Индуцирующий эффект a-токоферола на активности ферментов
реклама
На правах рукописи Прудникова Татьяна Юрьевна ИЗУЧЕНИЕ ГЕНА D-ГЛЮКУРОНИЛ С5-ЭПИМЕРАЗЫ КАК ВОЗМОЖНОГО ГЕНА-СУПРЕССОРА ОПУХОЛЕВОГО РОСТА 03.00.04 – биохимия 03.00.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) Научный руководитель: кандидат биологических наук Григорьева Эльвира Витальевна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Душкин Михаил Иванович кандидат биологических наук Катохин Алексей Вадимович Ведущая организация: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск. Защита диссертации состоится «___»_________2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научноисследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке исследовательского института биохимии СО РАН. ГУ Научно- Автореферат разослан «___» _________2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.С. Русских 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время открыто множество биологических молекул, которые участвуют в процессах злокачественной трансформации. К таким молекулам относятся и протеогликаны (ПГ) - сложные макромолекулы, состоящие из белкового кора и присоединённых к ним цепей гликозаминогликанов (ГАГ). Протеогликаны находятся на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе (ВКМ), выполняя разнообразные функции, в том числе связанные с участием в межклеточных взаимодействиях и во взаимодействиях клетки с ВКМ за счет связывания с различными компонентами ВКМ, включая факторы роста и их рецепторы (Ori et al., 2008; Lindahl et al., 2007, Santra et al., 2002). Изменения экспрессии или локализации этих молекул, так же как и ферментов, вовлеченных в их биосинтез и деградацию, ассоциированы с измениями пролиферативной активности клеток (Yip et al., 2006; Li et al., 2008), изменениями их подвижности (Gordon et al., 2008; Giordano et al., 2008) и ангиогенеза (Bix et al., 2008). Известно, что при злокачественной трансформации меняется структура, состав, степень сульфатирования (Theocharis et al., 2003; Achilleas et al., 2002) и эпимеризации протеогликанов – замещения остатков глюкуроновой кислоты (GlcUA) на идуроновую (IdoUA) (Timar et al., 2002; Valla et al., 2001). Содержание остатков идуроновой кислоты в составе протеогликанов (ПГ) имеет важное значение для нормального функционирования гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ) (WestergrenThorsson et al., 1991). Показано, что содержание идуронового компонента коррелирует с антипролиферативным эффектом гепарансульфат протеогликанов – ГС, богатые остатками идуроновой кислоты (IdoUA) оказывали значительный антипролиферативный эффект на клетки мезотелиомы, тогда как ГС, имеющие в своем составе в основном остатки глюкуроновой кислоты, не имели подобного эффекта (Syrokou et al., 1999). При опухолях прямой кишки (Tsara et al., 2002), толстого кишеника (Theocharis, 2002), опухолях поджелудочной железы (Skandalis et al., 2006a) и карциномы гортани (Skandalis et al., 2006b) содержание идуроновой кислоты в углеводных цепях ГАГ версикана и декорина снижается. Изменения в структуре и соотношении GlcUA/IdoUA в опухоли могут свидетельствовать о том, что, возможно, при злокачественной трансформации происходит нарушение в процессе биосинтеза ПГ, в частности в процессе эпимеризации. Одним из ключевых ферментов биосинтеза гепарансульфат протеогликанов является D-глюкуронил С5-эпимераза (GLCE). Этот фермент проводит реакцию эпимеризации остатков глюкуроновой кислоты в идуроновую в углеводных цепях ГСПГ, участвующих в поддержании межклеточного контакта и передаче сигнальной информации. Эпимераза является единственным ферментом биосинтеза ГСПГ о котором практически 3 ничего не известно. До настоящего времени эпимераза изучалась исключительно как фермент биосинтеза ПГ – определена ее субстратная специфичность, кинетические свойства (Hagner-McWhirter et al., 2000b), механизмы эпимеризации глюкуронила (Prihar et al., 1980; Backstrom et al., 1979), клонирована кДНК эпимеразы из легкого быка (Li et al., 1997), мышиной печени (Li et al., 2001) и клеток мышиной мастоцитомы (Crawford et al., 2001). Разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбрионов, у которых были обнаружены дефекты развития почек, легких, нарушения в костной ткани (Hagner-McWhirter et al., 2004). Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия/акивность эпимеразы может иметь важное значение для правильного формирования органов. Отсутствие других данных о D-глюкуронил С5-эпимеразе не позволяет получить представление о том, есть ли какая-либо тканеспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека, изменяется ли экспрессия/активность этого фермента при злокачественной трансформации и существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы. Нами была высказана гипотеза, что при злокачественной трансформации клеток происходит нарушение экспрессии либо активности D-глюкуронил С5-эпимеразы, что приводит к изменению структуры и состава ГСПГ и пролиферативной активности клеток. Цель данной работы: исследовать роль D-глюкуронил С5-эпимеразы в регуляции клеточной пролиферации при злокачественной трансформации. В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи: 1. Определить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека 2. Исследовать экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах злокачественных и доброкачественных опухолей и культурах опухолевых клеток рака легкого, молочной и предстательной железы человека. 3. Изучить влияние экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферативную активность опухолевых клеток карциномы молочной железы (MCF7), карциномы предстательной железы (LNCaP) и мелкоклеточного рака легкого (U2020) in vitro. 4. Изучить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей in vivo (мыши SCID) и провести анализ ее экспрессии в выросших опухолях. 