Лабораторная работа №12 «Реакции с биологически активными соединениями» Цель работы: закрепить на практике качественные реакции на витамины; проверить действие ферментов на некоторые вещества; провести анализ лекарственных препаратов. Часть 1. «Обнаружение витаминов» Теоретическое введение Витамины – низкомолекулярные органические вещества разнообразного строения. Витамины делятся на: • жирорастворимые (А, Д, Е, К) • водорастворимые (С, Р, В1, В2, В3, Вс, В6, В12, РР, Н) Витамин А хорошо растворим в жирах и жирорастворителях: бензине, хлороформе, ацетоне и др. Предполагают, что витамин А участвует в окислительно-восстановительных процессах, входит в состав зрительного пурпура – родопсина, находящегося в палочках сетчатки и принимающего участие в процессе зрения. Витамин А представляет собой полиненасыщенный одноатомный спирт, который устойчив к нагреванию. В присутствии кислорода и под действием света витамин А быстро разрушается. Поэтому продукты, содержащие витамин А необходимо хранить в тёмном месте. В свободном виде содержится витамин А только в продуктах животного происхождения. Витамин С является одним из самых мощных антиоксидантов, и впервые он был выделен из сока лимона. Он прекрасно растворяется в воде, и это даёт ему ряд преимуществ – например, благодаря этому свойству витамин С может легко и быстро проникать туда, куда нужно, помогать иммунной системе ликвидировать сбои в организме, и запускать процессы, необходимые для здоровья и жизни человека. Витамин D – среди витаминов группы D наиболее распространены эргокальциферол и холекальциферол, образующийся в коже под действием УФ-лучей из 7-дегидрохолестерина. Витамин Д – это жирорастворимое соединение, которое участвует в обеспечении формирования костей. В человеческом организме он может накапливаться в разных органах, но наибольшее его количество содержится в печени и подкожной жировой клетчатке. Оборудование и реактивы: пробирки, штатив для пробирок, подсолнечное масло, хлорид железа (III), яблочный сок, дистиллированная вода, крахмальный клейстер, рыбий жир, раствор брома. Опыт 1. Определение витамина А в подсолнечном масле В пробирку налили 1 мл подсолнечного масла и добавили несколько капель 1%-го раствора FeCl3. Если наблюдается ярко-зелёное окрашивание, то в масле содержался витамин А. Опыт 2. Определение витамина С в яблочном соке В пробирку налили 2 мл сока и добавили воды, доведя объём до 10 мл. Затем добавили немного крахмального клейстера. Затем по каплям до появления устойчивого синего окрашивания на 10-15 с добавляют раствор иода. Техника определения витамина С основана на том, что молекулы аскорбиновой кислоты легко окисляются иодом. Как только иод окислит всю аскорбиновую кислоту, следующая же капля, прореагировав с крахмалом, окрасит раствор в синий цвет. Опыт 3. Определение витамина D в рыбьем жире В пробирку налили 1 мл рыбьего жира и прилили 1 мл раствора брома. Если наблюдается зеленовато-голубое окрашивание, то в жире содержался витамин D. Часть 2. «Действие ферментов на различные вещества. Амилаза, дегидрогеназа» Теоретическое введение Ферменты – это белковые молекулы, синтезируемые живыми клетками. В каждой клетке имеются сотни различных ферментов. С их помощью осуществляются многочисленные химические реакции, которые проходят с большой скоростью при температурах, подходящих для данного организма, то есть в пределах от 5 до 40 градусов. По строению ферменты делят на 2 группы: А) ферменты-протеины (однокомпонентные, т.