ЛЕКЦИИ
о клеточном
цикле
ЛЕКЦИИ
О
КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ
ГЛАВА 1. ДЕЛЕНИЕ КЛЕТКИ И НОНЯТИЕ
О КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ
Предмет изучения
Предлагаемая книга содержит материалы курса лекций «Клеточный цикл», которые были прочитаны в 1990-1996 гг. на
кафедре цитологии биологического факультета МГУ. Что такое
клеточный цикл? Разумеется это не самостоятельная научная
дисциплина и не конкретная область знания. Правильнее всего
будет сказать, что в контексте данной книги понятие «клеточный
цикл»
включает
в себя
систему
представлений
о том,
что
побуждает клетки к самовоспроизведению и как осуществляется контроль этого процесса в организме.
По ходу изложения будут раскрыты эти явления и прослежена вся история развития учения о клеточном цикле, от его
первоначального описания до наших дней. История эта изобиловала драматическими событиями, и даже само существование клеточного цикла еще сравнительно недавно ставилось
под сомнение. Тем более замечательно, что сейчас наметился
в буквальном смысле слова прорыв наших знаний в этой
области, когда удалось установить общность молекулярных
механизмов размножения клеток у всех эукариотов — от
дрожжей до человека, и теперь известно, какие это молекулы
и как они взаимодействуют. Нам предстоит оценить современное состояние вопроса и наметить основные направления его
изучения.
Случилось так, что мне и тем, кто трудился со мной на
протяжении более чем тридцати лет, довелось непосредственно
участвовать в развитии тех или иных положений о клеточном
цикле. Мы изучали клеточный цикл прежде всего как экспериментаторы, и, хотя в процессе исследований нами было разработано немало методических приемов, их описание не войдет в
настоящий курс. Этим методам посвящены специальные руководства,
где каждый может почерпнуть необходимые сведения.
Не будут рассматриваться детально также и многие принципиально важные проблемы клеточной биологии, связанные с
прохождением клетками цикла, но имеющие самостоятельное
значение (такие, как механизмы митоза, участие в этом процессе различных клеточных компонентов, механизм инициации
синтеза и редупликации ДНК и др.). Каждый из этих вопросов
может служить предметом отдельного курса.
Основная цель книги, как уже было отмечено, — попытаться
проанализировать, что именно заставляет клетки делиться и как
регулируется этот процесс. Но не менее важна и другая сторона
вопроса: почему клетки иногда прекращают на длительное
время свое размножение, какие силы удерживают их в этом
состоянии и что служит причиной их возврата к пролиферации?
Понимание этих процессов совершенно необходимо для проникновения в такие фундаментальные направления биологии,
как дифференцировка клеток, их нормальное функционирование, старение, гибель и злокачественное перерождение. Эти
проблемы также явятся предметом рассмотрения в предстоящих
лекциях. Таким образом, в центре внимания будут, главным
образом, общие принципы регуляции размножения клеток в
живой природе, хотя речь пойдет преимущественно о животных
клетках.
В учение о клеточном цикле внесли свой вклад многие
замечательные исследователи. О тех, кого уже нет в живых,
будет рассказано подробнее. Учение это, как мы увидим,
необычайно динамично, оно все время находится в процессе
формирования, и то, что было открытием вчера, сегодня уже
становится историей. Поскольку это история продолжающихся
открытий, изложение будет носить в основном хронологический характер.
Мы начнем с изложения некоторых вопросов биологии
клеточного деления, истории открытия клеточного цикла и
подходов к его изучению.
Биологический смысл деления клеток
Пожалуй, с наиболыним лаконизмом охарактеризовал сущность процесса клеточного деления современник этого открытия Эдмунд Вильсон, сказавший, что «от клеточного деления
зависят не только явления наследственности, но и сама непрерывность жизни». При этом он несомненно развивал известный
принцип Вирхова о непрерывности развития клеток при помощи деления. Несмотря на колоссальный прогресс знаний в
области цитологии и генетики, к этому положению мало что
можно добавить, и биологи последующих поколений обычно
лишь перефразировали формулировку Вильсона.
Образно выражаясь, деление обеспечивает «биологическое
бессмертие» клеток путем непрерывного обновления цитоплазмы. Поддержание жизни клетки требует в свою очередь полного
и безошибочного воспроизведения ее организации, то есть всех
структур и прежде всего генетического материала, заключенного в ядре. Равномерное же распределение наследственного
материала между двумя дочерними (сестринскими) клетками
обеспечивается митозом, представляющим собой сложный процесс структурных преобразований и перемещений внутриклеточных компонентов, завершающийся делением клетки.
История открытия митоза
Как нередко бывает с великими открытиями, истинный
смысл клеточного деления был постигнут лишь много лет
спустя после того, как это явление впервые описали французские ученые Прево и Дюма, наблюдавшие дробление яиц у
животных. Их исследование было опубликовано в 1824 году в
трех выпусках трудов по изучению естественных наук. В то
время во Франции научные работы печатались в журналах как
романы, с ремаркой «продолжение следует». Удивительное
ощущение возникает, когда держишь в руках эти маленькие
томики в сафьяновых или атласных переплетах, так непохожие
на современные периодические издания и скорее напоминающие поэтические сборники.
Прево и Дюма описали процесс деления клеток с болыцой
точностью, и не их вина в том, что открытие митоза не было по
достоинству оценено современниками. Историки естествознания обычно упрекают в этом авторов клеточной теории Шлейдена и Шванна (1838-1839), допускавших свободное образование клеток изокружающей их плазмы (бластемы). Как же могло
случиться, что два крупнейших микроскописта и естествоиспытателя своего времени, создавшие теорию, не менее значимую
для биологии, чем эволюционное учение Дарвина, пришли к
столь ошибочному заключению?
Здесь следует немного подробнее остановиться на личности
Шлейдена. В противоположность Шванну, который отличался
уравновешенным характером и был настолько осторожен в
своих высказываниях, что на каждую публикацию испрашивал
разрешения епископа, Шлейден, напротив, снискал репутацию
человека сумасбродного и необузданного, с непредсказуемым
поведением. Будучи успешно практикующим адвокатом, он
неожиданно разочаровался в выбранной профессии и в состоянии тяжелой депрессии пытался пустить себе пулю в лоб, лишь
по счастливой случайности отделавшись шрамом. Выздоровев,
он обратился сначала к медицине, а затем к ботанике и,
проучившись в общей сложности еще тринадцать лет, был
наконец аттестован как биолог. Таким образом, к началу работы
над клеткой Шлейдену исполнилось уже тридцать пять лет.
Однако это нисколько не отразилось на его темпераменте.
Именно «неистовый тевтон», как окрестили Шлейдена коллеги,
был постоянным возмутителем спокойствия для Шванна, побуждая его к решению задач, порождаемых своей безудержной
фантазией. К сожалению, будучи тщательным и объективным
наблюдателем, Шлейден допускал порой слишком вольную
интерпретацию описываемых фактов, что и привело, в частности, к ошибочному взгляду на возникновение клеток из бластемы, окружающей ядро, которое, в свою очередь, формируется,
якобы, вокруг ядрышка. Авторитет создателей клеточной теории был так велик, что немедленно нашлись исследователи,
«подтвердившие» это наблюдение, и результаты опытов Прево
и Дюма подверглись забвению. Впрочем Шлейден всего лишь
десять с небольшим лет был занят всерьез изучением клетки.
Увлекшись в 1848 году революционными событиями во Франции, он надолго оставил всякую научную деятельность, а
последние годы жизни посвятил преподаванию антропологии и
написанию лирических эссе (подробнее о Шлейдене и Шванне
см. ЕгапКе, 1988).
Так или иначе, открытие митоза отделяет от опытов Прево
и Дюма целое пятидесятилетие. Во второй половине семидесятых годов прошлого столетия последовала серия классических
работ Страсбургера и его учеников, описавших отдельные фазы
деления клетки; Флемминга, открывшего различные типы деления ядра; Вальдейера, охарактеризовавшего хромосомы, и других исследователей.
Термин «митоз» (от греческого имос — нить) принадлежит
Флеммингу. Это слово прочно вошло в научную литературу,
вытеснив введенный ранее Шлейхером термин кариокинез (от
греческих харооу — орех и луцощ — движение). В настоящее
время общепризнано, что митоз является самым древним способом клеточного размножения, а все остальные формы деле-
ния
возникли
в процессе
патологические
ставление
эволюции
изменения.
о митозе
ного
распределения
ними
клетками.
как
как его регуляционные
В основе
наиболее
этого
логичном
наследственного
взгляда лежит
способе
материала
или
пред-
равномер-
между
дочер-
”
Организация митоза
Для равномерного распределения наследственного материала между дочерними клетками необходима его предварительная
упаковка в неболыное число структурных единиц — хромосом
(название подразумевает способность хромосом интенсивно
окрашиваться гистологическими красителями; термин принадлежит Вальдейеру). В хромосомах, число которых постоянно
для каждого вида животных, находятся материальные носители
наследственности — гены.
Каждая
хромосома
состоит
из
двух.
нитей
—
хроматид,
несущих идентичный генетический материал. На протяжении
митоза происходит продольное расшепление хромосом и составляющих ихединиц с последующим расхождением хроматид
к полюсам
клетки.
Именно
эти
два
события
обеспечивают
равномерное распределение наследственного материала между
дочерними клетками, иначе говоря их самовоспроизведение.
Для перемещения хромосом в клетке нужен механизм, осуществляющий временную и пространственную хореографию клеточных компонентов. Поэтому весь: процесс митоза логически
разделяется на две части:
(А) Формирование такого механизма. Это ахроматиновый аппарат, состоящий из центриолей и микротрубочек веретена, с которы-
ми хромосомы соединены при помощи кинетохоров. Совокупность
ахроматиновогоаппарата и хромосом называютмитотическим
аппаратом.
(Б)
Перемещение
хромосом к полюсам.
Кульминацией
митоза является
Рис. 1. Метафаза растительной клетки.
ме-
тафаза, когда митотический
аппарат
полностью
сформи-
рован, и хромосомы располагаются в экваториальной плоскости
веретена (рис. 1 и рис. 2-3). Как
предлагает Мэзия (1963), отсюда
следует «оглянуться назад и посмотреть вперед».
При этом можно выделить глав-
.
ные группы событий (рис. 2):
Профаза — разделение хромосом на хроматиды и образование
веретена. Прометафаза — расхож-
дение центриолей к полюсам и
начало перемещения хромосом
(метакинез). Анафаза — движение
хромосом к полюсам и телофаза —
деление клетки.
Поскольку митоз представляет собой единый и непрерывный
процесс, границы между отдельными его этапами не всегда могут
быть четко выявлены. Кроме того,
у разных биологических объектов
детали
митоза
иногда
существен-
= Рис. 2. Общая схема митоза у
многоклеточного
животного
(по
но варьируют. Однако эти разли- ГРЕЛЮ): | — профаза, 2 — промета-
фаза, 3 — метафаза, 4 — анафаза,
чия касаются в основном второ- 5 _ телофаза
степенных признаков, а генеральный план митоза остается общим для всех видов.
Специфические черты митоза как биологического процесса
Митозу присущи все особенности, которые философы называют «атрибутами живого».
Это, в первую очередь, как подчеркивает В.А. Энгельгардт
{1960), проявление «единства во множестве, или тождества в
многообразии»,
когда,
как уже
было
сказано,
у эукариотов
сходен не только конечный эффект (деление клетки), но и
составляющие его ступени (фазы). Второй специфической чер-
той митоза как биологического процесса следует считать наличие явлений авторегуляции, когда возможное отклонение от
нормальной функции само по себе служит стимулом к ее
восстановлению (подробнее об этом см. в главе \). И, наконец,
митоз,
как
и
многие
важнейшие
биологические
процессы,
отличает цикличность протекания, что послужило основанием
для возникновения понятия о митотическом цикле.
Представление о митотическом (клеточном) цикле
и его периодах
Понятие о митотическом цикле существовало уже давно,
однако точное определение его отсутствовало. Поскольку основным объектом изучения митотического деления клеток обычно
служили синхронно дробящиеся яйца животных с быстро протекающими митозами, где вслед за телофазой почти сразу же
начинается профаза, митотический цикл нередко отождествляли
с самим митозом. Лишь позднее появился термин «интерфаза»,
обозначавший подготовительный период к делению в целом.
При этом митоз противопоставлялся интерфазе как активное
состояние клетки пассивному, о чем свидетельствует и первоначальное название интерфазы — «интеркинез».
Первая успешная попытка расчленить интерфазу принадлежит Говард и Пелку (Но\ага, Ре]с, 1953), показавшим
методом
радиоавтографии (см. следующую главу), что включение радиоактивного фосфора (?Р) в ДНК клеток корня конского боба
Иса
Лаба
происходит
только
в
интерфазе,
заканчиваясь
за
определенное время до начала митоза.
Авторы
выдерживали
корешки
в среде, содержавшей
?2Р, в
течение 1 часа, а затем переносили в среду с нерадиоактивным
фосфором
и
фиксировали
удаления меченой
через
каждый
час
(рис.
3).
Для
РНК препараты обрабатывали рибонуклеа-
зой. Первые меченые митозы (профазы)
жить на радиоавтографах только через
можно
8 час.
было обнарупосле начала
контакта клеток с радиоактивным фосфором, из чего был
сделан вывод о прекращении синтеза ДНК за 8 час. до начала
митоза.
Через 6 час. после появления первых меченых митозов снова
начинали преобладать немеченые митозы, что свидетельствовало о локализации синтеза ДНК в течение определенного периода интерфазы, равного 6 час. Авторам удалось проследить
появление второго максимума меченых митозов — через 30 час.
после первого. Это позволило предположить, что весь митотический цикл клеток корня, включая митоз и интерфазу, продолжается 30 час. Поскольку было известно, что митоз в клетках
Нерадиактивный
фосфор + РНКаза
р
Вау
аз
фиксация
ит.
клеток
Т=30 ч.
и
Меченые
митозы
|
Время
после введения
5
радиактивного
бч.
|
индикатора
5
Рис. 3. Схема опытов
Говард и Пелка по выявленио периодов
митотического цикла в клетках корневой меристемы И. /афа (объясне-
ния в тексте). С,, $ — периоды цикла, Т — продолжительность цикла.
корня 7. /аба длится около 4 час., а суммарная продолжительность репликации ДНК и отрезка времени, предшествующего
митозу, составляла, по данным Говард и Пелка, 14 час., авторы
пришли к заключению о наличии в митотическом цикле еше
одного периода, продолжительность которого равна 12 час. Они
предложили разбить митотический цикл на четыре периода, или
фазы: собственно деление клетки
(митоз), пресинтетический период С, (от англ. вар — интервал)
период синтеза ДНК ($) и премитотический период С, (рис. 4).
Разработанный ими прием опре-
деления временных параметров
митотического цикла, получивщий название «отсчет вспять»
(соипЕ до\п), впоследствии лег в
Рис. 4. Изображение митотического (клеточного) цикла,
принятое после открытия Го-
основу создания метода меченых
митозов.
вард и Пелка. М (митоз), С, 5,
С, — периоды цикла,
Несмотря на технические несовершенства, значение работ
Говард и Пелка трудно переоценить. Ими была установлена
дискретность репликации ДНК в митотическом цикле, опрокинуто представление об инертности клетки в интерфазе и тем
самым открыт путь к широкому экспериментальному изучению
происходящих в ней событий.
Здесь уместно сказать несколько слов об авторах этого
открытия. Альма Говард родилась в Монреале, окончила с
отличием университет Макгилла по кафедре генетики и была
награждена медалью за диссертационную работу о роли хромосомных изменений в развитии рака молочной железы у мышей.
Выйдя в 1939 году замуж за англичанина ирландского происхождения, она продолжила работу в радиобиологическом отделе Хаммерсмитовского госпиталя в Манчестере, где и познако-
милась со Стивеном Пелком (тефаном
Пельцем), эмигриро-
вавшим во время войны из Чехословакии в Англию. Пелк в то
время был занят изучением функции щитовидной железы с
помощью радиоактивного йода. Говард предложила Пелку совместно исследовать включение радиоактивного фосфора в
ДНК делящихся клеток мыши, однако проект оказался слишком дорогостоящим, и пришлось проводить опыты на корневой
меристеме фасоли. Так состоялось открытие клеточного цикла.
Можно лишь добавить, что оба автора этого удивительного
исследования были в высшей степени мужественными людьми.
Овдовев в 1947 году и оставшись одна с двумя детьми, Говард
вынуждена была буквально бороться за жизнь в тяжелые послевоенные
годы. А Пелк,
ютившийся
в крошечной
захламленной
лаборатории, по вечерам подрабатывал в качестве скрипача в
местном оркестре. По свидетельству коллег, он был хорошим
профессиональным музыкантом.
Открытие Говард и Пелка в полной мере можно отнести к
категории парадигм, которые автор этого понятия Теодор Кун
определяет как «признаваемое научным сообществом достижение, служащее в течение определенного времени основой
для его деятельности», иначе говоря, позволяющее ставить и
решать научные задачи. Парадигма отвечает двум требованиям. Она должна быть беспрецедентной (чтобы отсутствовали
конкурирующие модели) и открытой (чтобы новые поколения
исследователей могли находить в ее рамках нерешенные проблемы).
Беспрецедентность открытия Говард и Пелка состоит в том,
что они сместили акцент с изучаемого события как такового
{репликация ДНК)
на время его осуществления, создав для нас
не только азбуку клеточного цикла, но, по образному выражению
Мэзии
(Мала,
1978), также
его грамматику
и календарь.
Подобно тому, как историки придумали задним числом эпоху
Возрождения
или эпоху Просвещения,
Говард
и Пелк сумели
создать историю отдельно взятой клетки с ее периодами, хотя
границы между ними так же условны, как границы между
историческими эпохами.
Литература
Вильсон Э. — «Клетка»,
Биомедгиз,
1936.
Кун Д. — «Структура научных революций», М., Прогресс,
1975.
Мзэзия Д. — «Митоз и физиология клеточного деления» (ред. —Л.Н.Жинкин), М., ИЛ, 1963.
Энгельгардт В.А. — Вопр. философии, 1960, 49, 240-259.
Ргапке \/.М/. — Еиг. 7. Сей В:ю,, 1988, 47, 145-156.
Номага А., Рас $.В. — Негедипу, ЗиррИ.,
1953, 6, 261-273.
Мала О. — [п: «Се| КергодисНоп» (Ед. 5у Дикеп Е.В. еа|.), Асад. Ргезз,
МУ., 1978, р. 1-14.
ГЛАВА П. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ И КИНЕТИКА
КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
Метод радиоавтографии в изучении клеточного цикла
Открытие
Говард и Пелка
положило
начало учению
о кле-
точном цикле. Однако в полной мере значение полученных ими
результатов было оценено лишь позднее, когда они нашли
подтверждение в более точных радиоавтографических исследованиях с применением специфических предшественников ДНК.
Радиоавтография — один из основных количественных методов изучения метаболических процессов без нарушения целости
клетки
и клеточных
структур,
объединяющий
принципы
морфологического и биохимического анализов. Он позволяет
локализовать с помощью радиоактивных изотопов биохимические процессы, протекающие а клетках, и изучать таким образом
жизнедеятельность последних. Метод основан на введении в
исследуемый
объект
радиоактивного
метаболита
(«метки»)
и
выявлении места его включения путем фотографической регистрации излучения.
Наиболее крупные успехи в изучении клеточного цикла
были достигнуты благодаря использованию в радиоавтографии
слецифического предшественника ДНК — тимидина, меченного тритием. Тритий (3Н) — единственный радиоактивный изо-
топ водорода;
период его полураспала
равен приблизительно
12,5 г. Возникающие при распаде трития В-частицы обладают
малой энергией и как следствие — небольшой длиной пробега
в фотоэмульсии (1-2 мк). Практически это означает, что если в
исследуемом биологическом объекте два точечных источника
излучения отстоят друг от друга на 1 мк, то на автографе они
будут выявлены как два отдельных зерна фотоэмульсии.
Тимидин — один из четырех нуклеозидов, участвующих в
образовании полинуклеотидной структуры ДНК, который харак-
терен только для молекулы ДНК, вследствие чего он является ее
специфическим предшественником. Помимо избирательности в
отношении ДНК, к числу достоинств ЗН -тимидина как меченого
индикатора
относятся
его доступность
для
тканей,
быстрота
включения в структуры, синтезирующие ДНК, и кратковременное (не более нескольких минут) пребывание в свободном
состоянии в организме животных. Существенным обстоятельством является также стабильность образующейся метки, кото-
рая, как будет ясно из дальнейшего, может быть «разбавлена»
лишь в Ходе последовательных клеточных делений.
Основные приемы радиоавтографического анализа
клеточного цикла.
Принципы радиоавтографического анализа клеточного цикла были разработаны сотрудниками Брукхейвенской национальной лаборатории во главе с Квастлером (ОцазИег), а затем
расширены и дополнены многими исследователями.
Это направление в изучении регуляции клеточного цикла
стало самостоятельной научной дисциплиной, получившей на-
звание «кинетика клеточных популяций», или, сокращенно,
«клеточная кинетика». Она оказалась настолько плодотворной,
что позволила в сравнительно короткий срок не только сформулировать новые представления о структуре клеточного цикла,
но и успешно приступить к его анализу с помощью математического моделирования.
Основной вехой в развитии этого направления явилась
разработка метода меченых митозов с применением *Н-тимидина. Метод основан на тех же экспериментальных подходах,
которые были впервые описаны Говард и Пелком, использовавшими в качестве индикатора синтеза ДНК в клетках корневой
меристемы
фасоли
радиоактивный
фосфор.
При
введении
в
организм 3ЗН-тимидина в любой популяции мечеными оказываются лишь те клетки, которые в данный момент синтезируют
ДНК, то есть находятся в $-периоде клеточного цикла. Клетки,
находящиеся
в момент
введения
меченого
предшественника
ДНК в периодах С, и С, а также в митозе, соответственно не
содержат метки
(рис. 5).
Прололжительность периодов клеточного цикла можно
определить графически, регистрируя изменение процента меченых митозов в различные промежутки времени после однократной инъекции *Н-тимидина (рис. 6). В течение некоторого
времени после инъекции в митоз продолжают вступать немеченые клетки, которые в момент введения меченого предшественника
находились в периоде
С, Затем
в митоз
начинают
вступать меченые клетки, причем первыми входят те клетки,
которые были помечены в конце $-периода, а последними —
те, которые были помечены в его начале. Позже в митоз
начинают вступать немеченые клетки из периода С..
Рис. 5. Автограф культуры клеток китайского хомячка, меченных 3Нтимидином.
т.
100|--—
50|
На рис. 6 изоб-
т ———-— -
Е
--
————
5
о
т]
Рис. 6. Изменение процента меченых митозов в различные сроки после однократного введения в организм 3Н-тимидина. Гипотетический
случай, когда продолжительность каждого периода клеточного цикла постоянна для всех
клеток
популяции.
По
оси
абсцисс
—
время
после введения меченого индикатора, по оси
ординат — процент меченых митозов. Т — продолжительность
клеточного
цикла, 82? 1. 1, $?
®т —
продолжительность периодов С„, $ и митоза.
ражен идеальный
случай, когла продДОлЖИтТельность
каждого периода
митотического
цикла является постоянной величиной для всех клеток популяции.
При этом длительность 3-периода
равно отрезку прямой, соединяющей
точки, соответству-
ющие 50% меченых
митозов на восходящей и нисходящей частях первой
волны меченых
митозов. Однако
в реальных клеточных системах
кривые меченых
митозов
носят
107——т
т
т
т
$
05
|
несколько иной
характер (рис.7).
Вследствие варь-
\
3
е
до
оо
о
1
1
1
о | бо
ы
о
|.
р
]
о
ирования
дли-
0
5
КО
15
20
25
30
35
4
тельности периодов клеточного
цикла, увеличе-
Рис. 7. Изменение процента меченых митозов
в эпителии крипт подвздошной кишки мыши в
ние
процента
меченых митозов
(восходящая
различные часы после однократного введения *Н— ТИмидина (по данным Квастлера и Шерман). По
оси абсцисс — время (ч) после введения меченого
индикатора, по оси ординат — процент меченых
часть кривой)
митозов.
происходит медленнее, чем это предполагается в идеальном случае. Поэтому в.
реальных клеточных системах минимальная и средняя продолжительность периода С, различаются между собой, а нисходящая часть кривой меченых митозов оказывается более пологой,
и второй пик меченых митозов выглядит несколько «размы-`
тым», что иногда затрудняет установление продолжительности
всего клеточного цикла.
Для преодоления этих трудностей были разработаны приемы, позволяющие контролировать правильность определения
параметров клеточного цикла по кривой меченых митозов.
Критерием того, что разделились все клетки, находившиеся в
момент введения ЗН-тимидина в З-периоде, может служить
удвоение числа меченых клеток. В противоположность этому,
среднее число зерен серебра на клетку, напротив, должно
уменьшаться в два раза после каждого деления.
Метод меченых митозов остается и в наше время одним из
самых распространенных способов определения продолжительности периодов клеточного цикла. Со временем в него были
внесены уточнения, которые, однако не поколебали положенные в его основу принципы,
Наряду с методом меченых митозов, Квастлером (ОцазНег,
1960) были предложены уравнения, позволяющие определять
продолжительность периодов митотического цикла в клеточных системах, находящихся в так называемом стационарном
состоянии (см. главу У). В таких системах число клеток, поступающих за единицу времени влюбой период цикла, равно числу
клеток, выходящих из этого периода, а отношение числа клеток
п, В каком-либо периоде цикла к средней продолжительности
этого периода {есть величина постоянная и равная отношению
общего числа клеток М в митотическом цикле к его длительности Т:
пИв = соп$. = М/Т, откуда п/М = ИТ
Пользуясь этим уравнением, можно вычислить продолжительность любого периода цикла, в том числе 5-периода (15),
если известны индекс меченых клеток п/М и величина Т; точно
так же, зная продолжительность $-периода, можно определить
величину Т.
Вклад Квастлера в учение о клеточном цикле необычайно
велик. «Этому человеку клеточная кинетика обязана более, чем
кому-либо. В научном отношении он был идеально снаряжен,
чтобы
стать пионером
в данной
области»,
— пишет английский
исследователь Лен Ламертон в некрологе, посвященному Квастлеру.
Создатель метода меченых митозов и клеточной кинетики —
Генри Квастлер начинал свою карьеру как врач-рентгенолог
сначала в Вене, а потом в Албании. В 1937 году он эмигрировал
в США и продолжал практиковать там еще в течение нескольких лет. Участвуя в совместных радиобиологических исследованиях с сотрудниками Иллинойского университета, он понял,
что ему не хватает фундаментальных знаний, и самостоятельно
изучил математику и теоретическую физику, причем в такой
степени, что не только смог успещно применять их для решения
биологических проблем, но и опубликовал ряд крупных исследований в области теории информации, математической биологии и физики проникающих излучений.
Последние восемь лет жизни Квастлер проработал в Брукхейвенской лаборатории, где приступил к исследованиям по
кинетике клеточных популяций. Обладая мощным интеллектом
и большой внутренней силой, Квастлер привлекал к себе
многочисленных учеников. «Хотя его работы в области клеточной кинетики и легли в основу наших знаний о ней, — пишет
Ламертон, — едва ли не большее значение имело его личное
влияние. Он был руководителем, консультантом и другом многих исследователей из разных стран мира. Его доброжелательность, научная щедрость и широта кругозора не знали границ».
Квастлер ушел из жизни в [963 году в возрасте пятидесяти пяти
лет, покончив с собой после смерти жены.
Общие
закономерности прохождения клеточного цикла
и его периодов
Представление о клеточном цикле с течением лет претерпело
изменение. Вначале под клеточным циклом подразумевали весь
жизненный цикл клетки от момента ее возникновения до
гибели, включая периоды дифференцировки и другие физиологические состояния. Постепенно понятие клеточный цикл стали использовать только как синоним митотического, или пролиферативного цикла с его четырьмя периодами. Такое смещение понятий — нередкое явление в научной литературе. Оно
происходит непроизвольно и отражает развитие научной мысли, которая стремится выйти за рамки жестких определений.
Швейцер полагал, что отвлеченные категории затрудняют естественный ход мысли, подобно тому, как колеи на дорогах
сковывают движение.
В настоящее время клеточный цикл удобнее всего обозначить как интервал между завершением митоза в исходной
клетке и завершением митоза в ее дочерней клетке. Время,
необходимое для прохождения одного клеточного цикла, получило название времени генерации. В физиологическом отнощении клеточный цикл подразумевает последовательность хронологически связанных событий, происходящих в клетке как во
время подготовки к делению, так и в самом митозе.
Появление метода меченых митозов повлекло за собой в
полном смысле слова лавину исследований по кинетике клеточ-
ных популяций. Расцвет этих работ приходится на начало 60-х
годов, когда были получены многочисленные кривые меченых
митозов и определены параметры клеточных циклов в самых
разнообразных биологических системах, от низших эукариотов
до многоклеточных организмов — высших растений и животных.