4 Научная новизна работы В данной работе впервые было показано, что: ген D-глюкуронил С5-эпимеразы экспрессируется во всех изученных нормальных тканях человека (молочная железа, легкое, тимус, щитовидная железа, почка, кишечник, предстательная железа) и показана тканеспецифичность экспресии данного гена. при злокачественной трансформации ткани молочной железы и предстательной железы человека происходит снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с нормальной тканью. Снижение экспрессии гена эпимеразы детектируется даже в неизмененной ткани, окружающей опухоль молочной железы. восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы оказывает антипролиферативное влияние на культуру опухолевых клеток различного происхождения - культуру клеток рака молочной железы линии MCF7, рака предстательной железы линии LNCaP и мелкоклеточного рака легкого линии U2020. восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы оказывает супрессирующий эффект на формирование и рост экспериментальных опухолей у иммунодефицитных мышей линии SCID Научно-практическая значимость Полученные данные о снижении гена D-глюкуронил С5-эпимеразы не только в опухоли молочной железы, но и в неизмененной ткани, окружающей опухоль, привлекает внимание к этому гену как новому возможному маркеру доклинической диагностики рака молочной железы. Способности эпимеразы супрессировать пролиферацию опухолевых клеток in vitro и рост экспериментальных опухолей in vivo дают основу для дальнейших исследований гена D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможного кандидата для генотерапии злокачественных новообразований. Основные положения, выносимые на защиту 1. Ген D-глюкуронил С5-эпимеразы человека экспрессируется во всех исследованных тканях человека, с наивысшим уровнем экспрессии в молочной железе и легком и меньшей экспрессией в тканях почки, тимуса и щитовидной железы. 2. В злокачественных опухолях молочной и предстательной железы человека происходит значительное снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, при гиперплазии и в 5 доброкачественных опухолях экспрессия гена в большинстве случаев сохраняется на нормальном уровне. 3. Усиление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках при введении плазмидной конструкции, несущей полноразмерную кДНК эпимеразы, супрессирует пролиферацию опухолевых клеток in vitro для клеточных линий MCF7 (рак молочной железы), LNCaP (рак предстательной железы) и U2020 (мелкоклеточный рак легкого). 4. D-глюкуронил С5-эпимераза подавляет формирование экспериментальных опухолей in vivo у мышей SCID – при инокуляции экспрессирующих эпимеразу клетками U2020 опухоли образовались лишь у 5 из 10 экспериментальных мышей, в выросших опухолях экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы практически отсутствует. Апробация работы Результаты работы были представлены и обсуждены на 42ой Международной Научной Студенческой Конференции «Студент и научнотехнический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2004), на 8ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2004), на Российской Научно-практической конференции «современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, Россия, 2004), на Российской Научнопрактической конференции «Новые технологии в онкологии» (Барнаул, Россия, 2005) , на Мировом конгрессе по онкологии и Симпозиуме по молекулярной медицине (The World Congress on Advances in Oncology, and International Symposium on Molecular Medicine, Крит, Греция, октябрь 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), на 6ой Европейской конференции по раку молочной железы (6th Europeam Breast Cancer Conference, Берлин, Германия, 15-19 апреля 2008), на 8ой Международной конферении по исследованию рака (8 th International Conference of Anticancer Research, Кос, Греция, 2008), на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная Онкология» (Новосибирск, Россия, 2008). Публикации. По материалам диссертации имеется 15 печатных работ. Структура работы. Диссертационная работа изложена на 95 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 3 таблицы и 37 рисунков и состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, содержащего 123 зарубежных источника. 6 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для изучения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы использовали клинические образцы нормальной ткани (косметические операции), доброкачественных опухолей (фиброаденомы), образцы из зоны опухолевого очага и наименее измененных удаленных участков молочной железы одного и того же пациента, удаленные в ходе хирургического вмешательства. Операционный материал получали в Городской Клинической Больнице N1 г. Новосибирска, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска д.м.н., проф. С. В.Сидорова, диагноз верифицирован гистологическим исследованием. От всех пациентов имеется письменное информированное согласие на участие в исследовании, эксперименты соответствуют этическим принципам Хельсинкской Декларации и стандартам биоэтического комитета ГУНИИ МББ СО РАМН. Образцы опухолей и гиперплазий предстательной железы были получены из Университета Крита, Лаборатория Клинической Вирусологии, Греция. В качестве нормальных образцов использовали ткань предстательной железы, полученную от людей, погибших в результате несчастного случая. Суммарную РНК выделяли с использованием реагента PureLink Total RNA Purification System (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. Относительное содержание мРНК GLCE определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР и количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. В качестве эндогенного внутреннего контроля были выбраны гены «домашнего хозяйства» β-актин и GAPDH. Для синтеза кДНК брали по 1 мкг РНК на пробу. Каждая проба ПЦР содержала ~100нг кДНК, 1 мкл 10x ПЦР-буфера (10 мМ Tris-HCl, 1,8 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3), 10 пмоль каждого праймера, 0,1 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед.акт. Taq-ДНКполимеразы. Для гена эпимеразы, амплификация проводилась в течение 15 циклов, после чего в реакционную смесь добавляли праймеры для GAPDH и проводили еще 18 циклов амплификации. Каждую пробу амплифицировали трижды. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5 - 2% агарозном геле, гель окрашивали бромистым этидием и сканировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва). Денситометрию проводили с помощью программы ”Total Lab”(Nonlinear Dynamics, UK). Содержание мРНК GLCE оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена эпимеразы к интенсивности полосы гена «домашнего хозяйства» GAPDH. Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием Custom GLCE TaqMan Assay (AppliedBiosystems, США) на приборе BioRad IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (BioRad, США). Реакционная смесь содержала ~100 нг кДНК, 1х TaqMan Universal PCR Master Mix (AppliedBiosystems, США), по 100нМ каждого праймера, 250нМ пробы. Каждая пробу амплифицировали трижды. 7 Детекцию белка D-глюкуронил С5-эпимеразы проводили при помощи метода Вестерн-блота. Белки разделяли электрофорезом с использованием системы Mini-Protean II Cell-system (Bio-Rad, США), переносили на PVDF мембрану (Bio-Rad Laboratories, США). Мембрану инкубировали с поликлональными антителами против GLCE человека (GenScript Corp., США). Визуализацию иммунореактивных полос проводили проводили с использованием системы ECL Plus Western blotting detection reagents (Amersham Biosciences) и рентгеновской пленки. Иммунохимическое окрашивание проводили при помощи системы ImmunoPure Ultra-Sensitive ABC Standard Peroxidase Staining Kit (Pierce,USA) согласно инструкции производителя. Стекла с парафиновыми срезами депарафинировали при помощи ксилола и спиртов различной концентрации, демаскировку антигенов приводили при помощи раствора Unmasking solution (Vector,США). Срезы инкубировали с поликлональными антителами против GLCE человека (GenScript Corp., США) Визуализацию проводили при помощи субстрата ДАБ, ядра клеток окрашивали гематоксилином. Клонирование гена эпимеразы проводили в экспрессирующий эписомальный вектор pETE/BSD с последующим переклонированием в вектор pCEP4. Последовательность вставки была подтверждена секвенированием (Dye Terminator Cycle sequencing Kit (Perkin–Elmer) на ABI PRISM 3700 genetic analyzer). Трансфекцию проводили при помощи реагента Липофектамин-плюс (Lipofectamine LTX-Plus Reagent combination (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя. Клетки культивировали в 12-луночном планшете, в среде IMDM-L-Gln-pen/strep-10%FBS. Плазмиднyю ДНК смешивали с Липофектамином и IMDM-L-Gln средой и добавляли к клеткам. Через три часа добавляли по 300 мкл среды с двойным содержанием сыворотки (IMDML-gln-pen/strep-20%FBS) и культивировали 24-48 часов в CO2 инкубаторе. Для получения стабильных клонов, транзиентно-трансфецированные клетки через 48ч после трансфекции рассаживали на 10см чашки и культивировали 26 недель в IMDM среде, содержащей 5 мкг/мл Bsd. Отбирали одиночные клоны и растили отдельно в той же среде. Степень клеточной пролиферации определяли при помощи набора реагентов CY QUANT NF Cell Proliferation Assay (Invitrogen, USA) согласно инструкции производителя. Клетки рассаживали плотностью 100-500 клеток/лунку в 8-12 лунок 96-луночного микропланшета. Количество ДНК в лунках измеряли каждые 24 часа – удаляли среду, добавляли по 50мкл флуоресцентного красителя и инкубировали 30 минут при 37 оС. Интенсивность флуоресцентного свечения каждого образца измеряли при помощи Fluorescence Microplate Reader (SPECTRA max, “Molecular Devices”, Великобритания), с детекцией на длине волны 530нм. Способности к формированию опухолей in vivo клетками исходных линий U2020 и клетками, стабильно экспрессиирующими эпимеразу, определяли методом инокуляции клеток иммунодефицитным мышам линии SCID. Для инъекции использовали клетки в концентрации 28 3*106 клеток на 100 мкл, каждому животному инокулировали 2-3*106 клеток в смеси с Матригелем согласно инструкции производителя (BD Biosciences, Belgium). Наблюдения за формированием опухолей проводились дважды в неделю в течение 35 дней, выросшие опухоли были использованы для определения уровня экспрессии эпимеразы методом ПЦР в реальном времени и иммуногистохимического анализа, как описано выше. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA 6.0. Результаты представлены в виде M ± m, где М среднее, m – ошибка среднего. Для оценки достоверности проводили по критерию Манна-Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение экспрессии эпимеразы в нормальных и опухолевых тканях человека. А. М GLCE GAPDH 1 2 3 Б 4 5 6 . Экспрессия эпимеразы/GAPDH Для того, чтобы оценить уровень экспрессии эпимеразы в различных тканях человека был проведен анализ экспрессии гена эпимеразы методом мультиплексной ОТ-ПЦР с использованием кДНК из различных тканей (Multiple cDNA Panel, Clontech) (Рис.1.) 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 Рисунок 1. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека. А. – Электрофореграмма продуктов мультиплексной ПЦР. М – маркер молекулярного веса, 100bp (Fermentas), 1 – молочная железа, 2 – легкое, 3 – щитовидная железа, 4 – тимус, 5 – почки. 