е. состоят только из белка). Б) ферменты-протеиды (двухкомпонентные, состоящие из белка и небелковой части). Небелковая часть: • это могут быть ионы металла - они называются кофактор. • органическое вещество, непрочно связанное с белком - кофермент. • органическое вещество, прочно связанное с белком - простетическая группа. Амилаза — фермент, гликозил-гидролаза, расщепляющий крахмал до олигосахаридов, относится к ферментам пищеварения. Расщепляет α-1,4-гликозидную связь. Амилаза присутствует в слюне человека и некоторых млекопитающих, где фермент начинает химический процесс переваривания пищи. Продукты с высоким содержанием крахмала и низким содержанием сахара, такие как рис и картофель, могут приобретать сладковатый вкус при длительном пережёвывании за счёт превращения амилазой крахмала в сахар. Поджелудочная железа и слюнные железы выделяют амилазу, расщепляющую крахмал до ди- и трисахаридов, которые, в свою очередь, превращаются другими ферментами в глюкозу, источник энергии для организма. Дегидрогеназы — группа ферментов из класса оксидоредуктаз, катализирующих перенос протонов от субстрата (органических веществ) и пары электронов — к акцептору. Важную роль играют митохондриальные цитохромредуктазы (флавопротеиды), ферменты, отщепляющие протоны в клетках животных, растений и микробов от восстановленных коферментов и передающие электроны на цитохром. Дегидрогеназы представлены в реакциях углеводного (цикл Кребса, пируватдегидрогеназа) и жирового обмена, окисления изоцитратдегидрогеназа, альфакетоглутаратдегидрогеназа. Каталаза — фермент, который катализирует разложение образующегося в процессе биологического окисления пероксида водорода на воду и молекулярный кислород, а также окисляет в присутствии пероксида водорода низкомолекулярные спирты и нитриты. Содержится почти во всех организмах. Участвует в тканевом дыхании. Оборудование и реактивы: мерный цилиндр, химический стакан/мензурка, пипетки Пастера, пробирки, штатив для пробирок, предметное стекло, стеклянная палочка, секундомер, резиновая груша, стеклянная трубка, лучинка, спички, образцы слюны, дистиллированная вода, раствор крахмала, формалин аптечный, молоко, метиленовый синий, растительное масло, пероксид водорода, кусочек сырого и вареного мяса, картофель сырой кусочками, тертый и вареный. Опыт 1. Действие амилазы слюны на крахмал 1. Предварительно прополоскав рот, набрали 2-4 мл слюны и поместили в маленький мерный цилиндр. В цилиндр добавили воды, доведя объём до 10 мл. 2. Смешали 5 мл раствора крахмала с 1 мл раствора фермента в маленькой мензурке. Через 30 с после перемешивания взяли каплю полученного раствора и проверили её на содержание крахмала, перемешав её с каплей раствора иода на предметном стекле. Если крахмал ещё не присутствует, то необходимо проверять раствор через каждые 30 с до тех пор, пока крахмал станет не обнаруживаем. Записали общее время, необходимое для полного гидролиза крахмала. 3. Вновь смешали 5 мл раствора крахмала с 1 мл раствора фермента и разделили полученный раствор поровну в 2 пробирки. Одну из пробирок поместили в стаканчик с холодной водой ( 35-40 °С). Каждые 30 с отбираем по 1 капле смеси растворов из каждой пробирки и смешиваем на предметном стекле с каплей иода до тех пор, пока крахмал станет не обнаруживаем. Записали в каждом случае общее время, необходимое для гидролиза крахмала. Делаем вывод, что амилаза наиболее эффективна при температуре 35-40 °С ( температура тела). Опыт 2. Действие дегидрогеназы на метиленовый синий (стиральная синька) 1. Небольшое количество аптечного формалина (с учётом его исходной концентрации) развели водой до получения 0,5%-го раствора формальдегида. 2. В две пробирки налили по 5 мл некипяченого молока, добавили по 15 капель 0,5%-го формальдегида и по несколько капель раствора метиленового синего. Наблюдаем, что краситель постепенно бледнеет и в конце концов обесцвечивается. Это объясняется тем, что благодаря содержащейся в молоке дегидрогеназе атомы водорода формальдегида присоединяются к молекуле красителя. 