Со временем было установлено, что суммарная длительность
периодов $, С, и митоза остается сравнительно постоянной, а
вариабельность клеточного цикла зависит, главным образом, от
Таблица
1. Продолжительность периода С, в тканях мыши
Ткань
Время (ч)
Опухоль Эрлиха
0,0
Эпителий
волосяных фолликулов
3.0
Эпителий
!2-перстной
кишки
4,5
Эпителий
подвздошной
кишки
9,5
Эпителий
роговицы
70,0
Эпидермис уха
528,0
продолжительности пресинтетического периода С, величина
которого может колебаться в разных тканях от нулевых значений до многих часов, а в некоторых случаях даже месяцев (табл.
1), что явно представлялось абсурдным. В данном случае резуль-
тат вступал
в противоречие
со здравым
смыслом,
а это, как
показывает научный опыт, нередко таит в себе зерно открытия.
Открытие действительно состоялось, и ему будет посвящена
следующая глава. Пока же достаточно сказать, что положение
стало проясняться, когда было установлено, что в отдельных
тканях может содержаться значительная доля клеток, которые
вообще не участвуют в митотическом цикле. Отношение пролиферирующих клеток к общему числу клеток в популяции
получило название фракции роста (Меп4е!зовп, 1960), или
пролиферативного пула (КляеезК ет а1., 1961).
При работе с культурами клеток пролиферативный
пул
обычно определяют по кривым насыщения. Если 3Н-тимидин
находится в непрерывном контакте с клетками в течение длительного времени, то в результате вступления новых порций
клеток в $-период индекс меченых клеток будет возрастать до
тех пор, пока все клетки, способные синтезировать ДНК, не
окажутся мечеными. Однако в целом организме 3Н-тимидин,
как уже было сказано, подвергается быстрому распаду и выведению. В связи с этим был предложен специальный прием
(КяеезК!
еЁ
а[.,
1961)
с использованием
частых
повторных
инъекций ?Н-тимидина с интервалами, меньшими чем длительность 5-периода, и на протяжении времени, превышающего
продолжительность всего клеточного цикла.
Применение методов клеточной кинетики позволило выявлять пролиферативный пул в динамике, что способствовало
зарождению новых идей, касающихся регуляции размножения
клеток. Стало очевидным, что события клеточного цикла не
охватывают всех возможных состояний клетки.
Литература
Епифанова О.И.,Терских В.В., Захаров А.Ф. — «Радиоавтография», М..,
ВШ,
1977.
КЖ чек \/.Е., Вазегеа В., 145со Н. — Аютргахх, 1961, 7, 81-85.
Мелде[5ойп М.Г. — 7. Мац. Сапсег Тпзе., 1960, 25, 485-500.
ОпазНег Н., — Апп. М.У. Асад. 5с1., 1960, 90, 580-591.
ОцазЧег Н., ЗНегтап М. — Ехр. Сей Вез., 1959, 17, 420-438.
ГЛАВА Ш. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ И СОСТОЯНИЕ
ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ПОКОЯ
Открытие периода С, (фазы «вне цикла»)
В 1963 году было впервые высказано предположение, что по
окончании митоза клетка не обязательно сразу же вступает в
пресинтетический период Са может выйти в состояние «вне
цикла», из которого при необходимости она вновь может
вступить в клеточный цикл под влиянием пролиферативного
стимула. К такому заключению пришли независимо друг от
друга Лайта (Тайфа, 1963) и Квастлер (ОчазИег, 1963), обозначившие это состояние
как период,
или фазу С, (рис. 8).
Открытие того, что клетки могут выходить из митотического
цикла и вновь возвращаться к пролиферации, имело, как будет
видно из дальнейшего, принципиальное значение для изучения
его регуляции. Однако при этом важно обратить внимание на
другое обстоятельство. Казалось бы, этот вывод напрашивался
сам собой. Ведь уже было известно, что во многих популяциях
лишь определенная фракция клеток проходит митотический
цикл. Более того, были разработаны приемы экспериментального определения пролиферативного пула. И тем не менее
многочисленные исследователи прошли мимо этого открытия.
Почему
же
так
получилось?
Мне
представляется,
что
в
значительной мере здесь повинна магия самих подсчетов и
расчетов — неожиданно открывшаяся возможность при помощи методов клеточной кинетики сравнительно легко измерять
временные параметры клеточного цикла. Но недаром у древних
была поговорка: исчисляемое еще не есть знание. От внимания
исследователей почему-то долгое время ускользало одно существенное логическое звено: если считать, что с увеличением
пролиферативного пула новые порции непролиферирующих
клеток вступают в клеточный цикл, следовательно раньше они
должны были выйти из него, а это, в свою очередь, означает, что
они
находились
вне
цикла.
Подобное
рассуждение
и легло
в
основу открытия Лайты и Квастлера. которое было сделано
полностью в соответствии с постулатом древневосточной философии о гармоничности мышления, «когда каждая рождающаяся мысль должна завершить свой ход, чтобы не оставлять
отбросов в бессознательном».
А
|
(1айва, 1963)
в, -- [6 — $ — =
Зозникновение
клетки
(ОцазЦег,
1963)
Время
генерации
Созревание
н
перемещенне
клеток
Рис. 8. Первые модели клеточного цикла, основанные на данных
клеточной кинетики и допускавшие возможность выхода клетки из
цикла. С’, 5, С, —- периоды
р — дифференцирующаяся
клеточного цикла, С, — фаза «вне цикла»,
клетка.
Что касается Квастлера, то он скорее интуитивно подошел к
заключению о возможности выхода клеток из митотического
цикла, опираясь на ранее высказанное предположение (Оча$Цег,
Зпегтап,
1959), что по окончании
митоза клетка должна
«при-
нять рещение», делиться ли ей снова или же переходить к
дифференцировке. Квастлер не успел развить эту идею, поскольку в 1963 году его уже не стало. Убедительные доводы
в пользу
представления о переходе клеток в фазу С, были сформулированы Лайтой, который по праву считается автором этого открытия.
Сын известного венгерского композитора — Ласло Лайта в
послевоенные годы приехал в Манчестер, где в радиобиологическом отделе Хаммерсмитовского госпиталя начал изучать
реакцию на облучение таких сложных систем, как костный мозг
и печень млекопитающих. Блестящий собеседник, полиглот,
эстет и меломан, Лайта легко натурализовался в Англии, где
прожил до конца своих дней. Он сделался членом престижных
клубов и легко мог предаться соблазнам светской жизни, если
бы не его пытливый ум, научное честолюбие и огромная
работоспособность.
Будучи
прекрасным
организатором,
он в
скором времени сам возглавил радиобиологический отдел и
направил усилия сотрудников на изучение клеточной кинетики
костного мозга и печени. Успех не заставил себя ждать. Именно
печень, отличающаяся низким уровнем пролиферации клеток в
обычных условиях, но быстро регенерирующая после частичной гепатэктомии, оказалась тем объектом, который позволил
экспериментально выявить период С,
Лайта аргументировал свое утверждение следующим образом. Что происходит в печени при восстановлении пролиферативной активности? Приблизительно через 15 час. после опера-
ции в гепатоцитах начинается синтез ДНК, который продолжается в течение 7-8 час. (рис. 9, Г). После короткого (2-3 час.)
периода С, клетки вступают в митоз (рис. 9, 2). Если бы в
клетках печени был очень длительный период С, (порядка
нескольких месяцев, как это следует из расчетов) и если бы он
просто сокращаялся до 15 час при регенерации, то должно было
бы наблюдаться немедленное увеличение числа клеток, синтезирующих ДНК (рис. 9, 3). На самом же деле перед началом
репликации ДНК всегда отмечается хорошо выраженный лагпериод (рис. 9, 1), указывающий на то, что клетки вообще не
были в цикле в момент стимуляции.
Наличие лаг-периода и кумулятивный характер кривых возрастания индекса меченых клеток и митотического индекса
типичны для индукции пролиферативных процессов. Не следуРис. 9. Последовательность событий в клетках
печени крысы после частичной гепатэктомии (по дан-
ным Лайты,
1964).
По оси абсцисс
— время после гепатэктомии (ч), по
—
оси ординат:
—
30
ДНК-синтезирующая активность (1, 3) и митотическая активность (2) (в условных
единицах}; 1, 2 — результаты, полученные экспериментально, 3 —
результат, ожидаемый в случае непрерывного прохождения клетками
регенерирующей печени «растянутого во времени» клеточного цикла.
ет конечно думать, что Лайта открыл само явление индукции
клеточного размножения. Вывод о гормональной регуляции
деления клеток в тканях-мишенях сформированного организма
был сделан ранее Суонном (5\апп, 1958), который сравнивал ее
с феноменом эмбриональной индукции, описанной еще Шпеманом. Однако именно Лайта сумел угадать по характеру поведения клеток, стимулированных к пролиферации под влиянием
митогена, их предшествующее состояние. Поэтому сего заключение о способности клеток переходить по окончании митоза в
фазу «вне цикла» получило всеобщее признание, а символ С,
стал неотъемлемой частью азбуки клеточного цикла.
Выявление клеток в периоде С, методами клеточной
кинетики
Особенности кинетики вступления стимулированных клеток в $-период (резкое увеличение индекса меченых клеток
после хорошо выраженного лаг-периода) позволяют с достаточной степенью уверенности судить о наличии в популяции
покоящихся
клеток (рис.
10).
Другим показателем присутствия клеток в периоде С, может
служить величина пролиферативного пула при насыщении
популяции *Н-тимидином. Однако при этом необходимо иметь
в виду возможные источники ошибок. Включение меченого
Рис.10.
рактер
вступление
80
Кумулятивный
кривой,
ха-
отражающей
в период
синтеза
ДНК лейкоцитов периферической крови человека после индукции пролиферации с помощью
фитогемагглютинина
(ФГА) (по данным МакКинни
и др., 1962).
зо
20
По
оси
абсцисс
—
время
после введения ФГА (ч), по оси
ординат — индекс меченных?Нтимидином клеток (%). ?Н-тимидин добавляли в среду за 2 ч
до фиксации клеток.
48
560
72
б
я
[::
36
тимидина всеми клетками еще не означает, что в популяции
отсутствуют непролиферирующие клетки. По мере увеличения
времени контакта клеток с изотопом пролиферативный пул
будет всегда стремиться к 100%, поскольку непролиферирующие клетки также будут включать метку, если длительность их
пребывания вне цикла окажется меныше продолжительности
контакта с ЗН-тимидином. Кроме того, фракция немеченых
клеток в динамике непрерывно разбавляется делящимися мечеными клетками и уменьшается вполовину после каждого удвоения размеров клеточной популяции, что также способствует
ассимптотическому стремлению индекса меченых клеток к
100%.
Поэтому
величину
пролиферативного
пула можно
рас-
сматривать как надежный показатель присутствия непролиферирующих клеток в популяции только в условиях относительно
длительного пребывания их вне цикла.
Метод меченых митозов позволяет выявлять наличие клеток
в периоде С, только лишь в тех случаях, когда происходит их
массовый выход из клеточного цикла. Именно такая картина
наблюдается
на заключительном этапе эмбриогенеза млекопи-
тающих, во время перехода организма от эмбрионального к
постнатальному развитию. Отсутствие второго подъема на кривой меченых митозов свидетельствует о выходе болышей части
клеток в фазу С, (рис.
11).
100
50
13
1%
202122
24
Рис.11. Выявление перехода клеток в период С, в процессе онтогенеза
(по данным
Жинкина,
1965).
По
оси
абсцисс
—
время
после
однократной инъекции 'Н-тимидина (ч), по оси ординат — процент
меченых митозов. | — теоретическая кривая меченых митозов по
Квастлеру;
2 — кривая меченых митозов в клетках подчелюстной
железы 15-дневного эмбриона крысы; 3 — кривая меченых
клетках поджелудочной железы новорожденной крысы.
митозов
в
Способность клеток выходить из цикла в периоде С,
Изучая пролиферацию клеток эпидермиса уха, Гелфант
(СеШапь 1963) обнаружил, что клетки могут задерживаться при
прохождении цикла как в периоде С, так и в периоде С,. Ему
удалось выявить небольшую фракцию эпидермальных клеток,
которые находились в периоде С, более двух суток и вступали в
митоз только после получения пролиферативного стимула (повреждение эпидермиса). Гелфант подразделил всю популяцию
непролиферирующих, но потенциально способных к размножению клеток эпидермиса уха мыши на две отдельные субпопуляции — С, и С,, соответственно периоду, в котором возникает
блок.
Одним из основных способов выявления клеток С,-популя-
ции может служить подсчет числа меченых и немеченых митозов на радиоавтографах в условиях непрерывной инкубации
клеток с *Н-тимидином. При этом клетки С,- популяции будут
вступать в митоз немечеными, поскольку они уже раньше
завершили синтез ДНК
(рис.
12).
Другим способом является параллельное определение митотического индекса и индекса меченых клеток в условиях стимуляции. Если увеличение числа митозов предшествует увеличению
числа
клеток,
синтезирующих
ДНК,
это означает,
что в
митоз вступают клетки, бывшие до стимуляции в периоде С..
Здесь наблюдается картина, прямо противоположная тому, что
5
&,
Рис.12. Выявление
С,-популяции клеток в
асцитном
раке
мыши
при действии антилимфоцитарной сыворотки
(по данным Де Коссе и
Гелфанта,
1968). До
введения
мышам
сыворотки
в течение 48 ч
инъецировали
ЗН-ти-
мидин с 4-часовыми
интервалами. Введение
сыворотки
отмечено
стрелкой. По оси абсцисс — время (ч) после
начала
введения
меченого
немеченых митозов.
индикатора,
по оси
ординат
| — контроль (без сыворотки),
—
2 — опыт.
процент
имеет место при стимуляции
сначала синтезируют ДНК,
клеток С,-популяции,
которые
а уже затем вступают в митоз.
Следует отметить, что при воздействии пролиферативного
стимула на клетки С,-популяции они вступают в митоз не сразу,
алишь по истечении определенного лаг-периода (Гайзи, Китига,
1985), что, как мы видели, характерно для клеток, получивших
стимул к пролиферации в периоде С, Подобная реакция на
пролиферативный стимул служит дополнительным признаком
того, что клетки способны выходить из цикла и в периоде С..
Представление о состоянии пролиферативного покоя
Следующим шагом в изучении клеток, находящихся вне
цикла, явилась попытка установить связь между данными
клеточной кинетики, выявляющими соотношение пролиферирующих и непролиферирующих клеток в популяции, и их
физиологическим статусом. Было сформулировано представление (Ерапоуа, ТегзюКВ, 1969) о пролиферативном покое как
особом физиологическом состоянии клетки, в котором она
может оставаться в течение неограниченного времени, не
пролиферируя, но полностью сохраняя жизнеспособность и
возможность вступления в цикл под влиянием адекватного
стимула. При этом клетки могут переходить в состояние покоя
как после окончания митоза, так и по завершении синтеза
ДНК. Для обозначения периодов покоя были предложены
символы В, (от англ. гез( — покой, соответствующий символу
С.) и К, (соответствующий понятию о С,-популяции), по-
скольку представлялось нецелесообразным использовать символы, применяемые в клеточной кинетике, для физиологической характеристики клеток (рис. 13).
Чередование периодов покоя иактивной пролиферации обеспе-
чивает контроль размножения клеток и их специализацию в
процессе индивидуального развития. Клетки, находящиеся в
состоянии пролиферативного покоя, могут (хотя и не обязательно) выполнять специфические функции в составе той или иной
ткани. Тем не менее и специализированные и неспециализированные покоящиеся клетки одинаково реагируют на митогенный
стимул,
побуждающий
их вступать в клеточный
цикл.
Однако
подобная реакция возможна лишь до определенного возрастного
предела в жизни клетки, после чего она может еще какое-то
время функционировать, но обречена на гибель (рис. 14).
Рис.13. Схема клеточного цикла, отражающая чередование периодов активной пролиферации (С, 5, С, и
М) и состояний пролиферативного покоя (К,
иВ,) (по Епифановой и
Терских,
1969).
2с —
количество ДНК, соответствующее диплоидному набору хромосом;
4с — удвоенное количество ДНК.
в
В физиологическом смысле понятие «вне цикла» предполагает, что при переходе в состояние пролиферативного покоя
клетка прекращает подготовку к митозу и соответственно теряет
некоторые фундаментальные свойства, присущие пролиферирующим клеткам.
1
Рис.14. Схема жизненного цикла соматических клеток высших
организмов, включающего в себя следующие события: митотический
(клеточный) цикл, периоды покоя, состояние специфического функционирования и гибель клетки. Обозначения те же, что и на рис.13.
Экспериментальные системы для изучения
покоящихся клеток
Специализированные клетки во взрослом многоклеточном организме различаются по своему пролиферативному
потенциалу. Их условную классификацию предложил в свое
время
выдающийся
канадский
гистолог Шарль Леблон
(1е]опа, 1964), который подразделил их на три основные
группы.
(1) Статичные, или непролиферирующие клетки, не размножающиеся при нормальных физиологических условиях. Типичными представителями этой категории клеток служат сегментоядерные лейкоциты, тучные клетки и эритроциты позвоночных. Хроматин в них до такой степени конденсирован, что это
практически исключает транскрипционную активность ядра.
Однако такие клетки сохраняют пролиферативный потенциал и
способны вступать в клеточный цикл в случае адекватного
митогенного стимула. К статичным клеткам относят также
миоциты и нейроны, хотя хроматин в них деконденсирован и
обладает транскрипционной активностью, что связано с выполнением клетками специфических функций в отсутствие пролиферации. При этом нейроны полностью утрачивают способность к размножению в постнатальном периоде развития организма.
(2) Растущие, или медленно пролиферирующие клетки,
отличающиеся низкой митотической активностью и незначительным уровнем гибели (лимфоциты, хондроциты, гепатоциты и др.). Такие клетки сохраняют способность к пролиферации при благоприятных для этого условиях. В частности, в
паренхиматозных клетках печени пролиферативный потенциал проявляется, как мы видели, после частичной гепатэктомии.
(3) Обновляющиеся
клеточные популяции, в которых
высокий уровень пролиферации уравновешивается гибелью
клеток. В этих клеточных популяциях основная масса вновь
образованных клеток мигрирует, специализируется, претерпевает терминальную дифференцировку и погибает. Примером таких популяций могут служить клетки гемопоэтической
системы, эпителиев, выстилающих полости органов, и эпидермиса. Стволовые клетки в обновляющихся популяциях
сохраняют на всем протяжении своей жизни пролифератив-
ный потенциал и способность к самоподдержанию и дифференцировке, восполняя таким образом клеточную потерю во
всей
популяции,
Из сказанного следует, что непосредственный анализ покоящихся клеток в тканях целого организма затруднен, поскольку
многие из них рассеяны среди пролиферирующих клеток и
практически не отличаются от них по морфологическим признакам. Стволовые клетки, которые пребывают в состоянии
покоя значительную часть своей жизни, составляют лишь неболыную долю в клеточных популяциях. Основная же масса
покоящихся клеток во взрослом организме выполняет многочисленные специфические функции.
Для преодоления этих трудностей успешно применяют
экспериментальный
прием,
заключающийся
в
митогенной
стимуляции покоящихся клеток с последующим анализом их
поведения в клеточном цикле. Наиболее распространенными
популяциями со стимулированным размножением клеток в
организме животных, помимо уже упоминавшихся гепатоцитов регенерирующей печени, служат клетки кроветворной
системы и эпителиальные клетки различных тканей, обработанных митогенами.
Широко используют в этих целях культуры животных
клеток, которые переводят в состояние пролиферативного
покоя путем увеличения клеточной плотности при многодневном культивировании, а также с помощью удаления из питательной среды сыворотки. В условиях высокой клеточной
плотности или истощения питательной среды число клеток в
популяции стабилизируется, и культуры переходят из экспоненциальной фазы роста в стационарную, отличающуюся
крайне низкими показателями уровня синтеза ДНК и митотической активности (рис. 15). При этом клетки остаются жизнеспособными в течение длительного времени, сохраняя пролиферативный потенциал.
Обычно подавляющая часть клеток стационарных культур
выходит из цикла по окончании митоза (период покоя В)).
Однако в некоторых клеточных популяциях неболышая часть
клеток
может
переходить
в период
покоя
В.
Эти
клетки
отличаются меньшей стабильностью и жизнеустойчивостью, по
сравнению с клетками в периоде В, и поэтому не годятся для
длительных наблюдений.
300
|
200 |
1
20 т
р
и
80
2
140
ыы
й
60
10,
430
ыы
3
20
й
30
2
20
й
р
[1
Рис.15.
3
8]
и
Характер
45
пролиферации
10
Л
20
25
культуры
клеток
при длительном
выращивании без смены среды. По оси абсцисс — время культивирования
клеток
(ч),
по
оси
ординат:
слева
—
общее
число
клеток
в
популяции (1), справа — индекс клеток, меченных 3Н-тимидином (2) и
митотический
Критика
индекс (3).
представлений
о клеточном цикле и состоянии
пролиферативного покоя
Несмотря на убедительность доводов Лайты, открывшего
фазу С, отдельные исследователи продолжали настаивать на
том, что клетки не выходят из цикла, а лишь замедленно
проходят период С, Они утверждали, что при непрерывном
контакте с 3Н-тимидином индекс меченых клеток в популяции
рано или поздно достигает 100%, а это означает, что все клетки
постепенно вступают в 5-период. Подобное возражение было
устранено после того, как выяснилось, что величина пролиферативного пула не всегда может служить надежным показателем
присутствия в популяции покоящихся клеток (см. стр. 33).
В 1973 году появилась статья Смита и Мартина (ЗтйВ,
Мат) с броским названием «Циклируют ли клетки?» Авторы
подвергли кардинальному пересмотру сложившееся со времени
работ Говард и Пелка представление о клеточном цикле с его
классическими четырьмя периодами и предложили собственную концепцию так называемого вероятностного перехода.
Согласно
их
модели,
клеточный
цикл
состоит
из двух
частей:
вероятностного состояния А, в котором клетки не пролиферируют, и детерминированной фазы В, включающей в себя периоды $, С, М и частично период С. Переход клеток из
состояния А в фазу В происходит случайно, иначе говоря все
клетки популяции имеют одинаковую вероятность вступления
в цикл, а митогенные стимуляторы лишь увеличивают эту
вероятность. В нормальных условиях клетки, вступившие в фазу
В, неизбежно должны разделиться. Модель однозначно постулировала, что контроль клеточного цикла существует исключительно на этапе А <> В ине зависит от предшествующей истории
клетки.
Гипотеза вероятностного перехода нашла многочисленных
приверженцев и оживила исследования в области клеточной
кинетики. Однако некоторые данные шли вразрез с ее постулатами. Так, стали появляться указания на зависимость продолжительности клеточного цикла от событий предыдущего цикла.
Была обнаружена также значительная
вариабельность фазы
В,
что свидетельствовало против ее жесткой детерминированности. Наконец, с помощью цейтраферной киносъемки отдельных
клеток в стационарной культуре фибробластов было установлено, что они обладают различной чувствительностью к митогенам и, следовательно, их шансы на вступление в цикл не
равновероятны
(ВтооК$ еЁ а|., 1984). Классическая
модель кле-
точного цикла устояла, и было окончательно признано, что
клетки могут выходить из цикла в особое состояние С, (см.
ВтооКкз$, ВзаЧе,
1988).
Особенности вступления покоящихся клеток
в митотический цикл.
Изучение клеточного цикла методами клеточной кинетики
доминировало в 60-х годах, но постепенно стало уступать место
ультраструктурным
и биохимическим
исследованиям
свойств
пролиферирующих и покоящихся клеток, подробному рассмотрению которых посвящена следующая глава. Начало биохимическому подходу было положено работами Базерги (Вазетра,
1968), который первым обратил внимание на то, что метаболи-
ческие процессы в непрерывно пролиферирующих клетках,
проходящих период С, по окончании митоза, отличаются от
процессов,
предшествующих
митогенной
стимуляции
началу
покоящихся
репликации
клеток.
ДНК
после
Оказалось,
что
стимулированным клеткам требуется болыне времени, чтобы
войти в $-период, чем непрерывно пролиферирующим клеткам.
Для обозначения отрезка времени между применением стимула
и началом синтеза ДНК Базерга предложил термин «пререпли-
кативный период» (рис. 16).
Продолжительность пререпликативного периода в животных клетках составляет‘от 10 до 24 час. Пролиферативный
стимул вызывает в клетках серию быстро протекающих множественных структурных и функциональных изменений — так
называемый плейотипический ответ. Ранний пререпликативный период характеризуется усилением транспорта низкомолекулярных веществ через наружную мембрану клетки и транзи-
торной активацией синтеза отдельных видов МРНК, и белков.
Эти изменения протекают в стимулированной клетке до определенного момента, получившего название «пункт ограничения» (гезийсИоп роте, пройдя который, клетка становится
необратимо комитированной к репликации ДНК (Рагдее, 1974).
ПРЕРЕПЛИКАТИВНЫЙ ПЕРИОД
ранний
поздний
Рис.16. Схематическое изображение событий, развертывающихся
при переходе клетки из состояния покоя (К) к пролиферации (Р). М —
митоз, С, — пресинтетический период, $ — период синтеза ДНК, гпункт — пункт ограничения, белые стрелки — плейотипический ответ
клетки на пролиферативный стимул (объяснения в тексте).
События позднего пререлликативного периода включают в себя
вторичное усиление общего синтеза РНК и белков, в том числе
образование инициаторов репликации ДНК. Попытки локализации пункта ограничения во времени не привели к однозначным результатам. Если рассматривать его как этап пререпликативного периода, после которого ингибитор пролиферации уже
не в состоянии воспрепятствовать прохождению клеточного
цикла и вступлению клетки в $-период, то скорее всего он
расположен в непосредственной близости от границы периодов
С.‚/5, что впрочем может варьировать для разных ингибиторов.
В 1974 году Аугенлихт и Базерга (АизепИсйе, Вазегра, 1974) в
опытах на диплоидных фибробластах человека обнаружили, что
чем долыше клетки находятся в состоянии покоя, тем больше
времени им требуется для прохождения пререпликативного
периода после стимуляции, причем уменьшается также фракция клеток, вступающих в 5-период. Авторы пришли к заключению, что популяция покоящихся клеток не является гомогенной, и что клетки могут «углубляться» в состояние покоя (см.
рис. 16). Со временем были выявлены и другие признаки
подобного углубления, в том числе изменение ряда метаболических характеристик, о чем пойдет речь в следующей главе.
Существенно, что клетки, вышедшие из цикла в период покоя
К,, также углубляются в это состояние по мере пребывания в
нем, о чем свидетельствует увеличение продолжительности лагпериода, предшествующего нарастанию митотической активности после стимуляции (Гайзи, Кипига, 1985).
Значение периодов пролиферативного покоя для
функционирования различных биологических систем
Способность клеток периодически прекращать пролиферативную активность лежит в основе различных физиологических состояний, связанных с наступлением пауз в развитии
организмов. Этим свойством обладают клетки самых разных
биологических объектов, независимо от уровня организации.
Такие явления, как образование бактериальных спор, инцистирование одноклеточных, покой семян у растений, паузы при
метаморфозе насекомых, зимняя спячка у млекопитающих и
многие другие процессы, возможны именно благодаря способности клеток переходить в состояние пролиферативного покоя, что можно считать одной из общих физиологических
характеристик живых существ (см. ЕрИапоуа, ТетзЮ\ЖН,
Иванов,
1969;
1974).
Вместе с тем необходимо отметить, что среди прокариотических и низших эукариотических организмов переход в состояние покоя в большей степени связан с необходимостью переживать неблагоприятные для размножения условия среды. У
многоклеточных же организмов этот переход начинает играть,
кроме того, сложную регуляторную роль.
Прежде всего, прекращение пролиферации клеток в тканях
многоклеточного организма создает предпосылки для выполнения ими специфических функций в соответствии с дифференцировкой, что может происходить как по окончании митоза
(переход
(переход
в состояние К,), так и по завершении синтеза ДНК
в состояние К,). Особое значение состояние покоя
имеет для функционирования стволовых клеток, которые, обладая неограниченной способностью к самоподдержанию, полностью сохраняют вто же время, с одной стороны, пролиферативный потенциал, а с другой — возможность образовывать функ-
ционально специализированные поколения клеток разной степени зрелости, как это происходит, в частности, при гемопоэзе.
Смена периодов покоя и активной пролиферации клеток
лежит также в основе координированного роста и регуляции
численности и размеров клеточных популяций в пределахткани
и органов. Филигранные исследования Жинкина и Самошкиной
(7нтЮт,
Зато$ИЮта,
1967)
показали,
что
в
процессе
разрастания децидуальной ткани матки во время беременности
клетки эпителия переходят в период С,, а по окончании
беременности
в С, переходят клетки
соединительной ткани.
Наконец, клетки, находящиеся в состоянии покоя, составляют регенерационный резерв ткани. При этом клетки в периоде
К, можно рассматривать как резерв быстрого регенерационного
ответа.
Литература
Жинкин Л.Н. — В кн: »Клеточная дифференцировка и индукционные
механизмы». 1965, М., Наука, с. 233-241.
Иванов В.Б. — «Клеточные основы роста растений». М., Наука,
АцвеписЬЕ Т.Н., Вазегра К. — Ехр. СеЙ Вез., 1974, 89, 255-262.
Вазегва К. — Се Т1зие Юпет., 1968, 1, 167-191.
