климатических камер. 7. Факторы, влияющие на рост и развитие суспензионной культуры клеток. Культуру клеток растений, выращиваемую в жидкой среде, называют суспензионной культурой. Для поддержания клеток во взвешенном состоянии при глубинном культивировании их перемешивают разными аппаратами. Аэрация клеток обеспечивается либо путем непрерывного вращения или качания среды, либо путем продувания жидкой среды стерильным воздухом. Состав питательной среды, в принципе, тот же, что и при поверхностном культивировании клеток. Клетки в суспензии имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками, выращиваемыми статическим способом на агаризованной поверхности: клетки популяции находятся в однородных условиях питания, аэрации и удаления токсических метаболитов клеточного окружения: у них легче проследить влияние на рост и метаболизм различных экзогенных факторов; они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических исследований; на них реальнее возможность получения стабильной клеточной популяции. Для успешного культивирования клеток необходима постоянная температура в пределах 25±2°С. Однако этот традиционный подход обусловлен ограниченностью сведений. Температура влияет на все процессы первичного и вторичного метаболизма растений. К внешним факторам, влияющим на культивирование клеток, относится также свет. До настоящего времени фотоавтотрофные культуры описаны только для 16 видов растений. Все остальные культуры не способны к фотоавтотрофному росту, поэтому их выращивают в темноте или на рассеянном свету. Действие света на ткани, лишенные хлорофилла обусловлено фитохромной системой. Подбор условий освещения культуры является одной из задач при разработке клеточных технологий. Важное значение для успешного выращивания клеток имеет аэрация. Суспензионная культура без аэрации вообще не может существовать. Что касается влияния компонентов газовой фазы (кислород, азот, двуокись углерода) на культуру клеток, то оно почти не изучено. При разработке состава сред и выращивании клеток следует также учитывать влияние такого физического фактора, как осмотическое давление питательной среды. Высокое осмотическое давление затрудняет усвоение питательных веществ. Особенно важно поддержание осмотических свойств у среды выделения и культивирования протопластов, лишенных клеточных стенок. Концентрация осмотика подбирается индивидуально для каждого вида растения и его физиологического состояния. 8. Клональное микроразмножение растений и его преимущества. Клон — растение, полученное путем бесполого, т. е. вегетативного размножения. Клоны идентичны материнскому растению и между собой. Клональное микроразмножение— это массовое бесполое размножение в культуре тканей и клеток, при котором возникшие растения генетически идентичны исходному экземпляру. Клональное микроразмножение имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными методами вегетативного размножения: 1. Высокий коэффициент размножения. Так, из одного растения герберы, земляники, хризантемы, розы при размножении их посредством культуры тканей можно получить в год свыше 1 млн. растений. Из одной почки яблони за 8 месяцев культуры можно получить до 60 тыс. побегов. При культивировании меристемы куста малины in vitro удается получить до 50 тыс. растений в год. Культура меристемы персикового миндаля, который служит подвоем для прививок и с большим трудом размножается при использовании традиционных методов, позволяет получить 1 млн. растений в год. 2. Одновременно с микроразмножением происходит оздоровление растения от вирусов и патогенных микроорганизмов. 3. Ускорение селекционного процесса. Сроки получения товарной продукции новых сортов сокращаются до 2—3 лет вместо 10—12. 4. Методом культуры тканей возможно размножение растений, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно, например пальмы. Так, методом клонального микроразмножения в промышленных масштабах размножается масличная пальма. 5. Экономичность. При микроразмножении экономятся площади теплиц. 6. Получение молодых растений (омоложение старых особей). 7. Можно поддерживать рост круглый год, что важно для растений, имеющих в цикле развития периоды покоя. 9. Влияние ауксинов на процессы морфогенеза в культуре клеток растений. Сначала каллус растет, набирает какую-то определенную критическую массу, потом переходит к морфогенезу. Однако только единичные клетки изменяют свою программу развития. Для перехода к морфогенезу необходимо строго определенное сочетание действия внешних факторов, в первую очередь индуктора, с состоянием детерминированности клетки, т. е. с ее готовностью под действием этого индуктора реализовать свои наследственные свойства. Главнейшей причиной, вызывающей дифференцировку клеток и их переход к гистогенезу с последующим формированием органогенных структур, можно считать действие фитогормонов. При этом основным фактором, определяющим тот или иной тип морфогенеза, выступает соотношение ауксинов и цитокининов в питательной среде. Эта закономерность впервые была обнаружена Скугом и Миллером в 1957 году, а затем подтверждена многочисленными экспериментами. При среднем отношении ауксин регенерационных процессов в каллусной ткани табака не наблюдается, а происходит лишь пролиферация клеток. Высокое отношение ауксин вызывает корнеобразование (ризогенез). Низкое отношение ауксин способствует формированию почек (геммогенез). В то же время одна и та же каллусная ткань, находящаяся в пробирке, может дать начало самым различным морфогенным структурам, то есть может иметь место и ризогенез, и побегообразование, и формирование соматических эмбриоидов. Эти случаи свидетельствуют о том, что в каллусной ткани возникают концентрационные градиенты фитогормонов. Тип образующейся меристемы зависит от соотношения между ауксином и цитокинином. Однако у целого ряда растений не всегда удается изменением баланса фитогормонов регенерировать почки или корни. На взаимодействие гормонов при регуляции дифференцировки почек или корней могут влиять и другие факторы, например содержание сахаров и фосфатов, источник азота и другие компоненты среды, в частности пурины. Открытие Скугом и Миллером того факта, что баланс экзогенных фитогормонов регулирует регенерацию почек и корней в тканях каллуса табака, сыграло важную роль в изучении морфогенеза in vitro, но механизм явления на клеточном и молекулярном уровнях остается до сих пор неясным. Гормональная концепция регуляции дифференциации и морфогенеза in vitro не может рассматриваться как универсальная. Во-первых, фитогормоны в регуляции дифференциации и морфогенеза не обладают специфичностью. Вовторых, есть клетки, не реагирующие на гормональные обработки. Даже если они делятся, тотипотентности не проявляют. В-третьих, способность клеток in vitro проявить свою тотипотентность зависит не только от гормонов. 10. Дифференцировка, морфогенез и регенерация в культуре растительных клеток. Хар-ной особенностью процесса дедифференциации клеток и разл-х тканей из самых разнообразных органов яв-ся то, что в резте возобновления эмбр-ной акт-ти все они обрют массу каллусной ткани. Исходя из св-ва тотипотентности раст-ной клетки предполагалось, что изм-ние условий культивирования может вызвать вторичную дифференциацию клеток в культуре in vitro. Наиболее простой вид дифференцировки появление в каллусной ткани дифференцированных клеток, имеющих специфическое морфологическое стр-е и выпщих особые ф-ции. Достаточно часто набл-ся возникновение эпибластов клеток, депонирующих зап. в-ва, а также вторичные метаболиты. 1. Гистологическая дифф. каллусных клеток (гистогенез) – обр-ние в каллусе разл. тканей. В каллусной ткани может происходить обр-ние млечников, волокон, трихом; сюда же можно отнести эл-ты сосудистой с-мы - трахеи и трахеиды ксилемы, ситовидные трубки и клеткиспутники флоэмы. 2. Органогенез (монополярные стр-ры) - это дифф. каллусных клеток в целые органы: превращение их в апексы стеблей или корней, флоральные эл-ты. 3. Соматический эмбриогенез (биполярные структуры) – обр-ние в каллусной или суспензионной культуре эмбриоидов, т. е. зачатков интактного раст-я, способных развиваться во взрослое раст-е. Дифференциация тотипотентных клеток in vitro зависит от ряда факторов: - вида растения и генотипа растения-донора; условий культивирования (различных питательных сред, экзогенных гормональных факторов, стимуляторов); физических факторов культивирования (фотопериода, качества и интенсивности освещения, - температурного режима, рН, аэрации). Процесс, в кот-м из неорган-ной массы каллусных кл. возн-ют организован. стр-ры, назют морфогенезом. Основу морфогенеза представ. клеточные дифференцировки, где клетки каллуса превращались в эл-ты проводящих и др. тканей, при морфогенезе они в рез-те вторичной дифференциации вновь приобретают стр-ру и фции специализированных органов. Морфогенез в каллусных тканях осущ-ся ч\з реализацию двух программ: ч\з программу соматического эмбриогенеза и ч\з программу органогенеза . При развитии ч\з органогенез из каллусных клеток в начале регенерируется отдельные монополярные органы и уже из них регенерируются целые раст-я. Исключения: корневой органогенез, на основе кот-го получить целое раст-е не удаётся. При дифференцировке стеблевых стр-р или эмбриоидов не вызывает затруднений дальнейшее превращение их в проростки и регенерация раст-й, способных пройти все стадии развития и дать потомство. Морфогенез возможен только в клетках при изоляции клеток от целого растения. При морфогенезе по типу органогенеза в случае преобладания цитокининов над ауксинами осущся стеблевой органогенез, а при преобладание ауксинов над цитокининами - корневой органогенез. Кроме изоляции клеток и наличия определённых соотношений в составе гормонов, в стимуляции морфогенезов участвуют такие соед-я как нитраты серебра и аммония, а\к пролин, тирозин и серии, полиамины путресцин и спермидин, маннит и сорбит. Каллусы ряда культур положительно реагируют на добавление в пит. среды гиббереллинов, кот-е ускоряют рост зачатков, и абсцизинов, кот-е усиливают дифференцировку органов у сом-ких эмбриоидов. Состав пит-х сред может оказать влияние на переход клеточных масс к морфогенезу. Клетки, компетентные к морфогенезу, отличаются от недетерминированных большими размерами ядер и уменьшенным - вакуолей, а также наличием утолщённых клеточных стенок, что способствует их обособлению от окружения. В инициальных клетках сод-ся больше зап. в-в липидов, крахмала. При морфогенезе основные процессы дифференциации осущ-ся в группах клеток. При этом каждая клетка получает сигналы двух типов: извне - из пит-го р-ра, и изнутри - от соседних клеток. Роль двигателя процессов морфогенеза вып-ет дифференцированная активность генов. Представляется желательным разложить весь генетический механизм развития на этапы, в котм каждый ген выполнял бы определённые перестройки в клетках. Морфогенез рассматривается как рез-т проявления активности двух генетических с-м: первичной регламентирует переход с-мы из одного состояния в другое и вторичной - определяет способность системы осуществлять автоматически своё формирование до некоторого определённого состояния. Регенерация - это восстановлении организмов поврежденной или утраченной части тела. Способность к регенерации широко распространена у раст-й то низших до высших таксонов. Это обусловлено: регенерация - один из самых неспецифичных способов защиты растй ведущих неподвижный образ жизни, многие формы регенерации успешно используются растениями как способ вег-го размножения. Если и исходить из механизмов регенерации, то классификацию наиболее часто встречающихся способов регенерации у раст-й: I) физиологическая регенерация, II) Травматическая регенерация 1. Регенерация, обусловленная дедиференцировкой клеток (заживление ран; органогенез, связанный с образованием каллуса; соматически эмброигенез; восстановление частей без обр-ние каллуса) 2. Регенерация на уровне меристем (восстановление апикальных меристем; органогенез из предсуществующих зачатков; органогенез из новообразованных адвентивных зачатков. 11. Предмет и методы биотехнологии животных. Место биотехнологии животных в системе биологических наук. Биотехнология жив.– это совокупность методов для придания биологическим объектам заданных свойств с целью их использования в разных отраслях производства. Методы. Генетическая инженерия — раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине и осуществлять контроль за синтезом необходимых метаболитов клетки. Возникнув на стыке химии нуклеиновых кислот и генетики микроорганизмов, генная инженерия занимается расшифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из клеток живых организмов или вновь синтезированных генов в животных с целью направленного изменения их наследственных свойств. Клонированные гены путем микроинъекции вводят в яйцеклетку млекопитающих, и из них выращивают целых животных, в геном которых встроены клонированные гены. Животные, геном которых изменен путем генноинженерных операций, получили название трансгенных животных. В основе клеточной инженерии лежит использование методов культивирования изолированных клеток и тканей на искусственной питательной среде в регулируемых условиях. Работа с этими объектами делает возможным использование в селекции нетрадиционных методов клеточной инженерии — соматической гибридизации, гаплоидии, клеточной селекции, преодоления нескрещиваемости в культуре и др. Соматическая гибридизация — это слияние двух различных клеток в культуре тканей. Сливаться могут разные виды клеток одного организма и клетки разных, иногда очень далеких видов, например мыши и крысы, кошки и собаки, человека и мыши. Клонирование — новое направление в биотехнологии, в основе которого лежит пересадка ядра из клетки тела в яйцеклетку другого организма, пересадка этой яйцеклетки в клетку другого животного с целью получения организма с новыми свойствами. Пример клонирования — получение овечки Доли в Англии. Биотехнология решает не только конкретные задачи науки и производства. У нее есть более глобальная методологическая задача — она расширяет и ускоряет масштабы воздействий человека на живую природу и способствует адаптации живых систем к условиям существования человека, т. е. к ноосфере. Биотехнология выступает в роли мощного фактора антропогенной адаптивной эволюции. На настоящий момент биотехнологии приобретают все более важную роль в повышении доходности животноводства. Внедрение результатов биотехнологических исследований в животноводство происходит в первую очередь в следующих областях деятельности: 1.Улучшение здоровья животных с помощью биотехнологии; 2.Новые достижения в лечении людей с помощью биотехнологических исследований на животных; 3. Улучшение качества продуктов животноводства с помощью биотехнологии; 4.Достижения биотехнологии в охране окружающей среды и сохранении биологического разнообразия. 12. Основные объекты биотехнологии животных. Правила содержания и разведения животных объектов в лабораторных условиях. Объектами биотехнологии жив. служат многочисленные представители животных, также изолированные из них клетки и субклеточные структуры (органеллы), геномы организмов и транспозоны. Из эмбриональных тканей наиболее широко используемыми являются эмбриональные ткани цыпленка, мыши и человека. Особенной выгодой отличаются куриные эмбрионы десяти-двенадцатисуточного возраста, используемые преимущественно для репродукции вирусов и последующего изготовления вирусных вакцин. Основным типом культивируемой животной клетки являются опухолевые клетки миеломы или саркомы (раковые клетки). В то же время, культивированию поддаются и другие типы клеток: клетки селезенки, фибробласты соединительной ткани, гепатоциты печени, лимфоциты и т.