3. В каждую пробирку добавили немного растительного масла, чтобы изолировать полученную смесь от воздуха и предотвратить окисления красителя. 4. Одну пробирку поставили в пустой стаканчик, а другую в стаканчик с тёплой водой ( 35-40 0С). Наблюдаем, что в пробирке, помещённой в тёплую воду, краситель обесцвечивается быстрее, чем в первой (так как наиболее эффективна дегидрогеназа в условиях, близких к температуре тела млекопитающих). 5. С помощью резиновой груши и стеклянной трубки через реакционную смесь продули воздух, наблюдаем восстановление цвета красителя (происходит его окисление). Опыт 3. Действие каталазы на пероксид водорода 1. В 5 пробирок налили по 2 мл раствора пероксида водорода. 2. В первую пробирку опустили кусочек сырого мяса. Наблюдаем выделение пузырьков газа. К отверстию пробирки поднесли тлеющую лучинку, наблюдаем вспыхивание и горение лучинки. 3. Во вторую пробирку опустили кусочек сырого картофеля и поднесли тлеющую лучинку. Вновь наблюдаем выделение пузырьков газа и вспыхивание лучинки. 4. В третью пробирку опустили измельчённый на тёрке картофель и поднесли тлеющую лучинку. Наблюдаем более интенсивное выделение газа, так как реакция катализируется, каталазой содержащейся в клетках не только поверхности одного куска, их стало больше (увеличилась площадь поверхности). 5. В четвёртую и пятую пробирки опустили по кусочку варёного мяса и картофеля. Ничего не происходит, так как при варке ферменты разрушаются и не катализируют реакцию разложения пероксида водорода. Часть 3. «Анализ лекарственных препаратов, производных салициловой кислоты» Теоретическое введение Салициловая кислота (орто-гидроксибензойная кислота – С6Н4(ОН)СООН) - бесцветные кристаллы, температура плавления -1590С. применяется в производстве красителей, лекарств и душистых веществ, в пищевой промышленности(консервирование), медицине (как наружное средство антисептического, раздражающего действия), как аналитический реагент. Ацетилсалициловая кислота (аспирин) – сложный эфир салициловой кислоты по фенольному гидроксилу. В состав молекулы входят карбоксильная группа –СООН, и радикал ацетил –СОСН3 (одновалентный остаток уксусной кислоты). Обладает обезболивающим, противовоспалительным и жаропонижающим действием. Лекарственные формы – удобные для применения и рациональные для лечебного эффекта формы, придаваемые лекарствам. Различают лекарственные формы: 1. жидкие (растворы, настои, отвары и др.); 2. мягкие (мази, пасты); 3. твердые (порошки, таблетки); 4. газообразные (аэрозоли). Оборудование и реактивы: фарфоровая ступка с пестиком, пробирки, штатив для пробирок, спиртока, спички, держатель пробирок, этанол, исследуемые образцы таблеток аспирина, дистиллированная вода, раствор гидроксида натрия, хлорид железа (III). Методика работы: 1. В ступке растёрли таблетки каждого из этих лекарств. Перенесли в пробирки по 0,1 г каждого лекарства. В каждую пробирку добавили немного воды, таблетки почти не растворились. На спиртовке нагрели пробирки до кипения, растворение порошков так и не произошло. 2. В пробирки внесли по 0,1 г порошков и добавили немного этанола. На спиртовке нагрели пробирки, наблюдаем растворение осадков. В этаноле лекарства растворяются лучше. 3. В пробирки внесли по 0,1 г порошков и добавили немного раствора NaOH, содержимое взболтали. Порошки растворились, так как происходит реакция, а образовавшиеся соли растворимы в воде. 4. В пробирки внесли по 0,1 г порошков, добавили немного воды, содержимое взболтали, добавили по несколько капель раствора FeCl3. В пробирках с салициловой кислотой и салолом окраска стала ярко-зелёной, так как они содержат фенольный гидроксид —ОН, который реагирует с FeCl3.