ВтооКк$ К.Р., ЮсИтопа
Рнузо1.,
Е.М., В49е
1984, 121, 341-350.
Р.М., ЮснНтоп4
К.М.У.
1974.
— У. Сей
Вгоок$ К.Е., К4е
Р.М. — Г. Се! $с., 1988, 90, 601-612.
РеСоззе /.7., СеМаги $. — Заепсе, 1968, 162, 698-699.
ЕрИапоуа О.Т., ТегзюКН У.У. — Сей Т!5зие Ктее., 1969, 2, 75-93.
Гадка Г.С. — }. Сей. Сотр. РВуз1ю1., 1963, 143-145.
ТайНа Г.С. — Мефсте, 1964, 43, 625-633.
ГеМопа С.Р. — МаН Сапсег пя. МоповгарН.,
1964, 14, 119-145.
МасКппеу А.А., о тап Е., Вгеснег 9. — В\оод, 1962, 19, 349-358.
Раг4ее А.В. — Ргос. МаЦ Асад. $с1., ЧЗА, 1974, 71, 1286-1290.
ОцазИег Н. — [п: «Се РгоШегаЧоп», 1963 (Е4. Бу Г.Е. Татепопапа К./.М.
Бгу ), Охюга, ВЙасК\еИ, р. 18-36.
Зтий Т.А., Мапи Г. — Ргос. Май Асад. $с1. ОЗА, 1973, 70, 1263-1267.
Зее! С.С. — Пиет. ]. Кафа. В1оЁ., 1986, 49, 227-235.
З\апп М.М. — Сапсег Вез., 1958, 18, 1118-1160.
Гайзи Н., Кипига С. — 7. Сей. Рвузо|., 1985, 124, 177-181.
Яншкт 1.М., ЗатозНКза М.А. — /. Епз6гуо/. Ехр. Могрн., 1967, 17, 593605.
ГЛАВА ТУ. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ПОКОЙ —
ОСОБОЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ
КЛЕТКИ
Экспериментальные предпосылки изучения метаболизма
покоящихся клеток
Какмы уже видели, к началу 70-х годов наметилось усиление
интереса
к изучению
метаболизма
клеток в разных периодах
цикла, а также в состоянии пролиферативного покоя. Этому в
немалой степени способствовало то обстоятёльство, что пред-
метом изучения стали не только асинхронно делящиеся клеточные популяции тканей {#1 уло или же биологические объекты с
естественно синхронным делением клеток (как, например,
дробящиеся яйца животных, многоядерные плазмодии грибов,
корневые меристемы прорастающих растений и т.п.), но также
культуры клеток млекопитающих с искусственно синхронизированным прохождением клеточного цикла. Суть процесса
синхронизации заключается в воздействии на культивируемые
клетки биохимическим, механическим или температурным
фактором, препятствующим прохождению цикла, в результате
чего значительная часть клеток аккумулируется в каком-либо
определенном его периоде. После снятия ингибирующего воздействия клетки с большей или менышей степенью синхронности проходят следующие этапы цикла. Применение различных
приемов сихронизации в совокупности с использованием клеточных культур, стимулированных митогенами, позволило сопоставлять метаболические и структурные характеристики пролиферирующих и покоящихся клеток в культуре, что в конечном итоге привело к представлению о пролиферативном покое
как особом
физиологическом
состоянии
клетки.
Структура клеточной поверхности и транспортная функция
наружной мембраны
Клеточная
ции,
связанные
поверхность
с переходом
выполняет
покоящихся
две
основные
клеток
функ-
в митотичес-
кий цикл. Она воспринимает внеклеточные
налы и обеспечивает транспорт в клетку
‘митогенные сигнеобходимых ве-
ществ,
пролиферативно-
принимающих
го ответа.
участие
в инициации
С помощью сканирующей электронной микроскопии было
установлено, что на поверхности клеток, находящихся в экспоненциальной фазе роста, присутствуют многочисленные микроворсинки, в то время как при недостатке сыворотки или
повышении плотности клеточной популяции число ворсинок
снижается. Другим морфофункциональным признаком сглаживания микрорельефа клеточной поверхности в состоянии покоя
можно считать также отсутствие складчатости.
Структурные и конформационные изменения наружной (плазматической) мембраны покоящихся клеток включают в себя
агрегацию внутримембранных частиц, снижение текучести липидов, экспрессии антигенов, способности аглютинироваться
растительными лектинами и другие изменения, затрагивающие
ее функции таким образом, что мембрана становится в целом
более стабильной. Что это означает?
Известно, что мембраны животных клеток состоят на 60% из
белков и на 40% из липидов. Основным компонентом последних являются фосфолипиды (75-90%), остальную же часть
составляет холестерин. Уменынение содержания в клетке холестерина снижает текучесть липидов и усиливает связь фосфолипидов с мембранными белками, что способствует стабилизации
мембраны. Именно такая картина наблюдается при переходе
клеток в состояние покоя, причем уменьшается содержание не
только самого холестерина, но также и его предшественников.
Другим фактором, стабилизирующим мембрану, служит увеличение на поверхности покоящихся клеток серосодержащих
глюкозаминогликанов — основных углеводных компонентов
внеклеточного матрикса. Пролиферирующие клетки содержат в
своем составе большое количество гиалуроновой кислоты и
лишь незначительное количество гепарина (гепарансульфата),
но при переходе в состояние покоя гепарин становится одним
из основных компонентов поверхности (рис. 17). Гепарин и
другие полисахариды связывают ионы кальция и фиксируют
мембранные белки, способствуя стабилизации мембраны.
Олисанные изменения поверхности покоящихся
клеток
вызывают снижение проницаемости плазматической мембраны
для низкомолекулярных веществ: ионов, нуклеозидов, сахаров,
некоторых аминокислот и полиаминов. Таким образом, существует хорошо выраженная корреляция между пролиферативным статусом клетки и скоростью поступления в нее питатель-
Рис.17. Схема, иллюстрирующая
распределение
ионов
кальция и серосодержащих
глюкозаминогликанов в пролиферирующих (Р) и покоящихся
(К) клетках
1 — Са?*, 2 — гепарин, 3 — гиалуроновая
кислота,
о!
=
2
К
ных веществ. В то же время низкая скорость проникновения
молекул в клетку сама по себе не может служить причиной
прекращения пролиферации. Точно так же и раннее усиление
транспорта низкомолекулярных веществ в клетку после митогенной стимуляции (характерная составная часть плейотипического ответа), является хотя и обязательным, но не достаточным условием для вступления покоящейся клетки в цикл.
Структура и функции хроматина
Хроматин покоящихся клеток, как правило, отличается
высокой степенью конденсации, что свойственно как животным, так и растительным клеткам разного происхождения. Чем
дольше клетки пребывают в состоянии покоя, тем более конденсированным становится их хроматин.
С помощью ультрафиолетовой микроспектрофотометрии и
микрофлуориметрии было обнаружено увеличение температурной устойчивости хроматина покоящихся клеток. Данные хроматографии нуклеопротеидов показывают, что комплекс ДНКбелок может находиться в двух альтернативных состояниях —
релаксированном и стабилизированном — характерных соответственно для пролиферирующих и покоящихся клеток. При этом
способность хроматина связывать интеркалирующие красители
(акридиновый оранжевый и бромистый этидий), а также актиномицин В снижается при переходе клеток в состояние покоя.
Описанные свойства хроматина покоящихся клеток указывают на репрессированное в целом состояние генома;
` что
проявляется в низкой матричной активности хроматина и его
сниженной способности транскрибировать новые молекулы
РНК.
Следует,
однако,
иметь в виду, что инактивация
генома
далеко не всегда бывает полной, причем для каждого типа
клеток характерна определенная степень подавления активности ядра. Это происходит потому, что переход в состояние покоя
сопровождается, с одной стороны, инактивацией генов, продукты которых контролируют прохождение клеточного цикла,
а с другой, стороны, напротив, экспрессией генов, обеспечива-
ющих дифференцированное состояние клеток данного типа,
иначе говоря выполнение ими специализированных функций
(подробнее см. на стр. 36 и в главе [Х).
Синтез макромолекул
клетки, завершившие митоз, содержат вполо-
Покоящиеся
вину
меньше
РНК,
чем
пролиферирующие
клетки.
Одна
из
причин этого — снижение транскрипционной активности хроматина. В то же время степень изменения транскрипции отдельных
классов
РНК,
варьирует
в зависимости
от типа
клеток,
Необходимо также, принимать во внимание, что конечное
количество каждого класса РНК определяется координированной регуляцией нескольких событий, включающих в себя синтез предшественников РНК в ядре, их процессинг, перенос в
цитоплазму и деградацию. Эти события могут быть затронуты в
покоящихся клетках разных объектов лишь частично или же
избирательно, однако в конечном итоге всегда наблюдается
снижение
общего уровня образования
РНК.
Скорость синтеза белка в покоящихся клетках также в
несколько раз ниже, чем в пролиферирующих, что может
происходить вследствие уменынения количества цитоллазматической матричной РНК (мРНК) итранспортной РНК (тРНК),
ограниченного числа функционально активных рибосом, собранных в полисомы, а также изменениями трансляционного
аппарата: снижением
ми, замедлением
причинами.
скорости связывания
элонгации
мРНК
полипептидной
В функционирование
цепи
с рибосома-
и другими
белок-синтезирующего
ап-
парата вовлекается актиновый цитоскелет, который претерпевает реорганизацию в покоящихся клетках (ЗНезаКоуа ей 21.,
1993). Несмотря на то, что не каждый из перечисленных
процессов может затрагиваться при переходе клеток в состояние покоя, происходящие изменения в совокупности приводят
к двукратному снижению
в них общего
количества белка.
Метаболизм
Обновление макромолекул
покоящихся клеток характеризуется
повыше-
нием скорости обновления, или кругооборота ({игпоуег) макро-
молекул, включающего в себя процессы их деградации и ресинтеза.
Рибосомная РНК (рРНК) практически полностью стабильна
в активно пролиферирующих клетках и сравнительно быстро
обменивается в покоящихся (табл. 2). Более стабильна в проли-
ферирующих
кой мРНК,
клетках и ТРНК. Что касается цитоплазматичесто она не является стабильной
ни в пролифериру-
ющих, ни в покоящихся клетках, однако в последних она, как
правило, менее стабильна. Оценить это бывает иногда непросто
по причине наличия в различных типах клеток короткоживущих
и долгоживущих молекул мРНК. Долгоживущие мРНК,
сохра-
няющие матричную активность, могут участвовать в образовании белка, обеспечивая быстрый
ответ покоящихся
клеток на
митогенный стимул в случае длительного пребывания клеток в
состоянии пролиферативного покоя.
Скорость обновления
белка
в покоящихся
клетках также в
целом выше, чем во время пролиферации, хотя встречаются и
отклонения от этого правила, зависящие от типа клеток и
свойств отдельных белков. Причиной ускоренного обновления
белка может служить его быстрая деградация, однако в некоторых случаях отмечена одинаковая скорость распада белков в
Таблица 2. Время обновления РНК и белка в пролиферирующих
{Р) и покоящихся (К) клетках
Клетки
Макромолекулы
Клетки куриного эмбриона
РРНК
Период полужизни макромолекул (ч)
Р-клетки
В-клетки
Полностью стабильна
35-45
Фибробласты мыши 3Т6
-“--
60
Фибробласты хомячка ВНК
—‘"-
25
Фибробласты мыши ЗТб
ТРНК
60
%
Фибробласты мыши 3Т3
мРНК
18
6-7
Короткоживущие
29
и
Е-клетки
белки
Таблица 3. Скорость обновления макромолекул в пролифернрующих (Р) и покоящихся клеток (К) клетках (условные ед./мии)
Деградация вещества в К-клетках ускорена
Процесс
Клетки
синтез
Р
10
1
10%
К
5
5
100%
Деградация
вещества
в Ри
К-клетках
деградация
обновление
вещества
одинакова
Процесс
Клетки
синтез
деградация
обновление
вещества
Р
10
5
50%
В
5
5
100%
пролиферирующих и покоящихся клетках. Тем не менее обновление белков в состоянии покоя ускоряется. Простые примеры,
поясняющие, каким образом при снижении общей скорости
синтеза белка и разной степени его деградации может возрастать скорость его обновления, приведены в табл. 3. В отличие от
пролиферирующих клеток, которые используют новообразованные белки в основном для своих нужд (удвоение массы,
регуляторные функции ит.д.), покоящиеся клетки легко избавляются от синтезируемых белков, выделяя их, наряду с другими
продуктами метаболизма, в окружающую среду.
Появление в покоящихся клетках новых белков
При переходе клеток в состояние покоя изменяется не
только количественное содержание белков, но также и их
состав. Так, гистон Н1?® (субфракция хромосомного белка —
гистона Н1) обнаруживается преимущественно в покоящихся
клетках и быстро исчезает при действии митогенов. Нуклеосомы покоящихся клеток содержат также некоторые субфракции
гистонов (в частности,
состоянии покоя.
Н2А), которые синтезируются только в
В последние годы с помошью моноклональных антител в
покоящихся клетках выявлены белки, считающиеся их специфическими маркерами, поскольку они в обычных условиях не
встречаются в пролиферирующих клетках. К их числу относится статин — белок с мол. массой 57 кД, присутствующий в
нуклеоплазме и ядерной оболочке покоящихся фибробластов и
терминально дифференцированных кератиноцитов (о других
белках, в том числе регуляторных -— см. гл. Х).
Таким образом, несмотря на снижение общего количества
вырабатываемых макромолекул, при переходе клеток в состояние покоя в них начинают синтезироваться новые белки,
отсутствующие или встречающиеся в ничтожных количествах
во время прохождения клеточного цикла. Это позволяет заключить, что покоящимся клеткам присун особый метаболический
статус, проявляющийся в характерном для этого состояния
наборе синтезируемых молекул.
Активность.
Активность
ферментов аиаболизма и катаболизма
анаболических
ферментов,
катализирующих
образование макромолекул, значительно снижается при переходе клеток в состояние пролиферативного покоя. Это касается
в первую очередь всех основных ферментов, участвующих в
репликации ДНК. В покоящихся клетках самых разных типов
многократно снижается активность ДНК-полимеразы <, ответственной за 90% тотального синтеза ДНК,
и орнитиндекарбок-
силазы — фермента, катализирующего первый этап биосинтеза
полиаминов, связанный с началом пролиферации клеток. Отмечается снижение активности ферментов, участвующих в фосфорилировании пиримидиновых оснований, входящих в состав
ДНК Симидинкиназы и дезоксицитидинкиназы), и ферментов,
катализирующих
разрыв
и воссоединение
фосфодиэфирных
связей в молекуле ДНК (топоизомераз Ги П). Активность
ферментов, катализирующих метаболические пути образования
РНК и белков, в целом также существенно снижается при
переходе клеток в состояние покоя.
В противоположность этому, в покоящихся клетках наблюдается повышенная активность многих ферментов катаболизма
(табл. 4). Первые доказательства усиления такой
катаболичес-
кой активности были получены при исследовании лизосом —
органелл, участвующих в аутолизе клеток путем образования и
Таблица 4. Повышение актнвности ферментов катаболизма
в покоящихся клетках
Тип клеток
Фермент
Фибробласты человека
Гидролазы,
Фибробласты мыши ЗТЗ
Клетки мыши ЕМТб
Е-клетки
Клетки гепатомы Ройбера
Ацетилхол инэстераза.
с лизосомамн
катейясии
[в
Фенилаланиигидроксилаза
Клетки крысы РС12
Клетки гепатомы 3924
Ксенотрансплантаты карциномы
толстой кишки человека
Клетки китайского хомячка
Клетки печени крысы
Клетки НеГл
Диплоидные фибробласты
\![-38
Фибробласты мыши ЗТЗ
связанные
человека
Тирозингидроксилаза
Пиримидинпуклеозидазы
Пуриннуклеозилазы
Лактатдегидрогеназа
Дегидрогеназа цикла трикарбоновых
кислот
Кислая фосфатаза
--``-Фосфодиэстераза сСМР
Сериновая протеаза
выделения гидролитических ферментов. Оказалось, что культивируемые покоящиеся клетки содержат большое число аутофагических вакуолей, гидролитическая активность которых коррелирует с накоплением липидов. Увеличение активности лизосомных ферментов в покоящихся клетках может быть предотвращено добавлением
ингибиторов
синтеза белка,
что свиде-
тельствует об индукции их образования при переходе клеток в
состояние покоя. Имеются также данные об активации в покоящихся клетках других (нелизосомных) ферментов катаболизма
(см. табл. 4).
Пролиферативный покой — активное метаболическое
состояние клетки
Итак, мы видим, что клетки, перешедшие в состояние
пролиферативного покоя, отличаются весьма своеобразным
метаболическим статусом по сравнению с пролиферирующими
клетками
(табл. 5). С одной стороны,
их характеризует значи-
тельная метаболическая инертность, проявляющаяся в снижении притока питательных веществ через наружную мембрану,
конденсации хроматина и уменьшении количества вновь образуемых макромолекул. С другой стороны, в покоящихся клетках
Таблица
Снижение
мембраны
5. Метаболические
проницаемости
наружной
Конденсация хроматина, снижение его
матричной активности
особенности
покоящихся
Ускорение обновления
Повышение
клеток
РНК
и белка
активности ферментов
катаболизма
Уменьшение образования макромолекул
избирательно активируются отдельные метаболические процессы: ускоряется обновление макромолекул и повышается активность ферментов катаболизма.
Возникают следующие вопросы. Являются ли обнаруживаемые в покоящихся клетках активные метаболические процессы
характерными признаками состояния пролиферативного покоя
как такового, а не реакциями, предшествующими или сопутствующими возможной гибели клеток в отсутствие пролиферации? И, если справедливо первое предположение, то в чем
заключается биологический смысл подобной активации?
Прежде, чем попытаться ответить на эти вопросы, уместно
сделать небольшое отступление. В этической системе чаньбуддизма существует сложная категория «увей» — недеяние, что
обычно трактуется европейскими синологами как пассивность
и непричастность. Швейцер же усмотрел в этом понятии наивысшую, совершенную форму поведения субъекта, когда его
деятельность не нуждается в показной активности, а направлена
на достижение самой важной цели, хотя и скрыта от глаз
постороннего наблюдателя. Что же происходит с клеткой,
переходящей в состояние пролиферативного покоя? Налицо,
казалось бы, ее общая метаболическая инертность, однако при
ближайшем рассмотрении в ней можно увидеть признаки избирательной и целенаправленной активации отдельных процессов, назначением которых служит, как будет ясно из дальнейшего, поддержание жизнеспособности клетки в отсутствие
воспроизведения.
|
Это заключение иллюстрирует рис. 18, где условно изображен характер синтеза основных макромолекул в клетке, находящейся в различных состояниях. В пролиферирующих клетках
(А) на протяжении клеточного цикла происходит редупликация
ДНК, атакже удвоение количества РНК и белка. Но окончании
митоза содержание макромолекул в клетке возвращается к
Рис.18. Схема, иллюстрирующая условное соотношение в содержании ДНК (1), РНК (2) и белка (3) в клетках, находящихся в состоянии
пролиферации (А). покоя (Б) и несбалансированного роста (В).
исходному (Б). Если искусственно подавить синтез ДНК какимлибо ингибитором, не влияющим на образование РНК и белка
(В), то наблюдается явление так называемого несбалансирован-
ного роста, когда клетка аномально увеличивается в размерах и
затем погибает. В отличие от этого, покоящиеся клетки (Б)
активно предотвращают избыточное образование РНК и белка,
что поддерживает внутриклеточное содержание макромолекул в
состоянии равновесия, необходимого для жизнедеятельности
клетки.
На рис.
в несколько
19 соотношение тех же событий
другом
аспекте,
иллюстрирующим
представлено
способность
А
Рис.19. Схема,
иллюстрирующая
возможность длительного
пребы-
вания клеток в состоянии пролиферативного покоя: А — репродукция
клеток, Б — самоподдержание клеток без воспроизведения, В — гибель
клеток вследствие несбалансированного роста. Стрелками
обозначены
переходы клеток из одного состояния в другое; тонкими стрелками —
недостаток поступления питательных веществ извне, компенсируемый
частичной аутофагией.
покоящихся клеток (Б) компенсировать недостаток поступления питательных веществ извне путем частичной аутофагии,
вызываемой активацией гидролитических ферментов лизосомного аппарата.
Таким образом, если пролиферирующие клетки поддерживают себя посредством воспроизведения, то в покоящихся
клетках существует механизм самоподдержания без воспроизведения, препятствующий их гибели в неблагоприятных условиях и позволяющий им пребывать в состоянии покоя неограниченное время.
Теперь известно, что в покоящихся клетках активируются и
другие метаболические реакции, назначением которых служит,
помимо поддержания жизнеспособности, также и предотвращение возврата клетки к пролиферации. Одним из таких процессов можно считать уже упоминавшуюся аккумуляцию ионов
кальция на поверхности покоящихся клеток, являющуюся частью механизма стабилизации наружной мембраны с последующим снижением поступления питательных веществ в клетку,
утратой подвижности и прекращением пролиферации. Впрочем
необходимо помнить, что роль ионов кальция в метаболизме
клеток многообразна и не является специфической в инициации событий клеточного цикла. К этому вопросу мы еше
вернемся позднее.
При переходе клеток в состояние пролиферативного покоя
наблюдается повышение активности некоторых ферментов,
принимающих участие в модификации хроматина, в частности,
его деацетилировании, что снижает транскрипционную активность и в конечном итоге тормозит пролиферацию. Другим
примером может служить активация в покоящихся клетках
фермента поли(АОР-рибозо)-полимеразы, способной сшивать
молекулы гистона Н|, расположенные в межнуклеосомных
участках хроматина, и способствующей таким образом его
конденсации, что, как мы видели, характеризует состояние
покоя.
В поддержании состояния покоя существенную роль играет
также усиление реакций фосфорилирования белков с участием
сАМР-зависимых и сАМР-независимых протеинкиназ. На рис.
20 схематически изображено, каким образом сАМР-зависимая
протеинкиназа может препятствовать синтезу белка в культуре
фибробластов путем фосфорилирования ингибитора, функция
Рис.20.
Участие
сАМР-зависимых
протеинкиназ
в
поддержании
состояния покоя.
Активация
ингибитора
Активация
факторов инициации
трансляции Е!Е-2
ингибитора
фосфодиэстеразы
]
Увеличение
содержания
2`, 5`-олигоаденилата
|
Активация
|.
Гидролиз
РНКазы
|
РНК
Подавление синтеза белков
которого в фосфорилированном состоянии заключается в подавлении инициации процесса трансляции (левая часть рисунка}, а также воздействием на другие метаболические реакции
(правая часть рисунка).
Биологический смысл избирательной активации
метаболических процессов в состоянии пролиферативного
покоя
Как примирить две, казалось бы, противоположные тенденции в поведении клеток: с одной стороны, стремление к
непрерывному размножению, обеспечивающему «биологическое бессмертие», а с другой — способность на длительное время
прерывать пролиферацию?
Известно, что каждая отдельная клетка имеет ограниченную
продолжительность жизни и предел роста, но оба эти ограничения преодолеваются при делении исходной клетки с образованием двух новых. Вместе с тем, реальные клеточные системы
постоянно сталкиваются с воздействиями, неблагоприятными
для воспроизведения. Поэтому еще на раннем этапе эволюции
клеткам необходимо было выработать механизм, позволяющий
использовать благоприятные возможности для репродукции и
прерывать ее при неблагоприятных условиях. Эта задача была
решена таким образом, что каждая клетка приобрела способность находиться в двух состояниях — активной пролиферации
и пролиферативного покоя, когда она выходит из клеточного
никла, но полностью сохраняет жизнеспособность и пролиферативный потенциал.
|
Покоящиеся клетки становятся в целом более инертными в
метаболическом отношении, чем пролиферирующие. Переход в
состояние покоя у прокариотов и низших эукариотических
организмов нередко сопровождается формированием спор, цист
и подобных образований, благодаря чему клетки успешно
переносят неблагоприятные условия.
В то же время в покоящихся клетках избирательно активизируются отдельные метаболические реакции. Среди процессов, обеспечивающих жизнедеятельность покоящихся клеток,
особенно существенны повыщение скорости обновления макромолекул и активация ферментов катаболизма (табл. 6). Повышенная активность ферментов катаболизма обусловливает частичную аутофагию покоящейся клетки, компенсирующую недостаток поступления в нее питательных веществ. Ускоренное
обновление РНК и белков, наряду с возможностью экскреции
последних, препятствует несбалансированному росту и гибели
покоящихся клеток, а также обеспечивает их устойчивость к
внешним воздействиям за счет более активного разрушения
поврежденных молекул, которые менее стабильны, чем нормальные.
Избирательная активация отдельных метаболических процессов в состоянии пролиферативного покоя присуща как
низшим, так и высшим организмам и может рассматриваться
как единый принцип существования покоящихся клеток. Способность же клеток переходить в состояние покоя является, как
мы видели, общим свойством живых систем, приобретенным в
процессе эволюции.
Таблица 6. Поддержание жизнеспособности покоящихся клеток
Активация
Ускоренное
ферментов
катаболизма
обновление
>
макромолекул
Фосфорилирование
и деградация
белков
\
Разрушение
дефектных
молекул
Частичный аутолиз
Пополнение лула
предшественников
Экскреция белков
и полиаминов
Аккумуляция
липидов
|
<.
Постоянство количества
РНК и белка
Комленсация недостатка
питательных веществ
Постоянство объема
и массы
Быстрая реакция на
изменения окружающей
среды
Литература
Епифанова
О.И., Терских
В.В.,
Полуновский
В.А.
клетки», 1983, М., Наука.
Епифанова О.И., Терских В.В.,
Полуновский
В.А.
механизмы пролиферации
том 10, М., ВИНИТИ.
Завадская Е.В. — «Культура
1977, М., Наука.
клеток»,
востока
—
—
«Покоящиеся
«Регуляторные
1988, Итоги науки и техники,
в современном
западном
мире»,
ЭНезакома Е.А., Мои [.Р., СаугИоуа Г.Р. — СеН В!. Пиегп., 1993, 17,
417-421.
У’апЕ Е. — 7.Сей В1о1., 1985 а, 100, 545-551.
У!апё Е. — /.Се! Вю, 1985 6, 101, 1695-1701.
ГЛАВА У. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА.
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ (ЭКЗОГЕННЫЕ)
РЕГУЛЯТОРЫ
Общие принципы регулирования в живых системах
Следует подчеркнуть, Что назначение регуляторных механизмов клеточного цикла состоит не в регуляции прохождения
цикла как такового, а в том, чтобы обеспечить в конечном счете
безошибочность распределения наследственного материала в
процессе репродукции клеток. Поэтому целесообразно вначале
рассмотреть общие принципы регулирования в живых системах.
Вопрос этот имеет свою историю, которую важно знать хотя бы
в общих чертах, поскольку современные представления о регуляции клеточного цикла (а, если говорить шире, то о регуляции
размножения клеток в целом организме) возникли, естественно, не сами по себе, а как логическое развитие идей, высказанных выдающимися учеными задолго до нашего времени. Причем некоторые из ранее введенных понятий так прочно вошли
в научный лексикон, что ими и по сей день широко пользуются
в естествознании.
Все биологические образования характеризуются
наличием
более или менее сложной системы регуляторных механизмов,
обеспечивающих возможность их приспособления к изменяющимся условиям. В пределах живого организма можно выделить
различные уровни регуляции, складывающиеся в определенный
иерархический порядок регулирования. В упрощенном виде
такую схему регулирования изобразил известный биолог Науль
Вейсс (рис. 21). Смысл ее заключается в том, что она отражает
постоянное взаимодействие внутренних и внешних частей (компонентов) живой системы, представляющей собой единую сеть
регуляции, охватывающую и молекулярный, и надклеточный
уровни, а также окружающую организм среду. Проще говоря, на
всех уровнях системы действует один и тот же принцип регуляции.
Основным назначением совокупности регулирующих механизмов в живых объектах служит устранение или ограничение
действия
факторов
(шумов),
нарушающих
постоянство
внут-
ренней среды объекта. Понятие о постоянстве внутренней
среды организма ввел в биологии еще один гигант прошлого
Цитоплазма
Ткань
Организм
Среда
Рис.21. Схема возможных взаимодействий в организме,
живой системы с окружающей средой по Вейссу.
а также
столетия Клод Бернар в своих знаменитых «Лекциях о телесных
жидкостях» (1855-1856). Роль этого ученого в развитии физиологии поистине уникальна. Будучи уже всемирно известным
практикующим врачом — основателем блестящей школы физиотерапевтов, Клод Бернар неожиданно обратился к лабораторным исследованиям на животных, что потребовало от него
болыного
мужества
и немалых усилий. Он
плохо знал основы
биохимии и с трудом овладевал навыками препаративной работы. В то же время Бернар полагал, что ему повезло, так как он
мог продвигаться шаг за шагом, не будучи ничьим апологетом.
«Я был избавлен от необходимости следовать сумме принятых
знаний,
что
позволило
мне
прийти
взглядам на физиологические
к
совершенно
свежим
процессы», — признается он в
своих «Заметках»,
Результатом
явились
почти двадцатилетних
фундаментальные
открытия
печени — ее гликогенной функции
исследований
в области
Бернара
физиологии
и роли в глюконеогенезе.