6 – тонкий кишечник. Б – Полуколичественный анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD . Полученные результаты показали, что ген эпимеразы экспрессируется у человека на достаточно высоком уровне в молочной железе, в легких и в меньшей степени в щитовидной железе, тимусе и почках. Таким образом, мо9 лочная железа была выбрана нами для дальнейшего анализа экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы. Уровень экспрессии эпимеразы в нормальной ткани молочной железы человека был изучен при помощи набора праймеров для гена GLCE (NM015554). Поскольку нет никакой информации о существовании изоформ или альтернативно сплайсированных форм эпимеразы, то нами были подобраны комбинации праймеров для различных участков гена эпимеразы (Рис.2). Рисунок 2. Схема расположения сайтов для праймеров для амплификации различных участков гена D-глюкуронил С5-эпимеразы. Экспрессия GLCE была исследована в нормальной ткани молочной железы человека (от пациентов, не страдающих злокачественными заболеваниями – косметические операции) и в клинических образцах молочной железы (опухолевая и контрольная ткань от одного и того же пациента) при помощи 6 различных пар праймеров. Рисунок 3. Анализ экспрессии GLCE методом мультиплексной ПЦР. (А) Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР из нормальной ткани молочной железы человека. (Б) Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР из клинических образцов опухолевой (О) и контрольной (К) ткани одного пациента. 1-6 – различные пары праймеров. В качестве внутреннего стандарта использовался ген GAPDH. 10 В нормальной ткани молочной железы все праймеры давали фрагмент ДНК ожидаемого размера, приблизительно одинаковой интенсивности (Рис. 3А). Однако у некоторых пациентов в опухолевых образцах наблюдалось различие в интенсивности и размерах амплифицированных фрагментов (Рис. 3Б). Так, пара праймеров на 4 экзон (1 и 2 пара) в опухоли и контроле давала полосы одинаковой интенсивности, тогда как пары 3, 4 и 5 (затрагивающие 2 и 3 экзон) показывали значительные различия в опухоли по сравнению с контролем (Рис.3Б) – полоса в опухоли была заметно меньшей интенсивности, 4 пара праймеров давала фрагмент меньшего размера. Возможным объяснением такого различия в экспрессии при использовании различных пар праймеров может быть альтернативный сплайсинг или патологическое укорочение мРНК эпимеразы в опухолях молочной железы в районе 3 экзона. Таким образом, пара праймеров 4 была выбрана нами для дальнейшего анализа экспрессии и для выявления возможного сплайсинга Dглюкуронил С5-эпимеразы в опухолях молочной железы методом мультиплексной ПЦР. Для сравнительного анализа экспрессии GLCE в тканях молочной железы человека были использованы три типа образцов, обозначенные как норма, контроль и опухоль. Нормальными образцами считались клинические образцы молочной железы пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями, полученные в результате косметической хирургии. Опухолевая и контрольная ткань – центральная часть опухоли и максимально удаленный образец неизмененной ткани железы одного и того же пациента. Выделенная РНК использовалась в дальнейшем ОТ-ПЦР анализе с использованием праймеров для GLCE (пара 4) и внутреннего контроля гена GAPDH (Рис. 4). Экспрессия гена эпимеразы была определена в 10 образцах нормальной ткани и 43 парах образцов опухолевой и контрольной ткани, при прочих равных условиях. Уровень мРНК гена GLCE оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности амплифицированного фрагмента GLCE к интенсивности фрагмента гена GAPDH. Относительный уровень экспрессии гена эпимеразы определяли с помощью компьютерной программы ”Total Lab, Nonlinear Dynamics, UK”. 11 Относительное содержание мРНК эпимеразы/GAPDH Рисунок 4. Анализ экспрессии гена эпимеразы в нормальной, контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека. (А) Относительный уровень экспресссии гена эпимеразы в норме (Н), контроле (К) и опухоли (О) у различных (1-125) пациентов по отношению к гену GAPDH. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD. Обнаружено, что уровень мРНК D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли был значительно ниже, чем в нормальной ткани – у 82% исследованных пациентов экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы снижена более чем в два раза. Более того, в большинстве случаев уже в контрольной ткани было отмечено снижение экспрессии эпимеразы по сравнению с нормой. Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека Количественную оценку yровеня экспрессии гена D-глюкуронил С5эпимеразы определяли методом количественной ПЦР в реальном времени. Были подобраны специфические праймеры и проба (TaqMan) на область 3 экзона гена эпимеразы, дополнительно исследовано 11 нормальных образцов молочной железы человека и 31 пара контрольных и опухолевых образцов (Рис. 5). 12 Содержание молекул эпимеразы/1000 молекул актина Рисунок 5. Анализ экспрессии гена эпимеразы методом количественной ОТПЦР в реальном времени. (А) Экспрессия эпимеразы в нормальной (Н), контрольной (К) и опухолевой (О) ткани молочной железы человека (TaqMan Assay, Applied Biosystems). Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD. Результаты количественной ОТ-ПЦР в реальном времени подтвердили имеющиеся данные мультиплексной ОТ-ПЦР. Согласно полученным данным, в номальной ткани эпимераза экспрессируется на уровне 1000-2000 молекул (на 1000 молекул актина). Среди опухолевых пациентов лишь у одного уровень экспрессии эпимеразы и в опухоли, и в контроле оказался сопоставимым с нормальной тканью (№133). Большинство пациентов имели сниженную экспрессию эпимеразы (не больше 387-396 молекул эпимеразы/1000 молекул актина) как в опухоли, так и в прилежащей контрольной ткани. Все пациенты были разделены на 4 группы соответственно изменению уровня экспрессии эпимеразы в контрольной и опухолевой тканях: I – нормальный уровень экспрессии в контрольной и опухолевой ткани (К+О+), II – нормальная экспрессия эпимеразы в контроле, сниженная в опухоли – (К+О), III – экспрессия эпимеразы снижена как в контрольной, так и в опухолевой тканях (К-О-), IV – сниженная экспрессия эпимеразы в контроле, при нормальной экспрессии эпимеразы в опухоли (К-О+). Как видно из диаграммы (Рис. 6) только 16% опухолей и 23% контрольных образцов показывали экспрессию эпимеразы, сопоставимую с нормой. 