Восстановление клеточной популяции 1. Клеточный цикл и механизмы его регуляции Ю.А. Челышев План • Клеточный цикл. Фазы • Молекулы-регуляторы деления клетки • Контрольные точки клеточного цикла • Факторы роста Клеточный цикл: фазы G1 (gap 1) — обычно самая продолжительная фаза, от нескольких часов до нескольких дней (в среднем около 11 часов). У быстро делящихся клеток (эмбриональные и неопластические) эта фаза непродолжительна. Фаза следует за телофазой митоза. В эту фазу клетка синтезирует РНК и белки. G0. Клетки могут выйти из цикла (прекращать деление) и находиться в фазе G0. Они начинают дифференцироваться, достигая состояния терминальной (окончательной) дифференцировки (например, нейроны). В этой фазе клетки метаболически активны, они утратили свой пролиферативный потенциал, но под действием внеклеточного сигнала способны вступать в клеточный цикл. Клеточный цикл: фазы S. В фазу S в клетке продолжается синтез белка, происходит репликация ДНК, разделяются центриоли. Репликация ДНК устанавливается методом авторадиографии по включению предшественника [3H]тимидина. Продолжительность фазы — 8–12 часов. G2 (gap 2). Продолжается синтез РНК и белка (например, синтез тубулина для микротрубочек митотического веретена). Центриоли достигают размеров дефинитивных органелл. В эту же фазу накапливается АТФ для энергетического обеспечения последующего митоза. Продолжительность фазы — 2–4 часа. Митоз В ходе митоза делятся ядро (кариокинез) и цитоплазма (цитокинез). М – самая короткая фаза. При продолжительности всего клеточного цикла 24 часа она составляет 1 час. Митоз Фазы митоза Профаза • Конденсация хромосом. Каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид, соединённых центромерой • Исчезновение ядрышка • Образование митотического веретена. Прометафаза • Ядерная оболочка распадается на мелкие фрагменты • В области центромер появляются кинетохоры, функционирующие как центры организации кинетохорных микротрубочек. Отхождение кинетохор от каждой хромосомы в обе стороны и их взаимодействие с полюсными микротрубочками митотического веретена — причина перемещения хромосом. Митоз Метафаза • Хромосомы располагаются в области экватора веретена • Образуется метафазная пластинка, в которой каждая хромосома удерживается парой кинетохоров и связанными с ними кинетохорными микротрубочками, направленными к противоположным полюсам митотического веретена Анафаза — расхождение дочерних хромосом к полюсам митотического веретена со скоростью 1 мкм/мин. Митоз Телофаза • Хроматиды подходят к полюсам, кинетохорные микротрубочки исчезают, а полюсные продолжают удлиняться. • Образование ядерной оболочки • Появление ядрышка. Цитокинез — разделение цитоплазмы на две обособляющиеся части. Рост клетки Образование органелл Подготовка к делению Репликация ДНК Митоз Рост клетки Образование органелл Подготовка к репликации ДНК / http://www.biologynoteshelp.com/mpfapccyclosome КОНТРОЛЬНЫЕ ТОЧКИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА Контрольные точки Контрольные точки в клеточном цикле определяют завершение каждой его фазы. Контрольные точки клеточного цикла. 1. Точка выхода из G1-фазы, называемая точкой рестрикции (точка Start). После перехода через точку рестрикции R в конце G1 наступление S-фазы становится необратимым, т.е. запускаются процессы, ведущие к следующему делению клетки. 2. Точка S – проверка точности репликации. 3. Точка G2/M-перехода – проверка завершения репликации. 4. Переход от метафазы к анафазе митоза. Клеточный цикл останавливается при: • повреждении ДНК в G1-фазе • неполной репликации ДНК в S-фазе • повреждении ДНК в G2-фазе • нарушении связи веретена деления с хромосомами. http://www.slideshare.net/seasprite/presentation-01-the-cellcycle G1/S. Точка рестрикции (Start). Может ли начинать синтез ДНК? G2/M Закончился ли корректно синтез ДНК? Возможен ли переход к митозу? Контрольная точка веретена Все ли хромосомы прикреплены к веретену? Могут ли сестринские хроматиды корректно распределиться? МОЛЕКУЛЫ-РЕГУЛЯТОРЫ ДЕЛЕНИЯ КЛЕТКИ а. Cdk – циклин-зависимые киназы. б. Циклины — регуляторные субъединицы p34протеинкиназ. Активность