Возглавляя кафедру физиологии животных в Сорбонне, Бернар
одновременно усиленно занимается ботаникой, стремясь проникнуть в общие закономерности живого. Так он постепенно
приходит к основополагающему заключению о постоянстве
внутренней среды организма. В своих последних трудах Бернар
предстает перед нами как мыслитель, стремящийся предостеречь начинающих исследователей от бесплодных усилий и
разочарований. «В начале своей научной карьеры, — пишет он
в трактате «Принципы», — я растрачивал время на теории и
химеры. Я воображал, что истина лежит внутри меня, и настойчиво повторял одни и те же опыты, но неизменно получал один
и тот же отрицательный ответ. Впоследствии я осознал, что
борьба
была
неравной,
и что законы
природы
не могут подчи-
няться моей воле. Я понял, что мы должны пользоваться
теориями только как фонарями для освещения дороги, отбрасывая их по мере исчерпания». Ко всему сказанному можно
добавить, что Клод Бернар оставил нам в наследство также
подлинный шедевр эпистолярного искусства — «Письма из
Божоле», адресованные его пациентке, жене состоятельного
иностранного коммерсанта.
Понадобилось ни много, ни мало семьдесят пять лет, чтобы
идеи Клода Бернара о принципах регуляции получили дальнейшее развитие в трудах крупных физиологов. В 1929 году
американский ученый Уолтер Кеннон — исследователь нейрогуморальных взаимодействий — предложил термин «гомеостаз», отражающий способность организма приспосабливаться
к изменяющимся
условиям
среды.
В 1930 году английским
физиологом Хиллом было ввелено другое важное понятие — о
стационарном состоянии (${еаду $(а{е) живых систем. С этим
понятием мы уже встречались при рассмотрении уравнений
Квастлера для изучения кинетики клеточных популяций (см.
главу Ц).
Развивая свои взгляды на регуляцию, и Кеннон и Хилл
исходили из представлений о том, что во внутренней среде
организма (или его части) не может быть и речи о простом
равновесии. Высокая степень постоянства среды, обеспечивающая ее устойчивое состояние, достигается утонченным балансом непрерывно протекающих динамических процессов. Назначением механизмов внутренней регуляции, иначе — авторегуляции служит не только поддержание постоянства среды, но
также непрерывное приспособление системы к изменению
внешних условий для обеспечения наиболее эффективной работы всех его элементов. Другими словами, само отклонение от
нормальной функции является стимулом к восстановлению
нарушенного состояния (функция <> отклонение).
Крупным достижением в развитии идеи авторегуляции явилось учение Селье (1936-1966) об адаптационном синдроме как
стереотипном защитном ответе организма на раздражители
самой разнообразной природы — стрессоры. Огромное значение имело также создание нашим выдающимся биологом М.М.
Завадовским теории обратных связей между органами, известной как «принцип плюс-минус взаимодействия». На примере
взаимодействия органов эндокринной системы Завадовский
открыл и экспериментально обосновал существование регуляции по принципу отрицательной обратной связи, распространив это положение на все звенья организма (1941). К сожалению, эта работа была напечатана малым тиражом в виде
небольшой брошюры в самом начале войны с Германией, ив
силу обстоятельств не могла получить должного резонанса.
Скорее всего, онатак и осталась неизвестной научному сообществу на западе. Автором же открытия регуляции по типу отри-
цательной обратной связи стал Норберт Винер, обосновавший
это положение в своей известной книге «Кибернетика» (1948).
Действие принципа отрицательной обратной связи удобно
рассмотреть на примере регуляции работы многоферментных
систем в клетке, как это сделал Кафиани (1962). На рис. 22
буквами А-Д обозначены продукты реакций, буквой Ф с индексами 1-4 — ферменты, катализирующие реакции. В простейшем
случае ферментная реакция тормозится в силу специфического
3
ДНК
—+ РНК
—*+
белки:
А
Ф,
Ф,
ГО
ЛА
Б
Ф,
ГО
В
г
Ф
|д
Рис.22. Регуляция ферментной системы по механизму отрицательной
обратной связи (по Кафиани, 1962). 1 — угнетение активности фермента
непосредственным продуктом его действия (продуктное угнетение); 2 —
угнетение конечным продуктом первого фермента цепочки (ретроингибирование);
3 — репрессия образования ферментной
системы.
угнетения активности фермента непосредственным продуктом
его действия (продуктное угнетение). Однако в целом ряде
случаев имеет место так называемое ретроингибирование, когда
конечный продукт подавляет активность первого фермента
цепи реакций.
Этот путь является
биологически
более выгод-
ным, поскольку он исключает возможность ненужного образования и накопления соединений на каждом этапе реакций.
Наконец, возможен такой способ регуляции, когда действие
конечного продукта направлено на угнетение, или репрессию
образования всей ферментной системы, иначе говоря, на гене-
тический аппарат клетки. Если в первых двух случаях речь идет
об изменении активности фермента, то в последнем случае
происходит регуляция количества его молекул, то есть налицо
иной уровень в иерархии регуляторных процессов. Подробнее
о принципах регуляции в живых системах см. в книге Епифановой «Гормоны и размножение клеток» (1965).
Понятие об экзогенных и эндогенных факторах регуляции
Мы помним, что в основе регуляции размножения клеток
лежит смена состояний активной пролиферации
и пролифера-
тивного покоя. Регуляторные факторы, контролирующие размножение
клеток,
могут
быть
условно
подразделены
на
две
главные группы: внеклеточные, или экзогенные, и внутриклеточные, или эндогенные. Экзогенные факторы находятся в
Рис. 23. Факторы, регулирующие размножение клеток: А — экзогенные (внеклеточные); Б — эндогенные (внутриклеточные).
Рис. 24. Взаимодействие экзогенных регуляторов в контроле клеточного размножения: А, Б, В, В` — аутокринный контроль, В``
паракринный контроль.
окружающей
клетку
среде
и взаимодействуют
с клеточной
поверхностью (рис. 23А). Соответственно, те факторы, которые
синтезируются самой клеткой и действуют внутри нее, относятся к энлогенным (рис. 23Б). Такое подразделение не исключает
возможности того, что некоторые факторы, будучи эндогенными по отношению к продуцирующим их клеткам, могут выходить из них и действовать на другие клетки как экзогенные
регуляторы
(рис. 24). Если регуляторные
факторы
взаимодей-
ствуют с теми же клетками, которые их вырабатывают, то такой
тип контроля носит название аутокринного. При паракринном
контроле синтез регуляторов всегда осуществляется другими
клетками.
Факторы роста и их участие в регуляции клеточного цикла
Поскольку в многоклеточном организме каждая клетка находится под влиянием больного числа самых разнообразных
факторов, регуляцию клеточного цикла удобнее изучать вне
организма, культивируя клетки в искусственных питательных
средах. Было замечено, что в этих условиях для нормального
размножения эукариотических клеток, помимо таких компонентов, как незаменимые аминокислоты, витамины и сахара,
необходимы также соединения полипептидной природы, стимулируюшие вступление клеток в цикл и его прохождение. Эти
соединения получили название факторов роста. При отсутствии
или недостатке факторов роста в питательной среде клетки
переходят в состояние пролиферативного покоя.
Для возникновения митогенного сигнала факторам роста нет
необходимости проникать в клетку. Каждый фактор роста взаимодействует с чувствительными по отношению к нему снецифическими рецепторами, расположенными на поверхности клетки,
вызывая модификацию структуры плазматической мембраны.
Вследствие этого, на внутренней поверхности мембраны возникают новые регуляторные сигналы, в передаче которых участвуют так называемые вторичные посредники (малые молекулы) и
группа специфических
протеинкиназ.
В результате происходит
активация факторов транскрипции и экспрессия генов пролиферативного ответа, что в конечном итоге инициирует репликацию
ДНК
и
вступление клетки в митоз. Более подробно эти процессы
будут рассмотрены в разделе, посвященном механизмам передачи митогенного сигнала.
В главе П уже было сказано, что стимулированные митогенами клетки проходят в пререпликативном периоде несколько
этапов, отличающихся по функциональным и метаболическим
характеристикам.
В 1977 году Плейджер
и соавторы (Р1едвег ©!
81.) обнаружили, что для прохождения пререпликативного периода
и инициации
синтеза ДНК,
как правило,
недостаточно
воздействовать на клетки каким-либо одним фактором роста.
Под влиянием первоначального воздействия клетки лишь приобретают компетентность к пролиферации, то есть становятся
чувствительными к новым воздействиям, от которых уже зависит их дальнейшая прогрессия в периоде С, завершающаяся
вступлением
в 5-период.
В соответствии
с этим,
все факторы
роста (как и другие регуляторы размножения) были подразделены на факторы компетентности и факторы прогрессии. Совместное действие нескольких факторов роста является одним из
наиболее общих принципов регуляции клеточного цикла у
многоклеточных организмов.
Прежде чем перейти к характеристике конкретных факторов
роста, следует отметить, что некоторые из них, будучи стимуляторами для одних типов клеток, ведут себя как ингибиторы но
отношению к другим. Более того, на особенности их воздействия (стимуляция или подавление пролиферации) могут влиять
условия культивирования клеток, а также присутствие в среде
других регуляторов.
Здесь
которых
мы
остановимся
в регуляции
только
на тех факторах
размножения
клеток
роста, роль
изучена
наиболее
Таблица 7. Основные полипептидные факторы роста, участвующие в регуляции
размножения
клеток
РОСЕ
ЕСЕ
Фактор роста из тромбоцитов
Эпидермальный фактор роста
РОЕ
Фактор роста фибробластов
1ОЕ-Г ($ С)
1ОЕ-И ($тА)
Инсулиноподобный
Инсулиноподобный
фактор роста | (соматомедии С)
фактор роста П (соматомедин А)
Та Ра
ТОРВ
Трансформирующие
факторы роста
1.-(1,2,3...)
Интерлейкины
С$Е-(1,2)
Факторы,
{1,2,3 ит.д.)
стимулирующие
рост
клеточных
колоний
подробно и которые чаще всего используются в экспериментальных исследованиях по данной проблеме. На самом же деле
число известных факторов роста давно превысило сотню, и
многие из них объединены в структурно и функционально
сходные семейства. Все они представляют собой полипептиды
с молекулярной массой в пределах 7-70 кД (табл. 7).
Фактор роста из тромбоцитов (РОСЕ)
Этому соединению (мол. масса 30 кД) посвящена, пожалуй,
самая большая литература, среди которой выделяются работы
шведских исследователей Хелдина и Вестермарка (Нет,
У\!ецегллатк, 1990 и др.). Освобождаясь при разрушении сосуди-
стой стенки, РОСЕ участвует в процессах тромбообразования и
заживления ран. В структурном отношении РОСЕ представляет
собой
основной
белок,
молекула
которого
состоит
из
двух
полипептидных цепей (субъединиц) А и В, кодируемых отдель-
ными генами. Субъединицы А и В образуются путем ограниченного протеолиза молекул-предшественников. Обнаружены три
изоформы молекулы РОСЕ: гомодимеры А-А и В-В и гетеродимер А-В, цепочки которых соединены дисульфидными мостиками (рис. 25). Эти изоформы различаются в функциональном
отношении. Дело в том, что рецепторы РОСЕ также представляют собой димерные молекулы, обозначаемые как сс, ВВ и “В.
Оказалось, что субъединица В молекулы РОСЕ способна связы-
ваться с обеими субъединицами рецептора — © и В, в то время
как субъединица А связывается только с субъединицей а (рис.
26). Отсюда следует, что максимальное насыщение рецелторов
РОСЕ, иначе говоря, наибольшая митогенная стимуляция достигается при использовании
изоформы
В-В.
Молекупы-предшественники
РОСЕ
протеолиз
В
дисульфидные
связи
А
Н
гетеродимер
гомодимеры
Рис.25. Образование трех изоформ
димерной
молекулы
РОСЕ.
ТЯ
9
Рис.26. Связывание
изоформ
[0
[02
В
ВВ
РОСЕ с димерными
рецепторами.
В
ранее
упомянутой
работе
Плейджера
и соавторов
было
показано, что РОСЕ является мощным фактором компетентности для покоящихся фибробластов, а функцию факторов про-
грессии выполняют компоненты плазмы, не связанные с тромбоцитами (такие, как незаменимые аминокислоты, эпидермальный фактор роста, инсулин). В дальнейшем оказалось, что
изоформа РОСЕА-А может выполнять только функцию фактора
компетентности,
в то
время
как
изоформы
А-В
и
В-В
способны
в значительной
мере обеспечивать
как компетент-
ность,
и прогрессию.
Естественно,
РОСЕ
так
что
не
может
служить фактором компетентности для всех типов клеток, о чем
речь пойдет ниже.
Эпидермальный фактор роста (ЕСЕ), фактор роста
фибробластов (ЕСЕ) и инсулиноподобные факторы
роста (1СЕ)
ЕСЕ был выделен в 1972 году из подчелюстных желез мыши
в лаборатории Стенли Коэна (см. СоПеп, 1987), но не сразу
привлек к себе всеобщее внимание, поскольку Коэн предпочел
досконально изучить его свойства, не прибегая к предварительным публикациям. В результате исследователи получили готовый, всесторонне охарактеризованный регулятор клеточного
цикла, с которым можно было уверенно работать, а Коэн был
удостоен
в 1986
году
Нобелевской
премии.
«Меня
настолько
никто не принимал всерьез и не проявлял никакого интереса к
моей
работе,
что я был
полностью
свободен
целиком», — сказал он в своей Нобелевской
и мог отдаться
ей
речи.
В настоящее время ЕСЕ изучен не менее обстоятельно, чем
РОСЕ,
и широко
используется
при
исследовании
регуляции
размножения клеток, особенно на этапе передачи митогенного
сигнала. Ему посвящена общирная литература, в том числе
монография
Никольского
и соавторов (1987). Мол. масса ЕСЕ
составляет около 6 кД и характерной особенностью его молекулы является высокое содержание тирозина. Для фибробластов
мыши, обработанных РОСЕ, ЕСЕ выполняет роль фактора
прогрессии, точно так же, как и для хондроцитов, приобретающих компетентность под влиянием инсулиноподобных факторов роста. Впрочем известны случаи, когда клетки (например,
эмбриональные клетки крысы линии
в присутствии только одного ЕСЁЕ.
ЕЁ)
могут размножаться
Семейство факторов роста фибробластов включает в себя
близкие по составу кислый (аЕСР) и щелочной (ЪЕСЁЕ) факторы, которые были выделены из экстрактов клеток головного
мозга и гипофиза в лаборатории Господаровича (Созродаго\/сг
ег а!., 1986}. Оба соединения могут выполнять роль факторов
компетентности при воздействии на фибробласты и другие
клетки мезенхимного происхождения или же обеспечивать
прогрессию при стимуляции хондроцитов инсулиноподобными
факторами роста. В экспериментах ЕСЕ обычно используют в
сочетании с другими регуляторами размножения клеток. В
организме он принимает участие в процессе ангиогенеза, стимулируя рост и развитие эндотелия.
Семейство инсулиноподобных факторов роста (1СР), которые называют также соматомединами ($11), включает в себя два
полипептида — 02-1 ($т-С) и 1СЕ-И ($т-А). Оба они имеют
близкую по значению мол. массу (-7 кД), сходный аминокислотный состав и образуются из более крупных молекул путем
протеолиза. К этой же группе относят и инсулин, который однако
стимулирует размножение культивируемых клеток лишь в концентрациях, значительно превышающих физиологические. При
этом он способен взаимодействовать не только со своими собственными рецепторами, но и с рецепторами к 1ОЕ-Т. Что
касается регуляции клеточного цикла, то, как мы уже видели,
представители семейства ТСЁЕ могут выполнять роль факторов
компетентности или прогрессии, в зависимости от типа клеток.
Трансформирующие
факторы роста (ТСЕ).
Трансформирующие факторы роста исходно получили свое
название вследствие способности стимулировать в мягком агаре
рост некоторых клеточных линий, зависимых от прикрепления
к субстрату. В последующем оказалось, что их функция в клетке
значительно многообразнее, а два из них — ТОЕРа и ТОЕВ
принимают непосредственное участие в регуляции клеточного
цикла. Особенно это касается ТО ЕВ, считающегося в настоящее
время одним из ключевых регуляторов механизма размножения
клеток.
ТСЕа был впервые получен из кондиционированной среды,
в которой выращивали клетки, трансформированные вирусом
саркомы мыши. Он обнаруживается также в болыних количествах в эмбриональных клетках млекопитающих. Характерно,
что молекула ТСРа близка по своей аминокислотной последовательности
молекуле
ЕСЕ,
и оба фактора
взаимодействуют с
одними и теми же рецепторами. При этом аффинность взаимодействия ТОЕс, к рецептору выше, по сравнению с ЕСЕ.
Семейство ТС ЕВ объединяеттри изоформы молекулы: гомодимеры ТСЕШ и ТСЕВ2, а также гетеродимер ТСЕВ1.2 (мол.
масса -25 кД). Своеобразие ТСЕВ заключается в том, что он
обнаруживается в самых различных тканях, выполняя при этом
двоякую роль — стимулятора размножения клеток мезенхимного происхождения, в том числе фибробластов, и ингибитора
размножения эпителиальных клеток. Мультифункциональная
роль ТОЕВ будет более подробно освещена в разделе о взаимодействии стимуляторов и ингибиторов клеточной пролиферации.
Интерлейкины (П.) и факторы, стимулирующие рост
клеточных колоний (С5Е)
Эту группу факторов роста объединяет не первичная струк-
тура, а общая функциональная направленность — участие в
реакциях клеточного иммунитета и кроветворения, где они
могут выступать и как стимуляторы, и как ингибиторы размножения
и
дифференцировки
лимфоцитов
на
разных
этапах
иммунного ответа. Поэтому они получили название лимфокинов (см. обзор: Смит, 1990).
На рис. 27 представлена схема взаимодействия
терлейкинов
в иммунном
организм чужеродной
разных
ин-
ответе клеток на проникновение
молекулы
— антигена.
Клетки
в
иммунной
системы — макрофаги выделяют интерлейкин 1 ([1.-1)}, одна из
функций которого заключается в стимуляции образования предшественников В-лимфоцитов в костном мозге. Для полного
иммунного ответа необходимо подключение вырабатываемых в
тимусе Т-лимфоцитов. Другая функция П-- [| состоит в стимуляции размножения Т-лимфоцитов, активированных антигенами
(так называемых Т-хелперов), секретирующих ключевой лимфокин П-2, который непосредственно стимулирует пролифе-
рацию цитотоксических Т-клеток, уничтожающих зараженные
клетки.
В настоящее время насчитывается около двадцати различных
лимфокинов. Некоторые из них охарактеризованы достаточно
полно, другие изучены менее подробно, но все они выполняют
Макрофаги
(у-1
0.-2
Предшественники
Ь-лимфоцитов
Стимуляция
——>
клеточной
пролиферации
Рецепторы
р
антигенов
Т-лимфоциты
В-лимфоциты
(костный мозг)
(тимус)
(
Тохелиеры
активированные
антигенами)
Цитоксические
клетки
Антитела одной
специфичности
Рис.27. Схема взаимодействия
клеток {объяснение в тексте).
интерлейкинов
в иммунном
ответе
определенные функции в иммунном ответе и в процессе кроветворения. Так,
Ш.-3 секретируется активированными
Т-хелпе-
рами и стимулирует пролиферацию и созревание предшественников лимфоцитов и других кроветворных клеток, в связи с чем
его называют мульти-СЗЕ.
К. группе СЕ
относятся
гликопро-
теиды С$Е-|, стимулирующий дифференцировку макрофагов,
и С5Е-2, действующий на предшественники макрофагов и
гранулоцитов. Т-хелперы вырабатывают также 1-4 — белок с
мол. массой 13 кД, стимулирующий пролиферацию Т-лимфо-
цитов и тучных клеток, а цитотоксичные Т-лимфоциты секретируют П--5 (мол. масса 12,3 кД), стимулирующий пролиферацию и дифференцировку предшественников В-лимфоцитов.
В некоторых случаях лимфокины
могут действовать и как
ингибиторы пролиферативных процессов. Показано, что 1.-]
подавляет рост эндотелия, выступая как антагонист ЕСЕ, а 1-
6, вырабатываемый фибробластами, с одной стороны, стимулирует размножение гепатоцитов, а с другой — подавляет пролиферацию
клеток меланомы.
Литература
Епифанова О.И. — «Гормоны и размиожение клеток», М,. Наука, 1965.
Завадовский М.М. — «Противоречивое взаимодействие между органами
в теле развивающегося животного», М., 194].
Кафиани К.А. — Успёхи биол. химии, 1963, 5, 100-150.
Никольский Н.Н., Сорокин А.Д., Соркин А.Б. — «Эпидермальный
фактор роста», Л., Наука, 1987.
Смит К.А. — В мире науки, 1990, М5, 16-24.
СоКеп
$. — 1п Уйшюо,
1987, 23, 239-246.
Созродаго\с2 О., Мец
1986, 46, 187-204.
С., Зспмввегег [.. — Мо]. Сей. Епдосйпо!,,
Нет
В. — Сей Кеви!ацоп,
С.-Н., \Уемегтатк
1990,
1, 555-556.
Но|тез Е.1.. — «Сане Вегпаг4 апд Апита! Свепеиу», Нагуага Упмуегзйу
Ргезз, Мазз.,
1974.
Р/едрег \/.1., ЗШе$ С.О., Апютадез Н.М., ЗсНег С.0. — Ргос. Ма Асад.
Зс1. ОЗА, 1977, 74, 4481-4485.
ГЛАВА УТ. ПЕРЕДАЧА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ
МИТОГЕННЫХ СИГНАЛОВ В ЯДРО
Рецепторы факторов роста. Мембранные белки
и вторичные посредники
При взаимодействии с чувствительными к ним клетками
экзогенные факторы роста в первую очередь соприкасаются с
клеточной поверхностью.
схематически изображены
Происходящие
на рис. 28.
при
этом
события
Первая реакция клетки на воздействие факторов роста
состоит в их связывании со специфическими рецепторами (по
образному выражению
ся в плазматической
компонентов
Берриджа,
мембране.
мембраны,
«антеннами»), находящими-
Их назначение,
как и других
о которых будет идти речь в дальней-
шем, заключается в преобразовании внешних сигналов во
внутриклеточные. В настоящее время существует обширная
литература, посвященная строению и функциям рецепторов
различных факторов роста, и здесь будут рассмотрены лишь те
аспекты вопроса, которые необходимы
для понимания принципа передачи в клетку митогенного сигнала.
Рецепторы
полипептидных
факторов
роста
представляют
собой преимущественно интегральные мембранные гликопротеиды. Их домены, способные связывать лиганды, расположены
на внешней стороне плазматической мембраны, а эффекторные
домены
находятся
на ее внутренней,
цитоплазматической
по-
верхности. После связывания факторов роста с рецепторами
образовавшиеся лиганд-ренепторные комплексы группируются
в кластеры на внутренней поверхности мембраны и затем
подвергаются интернализации по механизму типа эндоцитоза и
разрушению с участием лизосом. Число рецепторов на поверхности клетки определяется скоростью интернализации комплексов, возвращением части освободившихся’ от лигандов рецепторов на поверхность клетки и синтезом рецепторов &е поуо.
В результате связывания факторов роста с рецепторами их
цитоплазматические домены приобретают способность фосфо-
рилировать определенные белки по тирозиновым остаткам.
Протеинкиназная активность рецепторов увеличивается в результате их аутофосфорилирования, как это, например, показано для рецепторов ЕСЕ и РЬСЕ.
Плазматическая
мембрана
С
РАС
з
Рецептор
Фосфорилирование по
остаткам тирозина
Протеинкиназа С
Фосфорилирование
по остаткам серина
и треонина
Факторы транскрипции
Экспрессия "ранних" генов
Рис.28. Схематическое изображение передачи митогенного сигнала в
ядро. С — С-белки, РИС — фосфолипаза С, Р|-4,5-Р,— фосфатидилинозит-4,5-дифосфат, АС — диацилглицерин, ПР, — трифосфоинозит.
Тем временем в плазматической мембране обеспечивается
дальнейший процесс передачи информации с участием цепочки
мембранных белков, последовательно взаимодействующих друг
с другом. Подобное взаимодействие вызывает конформационную
перестройку
каждого
слелующего
изменение его структуры и функции.
Элементы, получающие информацию
в
цепочке
белка
—
от первого звена —
рецептора поверхности, представляют собой мембранные бел-
ки, активирующиеся при связывании гуанозинтрифосфата (СТР)
и расщеплении его до гуанозиндифосфата (СОР). Эти белки,
получившие название С-белков, были открыты и подробно
изучены Гилманом (ОИтап) и соавторами (США), удостоенны-
ми за эти исслелования Нобелевской премии (см. Вагпез, 1986).
Активированные С-белки взаимодействуют со следующим эле-
ментом цепочки — так называемым усилительным ферментом
фосфолипазой С, которая расшепляет мембранный фосфолипид — фосфатидилинозит-4,5-дифосфат (Р1-4,5-Р.) на диацилглицерин (РАС) и трифосфоинозит (ТР.), превращая таким
образом молекулы вещжества-предшественника в молекулы-посредники, или «вторичные мессенджеры». При этом АС и ТР,
могут оставаться на внутренней стороне мембраны (см. обзор:
Каап, УИШагиз, 1997).
Дальнейшие события развертываются в цитоплазме. РАС
активирует Са?*- и фосфолипидзависимую
протеинкиназу
С,
которая, осуществляя фосфорилирование белков по остаткам
серина и треонина, посылает сигналы в ядро, а ГР, стимулирует
мобилизацию кальция из внутриклеточных депо, что усиливает
реакции фосфорилирования, а также активирует транспорт Са?*+
через наружную мембрану клетки.
Эти столь очевидные теперь процессы, которые можно
записать с помощью нескольких символов и стрелок, явились
плодом десятилетних усилий и поисков представителей разных
стран, в первую очередь, лабораторий, возглавляемых Берриджем (Веги4ве, США), Мичеллом
кой (№15 тика, Япония).
Описанный
(М!спе!й, Англия)
и Нишизу-
путь передачи митогенного сигнала характерен
для многих факторов роста, в частности, для РОСЕ. Однако
расщепление Р1-4,5-Р,на РАС и ТР, не является обязательным
условием передачи сигнала. Известно, например, что ЕСЁ не
способствует накоплению ТР, и слабо мобилизует Са?* из внутриклеточных депо. В то же время он активно участвует в
гидролизе фосфатидилхолина с образованием ПАС, что косвен-
но
приводит
случаях при
к активации
воздействии
протеинкиназы
С. В
митогенов содержание
некоторых
ТР, возрастает
за счет фосфорилирования его предшественников с помощью
фермента трифосфоинозит(Р1-З)киназы
и протекает без учас-
тия фосфолипазы С и последующего гидролиза Р1-4,5-Р.. Наряду с фосфолипазой С, в качестве усилительного фермента,
активируемого О-белками, функционирует также аденилатциклаза, которая превразкает аденозинтрифосфат (АТР) в циклический аденозинмонофосфат (сАМР), участвующий в много-
численных
внутриклеточных
дифференцировке
клеток.
событиях
при
размножении
и
На отдельных этапах в процесс передачи митогенного сигнала в ядро включаются метаболические реакции, протекающие
по принципу обратной связи, что может усиливать или ослаблять сигнал. Таким образом, регуляционные возможности клетки в этом плане в высшей степени многообразны.
МАР-киназы и каскад их фосфорилирования
Как уже было сказано в предыдущем разделе, в результате
связывания факторов роста с рецепторами последние приобретают
способность
фосфорилировать
белки
по
тирозиновым
остаткам. В начале 90-х годов было установлено, что такими
белками являются преимущественно протеинкиназы, которые,
будучи активированы митогенами, вызывают каскад последовательного
фосфорилирования
протеинкиназ
как
по тирозино-
вым остаткам, так и по остаткам серина и треонина, причем
процесс может переключаться с одних остатков на другие (см.
рис. 28). Эти протеинкиназы получили название МАР-киназ
(плКореп-асиужеЯ ргоеп К!лазез) или ЕВК (ежгасе!шаг-ярпа|гевша{еа К!пазез). Они представляют собой семейство белков с
мол. массой 44 кД (ЕККГ) и 42 кд (ЕКК2). Возможность их
двоякого (4иа[) действия оказалась необычайно важным свойством для передачи митогенного сигнала в ядро, поскольку при
этом активируются не только сами МАР-киназы, но также и
факторы транскрипции, являющиеся их субстратами. Факторами транскрипции считаются ядерные регуляторы, вызывающие
экспрессию линейно расположенных генов, в том числе генов
пролиферативного ответа. Следует особо отметить большой
вклад, который внесли в эту область исследования работы
Биохимического центра в Ницце, возглавляемого Пюисегюром
(Роцуззёриг; см. ВгопдеЦо е{ а1., 1997, а также обзоры Февег,
КтеБз, 1995 и \МазЮеуист, Соорет, 1995).