д. Культуры опухолевых клеток практически бессмертны, они переносят неограниченное количество пассажей; длительность существования культур других тканей ограничена. Простейшей питательной средой для животных клеток служит сыворотка крови, но в ряде случаев используются полусинтетические и синтетические среды. Широко используются лабораторные животные, в частности представители семейства Мышиные. Использование экспериментального животного нередко способно причинить самому животному боль, страдание, беспокойство либо нанести тяжелые ранения организму, угрожая его жизни, или быть непосредственной причиной его смерти. Эксперимент начинается с момента, когда животное используется впервые, и заканчивается, когда невозможно сделать ни одно наблюдение относительно проводимого эксперимента. Не любое животное может стать лабораторным или приобрести статус экспериментального. К таким животным предъявляются жесткие требования, позволяющие обеспечить чистоту эксперимента и достоверность научных выводов, получаемых в результате обработки экспериментальных данных. Среди возможных требований могут быть «чистота» генов вида, породы и конкретного животного, отсутствие ряда возбудителей заболеваний животного и человека, определенный возраст, условия содержания и разведения. Обеспечить наличие определенной совокупности признаков, необходимых для проведения того или иного эксперимента, могут лишь некоторые субъекты (специализированные организации). Обычно это виварии или питомники, которые занимаются разведением лабораторных животных для собственных целей или для реализации по заказу внешних пользователей научно-исследовательских учреждений. Не все виды животных, даже отвечающих предъявляемым для эксперимента требованиям, могут быть отнесены к категории экспериментальных. Чаще всего используют мышей, крыс, морских свинок, хомяков, кроликов, собак и кошек. В законодательстве ряда стран действуют запреты либо существенные ограничения по использованию отдельных видов животных для целей экспериментирования, что является отражением выработанных биоэтических принципов современной медицины и биологии. Эти принципы направлены на снижение количества животных в эксперименте, гуманизацию исследований, ограничение использования некоторых видов животных (например, приматов, собак). Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (1986) устанавливает правила содержания и использования животных объектов экспериментирования, определяет ограничения по использованию анестетиков, случаи обязательного умерщвления животного. Оговаривается, что животные для экспериментов должны поступать исключительно из зарегистрированных вивариев и питомников. 13.Вопросы биоэтики в биотехнологии животных. Биоэтика – часть этики, изучающая нравственную сторону деятельности человека в медицине, биологии. Термин предложен В.Р. Поттером в 1969 г. В узком смысле биоэтика обозначает круг этических проблем в сфере медицины и биологии. То есть она имеет философскую направленность, оценивает результаты развития новых технологий и идей в медицине, биотехнологии и биологии в целом. Новейшие биотехнологии создают огромные возможности вмешательства в жизнедеятельность живых организмов и неизбежно ставят человека перед нравственным вопросом: до какого предела допустимо вторжение в природные процессы? Любая дискуссия по биотехнологической проблематике не ограничивается научной стороной дела. В ходе этих дискуссий нередко высказываются диаметрально противоположные точки зрения по поводу применения и дальнейшего развития конкретных биотехнологических методов, прежде всего таких, как: - генная инженерия, - пересадка органов и клеток в терапевтических целях; - клонирование; - использование препаратов, влияющих на физиологию нервной системы, для модификации поведения, эмоционального восприятия мира и т.д. Особенно остро идут дискуссии по поводу клонирования. Клонирование человека в настоящее время официально нигде не осуществляется. Опасность в его применении в репродуктивных целях видят в том, что техника клонирования исключает естественное и свободное слияние генетического материала отца и матери, что воспринимается как вызов достоинству человека. Кроме того, клонирование сталкивается с некоторыми техническими препятствиями, которые подвергают опасности здоровье и благополучие клона. Есть факты, свидетельствующие о быстром старении клонов, возникновении у них многочисленных мутаций. В соответствии с техникой клонирования, клон вырастает из взрослой - не половой, а соматической клетки, в генетической структуре которой на протяжении многих лет происходили так называемые соматические мутации. Помимо прочего, у некоторых людей возникает страх перед клонированным человеком, перед его возможным превосходством в физическом, моральном и духовном развитии (российский врач-психиатр В. Яровой считает, что этот страх носит характер психического расстройства (фобии) и даже присвоил ему в 2008 г. название «бионализм» ). Безусловно, прогресс науки остановить нельзя и вопросы, которые она ставит, возникают быстрее, чем общество может на них найти ответы. Справиться с этим положением дел можно лишь понимая, насколько важно широко обсуждать в обществе этические и правовые проблемы, которые появляются по мере развития и внедрения в практику биотехнологий. Наличие колоссальных идеологических расхождений по этим вопросам вызывает осознанную необходимость серьезного государственного регулирования в этой сфере. 14. Основные этапы развития биотехнологии животных. Биотехнология формировалась и эволюционировала по мере формирования и развития человеческого общества. В 60-70-е гг. 20 в. начала бурно развиваться клеточная инженерия. С созданием в 1972 группой П. Берга в США первой гибридной молекулы ДНК in vitro формально связано рождение генетической инженерии, открывшей путь к сознательному изменению генетической структуры организмов таким образом, чтобы эти организмы могли производить необходимые человеку продукты и осуществлять необходимые процессы. Эти два направления определили облик новой биотехнологии, имеющей мало общего с той примитивной биотехнологией, которую человек использовал в течение тысячелетий. Показательно, что в 70-е гг. получил распространение и сам термин "биотехнология". С этого времени биотехнология неразрывно связана с молекулярной и клеточной биологией, молекулярной генетикой, биохимией и биоорганической химией. Основные даты: 1919: Венгерский инженер Карл Эреки впервые применил слово «биотехнология». 1972: Пол Берг получил рекомбинантную ДНК (собранную из частей, принадлежащих разным организмам). 1973: Стенли Коэн и Герберт Бойер сообщили об успешном переносе человеческого гена в плазмиду кишечной палочки. Сразу же после этого они объявили мораторий на свои исследования и призвали к этому своих коллег.1975: Георг Кёлер и Сезар Мильштейн разработали метод производства моноклональных антител. 1978: Первая беременность после оплодотворения в пробирке. 1980:Верховный суд США признал правоту микробиолога Ананда Чакрабарти против Бюро по регистрации патентов и торговых марок США, требовашего выдать патент на получение первого генетически модифицированного организма в истории. Суд провозгласил также, что патентоспособными являются все «живые системы, созданные руками человека». 1994:Американское управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств одобряет первый ГМ продукт: томаты «Flavr Savr».1994: Компания Monsanto Company вынесла на рынок генетически модифицированную сою «Roundup Ready», устойчивую к гербицидам. 1997: Британские учёные, возглавляемые Яном Вилмутом из института Рослина, сообщили о клонировании овцы по кличке Долли с использованием ДНК взрослой особи.2003: Первое ГМ домашнее животное GloFish появилось на американском рынке. Специально выведенная для обнаружения загрязнения воды, рыба светится красным светом на чёрном фоне благодаря добавлению гена биолюминесценции. 2004: Корейские учёные лечат травму спинного мозга путём пересадки мультипотентных стволовых клеток взрослого из пуповинной крови. 2004: Группа исследователей из парижского университета разработала метод для получения большого количества красных кровяных клеток из стволовых гемопоэтических клеток и создали среду, которая имитирует условия костного мозга. 2005:Исследователи из университета Висконсин-Мэдисон разделили бластоцисты стволовых клеток человека на нервные стволовые клетки и спинные двигательные нейронные клетки. 15. Тотипотентность, мультипотентность, плюропотентность клеток животных. Дифференцировка – это процесс постепенного увеличения фенотипической обособленности типов клеток, связанный с их созреванием. Различные стволовые клетки демонстрируют разные потенциальные возможности дифференцировки, т.е. способность давать начало большему или меньшему количеству специализированных клеточных линий. В связи с этим стволовые клетки можно разделить на несколько типов в зависимости от их потентности. Понятие «потентность» отражает широту реализации морфогенетической информации потомками стволовой клетки. Понятие тотипотентности, мультипотентности и плюрипотентности тесно связано с понятиями «потенция к развитию» и «детерминация». Тотипотентность – способность стволовых клеток давать начало всем эмбриональным и экстраэмбриональным тканям. Оплодотворенные яйцеклетки животных являются тотипотентными. В течение развития потомки зиготы утрачивают тотипотентность. У большинства животных бластомеры сохраняют тотипотентность в течение определенного количества делений дробления. У животных с детерминированным развитием (например, у круглых червей) первые потомки зиготы уже утрачивают тотипотентность. Плюрипотентность – способность воспроизводить любую ткань взрослого организма; способность формировать клетки всех типов, включая первичные половые клетки, за исключением клеток экстраэмбриональных тканей Плюрипотентностью обладают эмбриональные стволовые клетки. Мультипотентность – способность давать начало более чем одному типу дифференцированных клеток; способность формировать клетки многих клеточных типов. Примерами таких клеток являются гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки. Тотипотентными стволовыми клетками принято считать зиготу и бластомеры на стадии морулы. К плюрипотентным стволовым клеткам относятся эмбриональные стволовые клетки, стволовые клетки эмбриональной карциномы и эмбриональные зародышевые (герминативные) стволовые клетки. К мультипотентным стволовым клеткам относятся региональные стволовые клетки взрослого организма и плода, например, гемопоэтические (кроветворные) стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, нейрональные стволовые клетки и др. Практически во всех тканях взрослого организма человека содержится пул резидентных, т.е. характерных именно для этой ткани, мультипотентных стволовых клеток. Наличие в тканях взрослого организма монопотентных стволовых клеток остается под вопросом. Скорее всего, монопотентными стволовыми клетками являются прогениторные клетки на поздних стадиях созревания. Прогениторными, или клеткамипредшественницами, принято считать клетки, которые являются потомками мультипотентных стволовых клеток, но, несмотря на то, что обладают достаточно высоким пролиферативным потенциалом, утратили способность к асимметричному делению и вступили на путь дифференцировки. 16. Сырье и среды, применяемые в биотехнологии. Любое производство начинается с сырья. Общий объем биотехнологической продукции в мире измеряется в миллионах тонн в год. Гидролизаты растительного сырья - это растворы сахаров в виде смеси гексоз и пентоз, образующиеся при кислотном гидролизе древесины, подсолнечной и хлопковой шелухи, кукурузной кочерыжки, ботвы и т.п. Гидролизаты торфа считаются перспективными источниками сырья для получения кормовых дрожжей. При этом наибольшее значение имеет верховой торф, содержащий в своем составе до 50% полисахаридов. Глюкоза является продуктом пищевой промышленности. Идеальный субстрат практически для всех биотехнологических производств. Чаще всего она входит в состав комплексного сырья в виде гидрола отхода крахмало-паточного производства. Из органического сырья выделяют крахмал, разваренный в присутствии амилолитических ферментов, образует вязкую однородную массу, которую используют как субстрат для биосинтеза ряда биологически активных веществ, хотя для его ассимиляции микроорганизмами требуется сложный комплекс амилолитических ферментов, которым владеют только некоторые виды микроорганизмов (например, грибы рода Aspergillus, бактерии Вас. subtilis и др.). Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно - щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН среды является одним из главных требований условий культивирования. Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатно - солевой буфер Дульбекко и Фогта используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток. 17. Периодическое культивирование микроорганизмов. Стадии развития популяции в аппарате периодического культивирования. Культивирование микроорганизмов – это один из основных приемов в микробиологии. Для роста и развития микроорганизмов в природе и в лабораторных условиях необходимо наличие питательных веществ для энергетических и конструктивных реакций. Требования разных групп микроорганизмов к источникам энергии и химическим элементам определяются их метаболическими возможностями. Выращивание и поддержание микробных культур в лаборатории основано на моделировании естественных условий обитания данного организма в лаборатории, а также на знании особенностей обмена веществ. Особенности роста микроорганизма иногда служат одним из критериев при определении его систематического положения. Микробные клетки в зависимости от условий могут расти в виде суспензии, микроколоний или обрастаний в жидких средах и образовывать колонии, штрихи или газон на твердых средах. Колония может быть прозрачной, плотной, мягкой, хрупкой, врастать в агар, сниматься целиком в виде пленки, тянуться за петлей и т.д. Ее поверхность может быть блестящей или матовой, гладкой или шероховатой, иметь различные выпуклости, исчерченность и т.д. Морфология колоний может значительно изменяться в зависимости от состава среды, возраста культуры и температуры культивирования. Различают два основных способа культивирования микроорганизмов – периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Постепенно увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена, т.е. условия существования микроорганизмов изменяются. Периодическую культуру обычно рассматривают как замкнутую систему, переживающую разные фазы развития. Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза – это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходит увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диауксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лагфазу для подготовки к потреблению другого субстрата. В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 109 клеток/мл, для водорослей и простейших – 106 клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма преодолеют некие пороговые концентрации, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается. Непрерывное (проточное) культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Этого добиваются постоянным прибавлением новой питательной среды в сосуд для выращивания и одновременным удалением такого же количества среды с клетками. Подача свежей среды и удаление части суспензии происходит с той же скоростью, с какой растет культура. В этом случае устанавливается динамическое равновесие. 