циклинов зависит от стадии клеточного цикла. К середине M-фазы концентрация циклинов в клетке резко уменьшается с последующим нарастанием синтеза на протяжении всего цикла. в. Белок р53 специфически связывается с ДНК, подавляет рост клеток в фазе G1. Онкосупрессоры. Опухолевые клетки (вследствие отсутствия сдерживающего фактора) делятся бесконтрольно и неограниченно долго. В отношении этих клеток установлено, что белок р53 способен тормозить их пролиферацию. В фазе G1 клетка содержит одну центросому, которая состоит из двух центриолей, материнской и дочерней. Центросома окружена перицентриолярным материалом. Точка рестрикции При переходе из фазы G1 к фазе S центросомы удваиваются (дуплицируются). Каждая центриоль дает начало дочерней центриоли. Kierszenbaum, Tres, 2012 Точка рестрикции контролирует переход из поздней фазы G1 в фазу S. При отсутствии сигнальных молекул клетка переходит в фазу G0. К концу фазы G2 заканчивается удвоение центросом и каждая центриоль уже полностью сформирована. Kierszenbaum, Tres, 2012 Клеточный цикл во всех фазах регулируют комплексы циклинзависимых киназ (Cdk) и циклинов 1. Ранняя фаза G1. Циклин D активирует Cdk4 и/или Cdk6, что инициирует фосфорилирование белка ретинобластомы (Rb). Это приводит к высвобождению транскрипционных факторов E2F, которые активируют гены циклинов E и A. 2. Поздняя фаза G1. В результате связываения с циклином E активируется Cdk2. Фосфорилирование белка Rb завершается, но активация E2Fопосредованной транскрипции продолжается. Cdk2 и его регуляция особенно важны для протекания мейоза. 3. Запуск фазы S. Циклин А связывается с Cdk2 с последующим фосфорилированием белков, участвующих в репликации ДНК. 4. Переход от G2 к митозу. Для запуска профазы необходима активность комплекса циклин A/Cdk1. Устранение Cdk1 приводит к смерти в эмбриональном периоде. 5. Митоз. Активное участие комплекса циклин B/Cdk1 Факторы роста стимулируют переход из фазы G1 в фазу S Точка рестрикции Kierszenbaum, Tres, 2012 Фосфорилированный Rb белок путем активации комплекса циклин D-Cdk4 стимулирует переход через точку рестрикции Дефосфорилированный Rb белок сдерживает клеточный цикл в точке рестрикции в фазе G1 Методы изучения клеточного цикла (A) Метод авторадиографии. Меченые 3Hтимидином клетки. Гранулы серебра проецируются на ядра меченых клеток, находящихся в S-фазе цикла. (B) Иммунофлюоресцентное выявление бромдезоксиуридина (BrdU) в клетках, находящихся в S-фазе цикла. Анализ содержания ДНК методом проточной цитометрии Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002 Механизм контроля клеточного цикла у млекопитающих может быть изучен in vitro. Фибробласты человека прекращают деление после 25–40 циклов. Этот феномен называют репликативным старением клеток. Иногда вследствие мутаций клетки начинают безудержно размножаться и образуют иммортализованные клеточные линии. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002 Leland H. Hartwell Tim Hunt Sir Paul M. Nurse Лауреаты Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2001 г. За открытие ключевых регуляторов клеточного цикла Cyclin D-CDK4 Cyclin E-CDK2 Cyclin A-CDK2 Cyclin B-CDC2 Регуляция клеточного цикла Клеточный цикл регулируется: • циклинами • циклин-зависимыми киназами (CDK) • ингибиторами циклин-зависимых киназ (CDKIs) Shah, Schwartz, 2001 Белок р53 • фактор транскрипции • стимулирует синтез белка р21, который является ингибитором комплекса CDK-циклин • ингибирование комплекса CDK-циклин приводит к блокаде клеточного цикла в контрольной точке G1/S • в нормальных условиях концентрация белка р53 в клетке очень низкая из-за его нестабильности • при значительных повреждениях ДНК происходит стабилизация и накопление белка р53 • при необратимых повреждениях ДНК инициирует апоптоз. Chow, 2010 Функция белка р53 http://www.slideshare.net/SurenderRawat3/genomic-s-and-cancer Повреждение ДНК при действии высокой t°, радиации или химических агентов Остановка деления клетки, р53 активирует синтез ферментов для репарации ДНК Р53 «включает» процесс дезинтеграции необратимо поврежденных клеток ФАКТОРЫ РОСТА Факторы роста Применение