Активация факторов транскрипции происходит, как правило,
в ядре,
причем
МАР-киназы
способны
проникать
в ядро
только в фосфорилированном виде. Однако в некоторых случаях факторы транскрипции могут пребывать в латентном состоянии в цитоплазме, где и происходит их активация, после чего
они уже сами перемешаются
в ядро (Капт,
Нимег,
1995). Весь
процесс передачи митогенного сигнала от момента взаимодействия фактора роста с рецептором до начала экспрессии генов
пролиферативного ответа занимает 8-10 минут.
Гены пролиферативного ответа. Протоонкогены
В литературе нередко встречается такое понятие как «гены
клеточного цикла». Эти гены весьма многочисленны, поскольку
кодируемые ими белки регулируют прохождение разных этапов
цикла. Естественно, что в центре внимания оказались гены,
экспрессия которых происходит при переходе клетки от состояния покоя к пролиферации, то есть в момент ее вступления в
цикл. Такие гены получили название генов раннего пролиферативного ответа, или «самых ранних» генов (тте Че еайу
вепез), в отличие от «поздних» генов, которые экспрессируются
в пререпликативном периоде на границе периодов С‚/5. «Ранние › гены включают в себя довольно обширное семейство, куда
входят некоторые протоонкогены, а также другие гены. Изучение их экспрессии осуществляется с помошью современных
методов молекулярной биологии и генной инженерии, таких
как блотгибридизанция мРНК с ДНК-пробами; прямая трансфекция генов или их участков в клетки путем встраивания
конструированных плазмид в ДНК; микроинъекции продуктов
активности генов и антител против этих продуктов с последующей иммунофлуоресценцией и других приемов.
В последние два десятилетия детально изучены многочисленные гены вирусов, функция которых связана с неопластической трансформацией клеток. Они получили название вирусных онкогенов (у-онс). В дальнейшем было установлено, что
нормальные клетки позвоночных животных и других организмов содержат целые семейства эволюционно консервативных
генов, ДНК которых сходна по нуклеотидной последовательности с ДНК вирусных онкогенов. Эти консервативные гены
потенциально способны трансформировать клетки, однако не
проявляют свою способность в обычных условиях. Они называются клеточными онкогенами (с-олс), или протоонкогенами,
поскольку было показано клеточное происхождение вирусных
онкогенов.
Исследование протоонкогенов проводится путем анализа
продуктов их активности — онкобелков. В табл. 8 представлены
данные о функциях наиболее хорошо изученных онкобелков,
участвующих в регуляции событий клеточного цикла. Названия
конкретных протоонкогенов обычно соответствуют первым
буквам или сокращенным обозначениям опухоли, вызываемой
гомологичным онкогеном вируса (например, ген 55 — произ-
Таблица 8. Протоонкогены н онкобелки в клеточном цикле
Протоокоген
565
Онкобелок
Идентичен
В-цепи
молекулы
Максимальная
|Одинакова на протяжении
РОСЕ
клеточного цикла
<
га5
гар
15
ит
Тирозинкиназа (усеченный
рецептор ЕСЕ)
С-белок (р21)
Серин/треонинкиназа
Связан с ядерным _матриксом
""
--
тус
те
де
тув
И
С;/$
егь В
водное от Этап
экспрессия
Граница С;/$
Ди"
Ранний пререпликативный
период (15-20О мин)
-
(1- 2)
и$
$агсота; ген еб В — от егугоазюта;
гау —
от шабдотуозагсогпа и т.п.).
Продукт гена 55 практически идентичен субъединице В
молекулы фактора роста из тромбоцитов — РОСРЕ. Обнаруже-
ние этого породило в начале 80-х годов очередные надежды на
скорое решение проблемы рака, что вылилось в настоящую
гонку за приоритет открытия между лабораториями Уотерфилда
(УУжмете!4) из Института раковых исследований в Лондоне и
Дулитла (БооШ@е) из Национальных институтов здоровья в
Бетесде, США,
вплоть до опубликования предварительных
данных в газетах. К сожалению, большие надежды не оправдались, но все же было установлено, что клетки могут секретировать онкобелок, кодируемый геном 515, в окружающую среду и
таким образом стимулировать размножение клеток, имеющих
рецепторы
к РОСЕ.
Ген е’БВ, является наиболее изученным представителем
целой группы протоонкогенов (в том числе генов пеи, гоз, /тх и
КП), которые объединяет то, что их продукты представляют
собой
тирозинкиназы,
гомологичные
по аминокислотной
пос-
ледовательности рецепторам эпидермального фактора роста,
локализованным в наружной мембране. В частности, продукт
‘гена ег.В можно считать усеченным рецептором эпидермального фактора роста, соответствующим его внутреннему домену.
Продукт протоонкогена 5*с -тирозинкиназа, также расположенная в плазматической мембране, осуществляет фосфорилирование предшественников фосфатидилинозит-4,5-дифосфата, уча-
ствуя в общем процессе передачи митогенного сигнала.
Семейство протоонкогенов га включает в себя несколько
близких по первичной структуре генов, гомологичных онкогенам вирусов рабдомиосаркомы мыши Кирстена (К1-га5) и Харви
(На-га5), а также онкогены, выделенные из клеток нейробластомы (М-га5) и карциномы мочевого пузыря человека (Е/]-га$).
Продукт генов газ — белок р21 локализован на внутренней,
поверхности плазматической мембраны и может быть отнесен
к группе С-белков, участвующих в регуляции активности фос-фолипазы С и аденилатциклазы при взаимодействии факторо’‘;
роста с рецепторами. Экспрессия гена газ осуществляется пре-имущественно в конце периода С, однако функция кодируемого им белка не ограничивается участием в инициации синтез:
ДНК.
Как
мы
видели,
он
служит
одним
из звеньев
в цепи
передачи митогенного сигнала и должен присутствовать
клетке при инициации событий следующего цикла.
\
Другим, нижерасположенным (4о\уп$Неат) звеном в переда.
че сигнала является продукт одного из группы протоонкогено
га} — серин/треонинкиназа Кай, активируемая непосредствен -
но белком р21/95, который был ранее активирован вышераспс ложенным (ирягеат) звеном цепи передачи — ферменто:л
тирозинкиназой,
представляющей
собой
внутреннюю
часть
рецептора фактора роста, расположенную в плазматическо 1
мембране. Ка, в свою очередь, фосфорилирует и активируег
нижерасположенную МАР-киназу, способную к двоякому фос форилированию по остаткам тирозина и серина/треонина (сз
называют МЕК — шиореп-асНуже4 ежгасеПаг $1епа|!-гершае 1
ЮКтазе). Функция МЕК заключается в фосфорилировании ЕВК!
и ЕВК2, которые только в таком виде проникают в ядро, г.г
сами фосфорилируют факторы транскрипции и вызывают экс прессию генов раннего пролиферативного ответа. Указанный
процесс схематически представлен на рис. 29. При этом следу'т
иметь в виду, что белки, кодируемые протоонкогенами гаи га,
участвуют в митогенной стимуляции только в случае определе! ного (умеренного) уровня своей активности, в то время как в
условиях их интенсивной активации наблюдается торможение
пролиферативных процессов.
Ядерная локализация белков, кодируемых протоонкогенами
Лозип, тус и туб, сразу же позволила высказать предположени:з,
которое в дальнейшем подтвердилось, об их участии в регуляции
перехода покоящихся клеток к размножению. Особое внимание
Экспрессия
Рис.29. Передача сигнала от тирозинкиназ в ядро с последующей
экспрессией генов раннего пролиферативного ответа (объяснения в тексте).
привлекают к себе гены /05, лип и тус, поскольку их экспрессия
относится к ранним событиям после воздействия на клетки
митогенов. Иногда их объединяют под общим названием «семей-
ство генов компетентности» или «семейство ранних генов».
Белок, кодируемый геном /ю05, представляет собой фосфопро-
теид с мол. массой 55 кД. Экспрессия генаЮх резко увеличивается уже через 15-20 мин после стимуляции клеток митогенами.
Для него характерна транзиторность экспрессии. Образующиеся при этом молекулы мРНК и белка деградируют уже через 40
мин после воздействия. Кроме того, ген /05 образует путем
прямого стерического взаимодействия гетеродимерный транс-
крипционный
онкобелок ип
комплекс с геном /ин, продукт которого —
подавляет транскрипционную активность гена
125 (классический пример ингибирования по принципу обратной связи). Особенностью гена Лох является плейотропность
‘регуляции его экспрессии. Помимо митогенов, он реагирует на
разнообразные факторы, вызывающие дифференцировку клеток и другие биологические реакции посредством активации
новых генов и кодируемых ими белков, выполняя функцию
«главного переключателя»
(тазег з\п).
и
Ваз
Цитоплазма
Рецептор
х —_
2 Тирознн.
КаГ
киназный
домен
Рис.30. Активация экспрессии протоонкогена с-/05 с участием фак-
торов транскрипции по Карину и Хантеру, 1995 (объяснения в тексте).
Активация
экспрессии
гена 5
в ядре
происходит следую-
щим образом (рис.
30). ЕКК усиленно фосфорилирует фактор
транскрипции
(етагу
ТСЕ
сотрех
#стог),
который,
взаимо-
действуя с белком 5ВЕ (зегит гезропзе Гасфог, мол. масса 67 кД),
связывается с участком молекулы ДНК, называемым ЗВЕ (зегит
тезропзе е]етеп® и расположенным в области промотора гена
Ло5, что включает транскрипционный процесс (Тге1зтап, 1995).
Нротоонкоген с-тус является самым распространенным
представителем семейства генов тус. Продукт его активности —
ядерный фосфопротеид с мол. массой 65 кД, способный связы-
ваться с ДНК
и вызывать трансактивацию других генов, дей-
ствуя как фактор транскрипции. В покоящихся клетках обычнс
наблюдается крайне низкий уровень гена тус, что определяется
как снижением интенсивности его транскрипции, так и ускорением
посттранскрипционной деградации
мРНК.
Подобно
он-
когенам /05 и/ин, тус относится к генам раннего пролифератив-
ного ответа, но максимум его экспрессии наблюдается позже —
через 1-2 ч после стимуляции клеток митогеном. Его экспрессия
транзиторна, однако несколько продолжительнее, чем у гена /о5.
Несмотря на отчетливую временную последовательность активации генов /05//ип и тус
в ответ на пролиферативный стимул,
причинная связь, а также взаимозависимость этих событий не
установлены, и их регуляция, по-видимому, осуществляется
различными путями. Опыты с прямой инъекцией гена тус в
ядра животных клеток показали, что он может действовать как
фактор компетентности, заменяя собой РООСЕ. При этом повы-
шение его экспрессии не является достаточным условием для
реализации всех событий периода С, и перехода клеток к
репликации ДНК. В то же время кодируемый геном тус белок
рб5 используется клеткой на разных этапах цикла, в том числе
в 5-периоде и на границе периодов
5/С,. Продукт протоонко-
гена туфтакже относится к категории трансактиваторов генома.
Максимальная экспрессия гена туб отмечена на границе пери-
одов С,/5.
Наряду с этим, в процессе раннего пролиферативного ответа
происходит экспрессия многих генов, не относящихся к протоонкогенам. Они носят произвольные обозначения
(УЕ, КС, ЛВ,
р1р92 и др.), и их участие в событиях клеточного цикла досконально не изучено.
Из всего сказанного следует, что протоонкогены являются
частью контроля нормального клеточного размножения. На
разных этапах последовательной передачи митогенного сигнала
в ядро преимущественную роль играет функция того или иного
протоонкогена. В ответ на сигнал в ядре уже через несколько
минут происходит экспрессия «ранних» генов пролиферативного ответа, функция которых состоит в формировании состояния
компетентности клетки к дальнейшим пролиферативным событиям. Под влиянием факторов прогрессии происходит экспрессия «поздних» генов, контролирующих прохождение клетками
пререпликативного периода и вступление в $-период.
Продукты активности «поздних» генов носят название белков-инициаторов, или индукторов репликации ДНК, и каждый
из них играет определенную
роль в этом сложном
Среди данной группы белков
себе РСМА (ргоШеганте се!
особое
пибеаг
процессе.
внимание привлекает к
апИреп), который, как
теперь известно, служит одним из ключевых элементов регуля-
ции клеточного цикла. РСМА представляет собой кислый
ядерный белок с мол. массой около 30 кД. Его ген локализован
в 20-й хромосоме человека и экспрессируется через 16-18 ч
после воздействия на клетки митогеном. РСМА является 5кофактором ДНК-полимеразы и принимает непосредственное
участие в инициации синтеза ДНК. Его роль в регуляции
событий клеточного цикла будет освещена подробно в главе Х.
Литература
Вагпез Р.М. — Зоепсе,
1986, 234, 286-288.
Веги4ре М.7. — ВюЕззауз, 1995, 17, 491-499.
Вгопдео }.-М., Вгипе А., РопуззЕрмг )., МсКепие
Б.К. — Г. В1о|. Свет.
1997, 272, 1368-1376.
Каип
М., Нимег Т. —
Сите
В!1.,
1995, 5, 747-757.
Каап М., \ИШатез В.Г. — Зет. Сей ету. В1о., 1997, 8, 287-296.
Миевей
В.Н. — СеН Састит,
1982, 3, 429-440.
Мвытика У. — Заепсе, 1992, 258, 607-614.
Зерег К., Кгебз Е.С. — ЕАЗЕВ
7. 1995, 9, 726-735.
Тге1зтап К. — ЕМВО }., 1995, 14, 4905-4913.
У’а$Кеулс?2 А.]., Соорег Т.А. — Сшг.
Орт.
Се
В1.,
1995, 7, 798-805.
ГЛАВА УП. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ
(ЭНДОГЕННЫЕ) РЕГУЛЯТОРЫ КЛЕТОЧНОГО
ЦИКЛА
Пересмотр представлений о клеточном цикле и состоянии
пролиферативного покоя
Анализ путей передачи экзогенных сигналов в ядро так
поглотил внимание ученых, что эндогенные факторы, регулирующие прохождение клеточного цикла, на длительное время
остались вне поля их зрения. Как ни удивительно, побудили к
изучению этого вопроса работы, казалось бы, далекие, от
основного русла исследований клеточного цикла, но неожиданно поставившие под сомнение всю его концепцию и даже само
это понятие.
Первая группа исследований связана с разработкой методов
соматической гибридизации клеток млекопитающих, иначе
говоря, их слиянием
в культуре. На них мы подробнее остано-
вимся несколько позже. Вторая линия работ представляет собой
анализ поведения так называемых температурочувствительных
мутантов клеточного цикла. Основоположником этого направления считается американский исследователь Хартуэл (Напу\ей,
1976). Температурочувствительные мутанты размножаются при
культивировании только в условиях определенной (пермиссивной) температуры, но прекрашают прохождение клеточного
цикла после изменения температуры на непермиссивную. В
настоящее время описано большое число мутантов с генетическими дефектами по разным процессам в клеточном цикле,
многие из них — с дефектами по прохождению пререпликативного периода после митогенной стимуляции.
Принципиально важными в плане изучения регуляции клеточного цикла явились опыты, выполненные в лаборатории
Прескотта (Тл5Кау, Ргезсоц, 1978) на культуре клеток китайского
хомячка \79-8; у клеток этой линии отсутствует в клеточном
цикле
период С, и их обозначают
как клетки
С’. Оказалось,
что, ухудшая условия культивирования путем обеднения питательной среды, можно получить мутантную линию, клетки
которой проходят период С (клетки С"); однако при слиянии
между собой клеток С' и С, всегда доминирует фенотип С, (рис.
31). Наосновании этого был сделан вывод, что наличие периода
ГАЗИ
5
дб
М,
$
р
ки
Рис.31. Характеристиклеток Су — линии
\79-8 по данным Лиске и
-
+
С.
С.
+
С.
х
+
С.
—>»
—
С.
_
—>
Прескотта. ‘ М, . $, з В, 2 —
периоды клеточного цик-
С,
ла; Ст — клетки, у которых отсутствует период С,
в цикле;
—
4
циклогексилид
+
С.
С*—
клетки,
у
которых существует период С, в цикле; Ст (ри С
(П) — клетки,
у которых
появляется период С, при разных условиях культивирования; Х — знак
слияния клеток.
С, в клеточном цикле является следствием генетического дефекта. В пользу подобного соображения говорили также результаты опытов, в которых производили слияние между собой
клеток С, полученных путем создания различных дефектов
(недостаток сыворотки, изъятие из среды незаменимых аминокислот ит.п,). В таких случаях происходила комплементация, то
есть дефекты устранялись, и вновь возникал фенотип С’.
Подавление синтеза белка с помощью циклогексимида, напротив, вызывало появление фенотипа ©7. Исходя из совокупности
проведенных исследований, авторы пришли к заключению
принципиального характера, а именно, что в периоде С; клеточного цикла эукариотов клетка не несет никаких специфических
функций, и этот период возникает лишь в том случае, если
отсутствуют нормальные условия размножения клеток.
Универсальная модель размножения клеток
К заключению об отсутствии периода С’, в клеточном цикле
пришел также Купер (Соорег, 1979), который предложил уни-
версальную модель размножения клеток для всех прокариотических и эукариотических организмов, или модель «континуума» (рис. 32). В основу модели было положено допущение, чтс
в каждой клетке непрерывно синтезируется некий инициато[
белковой
Синтез ДНК
начинается
как только дости-
гается пороговая концентрация
инициатора.
Клетка проходит
периоды
природы.
$ и С ‚ (у бактерий они обозначаются буквами Си
О).
а затем вступает в митоз при любом уровне инициатора. Согласно модели Купера, митоз лишь завершает начавшийся процесс,
$(С)
6, (0) |
м
Рис.32. Универсальная модель размножения клеток Купера (модель
«континуума»). | — инициатор синтеза ДНК, 5(С) — период сиитеза
ДНК, С, (0) — премитотический период, М — митоз.
но сам ничего в дальнейшем не обусловливает, и для следующего раунда синтеза ДНК вновь требуется достижение нужного
порога инициатора. Любые воздействия, препятствующие этому событию, должны неизбежно вызывать появление в клеточном цикле периода С, который является, таким образом,
следствием дефектов, связанных с ухудшением условий роста,
а период С, (иначе говоря, состояние покоя) возникает, по
мнению Купера, в результате еще больших дефектов.
Благодаря своей простоте, универсальная модель снискала
на первых порах немало приверженцев. Однако постепенно
выяснилось, что ни одно из ее основных требований не соответствует результатам, полученным на клетках высших эукариотов.
Помимо частных противоречий, подробно рассмотренных в
более ранних публикациях (Епифанова и др., 1988), существенным недостатком модели является невозможность объяснить с
ее позиций избирательную активацию отдельных метаболических процессов при переходе клеток в состояние покоя, в первую
очередь, синтез новых специфических белков (см. главу ПУ).
Кроме того, как теперь стало известно, именно в митозе,
которому Купер отводил роль лишь завершающего этапа в
процессе деления клетки, начинается активация МАР-киназ
для следующего клеточного цикла, а также преобразование и
транспорт при участии веретена деления некоторых ключевых
белков-регуляторов. Наконец, переход клеток к репликации
ДНК, который Купер связывал с повышением до необходимого
уровня внутриклеточной концентрации инициатора, то есть
эндогенного стимулятора пролиферации, можно в равной мере
объяснить снижением концентрации эндогенного ингибитора
пролиферации. Иными словами, правомерно представить себе
по меныней мере два типа эндогенного контроля вступления
покоящихся клеток в цикл; позитивный и негативный. Проверка этого допущения была осуществлена в опытах с применением
метода клеточной гибридизации.
Изучение эндогенной регуляции размножения клеток
методом клеточной гибридизации
Автор метода клеточной гибридизации — английский исследователь Харрис (Нагг5, 1965). Слияние клеток осуществляется
чаще всего с помощью инактивированного вируса Сендай или
поверхностно-активных соединений, таких как полиэтиленгликоль. Используется также электрический разряд. Подробные
сведения об этом можно почерпнуть в монографии Зеленина и
соавторов «Реконструированная клетка» (1982).
Для того, чтобы выяснить, какой тип эндогенного контроля
пролиферании
клеток
(позитивный
или
негативный)
имеет
место в действительности, анализируют способность к вступлению в период синтеза ДНК ядер гетерокарионов, полученных в
результате слияния пролиферирующих и покоящихся клеток.
При этом, как правило, используют в качестве покоящихся
клетки, культивируемые в условиях низкого содержания сыворотки в среде, а в качестве пролиферирующих — клетки,
стимулированные сывороткой и проходящие период С, ноеще
не приступившие к синтезу ДНК. Предполагается, что в случае
позитивного типа контроля ядра покоящихся клеток в таких
гетерокарионах должны вступать в клеточный цикл и вдальней-
шем синтезировать ДНК под влиянием предполагаемого стимулятора, вырабатываемого пролиферирующими клетками. В противоположность этому, при негативном типе контроля ядра
стимулированных клеток в гетерокарионах должны переходить
всостояние покоя под влиянием ингибиторов, присутствующих
в покоящихся
клетках (рис. 33).
Важным аспектом при проведении опытов по слиянию
пролиферирующих и покоящихся клеток служит способ идентификации их ядер в гетерокарионах, поскольку морфологически они не отличаются друг от друга. С этой целью производится
предварительное маркирование ядер до слияния.
ПОЗИТИВНЫЙ
ге
т
()]
1—
а
—
[А
^
АА
А
А
внутриклеточный
стимулятор
р
НЕГАТИВНЫЙ
®
внугриклеточный
ингибитор
Рис.33. Возможные пути эндогенного контроля размножения
ток. В — покоящиеся клетки, Р — пролиферирующие клетки.
кле-
На рис. 34А воспроизведена в качестве иллюстрации схема
опыта по слиянию пролиферирующих и покоящихся фибробла-
стов мыши с помощью полиэтиленгликоля (Сетков и др., 1984).
Покоящиеся
клетки
(В) получали
путем
инкубации
клеток
в
течение трех суток в среде с низким содержанием сыворотки,
предварительно пометив их в экспоненниальной фазе роста “Стимидином, а пролиферирующие (Р) клетки получали путем
добавления среды с 10% сыворотки, оставляя их немечеными;
при этом использовали клетки на всем протяжении пререпликативного периода. После слияния клетки инкубировали в
течение 16 час в среде с ЗН-тимидином, с целью проследить за
вступлением
ядер
в 5-период.
Методом
радиоавтографии
с
использованием двойного изотопного маркирования (см. Епифанова и др., 1977) на препаратах можно идентифицировать
(рис. 34Б) различные ядра как в исходных клетках — монокари-
онах (Ки Р)}, так и в продуктах слияния: гомокарионах (Кх В
и РхР)
и гетерокарионах
(К х Р).
Сопоставляя
данные
по
включению ЗН-тимидина в ядра гетерокарионов с данными по
его включению в ядра моно- и гомокарионов в динамике,
можно судить о взаимном влиянии ядер пролиферирующих и
покоящихся клеток на прохождение ими клеточного цикла и
вступление в 5-период.
Для идентификации продуктов слияния клеток и их дальнейшего изучения применяют и другие способы, например, пред-
10% сыворотки
МС-|
|
А
тимидин
ПГ
0,5 или 10% сыворотки
ЗН-тимидин
Г:
м
`
сли
10% сыворотки
0,5%
[22 б
5
—
"Г
—
6
6,
я
Аб
Фиксация
клеток |
.
А
|6 час
Хо
16 1
4
|Пререпликативный!
‘период
$
6час
7
_
дни
р
Гетерокарион
Ра
МС-тимидин
Гомодикарионы
Рис.34. Схема опытов по слиянию клеток линии МН
3Т3 (А). ПЭГ
— полиэтиленгликоль, С, — состояние покоя, $ — период синтеза ДНК,
В — покоящиеся клетки, Р — пролиферирующие клетки. Идентификация исходных клеток и продуктов слияния (Б). К — покоящиеся клетки,
Р — пролиферирующие клетки, Х — знак слияния клеток.
Рис. 35. Автограф культуры фибробластов мыши МН ЗТЗ после
слияния с лейкемическими клетками человека НТ.60. Для идентификации продуктов слияния клетки НТ.60 были предварительно помечены 3Н-тимидином (зерна серебра) с последующим иммуногистохимическим выявлением синтеза ДНК в ядрах по включению бромдезоксиуридина. Автограф любезно предоставлен И.А.Прудовским. | —
включение ЗН-тимидинЁ 2 — включение бромдезоксиуридина.
варительное маркирование ядер Н-тимидином с последующим
выявлением
их способности синтезировать ДНК
методом
им-
муногистохимии при использовании бромдезоксиуридина (рис.
35) (РгидоузКу, Тзопе, 1991).
В первых же опытах, проведенных независимо в нескольких
лабораториях на культуре диплоидных фибробластов человека
(Ваытоуйсй, Могмоод, 1980; Зет, УапузНеузКу, 1981) и культуре
фибробластов мыши МН ЗТЗ (РопоузКу её а1., 1983), были
получены однозначные данные в пользу негативного типа эндогенного контроля вступления клётки в митотический цикл.
Когда в одном гетерокарионе в общей цитоплазме оказывалось
ядро пролиферирующей (стимулированной) клетки и ядро покоящейся клетки, ядро пролиферирующей клетки утрачивало способность синтезировать ДНК (рис. 36А). В то же время присутствие в гетерокарионе пролиферирующей клетки не индуцировало вступления покоящейся клетки в $-период (рис. 36Б).
Монокарионы
60
:=
>
ы
|
Гетерокарионы М —
40
|
,
|
рй
|
7
_
20
й
яПИ
ЙА
та,
И
|
|
ИМИ
И
МИ
о
й
й
#
й
2
4
6
8
12
14
16
й
йЙЙ
й
й
йй
й
КУ
2
4
6
8
% сыворотки
Рис.36.
10
перед слиянием, час
ыы
<
% меченых ядер
% сыворотки
Результаты
опытов
10
2
й
14
=>
$
— |
>
к
®
Гомокарионы
з
®
5
6
перед слиянием, час
по слиянию
пролиферирующих
(Р) и
покоящихся (В) клеток МТИЗТЗ. Схема опыта и идентификации клеток
представлены на рис. 34. А — включение ЗН-тимидина в ядра Р-клеток
после слияния с В-клетками; Б — включение 3Н-тимидина в ядра Вклеток после слияния с Р-клетками.
|
Дальнейшие исследования (Рошпоу5Ку е{ а1., 1983) показали, что предварительная обработка покоящихся клеток в
течение 4 час ингибитором синтеза белка — циклогексимидом
устраняет их тормозящее влияние на пролиферирующие клетки в гетерокарионах, что подтверждало предположение о
способности покоящихся клеток вырабатывать ингибитор пролиферации. Отсюда вытекало следующее заключение, а именно, что необходимым условием приобретения покоящимися
ЕСЕ
РРР
|
|
сн
2
|
—>
рии БСН
Пререпликативный
Рис.37. Схема, иллюстрирующая
РРАЫЕЕЕЕ
\
Ингибитор
пролиферации
период
предположение о том, что состоя-
ние компетентности клеток для вступления в митотический цикл может
быть индуцировано не только факторами роста, но также путем подавления синтеза белка. К — состояние покоя, $ — период синтеза ДНК.
РОСЕ, ЕСЕ — факторы компетентности;
прогрессии; СН — циклогексимид.
ЕСЁЕ,
$тС
—
факторы
клетками компетентности для осуществления пререпликативных реакций (см. главу У} должно служить снижение внутриклеточного уровня эндогенного ингибитора, которое можно
вызвать не только путем воздействия на клетки тем или иным
фактором роста (митогеном), но и с помошью циклогексимида, подавляя образование ингибитора пролиферации (рис. 37).
Экспериментальная
проверка этого предположения
методом
клеточной кинетики (Розенвальд и др., 1989) показала, что
даже кратковременная обработка покоящихся клеток МЁН ЗТЗ
циклогексимидом в течение 45 мин без дополнительного
воздействия фактором прогрессии (ЕСЕ) стимулирует их вступ-
ление в $-период.
Короткоживущие белки — репрессоры пролиферации клеток
Полученные результаты побудили к проведению сравнительного исследования внутриклеточных процессов, протекающих
при
воздействии
на
клетку,
с одной
стороны,
факторов
роста, а с другой стороны — ингибиторов синтеза белка. С этой
целью была изучена методом блотгибридизации мРНК с ДНКпробами экспрессия ранних протоонкогенов (/05, дип и тус) в
покоящихся при низком содержании сыворотки фибробластах
А
Рис. 38. Сопоставление действия
РОСЕ
(50 нг/мл)
РРОЕ и
12
‚ЗАж
(ч)
с-тус
циклогексимида
на
экс-
прессию «ранних» протоонкогенов
— в ПОКОЯщИхся клетках МН ЗТЗ (по
данным Розенвальда и др.). Результаты блотгибридизации мРНК по-
<-10$
— коящихся клеток (0,5% сыворотки
в течение 3 дней) с ДНК-пробами
с-ип
с-тус, с юз и с-/ип при воздействии
РОСЕ в течение 12ч
(А) и кратковконтроль ременной инкубации с циклогек"
симидом (10 мг/мл) в течение 10
мин, 45 мин и 4ч (Б); контроль —
экспрессия мРНК гена тубулина.