18. Непрерывный процесс культивирования микроорганизмов, преимущества перед периодическим, системы непрерывной ферментации, способы управления. Культивирование микроорганизмов может быть непрерывным и периодическим. Более перспективно непрерывное культивирование. Его сущность заключается в том, что в ферментаторе поддерживаются постоянные условия среды, в результате чего микроорганизмы остаются в определенном физиологическом состоянии. Подается свежая питательная среда и удаляется избыток среды с продуктами метаболизма, поддерживается фаза экспоненциального роста. Если для культивирования продуцента используется один ферментатор, то говорят о гомогенно-непрерывном процессе. Если же используется батарея, то это гетеронепрерывный процесс, так как в каждом ферментаторе, соединенном в батарею, поддерживаются постоянные условия. При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутствует смена фаз развития культуры. В таких процессах скорость потока питательной среды и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время. Поддержание динамики равновесия в реакторе осуществляется двумя методами: турбидостатным и хемостатным. По турбидостатному принципу концентрация биомассы поддерживается скоростью потока среды, а по хемостатному – концентрацией подаваемого субстрата. Известен также способ регулирования роста культуры по рН. При турбидостатном методе регулирования контролируются концентрации суспензии входящей жидкости, создаваемой микробными клетками. Метод осуществляется с помощью фотоэлемента или рН-электрода, если в культуральной жидкости образуются органические кислоты. Хемостатный контроль проще, так как он происходит по входящему потоку. Этот метод регулирования применим ко всем типам микроорганизмов и клеток различных тканей животных и растений. Биореактор в хемостатном режиме снабжен устройствами для вливания и выпуска питательной жидкости, имеет систему контроля скорости потока, перемешивание. При периодическом процессе весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют посевной материал и при оптимальных условиях продолжают процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы или определенного метаболита. В ходе периодического культивирования изменяется темп роста культуры, ее морфология и физиология. За время культивирования меняется состав среды - уменьшается концентрация питательных веществ, увеличивается содержание метаболитов. С физиологической точки зрения периодическое культивирование невыгодно. В ходе его возникает также ряд технологических трудностей - циклический ход операций, сменные режимы, что затрудняет контроль и регуляцию процесса. При периодическом процессе культивирования микроорганизмов с целью получения биомассы время конца процесса совпадает со временем перехода роста культуры в стационарную фазу. В случае проведения периодического процесса ферментации с целью получения продукта метаболизма время конца процесса определяется максимальным накоплением этого метаболита. Это может быть любая из фаз: фаза замедления роста, стационарная (фаза роста), ускорения отмирания микроорганизмов, отмирания микроорганизмов. 19. Стерилизация воздуха, характеристика фильтрующихся материалов. Стерилизация — полное освобождение какоголибо предмета от всех видов микроорганизмов, включая бактерии и их споры, грибы, вирионы, а также от прионного белка, находящихся на поверхностях, оборудовании, в пищевых продуктах и лекарствах. Осуществляется термическим, химическим, радиационным, фильтрационным методами. Обязательным условием осуществления многих биотехнологических процессов является работа в асептических условиях. В биотехнологических процессах воздух стерилизуют фильтрованием. Цель всех процессов стерилизации состоит в уменьшении числа выживших потенциально жизнеспособных клеток и спор до величины, меньшей единицы. Посторонняя микрофлора может попасть в ферментатор с водой, воздухом или с любым из видов сырья. Аэробные сапрофитные микроорганизмы наиболее опасные с точки зрения загрязнения б/т процессов, они составляют 0,1-1%. Содержание микроорганизмов в воздухе сильно колеблется в зависимости от района и составляет от 100 до 10 000 в 1м3. В непосредственной близости от микробиологических производств обсемененность воздуха резко возрастает. При осуществлении аэробных асептических процессов выращивания в ферментаторы непрерывно подают стерильный воздух. В отличие от процессов стерилизации оборудования и технологических жидкостей, осуществляемых термическим методом, воздух стерилизуют путем фильтрации в специальной системе очистки и стерилизации воздуха, включающую большое количество фильтров Значительная часть системы очистки воздуха предназначена для удаления пыли, влаги и других примесей. Задержка микроорганизмов происходит на фильтрах тонкой очистки, обычно волокнистых фильтрах глубинного типа, в которых фильтрация происходит по всей глубине материала. Для полного удаления микроорганизмов применяют ситчатые фильтры, имеющие поры размером менее 0,3 мкм. При значительной загрязненности воздуха пылью и микроорганизмами поры быстро забиваются, и гидравлическое сопротивление фильтра резко возрастает. Оптимальным решением этой проблемы является сочетание глубинного фильтра, обладающего большой емкостью, но не обеспечивающего полную задержку микроорганизмов, с мембранным фильтром, в котором происходит полная очистка воздуха от посторонней микрофлоры. 20. Биореакторы, используемые в биотехнологическом производстве, их классификация, принцип работы. Биореакторы (ферментаторы) составляют основу биотехнологического производства и отличаются широким диапазоном приложений. Примером может служить промышленное производство эритромицина, антибиотика, полученного из Saccharopolyspora erythraea путём ферментации при аэробных условиях. К. Шюгерль в 1982 г. предложил подразделить биореакторы на 3 основные группы согласно способу потребления энергии для перемешивания и диспергирования г стерильного воздуха (газа): - в биореакторах I типа энергия расходуется на механическое движение внутренних устройств; - в биореакторах II типа энергия расходуется на работувнешнего насоса, обеспечивающего реци ркуляцию жидкости и/или газа; - в биореакторах III типа энергия расходуется на сжатие и подачу газа в культуральную жидкость. Принцип работы: Выделяют следующие этапы в типичном порционном производстве: добавление насыщенных питательных сред, инокуляция микроорганизмов, подача пеногасителя и кислорода (многие микрооорганизмы, используемые в биотехнологическом производстве, аэробные). В подобных биореакторах аккумуляция производственных отходов и умножение микроорганизмов вызывают изменение условий во время ферментационного процесса. Витамины, минералы, жирные аминокислоты и, в зависимости от типа бактерий, стимуляторы роста могут добавляться на всём протяжении ферментационного процесса. Эффективность процесса увеличивается, если ферментационный цикл протекает при постоянной температуре. Химические реакции и механические процессы внутри ферментационной ёмкости нагревают систему, и, при несбалансированном теплообмене клетки умирают или теряют способность к воспроизводству. Поэтому процессу охлаждения требуется соответствующая система контроля. Регулирование pH и уровня аэрации, температуры, перемешивания и т.д. производится автоматически. 21. Применение микроклонального размножения растений и его перспективы. Микроклональное размножение - получение в условиях in vitro , неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В основе метода лежит способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Этот метод имеет ряд преимуществ: получение генетически однородного посадочного материала; освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; высокий коэффициент размножения; сокращение продолжительности селекционного процесса; ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами; возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала; Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа: 1)выбор безвирусного растения-донора; 2) собственно микроразмножение, когда получают максимальное количество клонов; 3) укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почве; 4) выращивание растений в теплице и подготовка их к продаже или посадке. Область применения микроразмножения довольно разнообразна и постоянно расширяется. Эта техника в первую очередь применяется для размножения взрослых древесных пород, особенно хвойных, которые очень плохо размножаются другими способами, и для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений, которые были размножены в лаборатории (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.) Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, который получил первых растений - регенерантов орхидей. 22. Влияние цитокининов на процессы морфогенеза в культуре клеток растений. Цитокинины — класс гормонов растений, стимулирующих деление клеток (цитокинез):кинетин,зиатин,6-БАП,фурфурил. Скугом и Мурасиге была выдвинута концепция, согласно которой можно получить образование стеблей, корней или недифференцированный рост каллуса, изменяя относительное содержание ауксинов и цитокининов. Индукция и образование каллуса наблюдается при сбалансированном отношении ауксинов к цитокининам, стеблевые почки образуются при повышении уровня цитокининов по отношению к ауксинам, корни формируются при высоком содержании ауксинов в среде. При преобладании ауксинов (недостатке цитокининов) начинается процесс ризогенеза. При преобладании цитокининов (недостатке ауксинов) образуются меристемы побегов: начинается геммагенез. Цитокинины в первую очередь оказывают влияние на деление клеток, хотя в некоторых случаях могут регулировать и их растяжение. Особенно ярко влияние цитокининов на процессы деления проявляется на культуре изолированных тканей. Цитокинины регулируют последнюю стадию деления, а именно цитокинез (деление самой клетки). Кроме того, они активируют рост растяжением изолированных листьев и семядолей у двудомных растений. Стеблевом каллусе табака показано их участие в органообразовании. Влияние цитокининов тесно связано с присутствием ауксинов. Взаимосвязь в действии этих фитогормонов проявляется поразному. В некоторых случаях действие цитокининов требует определенной концентрации ауксинов. Цитокинины способствуют пробуждению и росту боковых почек. Обработка пазушных почек растворами кинетина устраняла тормозящее влияние верхушечных почек, вызывая их рост. Цитокинины задерживают старение листьев. Одним из показателей процесса старения является разрушение хлорофилла. Обработанные цитокининами листья остаются в течение долгого времени зелеными. Цитокинины не только задерживают распад белка и хлорофилла, но и стимулируют синтез хлоропластных белков. В ряде исследований отмечается, что обработка растений цитокининами повышает устойчивость к различным неблагоприятным условиям среды. Цитокинины способствуют выходу из покоящегося состояния спящих почек, семян, клубней. 23. Этапы развития биотехнологии. Отрасли биотехнологии. Биотехнология - использование биологических агентов для получения ценных продуктов и осуществления целевых превращений. Впервые термин «биотехнология» применил венгерский инженер Карл Эреки в 1917 году. Этапы развития биотехнологии. В развитии биотехнологии выделяют следующие периоды: эмпирический научный, современный (молекулярный). 1) Эмпирическая биотехнология-зарождение биотехнологии с древних времен до конца XVIIIв. На данном этапе появляются сферы производства (с древнейших времен — приготовление теста, получение молочнокислых продуктов, сыро-, виноделие, пивоварение, ферментация табака и чая, выделка кож и обработка растительных волокон). В течение тысячелетий человек применял в своих целях ферментативные процессы, не имея понятия ни о ферментах, ни о клетках. На территории древней Месопотамии, Египте сохранились остатки пекарен, пивоваренных заводов. Т.е. зарождение биотехнологии тесно связано с сельским хозяйством, переработкой растениеводческой и животноводческой продукции. 2) XIX - первая половина XX в.- становление биотехнологии как науки. Этот этап связан с началом бурного развития биологических наук: генетики, микробиологии, вирусологии, цитологии, физиологии, эмбриологии. В XIX-XX вв. в ряде стран создаются первые биогазовые установки, в которых отходы животноводства и растениеводства под действием микроорганизмов превращались в биогаз (метан) и удобрение. В конце 40-х годов XX, века с началом крупномасштабного производства антибиотиков стала развиваться микробиологическая промышленность. Возникли предприятия, на которых с помощью микроорганизмов производились аминокислоты, витамины, органические кислоты, ферменты. 3) С середины 70-х годов XX века ознаменовался развитием биотехнологии в различных направлениях с помощью методов генной и клеточной инженерии. Формальной датой рождения современной биотехнологии считается 1972г., когда была создана первая гибридная ДНК, путем встраивания в нее чужеродных генов. В зависимости от объектов выделяют: бт животных, растений и микроорганизмов. По области применения выделяют: с/х биотехнологию, промышленную бт (пищевая микробиология, прикладная микробиология), медицинскую бт, ветеринарную бт, экологическую бт. 24. Клетки и ткани растений как объекты биотехнологии. Протопласты, клетки и ткани растений являются перспективными объектами современной биотехнологии. На сегодняшний день из растений получают свыше 25 % фармацевтических препаратов. Они – сырье для химии, а также источник биохимических компонентов для косметических изделий и пищевых добавок. Этому способствует ряд особенностей жизнедеятельности и размножения растений – способность к неограниченному вегетативному размножению, т.е. к регенерации полноценного растения из черенка, а в условиях биотехнологических систем – из небольшой группы клеток и даже из одной клетки. При культивировании в питательных средах растительные клетки способны в одних условиях неограниченно размножаться, быстро наращивать биомассу, в других – дифференцироваться, образовывать корешки, стебельки, листочки, а затем переходить к цветению и плодоношению. Оказывая на развивающиеся растения физические, химические и иные воздействия, можно направленно улучшать культивируемые сорта, повышать их продуктивность, использовать растительные клетки в качестве продуцентов биологически активных веществ. С помощью новых методов клеточной инженерии теперь сливают друг с другом клетки разных растений и получают из них новые гибридные растения. Клетки, лишенные целлюлозной оболочки, называют протопластами. Получают протопласты обработкой клеток смесью ферментов. Этим путем созданы межвидовые гибриды табака, картофеля, капусты с турнепсом. Протопласты используют также для переноса в них органоидов других клеток – митохондрий, хлоропластов, цитоплазмы. Культуру растительных клеток выгодно использовать для быстрого размножения медленно растущих растений — женьшеня, маслинной пальмы, малины, персика и др. Также клетки растений обладают таким свойством как -тотипотентность-свойство клеток в полной мере реализовать присущую им ген.информацию,и дальнейшее развитие до целого организма. Способность отдельной клетки растения воссоздавать целый организм, обладающий всеми признаками исходной растительной формы, успешно используется для клонального размножения редких и исчезающих видов растений, ценных селекционных объектов, для получения безвирусного материала. Растения регенеранты, полученные из каллусных тканей, отличаются от исходного материала. Это явление используется для создания новых растительных форм, так называемых сомаклональных вариантов, которые также расширяют генофонд для селекции растений. Также на культуре клеток можно проводить селекцию (то есть отбор определенных клеток, по какому-нибудь признаку, а затем выращивание из них растений). Можно проводить эксперименты по генной инженерии – создавать трансгенные растения, помещая нужный ген в клетку, отбирая клетки с правильно встроившимся геном и выращивая из них растения с соответствующим нужным признаком. Одним из самых важных и распространенных способов применения культур клеток является получение ценных веществ растительного происхождения – вторичных метаболитов. 25. Основные методы экспериментальной гаплоидии. Гаплоиды получают двумя способами. Первый способ классический – отдаленная гибридизация, когда в зиготе отдаленного гибрида хромосомы одного из видов элиминируют. Второй способ основан на методиках культивирования in vitro, где из неоплодотворенных половых клеток с редуцированным набором хромосом можно регенерировать целые растения. Обычно они стерильны, так как у них нарушено формирование мужских и женских гамет. При культивировании in vitro может произойти спонтанное удвоение хромосом, или его можно вызвать искусственно, например, обработав колхицином клетки или растения. Дигаплоиды фертильны и вполне жизнеспособны. Гаплоиды и дигаплоиды имеют ряд преимуществ в селекционной работе: 1.