13 Рисунок 6. Диаграмма эпимеразы. распределения пациентов по степени экспрессии Полученный данные подтвердили результаты мультиплексной ПЦР – только в 82-84% опухолей молочной железы человека уровень экспрессии эпимеразы снижен более чем в 2 раза по сравнению с нормальной тканью (Медиана 2067/65 p<0.0001). Причем в 77% случаев экспрессия эпимеразы была снижена как в опухолевой, так и в контрольной ткани. Статистический анализ проводили при помощи критерия Манн-Уитни (Медиана 2067/71, p<0.0001). Таким образом, мы наблюдали изменение экспрессии гена эпимеразы при злокачественной трансформации ткани молочной железы. Однако оставалось неясным, на какой стадии патологии молочной железы происходит снижение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы, и может ли она служить ранним доклиническим маркером злокачественной трансформации молочной железы. Поэтому следующей задачей было исследовать экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в доброкачественных новообразованиях молочной железы человека. Анализ экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в доброкачественных опухолях молочной железы человека. Экспрессия гена эпимеразы была определена в 21 образце доброкачественной опухоли (фиброаденомы) молочной железы методом мультиплексной ОТ-ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени (Рис. 7). GLCE GAPDH Рисунок 7. Анализ экспрессии гена эпимеразы в доброкачественных опухолях молочной железы человека. М – маркер молекулярного веса, 100bp (Fermentas). H1-H4 – образцы нормальной ткани молочной железы человека, Ф1-Ф3 – образцы фиброаденомы молочной железы человека. 14 Методом мультиплексной ОТ-ПЦР было показано, что в 4 клинических образцах фиброаденомы молочной железы экспрессия GLCE полностью отсутствовала, тогда как в 17 образцах ее уровень был сопоставим с нормой. молекул эпимеразы/1000 мол актина 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 пациенты Рисунок 8. Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в фиброаденомах молочной железы человека (12-28). 1-11 – нормальные образцы. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD Данные количественной ПЦР в реальном времени подтвердили результаты мультиплексной ПЦР – у 17 пациентов уровень экспрессии эпимеразы был сопоставим с нормальным (1000-2000 молекул эпимеразы на 1000 молекул актина), и лишь у 4 пацентов уровень экспрессии был значительно снижен (10-100 молекул эпимеразы на 1000 молекул актина). Согласно полученным данным, снижение экспрессии эпимеразы происходило в 20% случаев доброкачественных новообразований (медиана 2067/978, p<0.01). Однако эти изменения выявлены лишь на уровне мРНК, поэтому следующим этапом данной работы был анализ содержания белковой молекулы эпимеразы при злокачественных и доброкачественных патологиях молочной железы человека. Определение присутствия белка D-глюкуронил С5-эпимеразы Присутствие белка эпимеразы в нормальной, контрольной и опухолевой ткани изучали методом Вестерн-блоттинга при помощи поликлональных антител, специфичной для белковой молекулы эпимеразы (Рис. 9). 15 Н1 Ф1 Н2 Ф2 К1 О1 К2 О2 Рисунок 9. Вестерн-блот анализ наличия белковой молекулы эпимеразы в образцах молочной железы человека. Н – нормальная ткань молочной железы, К – контрольная ткань молочной железы, О – опухолевая ткань молочной железы человека; различные пациенты. Белок эпимеразы (68кДа) выявлялся в контрольной ткани всех пацентов с диагнозом рак молочной железы и во всех образцах фиброаденомы молочной железы (21 образец). Однако 84% опухолевых образцов показывали значительное снижение либо полное исчезновение эпимеразного белка. Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия эпимеразы значительно снижается в опухолях молочной железы человека, причем это можно наблюдать как на транскрипционном, так и на трансляционном уровне. Возможно, данный эффект каким-то образом связан с тенденцией окружающей опухоль ткани молочной железы к озлокачествлению – в нормальной ткани присутствует и мРНК, и белок эпимеразы, а в ткани, окружающей опухоль экспрессия мРНК может быть уже снижена, хотя белок еще детектируется. В опухоли наблюдается снижение как мРНК, так и белка эпимеразы. В случаях с доброкачественными опухолями (фиброаденомами) молочной железы у некоторых пациентов наблюдается практически полное исчезновение экспрессии эпимеразы на уровне мРНК. Является ли снижение экспрессии эпимеразы в опухоли специфичным лишь для молочной железы, либо данный эффект проявляется в различных типах опухолей, оставалось неизвестным. Поэтому следующим этапом нашей работы был анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы. Анализ экспрессии гена D-глюкурнил С5-эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы человека Уровень экспрессии гена эпимеразы в образцах предстательной железы определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием технологии TaqMan. В исследовании использовали 5 нормальных образцов (от людей, погибших в результате несчастного случая), 42 клинических образца злокачественных опухолей предстательной железы (карциномы предстательной железы) и 41 образец гиперплазии предстательной железы (Рис.10) . 