СН - 10 мин
0
0,5
2
8
СН - 45 мин
12
ТГ
0
0,52
тт
810
СН -4ч
0,52
8
с-тус
с-Ю05$
с-лп
контроль
мыши, подвергнутых действию РОСЕ, циклогексимида и пуромицина (Козеп\а!4 е{ а1., 1995). Как показывают данные рис.
З8А, экспрессия всех протоонкогенов в состоянии покоя минимальна, вто время как РОСЕ вызывает быструю и транзиторную
стимуляцию экспрессии. Сходная картина наблюдается при
действии на покоящиеся клетки циклогексимида (рис. 38Б),
причем экспрессия протоонкогенов наиболее отчетливо выражена через 45. мин после начала его применения. Опыты с
другим ингибитором синтеза белка — пуромицином, который
был использован в разных концентрациях, показали, что максимальная экспрессия протоонкогенов наблюдается при кратковременном (45 мин и 2 час) воздействии ингибитором на
покоящиеся клетки в условиях наибольшего подавления синтеза белка. В параллельных исследованиях по слиянию пролиферирующих клеток с покоящимися, предварительно подвергну-
тыми кратковременному воздействию циклогексимида и пуромицина в сочетании сактиномицином О, было установлено, что
для снятия тормозящего действия покоящихся клеток на ядра
пролиферирующих клеток в гетерокарионах не требуется транскрипции новых молекул РНК.
"Ранние"
Ген, кодирующий
гены
с-/05
с-шп
_Е
мРНК
АЗАТАЗА О)
ААА,
предполагаемый
белок-репрессор
с-тус
№ 1
ЛА,
Репрессор
паиининииниие))
СТИМУЛЯЦИЯ
——
Подавление
Рис. 39. Схема, иллюстрирующая
водящие
к экспрессии
«ранних»
Циклогексамид
Пуромицин
внутриклеточные процессы, при-
протоонкогенов
и возобновлению
синтеза ДНК в покоящихся клетках МН ЗТЗ, подвергнутых действию
фактора роста (РОСР) или кратковременному воздействию ингибиторами синтеза белка (циклогексимидом или пуромицином).
Транзиторное прекращение трансляции оказалось достаточным условием как для экспрессии генов раннего пролиферативного ответа, так и для возобновления синтеза ДНК, из чего
можно было сделать вывод, что вступление клеток в цикл связано
с элиминацией короткоживущего (лабильного} белка-репрессора (рис. 39). К. сходному заключению пришли Рязанов и Спирин
(Куагапоу, Зрилт, 1990) на основании изучения биологической
роли фактора элонгации 2 (еЕЁЕ?2), катализирующего движение
рибосом вдоль молекулы мРНК и стимулирующего таким образом трансляцию. Этот фактор активен только в дефосфорилиро-
ванном состоянии. Его фосфорилирование с помощью Са?*/
кальмодулин-зависимой еЕЁЕ2-киназы вызывает кратковременное подавление синтеза белка и исчезновение короткоживущих
белков-репрессоров, побуждая клетки к вступлению в период
синтеза ДНК.
Ингибиторы
пролиферации, вырабатываемые покоящимися
клетками в культуре
Естественно возникает вопрос — что же представляют собой
короткоживущие репрессоры пролиферации?
К настоящему времени известно, что покоящиеся клетки
разных культур вырабатывают и выделяют в окружающую среду
ингибиторы белковой природы, обратимо подавляющие пролиферацию клеток того же типа. По болышей части, это термолабильные белки с мол. массой 20-40 кД и менее, не обладающие
токсическим действием на клетки. Подробный перечень таких
ингибиторов
содержится
в книге
Епифановой
и др.
(1988).
Лучше всего охарактеризованы полипептиды и гликопептиды,
выделенные из кондиционированной питательной среды после
инкубации в ней покоящихся клеток. Среди них особого внимания заслуживает фактор В$С-|1 с мол. массой - 24 кД,
Таблнца 9. Некоторые ингибиторы клеточного размножения,
вырабатываемые и секретируемые покоящимися клетками млекопитающих в культуре
Тип
клеток
Источник получения
Характеристика
ингибиторя
ингибитора
Клетки эпителия почки
обезьяны (линия В$С-1)
Фибробласты мыши ЗТ3
и эмбриональные
фибробласты мыши
Миелоилные клетки
мыши М-1
Фибробласты мыши 3ЗТ3
и человека [МК-90/91
Кондиционированн
ая среда, в которой
инкубировали
покоящиеся клетки
Клеточная
поверхность
покоящихсл
Клетки эпителия
чеяовска и быка
аорты
|
ТСЕ-В-подобный белок (-24 кД)
Фактор, состоящий из двух
полипептидов (10 и 13 кд);
термолабильные факторы (15 и
40 кд)
Интерферон В
Интегральные мембранные
гликопротеиды (30 кД)
клеток
Перифернческий мембранный
компонент, чувствительный к
обработке триленном и
нагреванию (30-38 кД)
выделенный из среды, где предварительно инкубировали клетки
эпителия почки обезьяны, поскольку он практически идентичен
трансформирующему
помним,
фактору
является мощным
эпителиального
роста
ТСЕВ,
ингибитором
происхождения
который,
размножения
как
мы
клеток
(о нем пойдет речь в главе Х).
Эта группа факторов сходна по своим свойствам с так
называемыми кейлонами — термин, введенный в свое время
Буллоу и Лоуренс (ВиПоцрй, Гаигепсе, 1968) для обозначения
тканеспецифичного фактора, изолированного из клеток эпи-
дермиса мыши и обратимо подавляющего размножение эпидермальных клеток. Позднее кейлоны были обнаружены и в некоторых других тканях, но данные об их свойствах, равно как и
само существование кейлонов, постоянно подвергаются сомнению, ввиду сложности получения чистых препаратов.
Другая группа ингибиторов пролиферации, вырабатываемых
покоящимися клетками, включает в себя пептидные факторы,
связанные с клеточной поверхностью, которые, по-видимому,
близки по своим характеристикам с ингибиторами, выделяемыми в окружающую среду (см. Ер#апоуа, ВгооК$, 1994). Ни те, ни
другие факторы не могут рассматриваться как основные элементы
строго внутриклеточного
(шип$ю)
механизма
негатив-
ного контроля размножения клеток, поскольку они действуют
главным образом через рецепторы наружной мембраны, то есть
по паракринному способу регуляции, и влияют на всю популяцию в целом. Однако, как мы увидим в дальнейщем, они играют
важную вспомогательную роль в осуществлении общего негативного контроля
пролиферации.
Гены да5, специфичные для состояния пролиферативного
покоя, и продукты их активности
В конце 80-х годов были открыты и клонированы гены,
экспрессия которых связана преимущественно или исключительно с пребыванием клеток в состоянии покоя и прекращается уже через несколько часов после митогенной стимуляции
(Зснпе!4ег е{ а1., 1988). Эти гены получили название вау (го
агте${-зресс 2епез). Со временем семейства таких генов (в
частности, квайесцины) были обнаружены в разных культивируемых клетках, главным образом, в фибробластах (табл. 10).
Оказалось, что кодируемые ими белки входят по большей части
в состав плазматической мембраны или внеклеточного матрик-
Таблица
Тип
10. Гены, избирательно экспрессирующиеся
в покоящихся клетках
клеток
Фибробласты
МИН 3Т3
Гены
Са;
(Вгомий
аггез(зрес!с)
ваз |
мыши
845 2
Клетки МТН ЗТЗ и
клетки лейкемии
Френда
545 3
545 5
5а5 6
Фибробласты
\/1-38
Квайесцины
(ашезсип$)
О!
02
08
человека
904
Кодируемые
белки
Компонент плазматической мембраны с
мол. массой —-45 КД
Компонент микрофиламент с мол. массой
—36 кД
Трансмембранный гликопротеид
Белок, связанный с витамином К
Коллагены
Белок, входящий
в состав клеточного
матрикса
са, не выполняя, по-видимому, функций регуляторных молекул, которые были открыты позднее (см. главу Х). Кроме того,
продукты отдельных генов 5а5 могут даже способствовать размножению клеток, поскольку они, как выяснилось, входят в
состав рецепторов некоторых факторов роста (в частности, орецепторов РОСЁ) и, аккумулируясь на поверхности покоящейся клетки, обеспечивают ее быструю реакцию на митогенный стимул.
Взаимодействие эндогенных и экзогенных факторов
в регуляции клеточного цикла
|
Благодаря успехам в изучении эндогенного контроля размножения клеток, уже к началу 90-х годов стало очевидным, что
регуляция клеточного цикла у высших эукариотов осуществляется путем координированного взаимодействия внеклеточных и
внутриклеточных регуляторных факторов при переходе клеток
из состояния покоя к пролиферации и в обратном направлении.
На рис. 40 последовательность событий представлена в виде
повторяющихся витков спирали, каждый из которых включает
в себя клеточный
цикл
с периодами
С,
5, С, и митозом
(М).
>
факторы роста
Рис.
40.
Модель
размножения
высших
эукариотов,
отражающая
взаимодействие внеклеточных и внутриклеточных
регуляторов при
смене состояний активной пролиферации и пролиферативпого покоя.
С, $, С, М — периоды
клеточного цикла. К — состояние покоя, В’ —
более глубокое состояние покоя.
Клетки продолжают проходить один цикл за другим, то есть
непрерывно пролиферировать до тех пор, пока в окружающей
среде присутствуют факторы роста (помеченные стрелками).
Ширина ленты спирали условно отражает внутриклеточный
уровень индукторов репликации ДНК. В отсутствие экзогенных
факторов роста клетки прекращают пролиферацию и переходят
в состояние пролиферативного покоя, обусловленное достижением нужной концентрации эндогенного ингибитора. При
длительном отсутствии факторов роста клетки углубляются в
это состояние, и им требуется болыше времени для выхода из
него. Под влиянием факторов роста внутриклеточная концентрация ингибитора пролиферации снижается, что вызывает
серию пререпликативных реакций, завершающихся инициацией синтеза ДНК.
Существенным моментом в регуляции размножения клеток
высших эукариотических организмов следует считать чередование периодов активной пролиферации и пролиферативного
покоя, что придает гибкость и одновременно устойчивость всей
регуляторной системе.
Литература
Епифанова О.И., Терских В.В., Захаров А.Ф. — «Радиоавтография», М..,
ВШ,
1977.
Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. — »Регуляторные
механизмы пролиферации клеток», М., ВИНИТИ, Итоги науки и
техники, т.[10, 1998.
Зеленин А.В., Кущ А.А.. Прудовский И.А. — «Реконструированная
клетка», М., Наука, 1982.
Розенвальд И.Б., Макарова Г.Ф., Епифанова О.И. — Докл. АН СССР,
1989, 305, 977-980.
Сетков
Н.А.,
Полуновский
В.А., Елифанова
О.И.
— Цитология,
1984,
26, 691-697.
ВиНоцёН У\.$., Гаигепсе
Е.В. —
Еигор. ]. Сапсег,
1968, 4, 587-594.
Соорег 5. — Матиге, 1979, 280, 7-19.
ЕрНапоуа О.1., Вгоокз К.Е. — Сей Рго!.,
Нагиз Н. — Мате, 1965, 206, 583-588.
Напме! Г.Н. — 3. Ма. Ва,
[15Кау В.М., Ргезсой
О.М.
1994, 27, 373-394,
1976, 104, 803-817.
— Ргос. МаЙ Асад. $с1. ЦЗА,
1978, 75, 2873-
2877.
РоипоузКу У.А., ЗеаКоу М.А.,
Ер!апоча О.Т, — Ехр. Сей Кес., 1983, 146,
377-383.
РгидочзКу 1.А., Тзопв Т.У. — Беуеюрт.
Влю|.,
1991,
144, 232- 239.
ВаБпоуйсН Р.$., Могмоо4 Т.М. — Ехр. Сей Вез., 1980, 130, 101-109.
Козепуиа!4
1.В., Закоу
М.А.,
КатаКоу
У.М.,
Свеп
Т.-У., Куатапоу А.С.,
Гопаоп 1.М., ЕрНапоча О. Т. — СеЙ Ргой1,, 1995, 28, 631-644.
Куагапоу А.С., Зршл А.5. — Мем В1о|., 1990, 2, 843-850.
Звлезег С., Ктв В.М., РЫШрзоп 1. — Сей, 1988, 454, 787-793.
меш С.Н., УатреузКу В.М. — Ргос. Май Асад. $с1. ОЗА, 1981, 78, 3025-
3029.
ГЛАВА УШ. СТАНОВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО
ЦИКЛА В ПРОЦЕССЕ ИНДИВИДУАЛЬНОГО
РАЗВИТИЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ
КОНТРОЛЬ РАЗМНОЖЕНИЯ КЛЕТОК
Клеточные
циклы в раннем эмбриогенезе и при
специализации клеток
В многоклеточном организме вслед за оплодотворением
яйца начинается период дробления. Клеточные циклы в периоде дробления наиболее подробно изучены уамфибий, главным
образом, у шпорцевой лягушки Хепориз [аеу5. Неоплодотворенные зрелые ооциты амфибий, блокированные в метафазе второго мейоза, после стимуляции (например, при оплодотворении
или под воздействием повышенной концентрации ионов кальция всреде} заканчивают мейоз и претерпевают серию синхронных митотических делений. Опыты с трансплантацией ядер
соматических клеток в яйцо показывают, что цитоплазма яйца
содержит все необходимые компоненты по меньшей мере для
12-ти делений дробления, и транскрипции генетического материала не требуется. Эти деления протекают с интервалом
примерно в 30 мин., причем в клеточном цикле отсутствуют
периоды С, и С..
Подобная закономерность наблюдается при оплодотворении у
большинства животных, за исключением млекопитающих и некоторых других видов, у которых незначительный по продолжительности период С, обнаруживается уже в самых первых циклах
дробления. Синтез ДНК происходит на протяжении короткого 5периода, и один раунд репликации следует за другим, прерываясь
лишь для премитотической реорганизации хроматина и митоза. В
это время бластомеры не нуждаются для деления в экзогенных
стимуляторах пролиферации (факторах роста).
Число делений дробления варьирует у разных видов. В
дальнейшем происходит трансформация эмбрионального клеточного цикла в соматический — этим термином условно
обозначается клеточный цикл, устанавливающийся по завершении периода дробления яйца. У амфибий этот переход наблюдается на стадии средней бластулы,
Соматические клеточные циклы в многоклеточном организме характеризуются наличием хорошо выраженных периодов
С иС,, более продолжительного периода $, а также зависимостью прохождения цикла от митогенных стимуляторов. Иными
словами, темп размножения клеток начинает определяться
присутствием факторов роста, что создает предпосылки для
нового этапа регуляции, включающего в себя чередование
периодов активной пролиферации и пролиферативного покоя.
Принципиальное различие в этом плане между взрослым организмом и эмбрионом состоит в том, что эмбриональные клетки
сами способны вырабатывать и выделять в среду факторы роста,
то есть регуляция осуществляется как по паракринному, так и
по аутокринному типу.
На более поздних стадиях развития — во время нейруляции
и раннего органогенеза — наблюдается общее снижение пролиферативной активности клеток и их перераспределение по
периодам клеточного цикла таким образом, что в некоторых
участках зародыша увеличивается число клеток в периоде С..
Значительная часть клеток покидает клеточный цикл и переходит в состояние покоя. В это же время отмечается появление
ингибиторов пролиферации. Вместе с тем в отдельных очагах
органогенеза сохраняется интенсивный уровень размножения
клеток. Поэтому прохождение клеточного цикла на данных
стадиях развития организма может приводить к разным последствиям. В одних случаях клетки проходят несколько циклов
подряд, в результате чего возрастает численность клеточной
популяции, главным образом за счет клеток, мало отличающихся от своих предшественников. В других случаях в клетках
появляются признаки специализации, характерные для той или
иной ткани, и они начинают выполнять свои функции, пребывая в состоянии пролиферативного покоя (см. рис. 14 в главе
ПР. Специализированные клетки, необратимо перешедшие в
состояние покоя, относят к категории терминально дифференцированных клеток.
Регуляция клеточного цикла в эмбриогенезе и гипотеза
автономного осциллятора
Для объяснения механизма поддержания синхронного размножения клеток в эмбриогенезе Ньюпортом и Киршнером
(Меуроц, Кизсйпег, 1984) была предложена гипотеза автономного осциллятора, которую удобнее всего рассмотреть на примере процессов, происходящих при созревании и дроблении
Рис.41. Первоначальный вариант`\__
автономного осциллятора, обеспечивающего синхронное прохождение клеточных циклов в эмбриогенезе лягушки (по Ньюпорту и Киршнеру, 1984). $
— период синтеза ДНК, М — митоз,
МРЕ
МРЕ — фактор созревания яиц, СЗЕ —
цитостатический - фактор.
б' или Са
С$Е
Блок в
метафазе
яиц Х. (аемх. Согласно предлагаемой гипотезе, представленной
в упрощенном виде на рис. 41, клеточный цикл в дробящихся
яйцах лягушки управляется механизмом автономной осциллчции, ключевым элементом которого служит так называемиий
фактор
созревания
—
МРЕ
(таштаноп
рготоНпЕ
ас{ог,
или
Прогестерон
У
ь
Анти-
РЕ
МРЕ
|
СЕ
Са?*
©
Анти-
— Анти-
МРЕ
МРЕ
|
До 12
делеНИЙ
дробле-
Нил
(9
Т мейоз
Незрелый
ооцит
ИП мейоз
Преми-/——
тотическая
Зрелый
оецит
Рис.42. Функционирование
(9
интер
фаза
1 деление
2 деление
дробления
дробления
автономного
осциллятора
незе лягушки (по Мюррею и Киршнеру ‚, 1989).
.....
в эмбриоге-
пйо$15 рготойпЯ астог), содержащийся в неоплодотворенных
яйцах. В присутствии МРЕ клетки переходят из периода синтеза
ДНК в митоз. Для завершения митоза и вступления клетки в
следующий 5-период МРЕ должен быть разрушен другим внутриклеточным фактором — анти-МРЕ. Выяснилось, что в неоплодотворенных яйцах присутствует еще одно активное вещество, которое получило название цитостатического фактора,
или СЪЕ (см. Мазут, 1991}. Этот фактор поддерживает в клетках
высокий уровень МРЕ, защищая его от анти-МРЕ, и таким
образом блокирует яйцеклетку в метафазе второго мейоза.
Оплодотворение или стимуляция зрелых яиц приводит к инактивации СЗЕ, снижению уровня МРЕ и включает осциллятор,
который и регулирует пронесс дробления на протяжении первых 12-ти клеточных циклов, вплоть до стадии средней бластулы. На рис. 42 функционирование автономного осциллятора
представлено в развернутом виде (Миггау, КизсНпег, 1989), с
указанием начала образования МРР (на У и УГ стадиях роста
незрелого ооцита, блокированного в профазе первого мейоза)
под влиянием прогестерона, вырабатываемого фолликулярными клетками, окружающими ооцит.
Естественно, что подобная схема оставляла больше вопросов, чем предлагала ответов. Что такое анти-МРЕ? Что представляет собой С$ЗЕ? Откуда они берут свое начало и как
взаимодействуют с МРЕ? О самом МРЕ к тому времени было
уже известно, что это белок, способный фосфорилироваться с
участием протеинкиназ,
Общность регуляторных мёханизмов размножения всех
эукариотических клеток — крупнейшее открытие
современной биологии
В начале 90-х годов произошел подлинный прорыв знаний в
изучении регуляторных механизмов размножения клеток. И,
как ни тривиально это звучит, произошел он только благодаря
объединению усилий ученых, трудившихся до этого в далеких
друг от друга областях клеточной биологии. Действительно, в
течение многих лет исследования генов и продуктов их активности, регулирующие размножение клеток у дрожжей, развивались совершенно независимо от выяснения факторов, определяющих деления дроблений на ранних стадиях развития амфибий, а те, в свою очередь, были далеки от изучения механизма
перехода культивируемых клеток млекопитающих из состояния
покоя в клеточный цикл. Наступил момент, когда эти области
начали самым тесным образом переплетаться между собой, что
вылилось в серию блестящих работ, ознаменовавшихся крупными открытиями. Стало ясно, что речь идет об изучении одних
и тех же пронессов, и была доказана общность молекулярногенетического контроля клеточного размножения у всех видов
эукариотических организмов — отдрожжей до человека. Самым
поразительным в этом открытии оказалось то, что весь процесс
регуляции клеточного цикла стал представляться значительно
более ясным и менее сложным, чем прежде. Можно смело
сказать, что это самая крупная объединяющая теория последнего времени в биологии.
В суммарном виде она представляется следующим образом.
Исследователи, работавшие с низшими эукариотическими
организмами, такими как дрожжи, первыми обратили внимание
на то, что в нормальных условиях деление клеток зависит от
правильной координации событий клеточного цикла (см. Кте
е! а|., 1994). Эта координация обусловлена регуляцией трех
переходов (рис. 43): вступления в митоз, выхода из митоза в
прохождения через пункт ограничения (г-пункт) в периоде С,
{У дрожжей
он
называется
клетки становятся
ДНК (вступлению
точкой
«старт»},
после
которого
комитированными к инициации синтеза
в $-период). Усилиями нескольких групп
исследователей во главе с Нёрсом (Мигзе, Оксфорд, Англия),
Киршнером (Кизсппег, Сан-Франциско, США), Ридом (Кее4,
Ла Холла, США), Бичем
(Веасй,
Колд
Спринг Харбор, США)
2
и
другими
учеными
было установлено, что
каждый из этих переходов протекаетс участи-
ем одного и того же
белка — р34 (фосфолипида с мол. массой 34
КД)
или
его
гомологов.
М
С,
1
а
|
т
бан
го пункт
с
с
$5
о
Е
:
близких
Рис.43. Участие белка р34“%2 в координации событий клеточного цикла. С. 5,
Этот белок был пер-
С,. М — периоды цикла, С, — состояние
воначально
идентифи-
Покоя, г-пункт — пупкт ограничения.
Дрожжи
Амфибии
Грибы
Высшие растеиия
р
|
Насекомые
Х4аеуб5
Человек
$. роте
$. сегеуае
„^^“\ Гомологи
сас13 сас2
с4с28
МРЕ
^\
4?
63% гомологии
с белком
$. роте
(2.ВеасН)
(Р.Мигсе)
М-циклины
С,-циклины
Рис.44. Общность молекулярно-генетического контроля размножения клеток у эукариотов: с@с2 (сас28), сас!3 — гены дрожжей, кодирующие белки, которые входят в состав МРЕ (объяснения в тексте).
цирован Нёрсом как продукт активности гена сас2у делящихся
дрожжей 5. ротфе (рис. 44). Оказалось, что ему принадлежит
центральная роль в регуляции деления. Возрастание активности
белка р34“*? служит непременным условием прохождения дрож-
жевой клетки через точку «старт», а вторичное возрастание
обязательно предшествует митозу. Одновременно в лаборатории Рида было показано, что аналогичная картина наблюдается
при прохождении клеточного цикла у дрожжей ,5. сегеузае,
размножающихся почкованием, только в этом случае белок р34
является продуктом активности гена с4с28— гомолога гена сас2
у 5. ротре.
Неожиданным оказалось то, что белок р34““? одновременно
представляет собой каталитическую субъединицу МРЕ. Другая
субъединица, получившая исходное название «циклин», представляет собой белок-инициатор, точнее, группу регуляторных
белков с мол. массой около 60 кД, аккумулирующихся в клетке
на протяжении интерфазы и деградирующих в митозе. Циклины
были открыты при изучении синтеза белка в процессе развития
яиц
у морских
ежей,
червей,
моллюсков,
осетровых
рыб
и
лягушек Хантом (Нипе, Кембридж, Англия), который обнаружил, что они подвергаются
интенсивному фосфорилированию
перед каждым митозом. Эти циклины получили название мито-
тических циклинов (А и В). Они были идентифицированы в
лаборатории Нёрса у дрожжей 5. роте как продукты активно-
сти гена с4с13, ау 5. сетемяае выявлены лишь позднее, что
связано с методическими трудностями при изучении почку!ощихся дрожжей. Однако именно у этого вида дрожжей Ридом и
его сотрудниками были впервые найдены циклины, участвующие в регуляции прохождения клетками через точку «старт»,
или С, -циклины, обозначенные применительно к 5. сегеу5ше
символами СшТ, С112,С]п3...... ит.д.
Но самым поразительными и многообещающими можно
считать данные о высокой степени филогенетической консервативности белка р34“*? в клетках эукариотических организмов.
В опытах с применением моноклональных антител Мюрреем в
лаборатории Киршнера было показано, что МРЕ проявляет себя
как гомолог киназы, фосфорилирующей гистон Н1 у млекопитающих, и что клетки человека содержат продукт гена сас2 ипи
очень близкий гомолог. Так, протеинкиназа, выделенная из
клеток линии НеГа, оказалась по меньшей мере на 63% илентична белку р34“«? у дрожжей 5. ротБе, а последний — полностью идентичен субъединице МРЕ из яиц лягушки. В этом
фундаментальном исследовании участвовали совместно и независимо Нёрс, Бич, Ньюпорт (Ме\урой, Сан-Диего, США) н
Маллер (МаПег, Денвер, США). Близкая гомология регуляторных белков с р34<*? вскоре была выявлена у грибов, насекомых
и высщих растений. Так была постулирована общность молеку-
лярно-генетических механизмов размножения клеток у эукарисм. Мюррей,
отов (подробнее
Киршнер,
1991).
Взаимодействие р34<*? и циклинов при вступлении клетки
в митоз
Как уже было сказано, в процессе эмбрионального развития
митотические
циклины
(А и В) аккумулируются
в клетке
на
протяжении интерфазы и в дальнейшем разрушаются в митозе,
причем деградация циклина А опережает деградацию циклина
В. В лаборатории
экстрактов
яиц
Киршнера был разработан метод получения
лягушки,
способных
проходить
несколько
кле-
точных циклов в пробирке, что позволило установить особен-
Количество белка
ности флюктуации содержания циклинов от
Прючне белкк
ОДНОГО
ЦИКЛа
к другому.
Было показано, что в
отличие от всех остальных белков, содержание
которых нарастает равномерно с увеличением
массы эмбриона, уро-
Циклин
А
Б
вень циклина осцилли\ инки
МРЕ
/
Циклик
<
3
Ажтивация Деструкция
Рис.
циклина
45.
в
(А)
т
—
клеточных
$
осцилляции
циклах
уровня
экстрактов
рует по принципу «зубцов пилы» (рис. 45А).
Молекула
р34<2
инертна на всем протяжении клеточного цикла, то есть не обладает
протеинкиназной
ак-
тивностью. В начале
цикла она мономерна и
нефосфорилирована, но
постепенно фосфорилируется
в
периодах
$
и
яиц лягушки по принципу «зубцов пилы»
(по Киршнеру и Ханту, 1989). М —— митоз; .
(Б) — соотношение уровия циклина и
МРРЕ на протяжении нескольких эмбрио-
(5
Перед началом ми2°
тоза
происходит физи,
заимодействие
еское
вза
деистви
пальных клеточных циклов лягушки.
р34““?
с циклином,
ко-
торое вызывает конформационное изменение
молекулы р34°“2, способствующее ее дальнейшему фосфорилированию, главным образом, по остаткам тирозина и треонина.
Однако такой комплекс представляет собой неактивную (латен-
тную) форму МРРЕ (пре-МРЕ). Для активации МРЕ и вступления клетки в митоз необходимо дефосфорилирование р34=*? по
15-му остатку тирозина и 14-му остатку треонина. В то же время
он должен оставаться фосфорилированным по 161-му остатку
треонина (у дрожжей) или 167-му остатку треонина (у позвоночных). При этом активность МРЕ возрастает перед митозом
очень резко. Соотношения уровней циклина и МРЕ на протяжении нескольких эмбриональных клеточных циклов яиц лягушки иллюстрирует рис. 45Б. Для завершения митоза необхо-
дима деградация
циклинов А
Регулируется
и В под влиянием протеоли-
мн
мых от убиквитинов — малых
белковых молекул, активирующих
протеолиз
(см. Юте е
—
МРЕ
——
Циклин
Количество
тических ферментов, зависи-
а|., 1996)
Следует подчеркнуть, что
ГИазоя
в действительности процесс
активации-инактивации МРЕ
регулируется значительно более совершенным образом, а
именно, тончайшим балансом между активностью протеинкиназ и фосфатаз с вклю-
р.
Время
Сивтез
циклина
"Лаг-
период
чением механизмов положи-
Рис.46. Выявление внутриклеточ-
тельной и отрицательной обратной связи. Так, в лабора-
ного ингибитора (ПМН), удерживающего МРЕ в неактивном состоя-
тории
Киршнера
было
обна-
ружено (Зоотоп ега|., 1991),
что в этом процессе принимает
участие
негативный
нии (по данным лаборатории
Киш-
нера, 1990-1991).
регулятор
(ПМН),
представляющий
собой фосфатазу типа 2А. В опытах на экстрактах яиц лягушки
было показано, что внезапной активации
МРЕ всегда предше-
ствует лаг-период, продолжительность которого не зависит от
достижения пороговой концентрации циклина (рис. 46).