гаплоидные растения имеют один набор хромосом, характерный для гамет, что дает селекционерам возможность наблюдать мутации сразу же в ходе осмотра гаплоидных растений, поскольку все рецессивные генные мутации в гаплоидных организмах не маскируются доминантными аллелями; 2.если гаплоидные клетки подвергнуть полиплоидизации с помощью колхицина, то возникнут дигаплоиды, характеризующиеся абсолютной гомозиготностью. Скрещивание гомозиготных линий дает высокопродуктивное потомство. С другой стороны, в настоящее время картофель не размножают семенами из-за пестроты потомства, а создание с помощью гаплоидов гомозиготных линий устранит этот недостаток; 3.гомозиготные растения используются селекционерами и в других целях: количественный генетический анализ, изучение взаимодействия генов, изучение генетической изменчивости, определение групп сцепления, установление числа генов, действующих на количественные признаки, определение локализации полигенов и т.д. 4.гаплоидные растения лишены летальных или сублетальных мутаций, ведущих к гибели или ослаблению потомства. Гаплоиды высших растений можно получить из эксплантов, взятых на любой стадии развития гаметофита после редукционного деления клеток спорогенной ткани пыльника. Наиболее распространены следующие методы индуцирования гаплоидов: 1.индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы; 2.селективная элиминация хромосом в гибридном зародыше. Этот метод чаще всего используется в селекции злаковых; 3.псевдогамия - развитие гаплоидного зародыша после оплодотворения инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки или же развитие изолированной семяпочки (гиногенез). В клеточной инженерии чаще применяется первый метод. 26. Морфологические и функциональные особенности половых клеток – яйцеклеток и сперматозоидов. Гаметогенез у животных. Половые клетки имеют гаплоидный набор хромосом в ядрах, что обеспечивает воспроизведение в зиготе типичного для организмов данного вида диплоидного числа хромосом. Гаметы отличаются необычным для других клеток значением ядерноцитоплазматического отношения. У яйцеклеток оно снижено благодаря увеличенному объему цитоплазмы, в которой размещен питательный материал (желток) для развития зародыша. У сперматозоидов благодаря малому количеству цитоплазмы ядерно-цитоплазматическое отношение высокое, т. к. главная задача мужской гаметы — транспортировка наследственного материала к яйцеклетке. Половые клетки отличаются низким уровнем обменных процессов, близким к состоянию анабиоза. Процесс образования гамет у животных называется гаметогенезом. В результате сперматогенеза образуются мужские гаметы (сперматозоиды), а в результате оогенеза – женские гаметы (яйцеклетки). Начало гаметам дают диплоидные (2n) первичные зародышевые клетки, или клетки зачаткового эпителия половых желез организма. Образование мужских и женских гамет характеризуется собственной спецификой. Наиболее очевидная отличительная черта яйцеклетки - это ее большие размеры. Типичная яйцеклетка имеет сферическую или овальную форму. Потребность клетки в питательных веществах удовлетворяет в основном желток. Он содержится в желточных гранулах. Другой важной специфической структурой яйцеклетки является наружная яйцевая оболочка, состоящая в основном из гликопротеина. При активации яйцеклетки спермием кортикальные гранулы высвобождают содержимое путем экзоцитоза, в рез-те св-ва яйцевой оболочки изменяются таким образом, что через нее уже не могут проникнуть внутрь яйцеклетки другие спермии. Развивающаяся яйцеклетка называется ооцитом, ее дифференцировка в зрелую яйцеклетку отличается от обычных клеточных циклов. Половые клетки делятся путем мейоза, у ооцитов выработались специальные механизмы, позволяющие им приостанавливать ход мейоза: ооциты на длительный период задерживаются в профазе I , увеличиваясь в это время в размерах, а позже они в преддверии оплодотворения во многих случаях временно останавливают свое развитие на стадии метафазы II. Тип развития оплодотворенного яйца существенно зависит от количества содержащегося в нем желтка, представляющего собой запас питательных веществ. Алецитальные. Это яйца почти без желтка или с очень незначительным количеством его (яйцеклетки млекопитающих, плоских червей). Гомолецитальные. В этих яйцах желток относительно равномерно распределен в цитоплазме. Ядро расположено в центре (яйца многих моллюсков, иглокожих и ланцетника). Телолецитальные яйца. Желток резко неравномерно распределен в цитоплазме. В области анимального полюса мало или почти совсем нет желтка; большая часть его находится в вегетативном полушарии, где желточные зерна и пластинки лежат более плотно (яйца амфибий – лягушек). Сперматозоиды - это очень мелкие подвижные мужские половые клетки (гаметы), образующиеся в мужских половых гонадах семенниках. Процесс образования сперматозоида занимает примерно 70 дней. Сперматогенез состоит из нескольких стадий. Первая из них стадия размножения первичных половых клеток - сперматогониев, которые интенсивно делятся путем митоза. В результате прекращающегося синтеза РНК и, следовательно, белка профазные клетки увеличиваются в размерах. Это - стадия роста. Стадия, во время кот-й проходят одно за другим два мейотических деления, получила название стадии созревания. В рез-те первого деления созревания из одного сперматоцита первого порядка образуется два сперматоцита второго порядка . После второго деления из каждого сперматоцита второго порядка возникают две гаплоидные клетки - сперматиды . Из одной исходной клетки, вступившей в мейоз, обр-ся 4 сперматиды. Превращение сперматид в сперматозоиды происходит во время следующей стадии - стадии формирования. Каждый сперматозоид состоит из головки, шейки, промежуточного отдела и жгутика. Головка яйцевидной формы содержит ядро, обладающее, как и ядро яйцеклетки, гаплоидным набором хромосом. На переднем полюсе головки под плазматической мембраной расположена акросома. Акросома способствует проникновению спермия в ооцит непосредственно перед оплодотворением. В короткой шейке сперматозоида расположено множество митохондрий, обеспечивающих сперматозоид энергией движения. Подобно оогенезу, сперматогенез находится под влиянием гормональной регуляции. Под воздействием ЛГ клетки Лейдига, расположенные между семенными канальцами в семенниках, выделяют большие количества мужского полового гормона тестостерона. Он инициирует сперматогенез, это происходит благодаря действию тестостерона на клетки Сертоли. Они обеспечивают созревающим спермиям механическую опору, защиту и питание. Эти клетки секретируют и жидкость, с которой спермии проходят по канальцам. В отличие от яйцеклеток, у сперматозоидов дифференцировка в основном осуществляется после того, как они завершат мейоз и становятся гаплоидными. У женщин на ранней стадии эмбриогенеза из размножающихся оогоний образуется ограниченное число ооцитов, которые через определенные промежутки времени по очереди претерпевают овуляцию. Сперматогенез у мужчин начинается только после полового созревания и затем непрерывно продолжается в эпителиальной выстилке очень длинных, сильно извитых трубочек, называемых семенными канальцами, которые находятся в семенниках. 27 Эмбриологические основы биотехнологии животных. Гормональная регуляция размножения млекопитающих. Эмбриональный период. Дробление. В рез.дробления обр-ся кл, к-е наз.бластомерами. Дробление от деления отличает то, что бластомеры не увеличиваются в размерах. Био. значение процесса дробления: происходит размножение генотипа зиготы; накопление клеточной массы для дальнейших преобразований, зародыш из одноклеточного превращается в многоклеточный. Дробление завершается образованием бластулы. Бластула — однослойный зародыш. Она состоит из слоя клеток — бластодермы, ограничивающей полость — бластоцель. Возникающая при этом полость заполняется жидкостью. Целобластула (типичная бластула) образуется при равномерном дроблении. Имеет вид однослойного пузырька с большим бластоцелем (ланцетник). Амфибластула образуется при дроблении телолецитальных яиц; бластодерма построена из бластомеров разного размера: микромеров на анимальном и макромеров на вегетативном полюсах. Бластоцель при этом смещается в сторону анимального полюса (земноводные). Дискобластула образуется при дискоидальном дроблении. Полость бластулы имеет вид узкой щели, находящейся под зародышевым диском (птицы). Бластоциста представляет собой однослойный пузырек, заполненный жидкостью, в котором различают эмбриобласт (из него развивается зародыш) и трофобласт, обеспечивающий питание зародыша (млекопитающие). После бластулы начинается гаструляция (образование зародышевых листков). В результате гаструляции образуется двухслойный, а затем трехслойный зародыш — гаструла. Первоначально образуются наружный (эктодерма) и внутренний (энтодерма) слои. Позже между экто- и энтодермой закладывается третий зародышевый листок — мезодерма. Способы гаструляции: инвагинация, иммиграция, деламинация, эпиболия. Процесс формирования органов в эмбриональном развитии называют органогенезом. В нем выделяют две фазы: нейруляция — образование комплекса осевых органов (нервная трубка, хорда, кишечная трубка и мезодерма сомитов), в который вовлекается почти весь зародыш, и построение остальных органов, приобретение различными участками тела типичной для них формы и черт внутренней организации, установление определенных пропорций (пространственно ограниченные процессы). По теории зародышевых листков Карла Бэра, возникновение органов обусловлено преобразованием того или иного зародышевого листка — экто-, мезо- или энтодермы. Некоторые органы могут иметь смешанное происхождение, то есть они образованы при участии сразу нескольких зародышевых листков. 1. 17-гидроксипрогестерон (17-ОНР) – образуется в надпочечниках, половых железах и плаценте. 17-ОНР способен превращаться в андростендион, предшественник половых гормонов тестостерона и эстрадиола. 2. Андростендион – гормон, являющийся предшественником тестостерона и эстрона. Вырабатывается надпочечниками и половыми железами. 3. Антимюллеров гормон (АМГ) – нестероидный гормон белковой природы, выделяется у мужчин в яичках, а у женщин – в яичниках (клетками первичных фолликулов). Роль АМГ для мужчин и женщин различна. При формировании мужского организма он вызывает обратное развитие протока Мюллера, который является зачатком женской половой системы. У женщин антимюллеров гормон играет важную роль в определении «доминантного» фолликула, в результате развития которого происходит овуляция. 4. Глобулин, связывающий половой гормон (ГСПГ) –основная функция данного белка – связывание с половыми гормонами и регулирование их активности. 5. Дигидротестостерон (ДГТ) – мужской гормон. ДГТ образуется в тканях органовмишеней (например, простате, гениталиях, волосяных фолликулах). Играет большую роль в развитии мужского организма при половом созревании, в том числе определяет формирование гениталий, оволосения по мужскому типу, развития мускулатуры, полового влечения, сексуального поведения и потенции. 6. Тестостерон – основной мужской половой гормон, вырабатывается половыми железами. У мужчин определяет развитие организма по мужскому типу, формирование вторичных половых признаков, либидо, потенции, поведенческих реакций. Обладает анаболическим эффектом, участвует в регуляции обменных процессов. У женщин участвует в регуляции гипофизом (железой головного мозга) выработки половых гормонов, а также играет определенную роль в регрессии фолликула. 7. Эстрадиол – эстроген, один из основных женских половых гормонов. Вырабатывается у женщин яичниками и, в меньших количествах, надпочечниками. У мужчин в норме небольшое количество эстрадиола образуется в яичках, периферических тканях и надпочечниках. Эстроген определяет формирование женского организма и половых поведенческих реакций, обеспечивает подготовку внутреннего слоя матки (эндометрия) к беременности и регулирует маточный кровоток, обладает анаболическим действием. В регуляции размножения также участвуют лютеинизирующий гормон, прогестерон, пролактин, фолликулостимулирующий гормон и др. 28. Аллофенные животные (генетические химеры). Методы получения химер. Одно из перспективных направлений биотехнологии — искусственное получение химер (аллофенных животных). Аллофельными называют химерные организмы, содержащие разные ткани, произошедшие из клеток, полученных от разных родителей. Сущность метода получения химер заключается в искусственном объединении эмбриональных клеток двух и более животных. Животные могут быть как одной породы, так и разных пород и даже разных видов. Современная микрохирургия позволяет получать химер, имеющих 3—4 и более родителей. Химеры обладают признаками животных разных генотипов. Методы получения химер 1. Агрегационный — объединение двух и более морул или бластоцист в один эмбрион. Был предложен практически независимо друг от др. Тарковским и Минц (1961-1962 гг.). Из матки беременных самок-докторов извлекают зародыши на стадии 8 бластомеров. Бластомеры от 2 животных с различными генотипами (например, от мышей с белой черной окраской шерсти) помещают в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у к-й вызывают ложную беременность вводя гормоны. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него смешанная, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Ткани животных-химер мозаичны. Различия могут касаться белков, выполняющих фермент. фун-ю: могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными.(изоферменты). Агрегационные химеры можно получать м/у различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не больше обычной и подвержена де-ю механизмов эмбриональной регуляции. Преимущество метода - не требует вмешательства микрохирургической техники. 2. Инъекционный микроинъекция клеток внутриклеточной массы (ВКМ) бластоцисты доноров в бластоцель эмбрионареципиента. Разработан Р. Гарднером в 1968 г. Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона - рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки. Нашел применение при получении межвидовых химер. Первые межвидовые химеры – м/у 2 ближайшими видами мышей, кот-е не скрещиваются.i. Химерные эмбрионы, полученные инъекционным методом, нормально развивались только при пересадке их в матку того вида, чья бластоциста была использована в качестве рецепиента. Первые химерные животные были получены только в 1973 году Р. Гарднером и М. Джонсоном. А.М. неприемлем для получения химер крупного рогатого скота. Химеры не передают потомкам генетическую мозаичность. У них - расщепление, как у гетерозигот, поэтому ценные генетические комбинации нарушаются. Но на протяжении 1 поколения хозяйственно ценные признаки поддерживаются. 29. Сущность генетического клонирования. Развитие методов клонирования с помощью пересадки ядер. Генетич. клонирование- получение генетически идентичных копий из одной клетки. При клонировании исходный организм (или клетка) служит родоначальником клона – ряда организмов, повторяющих из поколения в поколение и генотип, и все признаки родоначальника. Сущность клонирования заключается в повторении одной и той же генетической информации. Одна из основных трудностей при попытках генетического клонирования многоклеточных организмов, и в особенности животных, заключается в том, что их клетки уже на ранних стадиях эмбрионального развития сильно дифференцированы — т.