в медицине Два десятилетия факторы роста все чаще применяли для лечения болезней крови, онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний, таких как: • нейтропения • миелодиспластический синдром (myelodysplastic syndrome, MDS) • лейкемия • апластическая анемия. Взаимодействие факторов роста со своими рецепторами приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей JAK/STAT, MAP киназы и PI3 киназы. Факторы роста • • • • • • • • • Ангиопоэтин (Angiopoietin (Ang) Глиальный нейротрофический фактор (Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) Инсулиноподобный фактор роста (Insulin-like growth factor (IGF) Интерлейкины Колониестимулирующий фактор гранулоцитов (Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) Колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Мозговой нейротрофический фактор (Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Морфогенетические белки кости (Bone morphogenetic proteins (BMPs) Сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor (VEGF) Факторы роста • • • • • • • • • • • Тромбоцитарный фактор роста (Platelet-derived growth factor (PDGF) Тромбопоэтин (Thrombopoietin (TPO) Трансформирующий фактор роста α (Transforming growth factor alpha (TGF-α) Трансформирующий фактор роста β (Transforming growth factor beta (TGF-β) Фактор некроза опухоли α (Tumor necrosis factor-alpha (TNFα) Фактор роста гепатоцитов (Hepatocyte growth factor (HGF) Фактор роста нервов (Nerve growth factor (NGF) Фактор роста фибробластов (Fibroblast growth factor (FGF) Факторы сигнального пути Wnt Эпидермальный фактор роста (Epidermal growth factor (EGF) Эритропоэтин (Erythropoietin (EPO) Фактор роста Источник Активность Комментарии Три различные димерные формы: АА, АВ, ВВ PDGF Тромбоциты, эндотелий, плацента Стимулирует пролиферацию Кл соединительной ткани, глиальных и ГМК EGF Подчелюстная железа, железы 12ПК Стимулирует пролиферацию мезенхимных ,глиальных и эпителиальных Кл Заживление ран TGFalpha Близок EGF 18 членов семейства, 5 различных рецепторов FGF NGF Тучные Кл, эозинофилы, стромальные Кл костного мозга, кератиноциты Поддерживает рост аксонов и выживание нейронов Из семейства нейротрофинов, рецептор TrkA Эритропоэтин Почки Стимулирует эритропоэз TGFbeta Активированные Тхелперы и NK-клетки Противовоспалительное действие, стимулирует заживление ран, тормозит пролиферацию макрофагов и лимфоцитов 100 членов семейства IGF-1 Печень Стимулирует пролиферацию Кл многих типов Близок IGF-2 и проинсулину, син. соматомедин С IGF-2 Разные Кл Стимулирует пролиферацию Кл многих типов у плода Близок IGF-1 и проинсулину Гормон роста (соматотропный гормон) действует на предшественники хондроцитов в проксимальной зоне эпифизарной пластинки, стимулируя продукцию инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1). В промежуточной зоне IGF-1, действуя по механизму паракринной регуляции, стимулирует размножение ранних хондроцитов. В дистальной зоне IGF-1, действуя по механизму эндокринной регуляции, поддерживает дифференцировку хондроцитов. Laron, 2001 Жировая ткань и адипоциты как источник факторов роста. Адипоциты продуцируют инсулиноподобные факторы роста 1 и 2 (IGF-1, IGF-2), которые действуют на многие клетки-мишени. Westley, May, 2013 Факторы роста для стимулирования регенерации Для стимулирования регенерации ткани исследуют и испытывают технологии прямой генной и клеточно-опосредованной (доставка генов при помощи клеточных носителей) генной терапии с применением терапевтических генов (трансгенов), кодирующих синтез факторов роста, с целью увеличения их экспрессии в поврежденной ткани. Примеры клинических испытаний применения факторов роста Рекомбинантные факторы роста человека Патология или состояние Эпидермальный фактор роста (EGF) Диабетическая стопа Фактор роста гепатоцитов (HGF) Фульминантная (молниеносная) печеночная недостаточность Фактор роста фибробластов 1 (FGF-1) Ишемия миокарда Фактор роста фибробластов 2 (FGF-2) Периодонтит Фактор роста нервов Пигментный ретинит Колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) Пациенты с трансплантацией аутологичных стволовых клеток