16 Опухолевые образцы 33% 21% 46% Образцы гиперплазии увеличение 47% 46% уменьшение 7% не изменялось А . Б. Рисунок 10. Диаграммы изменения экспрессии GLCE методом ОТ-ПЦР в реальном времени в опухолевых образцах предстательной железы человека и гиперплазиях. Согласно полученным данным, снижение экспрессии гена эпимеразы происходило у 46% пациентов со злокачественными опухолями предстательной железы и лишь у 7% пациентов с доброкачественными новообразованиями (более чем в 2 раза по сравнению с нормальной тканью). Остальные образцы имели уровень экспрессии эпимеразы, сопоставимый с нормой либо выше нормального. Таким образом, было показано, что уровень экспрессии гена эпимеразы снижается в опухолях не только молочной железы, но и предстательной железы. Возможно, что ген эпимеразы каким-то образом вовлечен в процесс злокачественной трансформации, и снижение экспрессии или активности этого фермента играют важную роль в индукции опухолевого роста. Поэтому следующим этапом данной работы было изучение влияния восстановления экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферативную активностькультуры опухолевых клеток in vitro и на формирование опухолей in vivo. Ген-инактивирующий тест (GIT – Gene Inactivaion Test) Для изучения функциональной роли D-глюкуронил С5-эпимеразы в процессе злокачественной трансформации был использован специальный тест, основанный на эффекте инактивации супрессорных генов в растущих экспериментальных опухолях (GIT – Gene Inactivation Test). Этот тест был специально разработан для проверки способности разных генов супрессировать развитие злокачественных опухолей in vivo (т.е. быть отнесенным к классу генов, супрессирующих развитие опухоли – Tumour Suppressor Gene – TSG). 17 Его основная идея заключается в следующем - клетки раковой линии трансфецируются плазмидой, несущей исследуемый ген (А). Затем отбирают стабильно трансфецированные клоны (Б), которые инокулируют мышам линии SCID (Severe Combined Immunodeficiency) (В). Далее проводят анализ выросших опухолей (ПЦР, Вестерн блоттинг, иммуногистохимический анализ) (Г) и сравнение экспрессии исследуемого гена в клетках до инокуляции и в выросших из них опухолях (Д) (Рис.11). Основным критерием определения гена как TSG является факт исчезновения его экспрессии в экспериментальной опухоли: если ген является супрессором, то его экспрессия в опухолевых клетках будет тормозить их пролиферацию и опухоли не должны развиваться. Если опухоли вырастают, то значит, ген каким-то образом был инактивирован (например, произошла мутация или делеция). А Целевой ген Б Отбор стабильных клонов В SCID Г Опухоли Анализ Д Рисунок 11. GIT – Ген инактивирующий тест (Gene Inactivation Test) (Protopopov et al., 2002). Для того, чтобы изучить возможный эффект восстановления экспрессии гена эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток in vitro и развитие экспериментальных опухолей in vivo, ген D-глюкуронил С5- 18 эпимеразы был клонирован в экспрессирующие эписомальные вектора pETE/Bsd и pCEP4. Для этого полноразмерная кДНК эпимеразы была амплифицирована с плазмиды KIAA-00836-pBluescript (Kazusa DNA Research Institute, Japan), содержащей фрагмент кДНК эпимеразы, укороченный с 5'-конца. Для реакции амплификации был синтезирован длинный олигонуклеотид, который использовался в качестве прямого праймера при наработке ДНК эпимеразы методом ПЦР (Рис. 12). Pисунок 12. Схема клонирования D-глюкуронил С5-эпимеразы в векторa pETE/BSD и pCEP4. Далее проводилась рестрикция вектора pETE и наработанного фрагмента ДНК эпимеразы по сайтам NotI и BglII и их лигирование. Для переклонирования гена эпимеразы из вектора pETE/BSD в вектор pCEP4 фрагмент ДНК эпимеразы нарабатывался с использованием ПЦР с матрицы 19 epi-pETE/BSD, далее проводилась рестрикция вектора pCEP4 и ДНК эпимеразы, и их лигирование. Последовательность D-глюкуронил С5-эпимеразы в конечных конструкциях была подтверждена секвенированием. Полученные конструкции со вставкой гена D-глюкуронил С5-эпимеразы обозначались как epi-pETE и epi-pCEP4. Влияние экспрессии D-глюкуронил стабильно трансфецированных клонов. С5-эпимеразы на рост Полученные конструкции epi-pETE/Bsd и epi-pCEP4 были использованы для восстановления экспрессии эпимеразы в клетках мелкоклеточного рака легкого линии U2020, клетках карциномы молочной железы линии MCF7 и клетках карциномы предстательной железы линии LCNaP. Была проведена трансфекция клеточных линий U2020 и LNCaP конечной конструкцией epi-pETE/Bsd, полученные клоны были обозначены как epi-U2020 и epi- LCNaP. Трансфекцию клеточной линии MCF7 проводили конструкцией epi-pCEP4, полученные клоны были обозначены как epiMCF7. В качестве контроля проводили трансфекцию пустыми векторами pETE/Bsd и pCEP, полученные клоны обозначали как pETE-U2020, pETELCNaP, pCEP-MCF7. После трансфекции были отобраны стабильные клоны, наличие экспрессии эпимеразы в которых было проверено методом мультиплексной ОТ-ПЦР (Рис. 13А). 20 А. Б. Клетки рака молочной железы линии MCF7 fluorescence 3000 2500 pETE-LNCaP 2000 1500 1000 Epi-LNCaP, кл.4 500 Epi-LNCaP, кл.5 0 Epi-LNCaP Клетки рака предстательной железы линии LNCap 0 5 15 days 10 2000 1500 pETE-U2020 1000 pETE-U2020, клоны 500 Epi-U2020 Клетки рака легкого линии U2020 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Рисунок 13. Влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток in vitro. А. Электрофореграмма экспрессии гена эпимеразы в стабильных клонах по сравнению с иходными клеточными линиями. Наибольшей экспрессией обладают epi-MCF7 клон 3, epi-LNCaP клон 5, epi-U2020 клоны 4, 7, 8. Б. Кривые пролиферации стабильных клонов epi-MCF7 1, 3, 4, pCEP4-LCNaP, 5, epiU2020 4, 7, 8 с использованием CyQUANT NF Cell Proliferation Assay 21 дни Восстановленный уровень экспрессии эпимеразы в клонах epi-MCF7 кл.3, epi-LNCaP кл.5 и epi-U2020 кл. 4 , кл.7 и кл.8 был значительно выше, чем в контрольных клонах с пустыми векторами (Рис. 13 А). Стабильные клоны с наивысшей экспрессией эпимеразы были использованы для определения пролиферативной активности клеток методом CyQUANT NF Cell Proliferation Assay (Invitrogen), позволяющим определять содержание клеточной ДНК при связывании ее со специфическим флуоресцентным красителем. Измерения флуоресценции проводились каждые 24 часа и по полученным данным строили прямую линию, угол наклона которой и определяет скорость клеточного деления (Рис. 13 Б). Из приведенных графиков видно, что во всех клеточных линиях эпимераза тормозила скорость деления клеток in vitro, хотя и в разной степени. Поскольку снижение