е. специализированы на выполнении своей функции (так, клетка печени отличается от нервной клетки того же индивида), Пересадки ядер у амфибий. В 1938 г. Ганс Шлеман предложил произвести опыт по переносу ядра какой-либо дифференцированной клетки в яйцеклетку, собственное ядро к-рой было предварительно удалено. Г. Шлеман в своих опытах продемонстрировал, что клетки бластулы недетерминированы, →, их ядра тотипотентны. Бриггс и Кинг стали переносить ядра клеток бластулы в механически энуклеированные (лишенные ядра) яйцеклетки леопардовой лягушки Rana pipiens. Ядра извлекали из недифференциров клеток бластулы – их пересадили в неоплодотворенные яйца с удаленным генетич содержимым. После того как яйца были простимулированы к развитию, из них выросли нормальные головастики. К 1960 году Бригс и Кинг пришли к выводу, что дифференциация сопровождается прогрессирующим сужением возможности ядер стимулировать нормальное развитие организма. В дальнейшем была разработана методика серийной пересадки: первонач-но берут ядро клетки потерявшей тотипотентность (н-р поздняя гаструла) переносят его в энуклеирован яйцо, развив до стадии бластулы, затем клетки этой бластулы снова использ как доноры ядер Большего успеха в клонировании эмбрионов амфибий добился биолог Джон Гордон. Он не удалял хирургическим путем ядро яйцеклеткиреципиента, а разрушал его УФ. Ядра клеток донора имели генетич. маркер - одно ядрышко на клетку вместо обычных двух. Объектом его исследований стала примитивная южноафриканская лягушка Xenopus laevis Гордон использовал метод серийных пересадок ядер и подтвердил гипотезу о постепенной утрате потенций по мере развития. Анг исследователь переносил ядра эпителиальных кишечных клеток в активированные энуклеированные ооциты лягушки. Число ядер, обеспечивающих нормальное развитие, составило около семи процентов. Некоторые из них были способны реализовывать генетическую информацию только до стадии бластулы, другие - до стадии плавающего головастика, но, кроме того, семь головастиков (около 1% от оперированных эмбрионов) претерпели метаморфозу и превратились в половозрелых взрослых лягушек, т. е. трансплантированные ядра были тотипотентными. Эти результаты были с недоверием восприняты другими учеными, поскольку развитие взрослых особей могло быть связано с использованием ядер первичных половых клеток, к-рые возникают из энтодермы и длительное время присутствуют среди клеток эпителия кишечника. Сходные результаты получили и другие исследователи. Ди Берардино и Хофнер в 1983 г. показали, что ядра таких дифференцированных клеток амфибий (Rana pipiens), как эритроциты, при пересадке в энуклеированные ооциты могут поддерживать развитие только до стадии ранней гаструлы, но в то же время серийная пересадка таких ядер обеспечивала развитие нормальных плавающих головастиков . Пересадки ядер у млекопитающих. Значительный шаг в развитии технологий переноса ядер млекопитающих был сделан в 1970-х - начале 1980-х, когда Модлинский микрохирургически трансплантировал клеточ ядра ранних эмбрионов мыши в зиготы, из к-рых в рез-те развивалось небольшое количество тетраплоидных эмбрионов до стадии бластоцисты. Далее в 1983 г. МакГрат и Солтер предл метод, к-рый заключался в удалении обоих пронуклеусов из зигот мышей с помощью микропипетки. Один или два пронуклеуса извлекались с небольшим количеством окружающей цитоплазмы без нарушения целостности мембраны, к-рая осторожно перешнуровывалась при соприкосновении с краем разрыва блестящей оболочки. Донорский кариопласт вводился вместе с вирусом Сендай через разрыв под zona pellucida.С помощью этого метода было выяснено, что для нормального развития эмбриона необходимы гены, достающиеся от обоих родителей, а отцовский и материнский геномы функционально различны. Виладсен опубликовал в 1986 г. результаты клонирования овец путем пересадки ядер бластомеров 8- и 16-клеточных эмбрионов. Успех Виладсена может быть объяснен тем, что он использовал в качестве цитопласта энуклеированный ооцит, а не зиготу: энуклеированная яйцеклетка представляет собой лучший реципиент, поскольку предоставляет донорскому ядру больше времени для адаптации и репрограммирования в цитоплазме. К тому же, как позднее оказалось, овцу легче клонировать, чем мышь. В эмбриогенезе мыши клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано с ранней активацией генома зародыша - на стадии 2 бластомеров. У кроликов, овец активация первой группы генов в эмбриогенезе, то есть транскрипция, происходит позднее, а именно на 8-16-клеточной стадии. 30. Известные осложнения применения метода клонирования. Сегодняшний уровень развития технологий позволяет проводить медицинские исследования в нужном направлении, но пока он недостаточен для клонирования человека. Репродуктивное клонирование оказалось дорогостоящим и пока весьма неэффективным. Жизнеспособны только 10% клонов. А для создания одного клона может потребоваться более ста процедур по переносу ядра. У животных более слабая иммунная система и они в большей степени подвержены инфекционным заболеваниям, появлению новообразований и другим болезням. . Около трети клонированных телят умирали вскоре после рождения. Многие клонированные животные прожили недолгую жизнь и не предоставили ученым достаточной информации о процессе старения клонов. Более того, клоны умирают без видимых причин. Н-р, первая клонированная овца казалась здоровой и энергичной даже в день смерти, и в ходе вскрытия причина смерти не была выявлена. Долли была единственным клоном, который был рожден живым из общего количества 277 клонированных эмбрионов. Эта очень низкая эффективность, объединенная беспокойствами по поводу безопасности, представляет серьезное препятствие для применения репродуктивного клонирования. Исследователи выявили некоторые проблемы со здоровьем у овцы и других млекопитающих, которые были клонированы. Это увеличение размера плода при рождении и разнообразные дефекты в жизненных органах, типа печени, мозга и сердца. Другими последствиями являются преждевременное старение и проблемы с иммунной системой. Другая потенциальная проблема заключается в возрасте хромосомы клонируемой клетки. Все клетки проходят их нормальные стадии деления. Кончик хромосомы, который называется теломером, с каждым делением укорачивается. Через какое-то время теломер становится настолько маленьким, что клетка не может больше делиться, и в конечном итоге погибает. Это обычный процесс старения, который присущ всем типам клеток. Следовательно, клоны, созданные от клетки, принятой от взрослой особи, могут иметь хромосомы, которые уже короче, чем нормальная, и это может повлиять на быстрое старение клонированной особи. Клонирование человека. За последние годы прозвучало немало заявлений о клонировании человека. Но ни разу не было представлено убедительных доказательств. Из-за технических трудностей, клонирование людей и других приматов тяжелее доказать, чем клонирование др. млекопитающих. Причина заключается в том, что ядро клонированных клеток пропускает две ключевых основы образования белков на веретене, которое является ключевой структурой в разделении ячейки. В яйцеклетках женских приматов, эти два веретена белка расположены очень близко к хромосомам. Следовательно, удаление ядра клетки, для того чтобы создать место для ядра соматической клетки донора также удаляет веретено белка яйца, который сталкивается с разделением клетки. Ученые полагают, что это может быть единственной причиной того, что для клонирования приматов не годятся соматические клетки. И, напротив, у таких животных как кроликов, мышей, кошек, два веретена белка распространены повсюду яйца и т. о. удаление ядра клетки не заканчивается потерей белков. Социально-этический аспект. Одна из основных опасностей — возникновение новой эры, где человек будет предметом искусственного манипулирования, а генетическая информация станет предметом торга в условиях рыночной экономики. Из-за дороговизны технологии финансовая верхушка общества сумеет получить дополнительные преимущества, что может привести к генетическому улучшению отдельных слоев общества. Как относиться к клону с дефектом? Как к «генетическому браку»? Подобный подход может в корне изменить представление о человечестве в целом, личности и свободе индивида. Граница между человеком и вещью может быть стерта... Опасения вызывают такие моменты, как большой процент неудач при клонировании и связанные с этим возможности появления людей-уродов. А также вопросы отцовства, материнства, наследования, брака и многие другие. Еще одна существенная проблема связана с тем, что клонированные особи живут недолго, так как исходные клетки, использованные для клонирования, уже имеют «память», соответствующую количеству лет организма. Клон, по сути, — особь, отсроченная во времени и уже имеющая возраст организма-донора при рождении. Разве справедливо отнимать часть жизни у полноценной особи? Или клон — это лишь биоробот с заданными свойствами, который никак не может быть признан обществом? Этико-религиозный аспект. С точки зрения основных мировых религий (христианство, ислам, иудаизм) клонирование человека является или проблематичным актом или актом, выходящим за рамки вероучения и требующим у богословов чёткого обоснования той или иной позиции религиозных иерархов. 31. Перечислите, по каким показателям оценивается ферментационный процесс. Для сопоставления эффективности разных процессов можно пользоваться энергетическим выходом процесса, который также называют термодинамической эффективностью процесса (коэффициент, аналогичный КПД). Ту часть свободной энергии субстрата, которая теряется в процессе биосинтеза, относят к непродуктивным затратам. Основной способ увеличения выхода продуктов синтеза - повышение содержания биомассы в ферментаторе за единицу времени, т. е. повышение скорости роста клеток. Рост культуры можно охарактеризовать временем удвоения количества клеток или биомассы. Но эти величины могут различаться, т. к. биомасса может увеличиваться и без деления клеток. Рост культуры микроорганизмов зависит от температуры, рН, редокс-потенциала, состава и концентрации питательных веществ, концентрации продуктов и ингибиторов и т.д. Отрицательные факторы задерживают рост и образование целевого продукта и даже вызывают отмирание части клеток. Основные показатели ферментационного процесса. 1. Концентрация биомассы(Х), субстрата(S), продукта(P) (для логарфимической фазы роста 2. ). скорость Удельная роста . 3. Коэффициент разбавления (для непрерывного процесса D = μ). 4. Продуктивность по биомассе (для периодического процесса и процесса 5. Продуктивность непрерывного ). по продукту (для периодического процесса и непрерывного процесса 6 Выход продукта из ). субстрата 7. . из субстрата Выход биомассы . 8. Удельная скорость образования продукта . 32. Объясните процесс выращивания посевного материала, из каких стадий он состоит? Получение посевного материала осуществляется постадийным увеличением массы культуры продуцента. В качестве примера приготовление посевного материала для производственного культивирования двух микроорганизмов. Лабораторную культуру продуцента переносят в инокулятор, где посевной материал выращивают в течение определенного времени, после чего пересевают его в другой аппарат или непосредственно в ферментер. На всех ступенях выращивания посевного материала в аппаратах поддерживается требуемая температура. Для получения высококачественного посевного материала заготавливать семена надо с сортовых участков, не пораженных болезнями и вредителями. Кроме агара, в качестве субстрата для получения исходного посевного материала используют пшено. Затем пшено оставляют в термосе из ваты и бумаги на 30 мин для набухания. После этого его тщательно растирают на отдельные зерна и засыпают в укладочные флаконы емкостью 250 мл но 15 г в каждый. Флаконы закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве в течение 45 мин при избыточном давлении 1 ат. После стерилизации пшено проверяют на стерильность и влажность. Состав питательной среды для главной ферментации и для получения посевного материала в значительной степени зависит от используемого продуцента, от его физиологических особенностей. Основным источником углерода в среде чаще всего используются глюкоза, сахароза, гидролизаты крахмала, свекловичная меласса, гидрол. Питательные среды по своему назначению разделяются на три основные группы: среды для поддержания штаммов-продуцентов в лаборатории и в музее; среды для получения посевного материала и среды, употребляемые в больших объемах в основном процессе производства. Технологический процесс выращивания микроорганизмов на мелассной и зерно-картофельной барде включает стадии: подготовку сырья и приготовление питательных сред, получение посевного материала, выращивание кормовых дрожжей, выделение и сгущение дрожжевой биомассы, ее витаминизацию и сушку. Обе эти операции очистка и сортирование - называют обработкой зерна. Первая стадия процесса мало чем отличается от обычного выращивания микроорганизмов. Она складывается из получения посевного материала и из культивирования дрожжей в ферментаторе с целью максимального накопления биомассы микроорганизма. Посевной материал можно получать периодически (исходный штамм в пробирке - выращивание в колбе на качалке выращивание в лабораторном ферментаторе, а затем в инокуляторе) или непрерывно. В зависимости от способа получения посевного материала содержание биомассы продуцента в посевной культуральной жидкости может быть различным - от 3 - 5 г / л при периодическом способе выращивания до 15 г / л при непрерывном. 33. В чем разница между глубинной и поверхностной ферментацией, какие объекты используются в каждом конкретном случае и почему. Биотехнологические процессы основаны на взаимодействии трех фаз: твердой, жидкой и газообразной. Твердофазные осущ-ся на основе растительного сырья и используют чаще всего мицельные грибы и дрожжи или их комбинации. Поверхностная ферментация на жидких субстратах реализуется в кюветах со средой, помещенных в вентилированные воздухом камеры. Культура микроорганизмов при этом образует биомассу в виде пленки или твердого слоя на поверхности жидкой среды. Культура потребляет кислород непосредственно из газовой фазы — воздуха. Массообмен в таких условиях малоинтенсивный. Глубинное культивирование микроорганизмов происходит во всем объеме жидкой питательной среды, содержащей растворенный субстрат. Ферментер должен обеспечивать рост и развитие популяций микроорганизмов в объеме жидкой фазы, подвод питательных веществ к клеткам микроорганизмов, отвод от микробных клеток продуктов их обмена веществ (метаболизма), отвод из среды выделяемого клетками тепла. Технология глубинного культивирования продуцентов лимонной кислоты представляет собой двухступенчатый процесс. Первая ступень включает выращивание посевного материала из конидиоспор в посевной среде (на качалке и в посевном аппарате) при 32—33 °С в условиях хорошей аэрации (0,8—1,0 объема воздуха на 1 объем среды в минуту) и при непрерывном перемешивании среды. Продолжительность культивирования на стадии выращивания посевного материала — 2 сут (1 сут — на ка­чалке, 1 — на посевном аппарате). Основную ферментацию в глубинных условиях осуществляют в производственном биореакторе при коэффициенте его заполнения 0,75—0,80 и количестве посевного материала 5—8% от объема ферментируемой среды. 34. Как определяется выход продукта в биотехнологическом производстве? Какое значение имеет этот показатель в производстве. Выход продукта (Y) (экономический коэффициент) определяется как количество продукта, получаемого из данного количества субстрата: Y = X/Sо – S, где S и So – конечная и исходная концентрация субстрата. Данный коэффициент выражает эффективность использования субстрата для получения целевого продукта и является очень важной характеристикой, так как непосредственно связан с продуктивностью и позволяет непосредственно влиять на себестоимость конечного продукта. Экономический коэффициент имеет четкий физический смысл, характеризующей степень перехода энергии, заключенной в субстрате, в продукт. Данная величина необходима для расчетов и прогнозирования процесса в целом и используется в качестве параметра для контроля и управления ходом различных процессов и сопоставления их эффективности. Конечная концентрация продукта должна планироваться с учетом продолжительности процесса и величины выхода продукта. Достижение конечной высокой концентрации продукта оправдано, когда выделение, концентрирование его трудоемки и дорогостоящи. 