Первоначально
было
высказано
предположение,
что
ПМН
дефосфорилирует циклин и удерживает его в неактивном состоянии до тех пор, пока потенциальная активность МРЕ не станет
такой,
чтобы
ядерной
обеспечить
оболочки,
все
события
конденсанию
митоза
хромосом,
(разрушение
реорганизацию
веретена деления и др.). В дальнейшем оказалось, что роль ИУН
далеко не так однозначна, и что в активации МРЕ принимают
участие многочисленные регуляторные молекулы, причем особая роль в этом
процессе
блестящим исследованиям
принадлежит
циклину А. Благодаря
на развивающихся яйцах лягушки,
выполненным, главным образом, в лаборатории Дорэ (Рогбе,
Ренн, Франция), удалось воссоздать последовательность и взаимосвязь
событий,
схематически
предшествующих
иллюстрирует рис. 47.
инициации
митоза.
Ее
ИН
2А фосфатаза).
Уее1/МИК
|=
Мее ИМ
|+-р
Негативные
регуляторы
(киназы)
м
р15
—- С4с2
р161
2161 / Позитивный
регулятор
Неактивный
“Фосфатаза)
пре-МРЕ
Активный
МРЕ
6,-м
Рис.47. Участие циклина А в активации МРЕ (по данным лаборатории Дорэ, 1993). \У!ее!/МЖ1! — тирозинкиназы (продукты генов
дрожжей $5. роте); С4с2 — каталитическая субъединица МРЕ (р34=*2);
С,, М — периоды
клеточного цикла (объяснения в тексте).
Главным позитивным регулятором превращения неактивного пре-МРЕ в активный МРЕ является продукт одного из
семейства генов с4с25 — тирозинфосфатаза, дефосфорилирующая р34“*? по 15-му остатку тирозина и 14-му остатку треонина,
оставляя при этом 161-й остаток треонина в фосфорилированном состоянии, что необходимо для прочной связи р34“*? с
циклином. Превращению пре-МРЕ в МРЕ препятствует мощ-
ный заслон негативных регуляторов — тирозинкиназ Уее|
и
МК. Они активны только в дефосфорилированном состоянии,
в котором их поддерживает уже известный нам ИН.
Их
нейтрализацию путем фосфорилирования осуществляет циклин А, находящийся в комплексе с р34“*?. Этот комплекс
активируется раньше, чем комплекс р34““?/циклин В; образно
говоря, циклин А прокладывает путь циклину В, «навешивая»
фосфор на регуляторные молекулы, препятствующие активации МРЕ. На самом же деле число молекул, тормозящих или
стимулирующих переход С.-М, значительно больше, чем изоб-
ражено на схеме. Это усиливает регуляционные возможности
клетки в случае неполной готовности к митозу и в то же время
способствует его правильному протеканию в нормальных услоВИЯХ.
В свете новых данных существенно дополнились представления о функционировании автономного осциллятора в эмбриогенезе Х. /деуйб (см. рис. 42). Помимо детального раскрытия
активации МРР и роли циклинов А и В в этом процессе, стало
известно, что анти-МРЕ — это группа убиквитин-зависимых
протеолитических ферментов, обеспечивающих разрушение
циклинов и выход клетки из митоза. Изучена также природа
цитостатического фактора СЗЁ, одним из активных компонен-
тов которого оказался продукт протоонкогена #105, способствующий блокированию клеток в метафазе второго мейоза зрелого
ооцита,
благодаря
1994). Другой
с
кинетохорами
МЕК,
относящийся
связыванию
компонент
—
(\!апр
ет
а|.,
к категории
МАР-киназ, препятствует деградации циклинов и, следовательно, завершению митоза (Ма[ег, 1994). Действие обоих компо-
нентов преодолевается при оплодотворении яйца.
Роль циклинов и зависимых от них протеинкиназ (СОК$}
в регуляции переходов С/С, и б,/5
Как уже было сказано, прохождение точки «старт» и переход
в э-период у дрожжей зависит от активации генов сс2 (у 5.
ротве) и с@с28 (у 5. сегемзае), в результате чего образуются
гетеромультимерные комплексы, содержащие белок р34““? и
нестабильные регуляторные белки — С -циклины (С1п$), обна-
руживающие ограниченную гомологию с митотическими циклинами.
Дальнейшие исследования показали, что у высших эукариотов, наряду с митотическим циклинами А и В, существуют
также и С‚-циклины, получившие валфавитном порядке названия С, Р, Еит.д. Входящие с ними в комплекс протеинкиназы
— гомологи белка р34=*?— стали обозначать символом СОК
(сусИп-дерепдеп( К1лазе), что отражает их тесную взаимозависи-
мость
с циклинами.
В соответствии
с этой терминологией,
символ СОК] у позвоночных соответствует символу СОС2 у
дрожжей (рис. 48). Киназа СОК] образует комплексы с митотическими циклинами, киназа СОК2 (гомолог киназы СОС2,
мол. масса 33 кД) — с циклинами А и Е, а близкие по гомологии
киназы СОК4 и СОК6 — с циклином О. Эти комплексы
выполняют
роль позитивных
регуляторов
клеточного
цикла,
Митотические
циклины
Рис.48. Циклины в комплексе
(СОК) (объяснения в тексте).
С, - циклины
с
циклин-зависимыми
киназами
обеспечивая последовательное прохождение его периодов (см.
обзоры: ЭЦегг, 1993, 1995; Огаема, 1994; [еез, 1995; вв, 1995).
В настоящее время расположение таких комплексов в клеточном цикле сформировавшегося организма выглядит следующим образом (рис. 49). Ключевыми позитивными регуляторами
вступления клеток в цикл служат циклины типа О, входящие в
комплексы с СОК4 или СОК6. Это единственные циклины,
образующиеся под влиянием внешних стимуляторов (митогенов) и синтезирующихся до тех пор, пока в среде присутствует
фактор роста. Пик их экспрессии приходится на середину
периода С,. Экспрессия циклина Е происходит периодически,
но максимальная активность его комплекса с СОК2 наблюдается на границе периодов С\/5, предшествуя активации комплекса СОК2/циклин А. Функции циклина А не исчерпываются,
таким образом, его участием в регуляции митоза. Основные события, осуществляющие-
СС
ся на протяжении клеточного цикла при вза-
имодействии комплексов
СОК/циклин,
представлены в 0бобРис.49. Расположение
комплексов СОК/циклин
вклеточном цикле. М, С,
$, @, — периоды цикла,
С, -состояние покоя, гпункт — пункт ограничеНИЯ.
Таблица
11. Взаимодействие циклинов и циклин-зависимых кипаз
в регуляцин событий клеточного цикла
Циклин
Кииаза
Максимальная экспрессия
— Регулируемый
процесс
циклина в клеточном
цикле
А
СРС2=Сок1
$-0,-М
“Протекция” циклипа В
на этапе ©: >М
СОК2
Иницнация и прохождение $-периода, {3—0
Ипициация митоза
В
СОС2=СокК1
С›-М
С
Не обнаружена
Су, далее
}в)
СОК4, СОКб
Середина С:
Е
(преимущественно)
СРК2, СОК5
Граница С-$
СОК2
[©
Не обнаружена
Н
СОК?
Е
Не обнаружена
постоянная
Прохождение С,
пернода
“Протекция“ циклниа А
Инициация $-перпода
Субстрат траискрийционной активности р53
Фосфорнлирование комплекса СОК4/6-цик.ин
Инициация митгоза
С:
2
(6.>М)
щенном виде в табл. 11. Подробнее их роль будет раскрываться
по мере дальнейшего изложения (см. главу Х), однако на
основании ранее рассмотренных материалов уже сейчас можно
сделать заключение, что назначением этих комплексов служит
преодоление действия эндогенных ингибиторов, являющихся
частью внутриклеточного контроля пролиферации клеток и
препятствующих прохождению клеточного цикла.
Литература
Мюррей
Э., Киршнер
М. — В мире
Рогёе М. — Сшт. Орш. Се! Вю,
науки,
1991,
№
5, 24-32.
1990, 2, 269-273.
Огаеца С.Е. — Сшг. Орт. Сей Вю, 1994, 6, 842-846.
СааКНопоу К., Веасн О. — Сей, 1991, 67, 1181-1194.
Ниле Т. — Мате, 1991, 350, 462-463.
Кпв В Л№., СоН2ег М., Кизсбпег М.\\. — Мо!. Вю!. Сей,
1357.
1996, 7, 1343-
К тр К \\., Гаскзоп Р.К., Кизсипег М.\/. — Сей, 1994, 79, 563-571.
Гее Т.Н., Зоютоп М.3., Мише М.С., Кизсйпег М.\И. — Сей, 1991, 64,
415-423.
Геез Е. — Сшг. Орт. Сей В1а., 1995, 7, 773-780.
Ма[ег /[.1.. — Зет. Оеу. Ва., 1994, 5, 183-190.
Мазш У. — Оеуеорт. Отомй & ОШ, 1991, 33, 543-551.
Мигау АМ., Кизсппег МЛ. — Майше, 1989, 339, 275-280.
Мемуроп /.\/., Кизсппег М.\/. — Се!, 1984, 37, 731-742.
№е
Е.А. — ВюЕззауз,
1995, 17, 471-480.
Мигзе Р. — Мафиге, 1990, 344, 503-508.
Кее4 $. — Тгеп5 Сепет., [991, 7, 95-99.
Кее4 $. — Вюспепз. ВорНуз. Аща, 1996, 1287, 151-153.
Эйегг С.7. — Сей, 1993, 73, 1059-1065.
Знегг С.Т. — ТТВ5, 1995, 20, 187-190.
Зоотоп
М.Г., С1оег
М., [ее Т.Н., Рыйрре М., Кизсипег М.\/. — Сей,
1990, 63, 1013-1024.
Хопв У., СоппойЙу Т., ЕщеНег В., Веасп О. — СеН, 1991, 65, 691-699.
ГЛАВА [Х. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ, СТАРЕЮЩИХ И
НЕОПЛАСТИЧЕСКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ
ПОПУЛЯЦИЯХ КЛЕТОК
Пролиферативный ответ клеток на действие митогенов
в функционально специализированных популяциях
Регуляция размножения клеток в условиях их функциональной специализации отличается рядом особенностей. Для того,
чтобы понять, как она осуществляется, необходимо иметь
представление о внутриклеточных сигналах, обеспечивающих
репрограммирование генома при переходе дифференцированных покоящихся клеток к пролиферации. Как известно, дифференцировка — это биологический процесс, приводящий к
появлению стабильных фенотипических изменений, отражающих специфическое функционирование.
Пролиферативный ответ клеток, не выполняющих в состоянии покоя специфических функций, и функционально специализированных клеток на действие митогенов во многом сходен, но обладает и чертами различия. Основное сходство заклю .
чается в обратимости состояния покоя, независимо от характера
клеточной специализации, что было установлено в опытах по
слиянию клеток (Нагг, 1965; В пвег2, Зауаве, 1976). Даже при
такой крайней форме инактивации хроматина, какая набл!одается в сегментированных кольцевидных ядрах перитонеальных
гранулоцитов, последние могут быть реактивированы в гетерокарионах с пролиферирующими клетками, если те содержат
достаточное количество индукторов синтеза ДНК (табл. 12).
В то же время функционально специализированные клетки
отличаются от неспециализированных тем, что их ядрам требуется больше времени для завершения пререпликативных реакций. Это наблюдается и в тех случаях, когда они находятся в
общей цитоплазме с ядрами неспециализированных клеток. В
отличие от покоящихся клеток, не выполняющих специфическую функцию, специализированные покоящиеся клетки, как
правило, не подавляют синтез ДНК в ядрах пролиферирующих
клеток в гетерокарионах
(рис. 50), что может быть связано с
отсутствием или недостаточным количеством эндогенного ингибитора пролиферации. Поддержание состояния покоя в спе-
Таблица 12. Примеры инициации сиитеза ДНК в ядрах покоящихся клеток статичных популяций (К), реактивированных после
слияния с пролиферирующими (Р) клетками
Тип
ВКа-клеток
Тип
Куриные эритроциты
Спермии кролика
Перитонеальные макрофаги,
гранулоциты и тучные
клетки мыши
‚
Р-клеток
Клетки
Неа
Клетки
китайского
хомячка
Диплоидные клетки человека \!1-38
Клетки сирийского хомячка
Клетки Не! а
Клетки меланомы
| -клетки
Клетки 3Т3-4Е
циализированных клетках осуществляется главным образом за
счет репрессивного состояния хроматина и инактивации генов,
экспрессия которых необходима для ответа на митогенный
стимул (см. главу Х).
р
:^-
А
22
‚Ра
хи
д А
рованных
(К)
неспециализиро-
ВАА
_
Рис. 50. Пове
дение специализиванных
и
(В) покоя-
щихся клеток в гетерокарионах
с
Б
х
—
пролиферирующими
(Р)
клетками.(А}
оба ядра
синтезируют ДНК
в гетерокарионе;
(Б) оба ядра’ не
синтезируют ДНК
в гетерокарионе;
® — ингибитор пролиферации;
А — стимулятор
пролиферации.
Углубление специализированных клеток в состояние покоя
Сопоставление пролиферативного ответа специализированных и неспециализированных клеток и поведения их ядер в
гетерокарионах привели к представлению о начальном и установившемся состояниях пролиферативного покоя.
В отсутствие митогенов клетки на первом этапе вступают в
начальное состояние покоя, которое поддерживается за счет
активных метаболических процессов (см. главу [\), включая
образование ингибитора пролиферации. Культивируемые фибробласты способны переходить только в начальное состояние
покоя, и при стимуляции в них быстро возобновляются пролиферативные процессы. Другие клетки, например, лейкоциты,
постепенно переходят в глубокое состояние покоя. В них
наблюдается сильная конденсация хроматина, они прекращают"
или почти перестают вырабатывать ингибитор пролиферации и
в конечном счете теряют способность реагировать на внеклеточные факторы роста. В то же время такие клетки могут
возобновлять синтез ДНК при слиянии с активно размножаю щимися клетками, содержащими достаточное количество индукторов пролиферации. Такой тип пролиферативного покоз
получил название установившегося, или неактивного состояния покоя.
Представление о способности клеток углубляться в состоя -
ние покоя первоначально было высказано Базергой и Аугенлихтом применительно к характеру пролиферативного ответа культивируемых клеток на стимул в зависимости от времени, проведенного ими в состоянии покоя (см. главу 1). Специанизированные клетки, как мы видим, также могут углубляться в
состояние покоя. При этом в процессе специализации клетки
обязательно проходят через начальное состояние покоя, общее
для всех клеточных типов и характеризующееся наличием
эндогенных ингибиторов пролиферации. На пути к терминальной дифференцировке специализированные клетки перехолят в
установившееся состояние покоя, когда в них отсутствуют (или
имеются в недостаточном количестве) ингибиторы, а размножение подавлено в результате инактивации генов пролиферативного ответа (рис. 51).
О способности специализированных клеток углубляться в
состояние покоя свидетельствуют, в частности, данные опытов
Скотта
и соавторов
(\/Ше,
Зсоц,
1982;
\Мег,
$соц,
1986),
детально изучивших соотношение процессов нетерминальной и
терминальной дифференцировки и прохождения клеточного
цикла на модели проадипоцитов, дифференцирующихся в жировые клетки (адипоциты) при культивировании в среде с
различными компонентами плазмы крови. Для экспрессии
® —
Рис. 51. Развитие состояния
ингибитор пролиферации,
покоя при клеточной специализации.
А — стимулятор пролиферации, Р —
пролиферация, В. — начальное состояние покоя, В, — установившееся
состояние покоя.
дифференцированного фенотипа проадипоциты должны находиться в определенном пункте (С) периода С, клеточного
цикла (рис. 52), откуда их можно стимулировать для возобнов-
ления пролиферации
дифференцировке
или же индуцировать к нетерминальной
(пункт
С..).
При
адекватных
воздействиях
нетерминально дифференцированные клетки могут либо снова
переходить к пролиферации,
либо претерпевать терминальную
дифференцировку с утратой способности к размножению.
Среди специализированных клеток взрослого организма существует много промежуточных вариантов активного и неактивного состояния покоя. В частности, гепатоциты интактной
печени способны вырабатывать ингибиторы клеточной пролиферации и в то же время в них почти не экспрессируются гены
в
(м)/
У
в
[]
Рис.52.
С
ТО
Соотноше-
ние процессов пролиферации, нетерминальной и Терминальной
дифференцировки
на
(в,)
(в,)
(5)
примере превращения
проадипоцита в адипоцит (по данным лаборатории Скотта). М, С,
$, С, — периоды кле-
точного
цикла;
С,
—
пунктначала дифферен-
цировки; С, — нетерминальная дифференцировка; ТО — терминальная
дифференцировка.
пролиферативного ответа. Клеточная популяция может быть
гетерогенна и содержать в себе клетки, находящиеся как в
начальном, так и вустановившемся состоянии покоя. Промежуточные варианты отражают развитие этого состояния в процессе специализации клеток.
Особенности пролиферации стареющих клеток
Под старением клеток вне организма понимается существование предельного срока культивирования, выраженного числом пассажей, или удвоений клеточной популяции (роршанон
ЗочбИтЕ Ите). Этот феномен был впервые описан Хейфликом
и Мурхедом (Нау ск, Мооеаа, 1961), которые определили,
что для диплоидных эмбриональных фибробластов человека
данный показатель составляет около пятидесяти пассажей. При
этом культура проходиттри стадии развития: первичная культура (клетки, изолированные изткани донора); растущая культура
(пролиферирующие клетки); стареющая культура (постепенная
утрата пролиферативного потенциала). Таким образом, основной характеристикой стареющей культуры служит снижение
способности клеток к размножению (см. обзор: Сатр!з1, 1996).
В процессе дальнейших исследований было отмечено замет-
ное сходство в метаболизме стареющих и покоящихся клеток.
Уже на 30-40 пассажах культуры фибробластов можно наблюдать снижение способности
клеток к репликации ДНК и
мат-
ричной активности хроматина, падение проницаемости плазматической мембраны к малым молекулам, повышение скорости
обновления РНК
катаболизма.
и
белков,
а также
активности
ферментов
Подобно покоящимся клеткам ранних пассажей, стареющие
клетки вырабатывают ингибитор пролиферации. В гетерокарионах, образующихся при слиянии нормальных, активно пролиферирующих и стареющих диплоидных фибробластов человека,
всегда доминирует фенотип стареющих клеток (Зет, Уап<Веу5Ку,
1981). Это проявляется в подавлении синтеза ДНК в ядрах
пролиферирующих клеток, находящихся в общей цитоплазме
со стареющими клетками, и свидетельствует о том. что последние содержат факторы, препятствующие вступлению ядер в 5период. По мере старения клеток уровень эндогенного ингибитора пролиферации возрастает. Тем не менее ядра стареющих
клеток могут быть реактивированы в гетерокарионах с клетка-
ми, в которых содержание индукторов синтеза ДНК очень
велико, например, с фибробластами, трансформированными
ДНК-содержащими вирусами, или с клетками Не[а, отличающимися высокой степенью злокачественности (см. заключительный раздел главы).
Вместе с тем, между свойствами покоящихся клеток на
ранних пассажах культуры и стареющими клетками имеются
существенные различия. Скорость обновления РНК и белков в
стареющих клетках не уравновешивает их образования, что
вызывает избыточное накопление этих макромолекул в клетке
и вусловиях низкого уровня синтеза ДНК
приводит к несбалансированному росту. Поэтому стареющие клетки увеличены в
размерах, в то время как постмитотические покоящиеся клетки
ранних пассажей обычно мельче пролиферирующих. Эти данные говорят о том, что при старении существенно повреждается
механизм, поддерживающий жизнеспособность клеток в состоянии пролиферативного покоя.
Действительно, в стареющих клетках изменен состав белков,
по сравнению с покоящимися клетками. Если маркером покоящихся клеток служит статин — белок с мол. массой 57 кд (см.
главу 1\), то маркер стареющих клеток, названный терминином, хотя и имеет такую же мол. массу, но распознается другим
антителом (\У/апё, Тотазте\зК1, 1991). Установлено также снижение экспрессии генов ха; по мере старения клеток.
В стареющих клетках нарушается цепочка ранних событий
пролиферативного ответа, и они, в отличие от покоящихся,
постепенно перестают реагировать на факторы роста (Битп,
Сатр:ч, 1994}. Наблюдается снижение активности ферментов,
участвующих в передаче митогенного сигнала, таких как фосфолипаза и протеинкиназа С, а также неспособность некоторых
МАР-киназ К «двоякому» фосфорилированию. Стареющие клетки не могут экспрессировать ген /05 по причине гиперфосфорилированного состояния фактора, реагирующего на сыворотку
(5КЕ), что препятствует его связыванию с промотором {5 (см.
главу УП). В то же время другие гены раннего пролиферативного
ответа экспрессируются. Это позволяет считать нарушение
экспрессии гена /05 одним из специфических признаков старения клеток.
В процессе старения затрагивается также и прохождение
клетками периода С, Несмотря на то, что общее количество
циклинов
и зависимых от них протеинкиназ не претерпевает
изменений, в образуемых комплексах СОК2/циклин Еи СОК4/
циклин О киназы находятся в нефосфорилированном состоя-
нии, и, следовательно, комплексы остаются неактивными. Это
приводит к тому, что стареющие клетки не могут перейти пункт
ограничения, завершить прохождение периода С/ и вступить в
$-период (РиШ6 е{ а1., 1993).
Утрата способности реагировать на факторы роста присуща
как стареющим, таки терминально дифференцированным клеткам, находящимся в состоянии глубокого пролиферативного
покоя (рис. 53). Однако отсутствие способности к размножению
поддерживается
в них
разными
Факторы
роста
механизмами.
Инактивация
Рис.53. Особенности пролиферирующих, покоящихся
клеток в пролиферативном
ответе на митоген.
и стареющих
Р — пролиферирующая
клетка, В — покоящаяся клетка, К, — клетка в установившемся
состоянии покоя, В, — стареющая клетка, Х — знак слияния клеток.
А — стимулятор пролиферации;
® — ингибитор пролиферации,
отсутствие реакции па фактор
==>—
роста;
факторы
—
стрелки
толстые
роста; тонкие стрелки — переход клетки из одного состояния в другое.
генов пролиферативного ответа в функционально специализированных клетках, не вырабатывающих ингибитор пролиферации, происходит, главным образом, вследствие сильной конденсации и утраты матричной активности хроматина, а также
других метаболических изменений, которые, как правило, могут быть преодолены в условиях, не встречающихся в пределах
целого организма, например, при слиянии с активно пролиферирующими клетками. Ядра стареющих клеток также могут
быть реактивированы в гетерокарионах с пролиферирующими
клетками, содержащими большое количество индукторов синтеза ДНК, но лишь до определенного возрастного предела. В
отличие от терминально дифференцированных клеток, стареющие клетки содержат в большом количестве эндогенный ингибитор пролиферации, блокирующий передачу митогенного сигнала и не позволяющий регуляторным молекулам осуществлять
инициацию и прохождение клеточного цикла. Поскольку иу
стареющих, и у терминально дифференцированных клеток
нарушен механизм поддержания жизнеспособности в отсутствие самовоспроизведения, присущий покоящимся клеткам, и
те и другие в конечном счете обречены на гибель.
Представление
терминальной
о
Аноптоз
гибели клеток
дифференцировки
как
завершающей
(Сг5юЁ1о,
1977)
фазе
приобрело
новое звучание в связи с интересом к явлению, получившему
название «апоптоз» (от греч. ало — от, лтос — падение), под
которым подразумевается физиологическая (программированная)
гибель
клеток,
например,
сбрасывание
хвоста
при
мета-
морфозе амфибий, листопад и др. Термин апоптоз был предложен Уайли и соавторами (\/уШе её а[., 1980) для того, чтобы
подчеркнуть морфологические различия между процессом физиологической гибели клеток (сморщивание клетки, межнуклеосомная фрагментация ДНК, дезинтеграция мембран) и некро-
зом (набухание клетки и разрыв мембраны
с выбрасыванием
клеточного содержимого). Однако детальное изучение апоптоза
началось лишь двадцать лет спустя, когда были охарактеризованы гены и продукты их активности, участвующие в регуляции
этого процесса у млекопитающих,
Выяснилось, что продукт протоонкогена с-тус индуцирует
апоптоз в покоящихся фибробластах. После индукции апоптоза
клетки ведут себя вначале сходным образом с клетками, получившими стимул к пролиферации, то есть они проходят этап ранних
пререпликативных реакций, однако в дальнейшем процесс завершается абортивно. При этом отмечается нарушение фосфорилирования основных регуляторных молекул, а также падение
содержания статина и других ингибиторов пролиферации клеток.
Апоптоз, индуцированный протоонкогеном с-тус в культуре
фибробластов, может быть подавлен с помощью РОСЕи
инсу-
линоподобных факторов роста, причем этот эффект не связан с
их митогенным
действием,
поскольку
он
проявляется
в любом
периоде клеточного цикла. Таким образом, указанные соединения способны, наряду со стимуляцией размножения клеток,
выполнять своеобразную функцию «факторов выживания». Для
клеток-предшественников гемопоэтической системы факторами
выживания служат отдельные интерлейкины, для клеток эндотелия — компоненты внутриклеточного матрикса.
В подавлении апоптоза лимфоцитов и некоторых других
типов клеток принимает участие продукт протоонкогена 2с/2
{цитоплазматический
белок Вс!2, вырабатываемый
В-лимфо-
цитами), который способствует переходу клеток в состояние
покоя и одновременно повыщает их жизнеспособность. Ген 5с/2
является представителем семейства генов, продукты которых
участвуют в регуляции апоптоза. Конститутивная повышенная
экспрессия белка Вс12 защищает клетки от сигналов, вызывающих их физиологическую и патологическую гибель (см. обзоры:
ОзБогте, ЭсИ\апт, 1994; Еуап е{ а|., 1995).
Механизмам апоптоза присуща эволюционная консервативность. Близким гомологом гена 6с/2 считается ген сеё9, предотврашающий апоптоз у беспозвоночных.
Особенности клеточной пролиферации в опухолях
и неопластически трансформированных культурах клеток
Превращение нормальной клетки в злокачественную представляет собой сложный многоэтапный процесс, который затрагивает разные стороны жизнедеятельности клетки, изменяет
ее структуру и метаболизм и отражается на функционировании
и взаимодействии клеток друг с другом как в ближайшем
окружении, так и в пределах всего организма. Поэтому биология раковой клетки — такая обширная тема, что ее с трудом
можно вместить в отдельный курс лекций. В рамках же насто-
ящего курса целесообразно сосредоточиться на нескольких
принципиальных вопросах, имеющих непосредственное отношение к клеточному циклу. Среди них можно выделить следующие: особенности пролиферации неопластических клеток и
нарушение регуляции размножения клеток в процессе канцерогенеза (вторая группа вопросов будет рассмотрена в Х главе).
Поскольку приобретение злокачественности — это конечный
результат сложного, иногда длительного процесса, его принято
в совокупности называть неопластической трансформацией.
Этот термин охватывает все этапы малигнизации клетки, начиная с самых ранних стадий канцерогенеза.
Изучение параметров клеточного цикла в опухолях мало что
дало для понимания процесса неопластической трансформации. Продолжительность клеточного цикла зависит от вида
опухоли, ее происхождения и степени прогрессии, причем
существенных сдвигов во времени генерации клеток, как правило, не наблюдается. В этом нет ничего удивительного, поскольку механизмы регуляции размножения клеток в сформированном организме действуют, главным образом, на этапах
смены состояний активной пролиферации и пролиферативного
покоя.
Для
понимания
сущности
изменений
в системе
такой
регуляции необходимо знать, может ли трансформированная
клетка переходить в состояние покоя и вступать в митотический
цикл под влиянием адекватных стимуляторов — факторов роста.
Всесторонний анализ клеточной кинетики опухолей, прове-
денный Стилом (Этее[, 1977), позволил сделать заключение, что,
помимо клеток, не способных проходить митотический цикл по
причине нарушенного кровоснабжения и недостатка питательных веществ, в опухоли присутствуют и покоящиеся клетки,
которые не пролиферируют в силу действия тех же механизмов
регуляции, что и в клетках нормальной ткани, из которой
произошла опухоль. На более поздних стадиях ее развития
решающим фактором, препятствующим прохождению цикла,
становится недостаток питания, приводящий к необратимым
изменениям клеток и некрозам. Поскольку наличие и поведение покоящихся клеток в растущей опухоли определяется
степенью сохранности дифференцированных участков исходной ткани (что варьирует от случая к случаю), их изучение
сталкивается с определенными трудностями. Последние могут
быть преодолены при использовании клеточных линий, проис-
ходящих из первичных опухолей, а также культур клеток,
трансформированных химическими веществами или вирусами.
Известно, что культивируемые клетки, трансформированные различными агентами, значительно меньше зависят от
экзогенных факторов роста, чем нетрасформированные. Одна-
ко они
утрачивают
не полностью
состояние
(табл.
покоя
13).