пролиферации наблюдалось в клеточных линиях различного гистохимического происхождения (мелкоклеточного рака легкого линии U2020, клетках карциномы молочной железы линии MCF7 и карциномы предстательной железы линии LCNaP), то можно предположить, что D-глюкуронил С5-эпимераза может обладать ткане-неспецифичным антипролиферативным эффектом. Для подтверждения возможной антипролиферативной активности Dглюкуронил С5-эпимеразы необходимо было провести эксперименты in vivo. Изучение влияния экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей in vivo Влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на развитие опухоли in vivo было изучено методом инокуляции суспензии опухолевых клеток, стабильно трасфецированных плазмидой epi-pETE\Bsd, иммунодефицитным мышам линии SCID (дефицит Т-клеток у SCID связан с дефектом процесса рекомбинации рецепторных генов). Для инокуляции были отобраны клоны epi-U2020 с максимально выраженным усилением экспрессии эпимеразы (клоны 4,7,8). В качестве контроля использовали клетки, несущие пустой вектор – pETE-U2020 (Рис. 14). 22 дни Рисунок 14. Влияние эпимеразы на рост опухолей у иммунодефицитных мышей линии SCID. Для инокуляции использовали три различных epi-U2020 стабильных клона (4, 7 and 8), в качестве контроля – клетки, несущие пустую плазмиду pETE-U2020. Измерения размера опухолей (мм3) проводились в течение 35 дней. Практически все экспериментальные опухоли epi-U2020 росли значительно медленнее по сравнению с контрольными (Рис. 14) либо не вырастали вообще. В течение 35 дней опухоли были выявлены у 5 из 6 контрольных мышей, инокулированных клетками pETE-U2020. У экспериментальных мышей, инокулированных клетками epi-U2020 клонов образовались лишь 5 опухолей из 10 (Рис. 15). 7 6 мыши без опухолей выросшие опухоли 1 5 4 1 3 2 5 3 3 1 1 1 1 0 pETE-U2020 клон 4 клон 7 клон 8 клоны epi-U2020 Рисунок 15. Влияние эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей у мышей линии SCID. Сформировалось 5 опухолей у 6 контрольных мышей и 5 у 10 экспериментальных. 23 Анализ экспериментальных опухолей Экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолях, выросших у мышей SCID, проверяли методами полуколичественной мультиплексной ОТПЦР и количественной ОТ-ПЦР в реальном времени (Рис. 16). А. Б. Рисунок 16. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в экспериментальных опухолях. А. Электрофореграмма мультиплексной ОТ-ПЦР, в качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH. Б.Относительная экспрессия гена эпимеразы по отношению к GAPDH. Подписи на графике соответствуют дорожкам на электрофореграмме. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD. Уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в выросших опухолях был значительно ниже, чем в исходных клетках epi-U2020, использованных для введения SCID мышам. Результаты количественной ПЦР в реальном времени подтвердили данные мультиплексной ОТ-ПЦР – экспрессия эпимеразы в опухолях, выросших из epi-U2020 клеток практически полностью отсутствовала, при уровне экспрессии 720-960 молекул эпимеразы/1000 молекул GAPDH в исходных клетках, использованных для инокуляции. Наличие белковой молекулы эпимеразы в опухолях, выросших у SCID мышей, определялось с помощью иммуногистохимического исследования опухолей с использованием анти-эпимеразной поликлональной сыворотки (GenScript Corp., USA) (Рис. 17). 24 А. Б. Рисунок 17. Иммуногистохимический aнализ экспериментальных опухолей, выросших у SCID мышей. Синим окрашены ядра (гематоксилин). Коричневым окрашена белковая молекула эпимеразы. Первичные антитела – поликлональная сыворотка. Вторичные антитела (anti-rabbit)- HRP антитела. Окраска ДАБ и гематоксилином. A. Гистологический срез опухоли, выросшей из клеток исходной клеточной линии U2020, содержащих пустую плазмиду. Б. Гистологический срез опухоли, выросшей из клеток эпимераза-U2020, 4 клон. Было продемонстрировано, что в опухолях белок D-глюкуронил С5эпимеразы не детектируется (рис. 17 А, Б). Полученные данные согласуются с результатами ОТ-ПЦР анализа о снижении уровня мРНК эпимеразы в экспериментальных опухолях по сравнению с уровнем мРНК в клонах, использованных для инокуляции мышам SCID. Это подтверждает наше предположение о том, что в опухолях происходит инактивация GLCE, что по-видимому, является необходимым условием развития опухоли, и, следовательно, ген D-глюкуронил С5эпимеразы может являться потенциальным геном, супрессирующим развитие опухоли. В целом, полученные данные свидетельствуют в пользу возможного супрессорного эффекта гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток и развитие опухоли. Наличие такого эффекта привлекает внимание к этому гену как возможному гену-супрессору развития опухоли и новому участнику механизмов регуляции пролиферативной активности клеток. 25 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящем исследовании впервые было начато изучение функциональной роли гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в процессе злокачественной трансформации. Мы показали значительное снижение экспрессии гена эпимеразы в опухолях молочной и предстательной желез. Особенный интерес вызывает то, что снижение экспрессии гена эпимеразы можно детектировать уже на ранних стадиях опухолевой патологии молочной железы: у большинства исследованных пациентов наблюдалось снижение уровня мРНК эпимеразы даже в неизмененной окружающей опухоль ткани. Такой эффект характерен для так называемых генов супрессоров опухолей (TSGs – Tumor Suppressor Genes), для большинства из которых показано, что они должны быть инактивированы либо делетированы в растущих опухолях для того, чтобы опухолевые клетки могли преодолеть механизмы, контролирующие клеточное деление. Полученные нами данные о снижении экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолях человека, и антипролиферативном эффекте восстановленной экспрессии гена эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток in vitro и in vivo дают возможность рассматривать ген D-глюкуронил С5-эпимеразы как новый потенциальный регулятор клеточной пролиферации и роста опухолей, а так же как возможную основу для создания новых препаратов для генотерапии рака легкого. 