35. Какой показатель используется для оценки количества продукта, получаемого на единицу объема реактора в единицу времени и от каких факторов он зависит? Продуктивность процесса характеризуется количеством продукта, получаемого на единицу объема биореактора в единицу времени. Продуктивность процесса зависит от многих факторов: активности продуцента, значений коэффициента выхода продукта из потребленного субстрата, количества активной биомассы в ферментере: П = qs Yp/s X [г/л ч.], где qs – скорость потребления субстрата (метаболический коэффициент), Yp/s- выход продукта (экономический коэффициент), X – концентрация биомассы, P – продукт, S – субстрат. Влиять на величину продуктивности можно путем изменения различных ее составляющих, но в каждом конкретном случае это приходится рассматривать отдельно. Так, при повышении величины Х могут возникнуть ограничения по массообменным характеристикам аппарата и лимитирующие состояния; влиять на величину метаболического коэффициента культуры возможно только при условии глубокого знания взаимосвязей между физиолого-биохимическими характеристиками продуцента и условиями среды. 36. При непрерывном культивировании характерно: A) Полная замена питательной среды; B) Контроль химического состава среды; C) Отвод биомассы в конце культивирования; D) Высокая плотность бактериальной суспензии; E) Отмирание культуры со временем нарастает. Какой системе непрерывного культивирования данный признак характерен: хемостату, турбидостату, рН-стату, оксистату. Дайте объяснение. Правильный ответ: B) Контроль химического состава среды. Непрерывное (проточное) культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Этого добиваются постоянным прибавлением новой питательной среды в сосуд для выращивания и одновременным удалением такого же количества среды с клетками. Подача свежей среды и удаление части суспензии (проток) происходит с той же скоростью, с какой растет культура. В этом случае устанавливается динамическое равновесие. Поддержание динамики равновесия в реакторе осуществляется двумя методами: турбидостатным и хемостатным. По турбидостатному принципу концентрация биомассы поддерживается скоростью потока среды, а по хемостатному – концентрацией подаваемого субстрата. Известен также способ регулирования роста культуры по рН. При турбидостатном методе регулирования контролируются концентрации суспензии входящей жидкости, создаваемой микробными клетками. Метод осуществляется с помощью фотоэлемента или рН-электрода, если в культуральной жидкости образуются органические кислоты. Хемостатный контроль проще, так как он происходит по входящему потоку. Этот метод регулирования применим ко всем типам микроорганизмов и клеток различных тканей животных и растений. Биореактор в хемостатном режиме снабжен устройствами для вливания и выпуска питательной жидкости, имеет систему контроля скорости потока, перемешивание. В случае длительного культивирования применение турбидостата связано с определенными трудностями, обусловленными прилипа-нием клеток к поверхности оптического элемента. В настоящее время разработаны различные варианты непрерывного культивирования микроорганизмов, работающие по принципу турбидостата – pH-стат, оксистат, СО2-стат, теплостат, вискозистат и т. д., названия которых соответствуют задаваемому параметру. Любой параметр, который изменяется в периодической культуре и на который существует датчик, может быть использован для управления ростом по типу турбидостата. Необходимо отметить, что управляющими параметрами могут быть комплексные параметры, например, содержание кислорода и углекислоты в отходящем воздухе, характеризующие дыхательный коэффициент. 37. Сосуд для выращивания представлен в виде трубки, в которую втекает и вытекает среда и посевной материал - это A) Термостат; B) Колба; C) Трубчатый ферментер полного вытеснения; D) Ферментер полного смещения; E) Стерилизатор. Дайте объяснение. Правильный ответ: C) Трубчатый ферментер полного вытеснения. Биореакторы идеального (полного) вытеснения – аппараты, в которых движение реагентов носит поршеневой характер, то есть каждый предыдущий объем, проходящий через аппарат, не смешивается с последующим, так как вытесняется им. В таком аппарате существует определенное распределение скоростей потока по его сечению. В результате состав, а так же температура реакционной смеси в цетре аппарата и у его стенок различны; и температур на входе и выходе из аппарата. К таким аппаратам относятся трубчатые реакторы при соотношении их высоты к диаметру, равным не менее 20 (H/D ≥ 20). Однако, в больших реакционных объемах, как правило, режим полного (идеального) вытеснения нарушается за счет эффекта обратного перемешивания. 38. Сосуд для выращивания представлен в виде емкости с системой продувания воздуха или с мешалкой – это A) Термостат; B) Колба; C) Трубчатый ферментер полного вытеснения; D) Ферментер полного смещения; E) Анаэростат. Дайте объяснение. Правильный ответ: D) Ферментер полного смещения. Ферментер (биореактор) полного смешения – жидкая фаза в них интенсивно перемешивается, постоянно подается питательная среда и отводится культуральная жидкость. Данные реакторы могут работать по принципу хемостата или турбидостата. В первом случае в системе поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов среды, причем постоянный подвод клеток не обязателен, поскольку в начальном периоде проводят периодическое культивирование, а затем включают подачу жидкости с клетками или без них. Во втором случае в биореакторе поддерживают постоянную концентрацию клеток, регулируя скорость протока среды. При достижении определенной максимальной концентрации клеток подача среды может быть автоматически прекращена и процесс протекает некоторое время в периодических условиях. 39. Какие количественные характеристики используются для производственных штаммов - A) Число генерации за определенное время; B) Скорость роста; C) Увеличение биомассы ; D) Количество клеток в конце культивирования; E) Число делений клетки за определенное время. Дайте объяснение и напишите уравнение. Одним из основных показателей, характеризующих адекватность условий ферментации, служит скорость роста продуцента. Скорость роста (увеличение биомассы) организмов с бинарным делением в хорошо перемешиваемой среде в периодической культуре будет пропорционально концентрации микробной биомассы: dX/dt = μX, где dX/dt – скорость роста, Х – биомасса, μ – коэффициент пропорциональности, («удельная скорость роста»); параметр аналогичен сложным процентам (например, если удельная скорость роста равна 0.1ч–1, – значит увеличение биомассы равно 10 % в час). Если величина μ постоянна, как это бывает в установившемся режиме культивирования, то интегрирование представленного уравнения дает: lnX = lnX0 + μ t, где Х0 – биомасса в начальный период времени t. График зависимости lnX от времени будет иметь вид прямой линии с наклоном μ. Удельная скорость роста является одним из основных параметров, характеризующих физиологическое состояние продуцента; ряд других параметров может быть выражен через этот показатель. 40. Составьте примерный перечень контролируемых параметров при выращивании микроорганизмов в биореакторах. Биореактор — прибор, осуществляющий перемешивание культуральной среды в процессе микробиологического синтеза. Биореакторы (ферментаторы) составляют основу биотехнологического производства. Назначением всякого биореактора является создание оптимальных условий для жизнедеятельности культивируемых в нём клеток и микроорганизмов, а именно обеспечивать дыхание, подвод питания и отвод метаболитов путём равномерного перемешивания газовой и жидкой составляющих содержимого биореактора. При этом нежелательно подвергать клетки тепловому или механическому воздействию. Для получения продукции в максимальных количествах активный штамм-продуцент выращивают на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования (посевная доза, температура, рН, окислительновосстановительный потенциал, аэрация, массообменные характеристики, питательные и ростовые добавки, сроки культивирования). Выращивание проводят в ферментаторах (культиваторах), вместимость которых может варьировать от 2 л до 100—400 м3 в зависимости от потребности в продукте. Процесс культивирования ведется в асептических условиях, чтобы получить чистые культуры целевых микроорганизмов или культуры клеток. Основным условием для успешного проведения технологического процесса является выбор или получение высокопродуктивного промышленного штамма-продуцента и поддержание его в активном состоянии. Вторым важным условием является подбор питательных сред, обеспечивающих максимальное накопление биомассы или целевого продукта; питательные среды должны состоять из дешевого, недефицитного и доступного сырья, поскольку при промышленном культивировании микроорганизмов потребляются огромные их количества. В крупномасштабном производстве для приготовления питательных сред служит обычно сравнительно дешевое сырье (меласса, парафины нефти, дрожжи, уксусная кислота, природный газ). Все формы и виды ферментационных систем создаются, имея основной целью обеспечение одинаковых условий для всех компонентов содержимого реактора. В ферменторах биокатализаторы суспендированы в жидкой среде, содержащей необходимые субстраты для обеспечения роста организмов и образования нужного целевого продукта. Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно придерживаться следующей генеральной линии: • Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранения требуемой микрофлоры. • Объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не было утечки или испарения содержимого. • Уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней аэрирования культуры аэробных организмов. • Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны постоянно контролироваться. • Культура при выращивании должна быть хорошо перемешиваемая. К материалам, используемым при конструировании сложных, прецизионно работающих ферменторов, предъявляются определенные требования: а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающимися в биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения металлами даже в следовых количествах; б) материалы должны быть нетоксичным и, чтобы даже при самой малой растворимости они не могли бы ингибировать рост культуры; в)компоненты и материалы биореактора должны выдерживать повторную стерилизацию паром под давлением; г) перемешивающая система биореактора и места поступления и выхода материалов и продуктов должны быть легко доступными и достаточно прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механических воздействиях; д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой, так что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть прозрачными. 41. По какой формуле рассчитывают прирост сырой биомассы каллусной ткани растений? Рассчитайте прирост сырой биомассы каллусной ткани, если известно, что сырой вес каллуса моркови, пассируемого и культивируемого в течение одного месяца составлял 2400 мг, при этом начальный вес сырой каллусной ткани моркови составлял 200 мг, в последующие 7, 10, 14, 18, 21, 25 дней культивирования вес каллуса был равен 650 мг, 840 мг, 1050 мг, 1 630 мг, 1960 мг, 2100 мг, соответственно. Прирост сырой биомассы каллусной ткани рассчитывается по следующей формуле: 𝑊𝑡 −𝑊0 ; 𝑊 0 где 𝑊𝑡 -конечный вес каллуса 𝑊0 - начальный вес каллуса 2100мг−200мг =9,5 мг 200мг Ответ: прирост сырой биомассы каллусной ткани составляет 9,5мг. 42. Использование клеточной культуры для промышленного получения биомассы и БАВ В настоящее время культура клеток высших растений является альтернативным способом получения биомассы редких лекарственных растений. По сравнению с использованием обычных растений, применение технологий растительных клеток имеет ряд преимуществ: возможность получения необходимых количеств качественного продукта с воспроизводимыми характеристиками в стерильных контролируемых условиях; независимость от климатических и политических факторов; - возможность внесения изменений в структуру и биохимию тканей растений для получения новых веществ, не свойственных дикому растению; - удобство производства и очистки продукта. Для производства биомассы растений в промышленных масштабах используются биореакторы. В них механическим путем полупроточным методом происходит постоянное перемешивание недифференцированных клеток растений, чтобы они постоянно делились и не образовывали ткани и органы. Клетки постоянно увеличивают свою биомассу и соответственно постоянно синтезируют полезные вещества, которые и используются при производстве препаратов. Использование биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения часто ограничено доступностью растительных ресурсов и может представлять серьезную угрозу для редких видов лекарственных растений. Культуры клеток высших растений могут служить возобновляемым источником ценных вторичных метаболитов, однако до настоящего времени известны лишь единичные примеры их коммерческого применения. Основными причинами сложившейся ситуации являются недостаточная продуктивность культур клеток по вторичным метаболитам и высокая стоимость выращивания. Используя традиционные методы —селекцию продуктивных штаммов, оптимизацию сред, элиситацию, добавление предшественников синтеза — можно повысить продуктивность культур клеток растений на один-два порядка. Методы метаболической инженерии — суперэкспрессия или выключение генов белков, определяющих синтез целевого продукта — могут существенно изменять биосинтетические способности клеток in vitro. В то же время, многие вторичные соединения не удалось пока получить в культуре клеток, что может быть обусловлено спецификой клеточной культуры — экспериментально созданной популяции соматических клеток — как биологической системы. Для этих случаев может оказаться эффективным использование культур органов растений или трансформированных корней (hairy root). Проводятся работы по получению вторичных метаболитов растений в дрожжах и бактериях, трансформированных растительными генами. Использование методов метаболической инженерии пока не привело к значительным успехам, но с развитием знаний по биохимии и физиологии вторичного метаболизма (регуляции и компартментализации синтеза, механизмов транспорта и запасания метаболитов) эти подходы могут стать весьма эффективными. 43. Рассчитайте, какое количество (в мл) 5% маточного-раствора витамина В6 (5% ампула, растворенная в 100 мл бидист.воды) необходимо взять для приготовления 1 л питательной среды Уайта для культивирования клеток томата, если учесть, что по прописи концентрация витамина составляет 1 мг/л. 1мг\л – 2000 мл х – 2000 мл 1 мг\л ×2000мл х= = 1 мг\л 2000мл 1000 мг – 100 мл х – 1 мл 1000 мг ×1 мл х = 100 мл = 10 мг 100 мл – 10 мг х – 1 мг 100мл ×1мг х = 10мг = 10 мл Ответ: для приготовления 1 л питательной среды Уайта для культивирования клеток томата необходимо взять 10 мл 5% маточного – раствора витамина В6. 44. Способы культивирования протопластов in vitro (изобразите в виде схемы). Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер. Способы культивирования протопластов Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензия протопластов в виде капель помещается в жидкой среде на пластиковые чашки Петри.→Метод обеспечивает хороший обмен газами через воздушную фазу и диффузию в раствор экскретируемых продуктов.→Кроме того, легко можно добавить свежий питательный раствор в нужной концентрации. Однако при культивировании этим способом протопласты агрегируются в центре каждой капли. →Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует успешному культивированию. Этот метод также не удобен, если надо проследить за судьбой индивидуальной колонии протопластов. Другой широко распространенный метод — агаровая культура (Nagata Т., Takebel., 1971). → В этом случае определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же самой среды, содержащей 1 % агар-агара. →Температура не должна превышать 45°С. →Чашки Петри заклеивают парафиллюмом и держат перевернутыми при температуре около 28°С. Протопласты фиксированы в одном положении и физически отдалены один от другого. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г. Во втором случае - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри,→добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС.→ После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС.→В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост. Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами. На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора: - видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения, - способ и условия выделения протопластов, - плотность высева протопластов, - состав питательной среды. 45. Технология криосохранения клеток, тканей, органов растений (изобразите схематично этапы технологии). Криосохранение замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196oC. Работа по криосохранению клеток состоит из следующих этапов: - подготовка культуры клеток, - добавление криопротектора, - программное замораживание, - хранение в жидком азоте, - быстрое оттаивание - удаление криопротектора, - рекультивирование и регенерация растений. 1)Особое значение имеет специальная подготовка культур, целью которой является обогащение ее клетками меристематического типа. Для суспензионных культур важным моментом подготовки является концентрирование. Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например: - 2-6% маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей; - аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5%), аспарагин, γ-аминомасляную кислоту; - кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8 - +10oC, а затем при +2 - +5oC в течение 1 - 6 недель. 2)Затем идет добавление криопротекторов. Криопротекторы - вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физикохимических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания. 3) Важно найти оптимальную программу замораживания. Выделяют три типа: медленное постепенное замораживание, быстрое и сверхбыстрое. При медленном постепенном замораживании температура в интервале от 0 – до -40 градусов снижается со скоростью 0,5 – 1 градусов в минуту. При быстром замораживании объект с криопротектором сразу же погружается в жидкий азот. 4) Оттаивание производят погружая ампулы с объектами в теплую баню (40 градусов) либо капая теплой водой на объекты. 5) После оттаивания удаляют криопротектор, это обычно делается на холоде. 46. Рассчитайте какое количество (в мл) 1% сток-растворов ИУК (индолилуксусной кислоты) и кинетина необходимо взять для приготовления 2 л питательной среды Гамборга Эвелега (В5) с целью индукции гемморизогенеза в каллусной культуре картофеля, если учесть, что модификация среды с ИУК 1 мг/л и 3 мг/л кинетина стимулирует процесс морфогенеза. 1мг -1000мл х - 2000мл 2000мл×1мг х= = 2мг 1000мл 1000мг-100мл х -1мл 1000мг×1мл х = 100мл = 10мг 10мг – 100мл 2мг – х 100мл×2мг х = 10мг = 20мл Ответ: для приготовления 2л питательной среды В5 с целью индукции гемморизогенеза в каллусной культуре картофеля необходимо взять 20 мл 1% сток-растворов ИУК и кинетина. 47. Генная инженерия. Современное состояние и перспективы генной инженерии. Генная инженерия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма. Генная инженерия позволяет включать и выключать отдельные гены, контролируя таким образом деятельность организмов, а также — переносить генетические инструкции из одного организма в другой, в том числе – организмы другого вида. Генная инженерия берет свое начало в 1973 году, когда генетики Стэнли Кохен и Герберт Бойер внедрили новый ген в бактерию кишечной палочки (E. coli). Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. Клонированные гены человеческого инсулина были введены в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Около 200 новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику, и более 100 генно-инженерных лекарственных веществ находится на стадии клинического изучения. Среди них лекарства, излечивающие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые опухолевые процессы и, возможно, даже СПИД. Практические достижения современной генной инженерии заключаются в следующем: – Созданы банки генов, или клонотеки, представляющие собой коллекции клонов бактерий. Каждый из этих клонов содержит фрагменты ДНК определенного организма (дрозофилы, человека и других). – На основе трансформированных штаммов вирусов, бактерий и дрожжей осуществляется промышленное производство инсулина, интерферона, гормональных препаратов. На стадии испытаний находится производство белков, позволяющих сохранить свертываемость крови при гемофилии, и других лекарственных препаратов. – Созданы трансгенные высшие организмы (многие растения, некоторые рыбы и млекопитающие) в клетках которых успешно функционируют гены совершенно других организмов. Широко известны генетически защищенные генно-модифицированные растения (ГМР), устойчивые к высоких дозам определенных гербицидов, а также Btмодифицированные растения, устойчивые к вредителям. Одной из основных задач, которая стоит перед генной инженерией, является создание программируемых генотипов. Перспективы развития генной инженерии огромны, так могут предоставить возможность человеческому организму противостоять радиации, обитать длительное время под водой, восстанавливать поврежденные органы и т.д. Генная инженерия направляет свои усилия на исследование различных белков, которые способны наделять отдельный организм определенными характеристиками. Другими словами, при помощи генетики ученные смогут наделять определенный организм (растение, животное, человек) свойствами, которые небыли присущи ему ранее. 48. Методы селекции соматических гибридов (изобразите в виде схемы). Соматическая гибридизация – является новым способом гибридизации, позволяющая преодолевать ограничения полового процесса и искусственно конструировать новые растения. Выделяют следующие методы: Генетическая комплементация – это такое взаимодействие генов в гибридной клетке, вследствие которого восстанавливается функция дефектных генов. Генетические комплементации производились на основе сорта Nicotiana tabacum , которая отличается дефектными светочувствительными хлоропластами (хлорофиллдефектные мутатанты). Половые гибриды этого сорта имели нормальные хлоропласты , потому что мутации в их клетках комплементировали. Такой же результат был получен путем слияния гаплоидных протопластов обоих сортов Nicotiana tabacum. Эксперимент состоит из следующих этапов: Сначала в культуре пыльников были получены гаплоидные растения. 1.Эти гаплоидные растения выращивались при слабом освещении и поэтому они имели зеленый цвет. 2.Затем из этих листьев выделялись протопласты. 3.Протопласты подвергали слиянию и культивировали до образования клеточных колоний. 4.Клеточные колонии пересаживали на среду, индуциирующую стеблевой органогенез, и дальше выращивали при хорошем освещении. 5.В этих условиях имели зеленый цвет и выживали только гибридные растения. Помимо хлорофиллдефектных мутантов используются ауксотрофные мутанты. Ауксотрофы – это биохимические мутанты клеток,которые вследствие мутации утратили способность расти на обычной питательной среде и требуют добавления какого-либо вещества, синтез которого у них блокирован мутацией. Например О.Шидер выделил гибрид мха печеночника, сливая протопласты мужского штамма, ауксотрофного по глюкозе, с протопластами женского штамма, дефектного по никотиновой кислоте. Физиологическая комплементация – под этим термином понимают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при котором родительские клетки этого делать не в состоянии. Для использования физиологической комплементации Э. Кокинг предложил следующий прием: - Сначала изучаются условия культуры для роста родительской формы и выявляются те, которые пригодны для роста клеток одного родителя и непригодны для другого. - Затем суспензию клеток после слияния помещают в различные среды, в каждой из низ соответсвенно погибают клетки одного из родителей, но продолжают расти и развиваться только гибридные. Механическая селекция, т.е. вручную, по визуальному признаку. - Для этого прежде всего необходимо выделить признаК, по которому можно было бы идентифицировать гибридные клетки, в смеси родительских клеток. Используя микроманипулятор или инвертированный микроскоп отобрать продукт слияния протопластов мезофилла и каллусов. - При отсутствии природных визуальных маркеров протопласты до слияния окрашивают флуоресцирующими красителями. - Протопласты подлежащие слиянию, метят красками разных цветов. 49. Практическое применение соматической гибридизации (покажите в виде схемы). Гибридизация соматических клеток является новой технологией для селекционного процесса. Она позволяет скрещивать формы и виды растений, для которых скрещивание половым путем невозможно, т.е. преодолевать несовместимость при межвидовой гибридизации. Практический успех соматической гибридизации связан с созданием межвидовых, внутриродовых гибридов Nicotiana, Solara, Datura. Посредством гибридизации соматических клеток были получены ценные формы для селекции картофеля. Так соматические гибриды между культурными и дикими видами картофеля имели хозяйственно ценные признаки, и был вовлечен в селекционные работы. К сожалению, при длительном скрещивании получились формы с преобладанием признаков дикого вида. Очень ценны для селекции также ассиметрические гибриды, содержащие один полный геном одного родителя и только несколько хромосом другого родителя. Для получения таких гибридов нужна направленная элиминация хромосом одного из родителей после слияния. Это осуществляется радиоактивным облучением протопластов этого родителя с целью дестабилизации хромосом. Методом соматической гибридизации в практике не выведены пока новые сорта сельскохозяйственных культур. Но принимаются меры и усилия. 50 Применение плазмид бактерий в качестве векторов в генной инженерии растений. Требования, предъявляемые к векторным системам. Векторы – это специфические в отношении клетки-хозяина и способные к репликации структуры, к-е м. присоед. к себе те или иные гены и переносить их в др.кл. Вектор – нуклеот. полс-ть, способная вкл. в ДНК, не нарушая ее целостности. В. д. отв. след. требованиям: 1. д. автономно реплицироваться, 2. Иметь маркеры, по к-м легко обнаружить трасформированные кл. 3. Введение чужеродного гена не должно нарушать функций вектора 4. Нeбольшие размеры. Большая ч. векторов получена из плазмид E.coli и др.бактерий. Б. сод. ольшое кол. маленьких кольцевых мол. ДНК, состоящих из неск. тыс. пар оснований и наз. плазмидами. Это автономно реплицирующиеся мол. ДНК (ген.элем.), они не сцеплены с гл.хр.и несут гены уст-ти к антибиотикам тетрациклин и канамицин. Плазмиды легко отделить от хр-й ДНК и получить в чистом виде. Сочетание структурного гена и вектора дает рекомбинантную (гибридную) ДНК. Плазмиду и фрагмент ДНК, сод-й нужный ген, переводят в линейную форму, расщепляя их к-л рестриктазой, обр.мол-ы со свободными концами, к-е м.б либо одноцепочечными, либо тупыми. Их удлиняют с пом.трансферазы, присоед.к ним А или Т, что приводит к получению желаемой комбинации обеих гетерологичных мол. Липкие концы затем сшиваются ДНК-лигазой, и обр.гибридная ДНК, к-ю м.ввести в бакт.кл. Плазмиды легко проникают в бакт.кл. Внутри они нач.реплицироваться. Чужеродная ДНК транскрибируется и транслириуется, и в кл.нач.синт.белка, кодируемого чужеродным геном, т.е происх.трансформация кл. В кл.E.coli м.осущ.экспрессию любого эукариотического гена. Для отбора бакт.кл, сод-х рекомбинантные мол.ДНК с нужным геном, в среду вводят антибиотик (тетрациклин или канамицин), поскольку плазмиды сод.ген уст-ти к ним. Бакт.кл без плазмиды погибают. Т.о, плазмиды служат векторами для клонирования чужеродных генов. В завис.от задач и целей эксперимента исп.разные плазмиды. Сущ.плазмиды с широким кругом хозяев, но есть, к-е размножаются в кл.двух и даже одного вида. Самым подходящим генным вектором для р-й оказались плазмиды почвенных бактерий Agrobacteria. Основной вклад в изучение этой проблемы внесли И. Шелл, М. Ван Монтегю, У. Нестор, М. Гордон, М. Хилтон. В группе почвенных бактерий Agrobacteria есть несколько видов, к-е м.заражать р-я и вызывать образование корончатых каллов, то есть наростов, - недифииеренцированной опухолевой ткани, растущей в месте заражения. К этим бактериям чувствительны почти все двудольные широколистные р-я, а однодольные – нет. Агентом, вызывающим опухоль, явл.плазмида этой бактерии – Ti-плазмида, конкретно – фрагмент, названный Т-ДНК. Значительный интерес как векторы для р-й представляют Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes, вызывающей раковую болезнь «бородатый корень». В кл.корешков содержаться опины и нес.копий Т-ДНК. В отл.от корончатых галлов трансформированные кл.корешков «бородатого корня» легко поддаются регенерации. 51. Методы разделения Xи Yсодержащих сперматозоидов. Еще в начале 80-х годов ученые начали проводить опыты по раз делению сперматозоидов, содержащих Х-хромосому (женскую) или Y-хромосому (мужскую), для этого использовали различные способы: осаждение, центрифугирование в градиенте, электрофорез, обработку специфическими антителами и т. д. Только ближе к 90-м года ученые установили, что с помощью проточной цитометрии сперматозоиды можно успешно разделять. Испытания показали, что телки голштинской породы, оплодотворенные Хсодержащей фракцией сперматозоидов, дали потомство, в котором было 89% самок. Метод разделения на X- и Y-сперматозоиды основан на различии содержания ДНК в X- и Y-хромосомах: X-содержащие сперматозоиды животных (женские) содержат на 4-5% больше ДНК, и при использовании флуоресцентного красителя и мощного фотоумножителя с помощью проточной скоростной лазерной цитометрии возможно выделять фракции, содержащие до 92% половых клеток с X- или Y-хромосомой. Сексированное семя, полученное по данной технологии, гарантирует получение желаемого пола животного до 90%. Единственным на сегодняшний день способом произвести клинически значимое обогащение спермы X- или Y-содержащими сперматозоидами является метод проточной цитометрии. Однако клиническое применение этого способа малоэффективно или даже опасно, так как при этом ДНК подвергается воздействию химических красителей и ультрафиолетовому облучению. 52 Методы определения жизнеспособности яйцеклеток, сперматозоидов и эмбрионов. 1. Жизнеспособность сперматозоидов хар-ся долей живых сперматозоидов. Подвижный сперматозоид всегда живой. Неподвижный сперматозоид может быть либо живым, но с нарушенными функциями движения, либо мертвым. 1) «Суправитальное окрашивание эозином» основано на неспособности этого красителя проникать через клеточные мембраны. Т.е., эозин не может проникнуть внутрь живого сперматозоида. Эозин проникает внутрь мертвого сперматозоида (поскольку целостность его наружной мембраны нарушена) и окрашивает его в розовый цвет. Для осущ. окрашивания каплю спермы на предметном стекле смешивают с каплей 0,5 % водного раствора эозина и исследуют препарат с пом. микроскопа. Мертвые сперматозоиды окрашены в розовый цвет. 2) «Гипоосмотический тест». Для осуществления теста 1 каплю спермы добавляют к 10 каплям раствора цитрата натрия и фруктозы, смесь выдерживают 30-120 мин при 37°С, затем исследуют с помощью микроскопа. Живые сперматозоиды набухают, что выражается в искривлении хвостов (образуются петли), мертвые сперматозоиды не меняют свою форму. 