26 ВЫВОДЫ 1. 2. 3. 4. Экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы показана для всех исследованных тканей человека, с наивысшим уровнем экспрессии в тканях молочной железы и легкого и меньшей экспрессией в тканях почки, тимуса и щитовидной железы. В злокачественных опухолях молочной и предстательной железы человека происходит значительное снижение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы (84% пациентов в случае молочной железы и 45% пациентов в случае предстательной железы), при гиперплазии и доброкачественных новообразованиях экспрессия гена значительно снижается только у 7-20% пациентов. Усиление экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы супрессирует в опухолевых клетках при введении плазмидной конструкции, несущей полноразмерную кДНК эпимеразы супрессирует пролиферацию опухолевых клеток in vitro для всех исследованных клеточных линий - аденокарциномы молочной железы (MCF7), предстательной железы (LNCaP) и мелкоклеточного рака легкого человека (U2020). D-глюкуронил С5-эпимераза подавляет формирование опухолей у мышах SCID – при инокуляции экспрессирующих эпимеразу опухолевых клеток U2020, опухоли образовывались лишь у 5 из 10 мышей SCID, тогда как в контроле опухоли образовывались у 5 из 6 мышей. В выросших опухолях экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы практически отсутствовала как на уровне мРНК так и на белковом уровне. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Ещенко Т.Ю. Экспрессия декорина и D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной ткани и опухоли молочной железы человека. // XLII международная научная студенческая конференция «Студент и научнотехнический прогресс. - 2004. - Новосибирск, Россия. - С. 15. 2. Ещенко Т.Ю. Экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека. // 8-ая Международная Пущинская школа- конференция молодых ученых “Биология – наука XXI века”. - 2004. - Пущино, Россия. - С. 24. 3. Григорьева Э.В., Ещенко Т.Ю., Герасимов А.Е., Сидоров С.В., Гуляева Л.Ф. D-глюкуронил С5-эпимераза как возможная причина снижения 27 уровня декорина в активно прилиферирующих клетках. // Российская научнопрактическая конференция «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии». - 2004. - Томск, Россия. - С. 111. 4. Рыкова В.И., Бородина А., Ещенко Т., Григорьева Э., Сидоров С., Чернаков А. Изменение состава протеогликанов в опухолевой ткани молочной железы человека. // Российская Научно-практическая конферения «Новые технологии в онкологии» - 2005. - Барнаул, Россия. - С. 17 5. Grigorieva E., Eshchenko T., Borodina A., Chernakov A.E., Sidorov S.V., Rykova V.I. Proteoglycans as potential modulators of cell proliferation in breast cancer. // Int J Mol Med. - 2005. - Vol. 16. Supl. 1. - P. 25. 6. Zaidman AM, Zaidman MN, Korel AV, Mikhailovsky MA, Eshchenko T.Y., Grigorieva EV. Aggrecan gene expression disorder as aetiologic factor of idiopathic scoliosis. Stud Health Technol Inform., 2006, 123:14-7. 7. Grigorieva E., Eshchenko T., Pavlova T., Rykova V.I., Chernakov A., Zabarovsky E., Sidorov S.V. Human D-Glucuronil C5-epimerase is a potential tumor suppressor gene. // Int J Mol Med. - 2007. - Vol. 20. Supl. 1. - P. 75. 8. Eshchenko T.Y., Rykova V. I., Chernakov A.E., Sidorov S. V., Grigorieva E.V. Expression of Different Proteoglycans in Human Breast Tumors. // Biochem (Moscow). - 2007. - Vol. 72. - No. 9. - P. 1016-1020. 9. Rykova V.I, Grigorieva E.V. Chernenko A.V., Eshchenko T.Y., Dymschic G.M.. Proteoglycans and human breast cancer. // Bull ExpBiol Med. 2007. - Vol. 144. - No. 9. - P. 310-312. 10. Eshchenko T.Y., Vergbitskaya N.E., Nepomnyaschih G.I., Aidagulova S.V., Rykova V.I., Grigorieva E.V. Immunohistochemical analysis of hondroitin sulfate AC and decorin location in human breast cancer. // Surgery, Morphology, Lymphology. - 2007. - Vol. 4. - No. 7. - P. 18-20. 11. Eshchenko T., Chernakov A., Zabarovsky E., Sidorov S, Grigorieva E. D-glycuronyl C5-epimerase expression is lost in human breast fibroadenoma. // E J Cancer. - 2008. - Vol. 6. - No. 7. - P. 81. 12. Eshchenko T., Domanitskaya N., Pavlova T., Kashuba V., Verzhbitskaia N.E., Zabarovsky E.R., Grigorieva E.V. D-glucuronyl C5-epimerase suppresses small-cell lung tumour formation in vivo. // Int J Mol Med. - 2008. - Vol. 22. Supl. 1. - P. 5. 13. Eshchenko T., Domanitskaya N., Pavlova T., Kashuba V.I., Nepomnyashchih G.I., Aidagulova S.V., Zabarovsky E.R., Grigorieva E.V. Antiproliferative effect of D- glucuronyl C5-epimerase to human breast cancer.// Anticancer Res. - 2008. - Vol. 28. - No. 53. - P. 103. 28 14. Eshchenko T., Domanitskaya N., Pavlova T., Kashuba V.I., Nepomnyashchih G.I., Aidagulova S.V., Zabarovsky E.R., Grigorieva E.V Heparan sulfate epimerase: a new potential marker and target for cancer diagnosis and treatment. // Russian Conference with International participation «Molecular Oncology» - 2008. - Novosibirsk, Russia. - P. 21. 15. Grigorieva E., Eshchenko T., Rykova V.I., Chernakov A., Zabarovsky E.R., Sidorov S.V. Decreased expression of human D-glycuronyl C5-epimerase in breast cancer. Int J Cancer. - 2008. - Vol. 122. - No. 5. - P. 1172-1176. Список используемых сокращений: ПГ ГАГ ВКМ GAPDH GlcUA IdoUA ГС ГСПГ ПЦР мРНК GLCE Соискатель протеогликаны гликозаминогликаны внеклетчный матрикс глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа глюкуроновая кислота идуроновая кислота гепарансульфат гепарансульфат протеогликан полимеразная цепная реакция матричная рибонуклеиновая кислота D-глюкуронил С5-эпимераза Т.Ю. Прудникова 29