2. Существуют методы оценки качества эмбрионов, к-е предполагают использование красителей (флюоресцентные красящие веществ FDA и DAP1. Живые эмбрионы ярко флюоресцируют после инкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов реакции обратные), выявляющих ферментную активность или специальной метки, определяющей повреждение мембран при дефектных состояниях эмбриональных кл. Также сущ.метод временного культивирования эмбрионов in vitro для уточнения оценки качества по морфологическим критериям . Работу по оценке эмбриона проводят под стереомикроскопом , учитывая стадию развития эмбриона, соответствие ее хронологическому возрасту, определяют морфологию зародышей и, исходя из этих критериев, оценивают качество зародыша и его пригодность для дальнейшего использования. Затем после морфологической оценки извлеченных эмбрионов их замораживают до o температуры -196 C, затем оттаивают и проводят повторную морфологическую оценку их качества. Сущность способа закл. в том, что к жизнеспособным относят те эмбрионы, которые в процессе замораживания и оттаивания не снизили своей оценки. Этот способ позволяет по степени изменения их качества прогнозировать результаты приживляемости после нехирургической трансплантации. Жизнеспособность эмбрионов также можно определить по количеству поглощаемой ими глюкозы, входящей в состав питательной среды, на которой развиваются зародыши. 3. Набор красителей позволяет охарактеризовать морфофункциональное состояние клетки, а именно: жизнеспособность, форму, состояние ядерного материала яйцеклеток. С помощью флюоресцентного красителя pi — пропидиума йодида — определялась целостность мембран яйцеклеток, так как известно, что он проникает только через поврежденные клеточные мембраны и окрашивает ядерный материал. Жизнеспособные нормальные клетки окрашивались только 6Cfda в зеленый цвет. Окрашивание в красный цвет АО пронуклеусов с помощью красителя клеток указывало на наличие однонитевых и двунитевых разрывов ДНК. В нормальной яйцеклетке отсутствует свечение пронуклеуса в красной области. 53. Доклинические испытания: эксперименты, проводимые in vitro и на лабораторных животных. Эксперимент с использованием лабораторных животных и других живых объектов является одним из ведущих методов познания в современной медицине, фармакологии, ветеринарии, биологии. Качество лабораторных животных во многом определяет результат эксперимента. Постоянно возрастают требования к качеству лабораторных животных. Поэтому важнейшей задачей лабораторного животноводства является организация их производства и содержания, обеспечивающих необходимое качество и стандартность животных. Проведение экспериментов на живых объектах должно обеспечивать эффективное использование животных в научных целях, уменьшение их количества, соблюдение принципов гуманного обращения. Основные этапы включают поисковые или исследовательские методы, которые имеют свои фазы разработки лекарств или программ для контроля за развитием болезней. Этапы разработки можно представить в виде следующей триады: 1)доклиническая стадия для определения безопасности и потенциальной эффективности лекарства; 2) клиническая стадия для установления безопасности и эффективности лекарства для человека; 3) постклиническая стадия, когда лекарство мониторируется на его безопасность и его производство и реализация тщательно контролируются с использованием неклинических исследований. За последнее время наблюдается существенный рост экспериментальных процедур, проводимых на животных. Наиболее часто используются в экспериментальной практике мыши, рыбы, крысы и птицы, также экспериментаторы работают на кроликах, собаках, птицах, рептилиях и земноводных. Что особенно характерно для последнего десятилетия – это рост использования приматов после весьма существенного снижения в предыдущие годы. При правильном подходе опыты in vitro позволяют получить информацию об уровне токсичности и ее клеточных и молекулярных механизмах. Токсикокинетические данные in vitro позволяют оценить потенциальные дозы и характер действия наночастиц для последующего исследования на лабораторных животных. Но только токсикологические эксперименты на животных дают достоверную информацию относительно опасности наноматериалов для человека. Поэтому единственным решением остается использование классического подхода в исследовании наноматериалов, где ключевыми объектами исследования остаются разные виды животных. Современное состояние науки по использованию альтернативных подходов in vitro не позволяет ответить на вопрос о системном действии наночастиц на организм человека. Главными недостатками экспериментов in vitro являются недостаточная валидация полученных результатов в сравнении с экспериментами на животных и невозможность моделирования сложных биологических процессов, например полного воспалительного ответа. 56. Представьте схему клонирования мышей. Схема клонирования по МакГрату и солтеру. Впервые пересадки пробовали МакГрат и Солтер на мышах(1983г). МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали зиготы. Из одной зиготы удаляли 2 пронуклеуса (мужской и жен.) и пересаживали туда муж и жен продукт другой зиготы. при этом они использовали обработку веществами, которые разрушали трубочки веретена деления (цитохолазин, колхицин, или колцемин), вследствие чего теряются хромосомы. С помощью микропипетки удерживали яйцо в области вегетативного полюса, затем прокалывали пипеткой отверстие, откуда «вытекали» хромосомы. При этом наружную блестящую оболочку хорошо прокалывали, в то время как цитоплазматич. мембрану слегка (лишь несильным нажатием). Между цитоплазм мем-ной и блест. оболочкой находится перивителлиновое пространство или зона pellucidа. Далее втягивали внутрь пипетки содержимое цитоплазмы и пронуклеуса. Пипетку с пронуклеусами погружали в каплю среды содержащую вирус Сендай(вирус,который стимулирует слияние мембран). микропипетку с донорскими пронуклеусамии вирусом Сендай таким же способом вводили в перивителлиновое пространство. Благодаря вирусу Сендай (пир тем-ре 37 градусов) происходит слияние мембран донора и реципиента с объединением цитоплазмы. схему нарисуйте по выше написан тексту.вот картинки, к-рые помогут ( вот так брали внутрь пипетки содержимое цитоплазмы и пронуклеуса ) Схема клонирования мышей по Янагимачи 54. Схематически представить получение химер путем слияния 8-ми-клеточных эмбрионов. 55 Микрохирургия эмбриональных клеток (морула, бластоциста) для создания аллофенных Животных. Представьте схематически Авторам удалось усовершенствовать метод Вильмута, они отказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической клетки с яйцеклеткой и изобрели микропипетку, с помощью к-рой можно было «безболезненно» извлекать ядро из соматической клетки и трансплантировать его в лишенную ядра яйцеклетку. Они использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит, клеток Сертоли из семенников и клеток, выделенных из мозга. Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощью микропипетки. Яйцо активировали к развитию помещением в специальный раствор. Эмбрионы культивировали до стадии 2–8 клеток и затем трансплантировали в матку приемной матери . Процент «выхода» рожденных мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18,5– 19-й дни беременности) был низок – в разных сериях экспериментов от 2 до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядер рожденных мышат к клеткам донора соматических клеток. Т. о., по крайней мере в некоторых случаях, была доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих 57 Стимуляция суперовуляции у самок млекопитающих. Вымывание яйцеклеток. Представьте основные методологические подходы. При суперовуляции (СО) (множественная) выходит большее количество яйцеклеток, чем при обычной. СО проводят у одноплодных животных с целью увеличения количества получаемых эмбрионов. Для этого используют фолликулостимулирующие гормоны (простагландины, эстрофан, эструмат, матазин и др.). Степень СО зависит от дозы СЖК— гормонального препарата, представляющего нормальную стерильную сыворотку кобыл, полученную в период от 40 до 100 дней жеребости. Технология предусматривает применение гормона прогестерона и антисыворотки СЖК. Прогестерон стимулируется желтым телом и активизирует процессы в матке для сохранения беременности. Антисыворотка СЖК применяется для сокращения действия СЖК, к-е длится около 5060-дней, что снижает качество получаемых эмбрионов. Овулируют в среднем 10 яйцеклеток. Их оплодотворяемость достигает 80% и более. Возможно применение аналогов простагландинаэстрофана, фоллигона и др. Главный недостаток СЖК — сильная антигенность, возможна резко выраженная аллергическая реакция. Также часто образуются кисты яичников, при обработке СЖК при повторных вымываниях процент оплодотворяемости я-кл снижается почти в два раза. Гипофизарный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) получают из гипофизов с/х животных. Основное действие ФСГ— стимуляция множественного роста фолликулов. ФСГ из гипофиза овец содержит примесь лютеинизирующего гормона (ЛГ). Разные формы ЛГ влияют на развитие фолликулов, секрецию эстрогенов, формирование желтого тела, продуцирование им прогестерона. Гонадотропин - рилизинг гормон образуется в передней доле гипоталамуса, вызывает выделение ФСГ и ЛГ из гипофиза. Хороший эффект достигается при введении ФСГ, выделяемого передней долей гипофиза. Гормон ФСГ в комбинации с ЛГ вводят в соотношении 5:1 многократно. От доноров в течение года можно получать эмбрионы пять раз с интервалами в 45-65 дней при вымывании в среднем по 5-6 эмбрионов за один цикл. Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут быть извлечены тремя способами: после убоя коровыдонора, хирургическим и нехирургическим. а) Извлечение эмбриона после убоя коровыдонора. Является самым простым и надежным способом. Известно, что яйцеклетки после овуляции и оплодотворения на четвертые сутки переходят из яйцепроводов в рога матки. Следовательно, если зиготы извлекать не позднее, чем трое суток после искусственного осеменения, то достаточно промыть лишь яицепроводы, в которых находятся ранние эмбрионы. Время между убоем донора и вымыванием эмбрионов не должно превышать 30-40 мин., пока не начался процесс кл-го переваривания в половых органах. б) Извлечение эмбриона хирургическим способом. Для трансплантации рекомендуется использовать бластоцисты, поэтому эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения. Имеется несколько способов: разрез верхнего свода влагалища; лапаротомия (вскрытие) по белой линии живота; лапаротомия в области голодной ямки. Способ более трудоемок; необходимы высокая квалификация хирурга, операционный зал и стерильные условия и особенно важно, им нельзя пользоваться многократно. в) Извлечение эмбрионов нехирургическим способом. Катетерный (нехирургический) способ практически не вызывает каких-либо осложнений в орг.жив-го. Можно успешно извлекать эмбрионы в животноводческом помещении. Эффективность способа высока, повторность многократна. Вымывают эмбрионы на 7-8 сутки после осеменения. Для вымывания используют специальную питательную среду Дюльбекко. Продолжительность манипуляции 20-50 мин.Для получения эмбрионов этим способом разработаны специальные катетеры, система био-ски нейтральных шлангов, сосуды для спец.среды и приема промывной среды с эмбрионами. Промывную среду вводят в рога матки и удаляют из них с помощью шприца. Фракционное (5-6 раз) промывание рогов матки обеспечивает извлечение до 76% эмбрионов. 58 Вазектомия у самцов. Отразите этапы операции. Вазектомия - иссечение спермиопровода; способ подготовки пробников (быков, баранов, хряков и реже жеребцов), доступный в условиях любого хва. Вазэктомированные самцы сохраняют способность к половому акту, но лишены возможности оплодотворения самки, т. к. во время коитуса в половые пути последней выделяют только секреты придаточных желез. Спермии в этом случае попадают в полость общей влагалищной оболочки семенника, где всасываются и оказывают стимулирующее воздействие на организм самца. Вазэктомированные самцы очень активны, являются лучшими пробниками-стимуляторами. Существует неск. способов В. самцов. Способ Краснитского. Быка фиксируют в правом боковом положении; подготавливают операционное поле. Вводят под кожу по линии намечаемого разреза 5,0—7,0мл 1%-ного р-ра новокаина с адреналином. В области каудальной поверхности шейки мошонки, параллельно шву мошонки, отступя от него на 0,5—1 см, разрезают кожу на длину не более 4 см, затем рассекают мускульно-эластич. оболочку, фасцию, волокна мускула поднимателя семенника и общую влагалищную оболочку. Чтобы не вызвать ранения большого кол-ва сосудов семенного канатика, общую влагалищную оболочку рассекают осторожно. Спермиопровод захватывают анатомич. пинцетом и после отпрепаровки от сосудов иссекают его ножницами. На рану (кроме общей влагалищной оболочки) накладывают 4—5 стежков узловатого шва. Швы в течение 8—10 сут прикрывают слоем стерильной ихтиоловой мази. Способ Шипилова. Разрезы делают на краниальной поверхности шейки мошонки, где волокна мускула наружного поднимателя семенника не проходят и легче обнаружить спермиопровод. После рассечения общей влагалищной оболочки в рану вводят указательный палец и захватывают им семенной канатик вместе со спермиопроводом. Освободив спермиопровод от брыжейки, его иссекают. В. молодых самцов можно делать через один разрез. Способ Андреевского. Рассекают все слои мошонки и общей влагалищной оболочки в области верхушки мошонки, извлекают хвост придатка и иссекают его вместе с начальной частью спермиопровода. Вазектомия самцов мыши. Наиболее удобный возраст для операции 6 недель, пока она не начали жиреть. Вазэктомия заключается в вырезании короткого фрагмента семявыводящего протока. операцию делают посредством единого поперечного брюшного разреза. Предварительно самца нужно наркотизировать авертином. Семявыносящий проток можно найти, не извлекая семенников, - для этого достаточно оттянуть жировую подушку. Недостаточно просто перерезать протоки, нужно перевязать их концы. После того как будет найден проток, нужно положить пинцет со сведенными браншами на длинный конец лигатуры, накинуть лигатуру сверху на бранши ножниц для образования петли. Слегка развести бранши, захватить ими короткий конец лигатуры, протащить через петлю и затянуть узел. Далее нужно наложить два шва на брюшину и три шва на кожу. Через несколько дней к самцу подсаживают самку для проверки успешности операции (иногда протоки срастаются). Если в течение трех недель самка не забеременела, самца можно использовать для получения ложнобеременных самок. 59 Представьте схему получения химер 60. Схематически отобразите основные подходы к клонированию генов: клонирование методом «дробовика» и «прогулка по хромосоме» и создание к-ДНКовых библиотек Можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК). Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока. Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами. Получают рекомбинантную плазмидную ДНК. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве, лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК). Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. Для примера, допустим, что имеются два случайных фрагмента, полученных методом дробовика: Цепь Последовательность Первоначальна я AGCATGCTGCAGTCATGCTT AGGCTA Первый фрагмент AGCATGCTGCAGTCATGCT------------------------TAGGCTA Второй фрагмент AGCATG------------------------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA Восстановленн ая последователь ность AGCATGCTGCAGTCATGCTT AGGCTA «Прогулка по хромосоме» заключается в последовательном отборе клонов, несущих перекрывающиеся в концевых участках фрагменты ДНК из определенной области генома. Выделив клоны путем скрининга библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с нужным геном, их используют в качестве ДНК-зондов для поиска других клонов с перекрывающимися последовательностями. В результате получают набор фрагментов, полностью перекрывающих область поиска гена. Строят физическую карту данной области.