способность
Радикальную
в
к переходу
механизма,
утрату
обеспечивающего пролиферативный покой, претерпевают только
вирусами, в
клетки, трансформированные ДНК-содержащими
то время как при трансформации РНК-содержащими вирусами
или канцерогенами этот механизм частично сохранчется,
Сходным
образом
ведут себя
неопластически
трансформи-
рованные клетки при слиянии с нормальными покоящимися
клетками того же типа. Если в гетерокарионах оказываются ядра
перешедших
фибробластов,
в
состояние
в условиях
покоя
низкого содержания сыворотки в среде, и ядра клеток, трансформированных канцерогенами или РНК-содержащим вирусом, то последние не синтезируют ДНК, то есть они переходят
Таблица 13. Утрата способности клеток 5\155 ЗТЗ и \\-38
к переходу в состояние покоя (К) при неопластической
трансформации
Клетки
Способность к
переходу
Поведение ядер нор-
в К
мальных
фибробластов
и
гетерокарионах при
слиянии с трансформированными клетками
Нормальные
фибробласты
Переходят в К при
содержании 0,1-0,5%
сыворотки в среде
--``--
Рисрм Х Киом
(контроль)
Трансформированные
Переходят в К только прн
Рух Коли > К
вирусом саркомы
|очень низком (0,01-0,02%}
содержании сыворотки в
среде
Трансформированные
бенз(а)пиреном
Рауса
Трансформиронанные
Рух
Не способны к переходу в К
— К
Киорм — К
|Рих Виры — Р
вирусом $\-46
Примечание:
Р
—
пролиферирующие
клетки,
К
—
покоящиеся
клетки, Х — знак слияния клеток, тр — трансформированные, порм —
нормальные; остальные объяснения в тексте.
в состояние покоя. Напротив, слияние покоящихся фибробластов
с клетками,
вирусами,
или
трансформированными
с клетками
линии
Неа,
ДНК-содержащими
вызывает
индукцию
синтеза ДНК в ядрах нетрансформированных клеток, содержащих большие количества эндогенного ингибитора пролиферации (51ет, Уап15ПеузКу, 1982).
Из всего сказанного следует, что клетки опухолей, а также
неопластически трансформированные клетки в культуре могут
(по крайней мере до определенного предела малигнизации)
переходить в состояние пролиферативного покоя. Это свидетельствует о частичном сохранении втаких клетках механизмов,
регулирующих их размножение. Вместе с тем, состояние покоя
трансформированных
клеток несколько отличается по метабо-
лическим характеристикам от состояния покоя нормальных
клеток того же типа. Различия касаются степени конденсации
хроматина, энзиматического профиля, отдельных звеньев образования макромолекул и структуры внутриклеточных компонентов
(подробно
см. Епифанова и др.,
1988). Однако
они
не
затрагивают основного свойства покоящихся клеток — способности возврата к пролиферации
при адекватных условиях. Это
обстоятельство необходимо учитывать в терапии опухолей во
избежание их рецидивов, поскольку покоящиеся клетки значительно более устойчивы к повреждающим воздействиям, по
сравнению с пролиферирующими, в силу особенностей своего
метаболизма
(см. главу ГУ).
Литература
Епифанова
О.И.,
Полуновский
В.А., Терских
В.В. — «Регуляция
раз-
множения клеток в процессе специализации, старения и неопластической трансформации»,
М., ВИНИТИ,
1}, 1988.
Сатр!з! 7. — Сей, 1996, 84, 497-500.
Итоги науки и техники, т.
|
Сизюо У.Т, — п: «Зепезсепсе. ОопитапЕ ог Кесезчуе ш Зотайс Сей
Сго$$?» (ЕЗ. Бу \МЛ. №спо[$ апд О.Ц. Мигрву), М.Х., Репит Ргезз,
1977, 13-21.
Отит @.Р., Сатр!з! 7. — Ехр. СеЙ Кез., 1994, 212, 132-140.
Би \У., ОИ арег [..Е., 1ее$ Е., Веед 5., Мет С.Н. — Ргос. Май Асад.
$с1. ОЗА,
1993, 90, 11034-11038.
Еуап С.[., Вго\ип [.., УМнуе М., Нагииеюп Е. — Си. Орт. Се! В+,
7, 825-834.
Нагиз Н. — Мацие,
1965, 206, 583-588.
1995,
Науйск 1., Моогвеад Р.$. — Ехр. Сей Вез., 1961, 25, 585-621.
ОзБогпе В.А., ЗсИ\апх Т.М. — Тгепдз Сей В!ю., 1994, 4, 394-399.
Втрег2 М.К., Зауаве В.Е. — «Сей Нубии», М.У., Асадепис Ргезх, 1976.
ЗЕее[ О.С. — «Отоми ЮКтейс$ оГТитоцсз», Охга, Сагепдоп Ргез, 1977.
Зет О.Н., Уап!5ВеузКу В.М. — Ргос. Ма| Асад. $1. ОЗА, 1981, 78, 3025-
3029.
$еш @.Н., УашзНеузКу В.М. — Ргос. Ма Асад. 51. ЗА,
5291.
У!апе Е., Тотазтем$Ю
@, — Г. Сей. Рвузо\.,
1991,
1982, 79, 5287-
147, 514-522.
\УЛег М.Т., $сойи В.Е. — Г. Сей Вю, 1986, 102, 1955-1964.
МУЛИНЕ 1.Г., $сои К.Е. — .. СеИ. Риузю., 1982, 112, 115-122.
Ууе А.Н., Кег 7.Е.В., Сигпе А.В. — 1мегл. Веу. Сук, 1980, 68, 251306.
ГЛАВА Х. НАРУШЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ
КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА ПРИ
НЕОПЛАСТИЧЕСКОЙ
ТРАНСФОРМАЦИИ
КЛЕТОК И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ФАКТОРЫ,
СЛЕРЖИВАЮЩИЕ ЭТОТ ПРОЦЕСС
Изменения в передаче митогенного сигнала в ядро при
неопластической трансформации клеток
Как уже отмечалось, неопластические клетки значительно
меныше зависят от присутствия в среде полипептидных факторов
роста, чем нормальные клетки. Это происходит потому, что в
процессе трансформации они сами начинают вырабатывать и
выделять в среду факторы роста, для которых на их поверхности
имеются специфические рецепторы. Эндогенное образование
факторов роста становится постоянным стимулом пролиферации
трансформированных клеток, и уних постепенно начинает преобладать аутокринный тип регуляции клеточного размножения,
наблюдаемый на ранних стадиях эмбрионального развития организмов (см. главу УПТ). В процессе приобретения клетками
злокачественности может меняться химическая структура отдельных факторов роста, а также их взаимодействие с рецепторами.
Для того, чтобы представить себе возможные нарушения в
системе фактор роста -- рецептор, необходимо иметь в виду, что
полипептидные факторы роста обладают, как правило, значительно более широким спектром действия, чем это предполагалось раньше (когда им были даны названия), фактически
являясь мультифункциональными агентами. Это означает, что
один и тот же фактор роста может выступать в роли стимулятора
или ингибитора клеточной пролиферации, а также проявлять
физиологическую активность, не имеющую отнощенияк пролиферации. Характер действия факторов роста определяется
совокупностью внутриклеточных условий, конкретно — присутствием других факторов роста, состоянием активируемых
ими сигнальных молекул, а также особенностями функционирования рецепторов: их аффинностью к факторам роста и
соотношением концентрации факторов роста и рецепторов в
общем микроокружении (Гуревич, 1997).
На рис. 54 схематически изображены разные ситуации, при
которых может происходить нарушение передачи митогенного
ТСЕ-а
1СЕ-И
ЕСЕ
Инсули
®
ТСЕ-а,
ТСЕ-И
[
[>
Е-с
ТСЕ-а
СЕЛ
РОСЕ
Рис. 54. Возможные модуляции в передаче сигнала от факторов роста
через рецепторы в клетку: (А) уменьшение числа рецепторов; {Б)
трансмодуляция рецепторов; (В) наличие
мультифункциональных
рецепторов (два лиганда — один рецептор); (Г) индивидуальные рецепторы для разных субъединиц одного и того же фактора роста (один
лиганд — два рецептора). ЕСЕ, ТС Е-а, инсулин, О Е-1, СЕ-И, РОСЕ
— факторы роста (объяснение в тексте).
сигнала на этапе фактор роста — рецептор. Рис. 54А показывает
случай уменьшения (до\уп-герШаНоп) числа рецепторов к кенкретному фактору роста (ЕСЁЕ) под влиянием гомологичного
лиганда (ТОЕ-а), который постепенно вытесняет ЕСГ. При
этом рецепторы восстанавливаются прежде, чем они деградируют, и вновь связываются с ТОЁЕ-а, благодаря более интенсивному фосфорилированию по остаткам тирозина, чем это происходит при связываниис
ЕСР. Рис. 54Б отражает феномен перерас-
пределения рецепторов в пользу одного фактора роста (например,
10 Е-П) под влиянием другого фактора роста (инсулина),
который непосредственно не связывается с рецепторами к
первому фактору. Этот феномен получил название трансмодуляции. Рецепторы, как и факторы роста, могут быть мультифун-
кциональными, то есть содержать в своей молекуле участки для
связывания разных лигандов (например, 1СЕ-Ги ЮЕ-П). Этот
случай изображен на рис 548. Вместе с тем, к разным субъединицам (А и В) одного и того же фактора роста — РОСЕ,
существуют,
как это уже было описано
в главе \, отдельные
рецепторы (а и В), причем а -рецепторы способны связывать все
три формы РОСЕР (А-А, А-В, и В-В), а В-рецепторы — только
форму В-В (рис. 54Г). Такой фактор роста, как ТСЕ-В, облада-
ющий ярко выраженными мультифункциональными свойствами, осуществляет передачу сигнала через систему взаимодействующих друг с другом рецепторов (на рисунке не показано).
При этом рецепторы типа Т отвечают за действие ТСЕ-В на
внеклеточный матрикс (подготовка микроокружения клетки), а
рецепторы типа И (в комплексе с рецепторами типа Г) участвуют
вопосредовании сигналов, регулирующих размножение клеток.
Благодаря этим многообразным свойствам комплекса фактор роста — рецептор, в клетке возникает сложный сигнальный
язык (сго$$-аК), в котором отдельные полипептиды выполняют
роль букв алфавита или кода. Малейшие нарушения в структуре
этого языка могут повлечь за собой изменение всей системы
сигнализации и соответственно внутриклеточного гомеостаза,
что может отразиться в конечном счете на темпах пролиферации клеток.
Рассмотрим это на примере взаимодействия двух факторов
роста
—
ТСЕ-а
и
ТСЕ-В
в
процессах,
происходящих
при
регенерации печени (Еаи$фо, Меад, 1989), где в полной мере
проявляются и аутокринный, и паракринный типы регуляции
размножения клеток. В упрозценном виде картина выглядит
следующим образом (рис. 55). Нормальный гепатоцит интактной печени не вырабатывает ТОЕ-В, однако содержит на своей
поверхности рецепторы, специфичные к нему, а также рецепторы,
специфичные
к ЕСЕ.
Поскольку
ТСЕ-В
образуется
в
соседних с гепатоцитами клетках эндотелия печени, он, будучи
ингибитором пролиферации, может легко уравновешивать стимулирующее действие других факторов роста, в том числе ЕСЕ.
В данном случае имеет место сбалансированная регуляция по
аутокринному и паракринному способам. При регенерации
печени после повреждающего воздействия в гепатоцитах наблюдается резкое снижение числа рецепторов к ЕСЁЕ, так как их
занимает ТОЕ-а, образование которого начинается через 12 час
после гепатэктомии. Максимальное содержание ТОЕ-о в реге-
мах тре
шах ["?
я
|=
|-]
Е
©
-=
[-]
Хх
в
8
8
24
‹ 36
96
Часы после гепатэктомпи
=”
Гепатоцит
ТСЕ-В
Паракринная
петля
ТСЕ-а
эндотелля
Аутокринная
петля
Рис.55. Аутокринная и паракринная регуляция размножения клеток
в печени крысы (по данным Фаусто и Мида), объяснения в тексте.
----
синтез ДНК
в гепатоцитах;
синтез ДНК
в клетках эндотелия.
нерирующей
печени совпадает с пиком синтеза ДНК в гепато-
цитах. Напротив, количество ТСЕ-В остается в это время
низким и начинает нарастать лишь спустя сутки после гепатэктомии, причем максимум ТСЕ-В наблюдается во время пика
синтеза ДНК
в клетках
эндотелия.
При
нормальном
течении
регенерационного процесса паракринный тип регуляции размножения клеток уравновешивает регуляцию по аутокринному
тилу. Смещение процесса в сторону преобладания аутокринного типа регуляции (например, вследствие недостаточного образования ТСОЕ-В) может приводить к необратимому повреждению всего контура обратных связей (Рее4-БасК сисий) и выходу
клеточного размножения из-под контроля регуляционных систем.
Вместе с тем способность клеток к самостоятельной выработке факторов роста, равно как и отклонения от их нормального взаимодействия с рецепторами, сами по себе не являются
достаточным и обязательным условием неопластической трансформации, поскольку клетки, как будет ясно из дальнейшего,
располагают мощным арсеналом метаболических реакций, противодействующих этому процессу.
При неопластической трансформации клеток могут затраги-
ваться отдельные звенья передачи митогенного сигнала в ядро
на уровне вторичных посредников. В частности, наблюдается
конститутивная активация протеинкиназы С в клетках, трансформированных
ментов,
вирусами,
принимающих
а также усиление
активности
фер-
участие в каскаде фосфорилирования
МАР-киназ и факторов транскрипции, с последующей экспрес-
сией генов раннего
протоонкогенов.
пролиферативного
ответа,
в том
числе
Экспрессия протоонкогенов при неопластической
трансформации клеток
Представления о причинах активации протоонкогенов в
процессе канцерогенеза опираются на две гипотезы, не исключающие
друг друга. Одна
из них
предполагает,
что протоонко-
гены преврашаются в трансформирующие гены в результате
мутации. Согласно другой гипотезе, получившей название «дозы
гена», различие между обычными и активированными протоонкогенами носит количественный характер и заключается в
усилении транскрипции неизмененных протоонкогенов, участвующих в инициации и прохождении клеточного цикла (см.
главу УТ, а также обзор Епифановой и др., 1988).
Как уже было отмечено в главе У, в 80-х годах появилась
надежда на реальный прорыв в изучении причин злокачественного перерождения клеток, когда было установлено, что про-
дукт протоонкогена 55 гомологичен В-цепи РОСЕЁЕ, а продукт
протоонкогена её В гомологичен части рецептора ЕСЕ. На
страницы научных журналов хлынул поток сообщений о повышенной экспрессии протоонкогенов при различного рода новообразованиях, а также в неопластически трансформированных
культурах клеток, причем подразумевалось причинная зависимость между указанными процессами. Однако все оказалось не
так просто. Рассмотрим это на нескольких примерах.
В некоторых случаях клетки, трансформированные вирусом
саркомы обезьяны (у-55), начинают секретировать в окружаю-
шую среду РОСЕ-
подобные
молекулы,
и на их поверхности
появляются рецепторы к РОСЕ, что указывает на возникновение аутокринного типа регуляции, характерного для неопластических клеток. Однако в других случаях трансформация тем же
вирусом клеток, претерпевающих злокачественное перерождение, не сопровождается секрецией РОСЕ, что не позволяет
рассматривать повышение экспрессии протоонкогена 5/5 как
непременное условие, предваряющее неопластическую трансформацию.
В ряде опухолей человека обнаружена амплификация протоонкогена е/ЪВ и усиление экспрессии его продукта, гомологичного внутреннему домену рецептора ЕСЕ. Однако остается
неясным, является ли усиление продукции рецептора ЕСЕ причиной или следствием неопластической трансформации клеток.
В равной мере это рассуждение можно применить и к
случаям амплификации в опухолях других протоонкогенов,
например, гена 5/с, продукт которого фосфорилирует мембранные фосфолипиды, гена газ, сопровождающейся повышенной
экспрессией его продукта — онкобелка р21, а также гена тус,
продукт которого участвует в трансактивации многих генов. Для
проявления трансформирующей активности онкобелка р21 необходима мутация гена /а5, в то время как активация гена /нус
иего продукта — рб5 достигается главным образом посредством
увеличения числа копий гена. Совместная трансфекция фибробластов генами га; и тус приводит к их неопластической
трансформации, в то время как по отдельности эти гены
неактивны. Наблюдаемый эффект, получивший название «трансформирующего воздействия», комплементарен, а не аддитивен.
Затрагиваемые при этом процессы включают в себя активацию
комплекса СОК2/циклин Б и фактора транскрипции Е?Ё (1еопе
ега|., 1997). Практически протоснкоген газ никогда не вызывает
при трансфекнии в клетки их полную неопластическую трансформацию. Для достижения этого результата необходимы дополнительные условия, например, подготовка микроокружения
клетки, а также воздействие на систему внутриклеточных ингибиторов пролиферации, что позволяет устранить факторы паракринного и аутокринного негативного контроля, противодействующие трансформации клеток (см. следующий раздел).
Данные, представленные в настоящем разделе, позволяют
заключить, что неопластическая трансформация клеток не
может быть следствием только повышенной экспрессии протоонкогенов, которая отражает лишь одно из многочисленных
нарушений метаболизма в процессе канцерогенеза.
Нарушения в системе эндогенной регуляции размножения
клеток при неопластической трансформации и возможность
биологической коррекции
Как уже неоднократно подчеркивалось, в основе регуляции
размножения клеток лежит сложный процесс взаимодействия
экзогенных и эндогенных регуляторов, обеспечивающих смену
состояний активной пролиферации и пролиферативного покоя.
Неопластические клетки частично или полностью выходят изпод контроля этой системы: они начинают сами вырабатывать
факторы роста, в них ускоряется передача митогенного сигнала
и усиливается экспрессия протоонкогенов. Однако этих нарушений недостаточно для превращения нормальной клетки в
злокачественную. То обстоятельство, что неопластическая трансформация
— крайне редкое событие в эволюции
многоклеточ-
ных, свидетельствует о весьма эффективном функционировании внутриклеточных факторов, противодействующих неконтролируемому размножению клеток.
Вместе с тем, в процессе канцерогенеза наблюдается посте-
пенное ослабление системы эндогенного контроля пролиферации клеток. Неопластические клетки теряют способность к
образованию в нужном количестве ингибиторов пролиферации,
атакже чувствительность к их действию, о чем свидетельствуют,
в частности, результаты опытов по слиянию нормальных и
злокачественных
клеток
(см.
главу
ГХ).
В
неопластической
клетке создается более высокий пролиферативный потенциал,
который не в состоянии преодолеть ее собственная система
эндогенного контроля.
Можно ли вмешаться в этот процесс? Попытки восстановления внутриклеточного гомеостаза посредством устранения дефектов, возникающих при неопластической трансформации,
предпринимались неоднократно с ббльшим или меньшим успехом. Один из подходов заключается в воздействии на неопластические клетки природными ингибиторами пролиферации, такими
как
интерферон
бета
(НЕМ-В),
ТОЕ-8
и другими
антипро-
лиферативными соединениями, вырабатываемыми нормальными клетками (см, главу УН), Лучше всего изучен в этом отноше-
нии 1ЕМ-В, который оказывает тормозящее действие на пролиферацию фибробластов и других клеток, препятствуя приобретению ими компетентности для прохождения пререпликативного
периода. При этом 1ЕМ-В ведет себя как антагонист РОСЕ, а
последний, напротив, стимулирует образование ГЕМ-В. В поддер-
жание
гомеостаза
например,
могут вовлекаться
ТОЕ-В,
также
и другие факторы
роста,
образование
ГЕМ-В
стимулирующий
при воздействии на фибробласты. В результате в клетке возникаможет при благопри-
ет каскад регуляторных событий, который
ятном стечении обстоятельств (правильный выбор дозы природного ингибитора в зависимости от исходного состояния клетки.
ее микроокружения ит.д.) восстановить внутриклеточный гомеостаз, благодаря разнообразным реакциям, протекающим по
типу положительной
и отрицательной
обратной связи.
Использование природных антипролиферативных соединений в клинической практике, в отличие от хирургического,
радио- и химиотерапевтического воздействий, относится к методам биологической терапии опухолей. Общий недостаток применения ингибиторов типа ТЕМ-В и ТОЕ-В — постепенная утрата
чувствительности к ним неопластических клеток в силу нарушения при трансформации более тонких регуляторных механизмов.
Например,
клетки
перестают
реагировать
на
ТЕМ
вследствие
дефектов в системе вторичных сигнальных молекул в частности,
в цепочке МАР-киназ. Для проявления антипролиферативного
действия ТОЕ-В на трансформированные клетки необходимо
подавление активности основных позитивных внутриклеточных
регуляторов — циклинов и зависимых от них киназ, что может
происходить только при полноценно функционирующем комплексе рецепторов ТСЕ-В типа [ и типа И
(см. стр. 128). Нарушс-
ние взаимодействия этих рецепторов в неопластических клетках
снижает их реакцию на ТСОЕ-В. Очевидно, что для биологической
коррекции требуются более совершенные способы воздействия
на клетки, претерпевшие неопластическую трансформацию.
Гены-супрессоры опухолей (антионкогены) и продукты
их активности
В
середине
80-х
годов
стали
предприниматься
попытки
обнаружить внутриклеточные антагонисты онкогенов. Удалось
установить, что многие нетрансформированные клетки содержат в определенных хромосомах гены, кодирующие белки,
нормальная функция которых состоит в подавлении неопластической трансформации. Они получили название генов-супрессоров опухолей, или антионкогенов. К настоящему времени
известно лишь несколько таких генов, в то время как число
онкогенов составляет многие десятки.
Лучше всего изучен ген-супрессор АБ, получивший свое
обозначение от названия опухоли — ретинобластомы, которая
возникает вследствие мутации или отсутствия этого гена. Ген АБ
локализован в 13-й хромосоме человека, и его аберрации могут
приводить к появлению разных опухолей. Продукт гена Ав —
белок рВВ (мол. масса 105 кД) присутствует во всех нормальных
тканях и вместе со своими близкими гомологами — р107 и р! 30
— является одним из ключевых элементов внутриклеточного
механизма регуляции размножения клеток.
Об этом свидетельствуют следующие данные.
Белок рКВ присутствует как в пролиферирующих, так и в
покоящихся клетках, однако в последних он находится в дефосфорилированном состоянии и только в таком виде проявляет
себя как ингибитор пролиферации. При вступлении покоящихся клеток в цикл рЁВ подвергается фосфорилированию (особенно интенсивному в позднем периоде С}, пребывая в этом
состоянии на протяжении периодов $ и С,, после чего происходит его дефосфорилирование в митозе (рис. 56). Таким
образом, фактором, препятствующим прохождению клеточного
цикла, служит не наличие или отсутствие молекулы ингибитора,
а ее биохимическая трансформация. Существенно при этом,
что, будучи в нефосфорилированной форме, рКВ тесно связан
с компонентами ядра, а фосфорилирование освобождает его,
позволяя осуществлять другие внутриклеточные функции. Отсюда следует, что важен не только пронесс модификации
ингибитора, но и его перемещение в клетке.
Наконец, еще одним свойством рКВ является его способность образовывать в нефосфорилированном или гипофосфорилированном состоянии комплексы с факторами транскрипции и подавлять таким образом активность генов, продукты
которых участвуют в инициации синтеза ДНК. Это, прежде
всего, комплекс с фактором Е?Е (активатором промотора аденовируса Е2), точнее содним из представителей этого семейства
6,
(в)
(активен)
о
те
6,
|
(неактивен)
Рис.56.
Активность
С,
6,
+
(активен)
Фосфатаза
Хеймелу).
—-®—
5
5,
на
Г 6,
(неактивен)
Циклин-зависимые
РКВ
$
протяжении
С„, М — периоды
цикла,
киназы
клеточного
цикла
(по
С, — состояние покоя.
факторов транскрипции.
Комплекс — рВВ/Е?2Е обнаруживает-
ся
пролиферативного
только
в состоянии
покоя
и раннем
периоде С, исчезая при гипофосфорилировании рВВ. Образо-
вание этого комплекса следует рассматривать как принципиальное событие в осуществлении негативного контроля пролиферации клеток, поскольку сам РЕВ не способен связываться с
ДНК и может препятствовать репликации только путем взаимодействия с другими белками, вчастности, выключая Е2ЁЕ (Меу!пз,
1992; Та Тваприе, 1994).
В фосфорилировании РВВ последовательно участвуют комплексы циклинО/СОК4,6 (осушествляющие гипофобсфорилирование) и циклин Е/СОК2 (вызывающий гиперфосфорилирование), после чего наблюдается
инициация синтеза ДНК
(Е7НеузКу её а, 1997). Сходным образом происходит, повидимому, и фосфорилирование гомолога рКВ — белка р107. В
отличие от рВВ и р!07, третий представитель этого семейства
— белок р130 не подвергается лефосфорилированию при пере-
ходе клеток в состояние покоя, а, напротив,
проходит этапы
ступенчатого фосфорилирования, последовательно образуя ком-
плексы с разными формами фактора транскрипции
Е?2Е. При
этом фосфорилирование р130 осуществляется протеинкиназой,
не относящейся к классу циклин-зависимых киназ и активной
только в покоящихся клетках. Комплекс р130/Е?2Е уникален для
клеток в состоянии покоя и терминальной дифференцировки и
не обнаруживается в раннем пререпликативном периоде после
митогенной стимуляции,
как это наблюдается в случае комп-
лекса рРКВ/Е2Е, который распадается значительно позже, веро-
ятно — в пункте ограничения. Взаимодействие различных форм
белков семейства рКВ создает большие возможности для эндо-
генного
негативного
контроля
обзоры:
МаЙег,
У/етбетге,
1995;
клеточного
1995;
размножения
Вецег«бегреп,
(см.
Вегпаг4$,
1996; Мауо! её а|., 1996).
Еще одним представителем продуктов генов-супрессоров,
достаточно детально изученным, является белок р53, известный
также как активатор апоптоза, благодаря способности к транскрипционному выключению гена дс/2, продукт которого защишает клетки от гибели (см. главу [Х). Другим важным свойством
р53 служит его антипролиферативная активность, проявляющаяся, в частности, в остановке прохождения клетками периода С,
при повреждениях ДНК. В пронессе исследования механизма
ингибирующего действия р53 на размножение клеток выясни-
лось, что в его присутствии происходит транскрипционное
включение гена, кодирующего образование другого белка —
р21, который подавляет активность комплексов СОК/циклин и
как следствие — вступление клетки в 5-период и митоз. Впрочем белок р21 может экспрессироваться и функционировать
независимо от белка р53 (см. обзоры; Сох, Гапе, 1995; СойНеб,
Огеп, 1996).
Белок р21 (не имеющий гомологии с белком р2{1 — продук-
том гена 7а5) был обнаружен в разных типах клеток, в том числе,
в клетках стареющих культур. Эти работы были выполнены
одновременно и независимо в нескольких лабораториях США
и Израиля в конце 1993 года (см. обзор: ЕрШапоуа, ВтоокКс, 1994),
что вывело ученых на открытие нового класса внутриклеточных
антипролиферативных регуляторов — ингибиторов циклинзависимых киназ (сус!п-дерепделЕ Ктазе пН1Иогз, или СК[$).
Ингибиторы циклин-зависимых киназ (СК]$)
Изучение СК развивается так стремительно, что позволяет
уже сейчас получить довольно полное представление об их
действии и сгруппировать по основным свойствам. Как следует
из данных табл. 14, все СК позвоночных могут быть условно
объединены в два семейства — Ср/К!р и ПМК. Эти обозначения
представляют собой сокращенные варианты одного и того же
понятия — ингибитор СОК (например, Ср — СОК-ниегасИпв
ргоет, Кр — Ктазе пЫЬИогу ргоет, ПМК — Клазе шМбиог).
Обилие таких сокращений, равно как и синонимов названий
отдельных ингибиторов, объясняется их быстрым параллельным изучением в разных лабораториях, что не оставляет времени для согласования терминов.
Белок р21 обладает способностью взаимодействовать физически почти со всеми циклин-зависимыми киназами, входящиТаблица
14. Ингибиторы циклин-зависимых киназ (СКТ5)
в клетках млекопитающих
Название
Семейство Ср/Кр
р21
(С1рт, \ай, $41)
Преимущественное
Некоторые свойства
СВЯЗЬ
СРК2/циклин А
СРК2/циклин Е
СРК4,6/циклин Р
1) Продолжительность
полужизни -2ч
2) Участвует в образовании тетрамерных комплексов с СОК/циклинами и РСМА
3) Уровень мРНК и белка возрастает в состоянии покоя и
продолжает увеличиваться в
течение первых часов после
митогенной стимуляции клеток
1) Продолжительность полужизни
-2ч, возрастает до 6-8 чв
состоянии покоя
2) Уровень белка значитёльно возрастает в состоянии покоя, благодаря ускорению трансляции и
пост-трансляционной стабилизации
3) После стимуляции клеток
митогеном уровень белка нсмедленно снижается
р27 (Кр!)
СРК2/циклин А
СОК2щиклин Е
СРК4,6/диклин О
р57 (К1р2)
СРК2/циклии А
СРК2/циклин Е
Характеризуется тканеспецифич-
СОК4,6/циклин О
в дифференцированных
СРК4,6/циклин
|} Белок р16 препятствует сборке
комплекса СОК4,6/циклин Р
2) Уровень р16 низок на
ностью,
В
присутствует,
в основном,
клетках
протяжении пререпликативного
периода после митогенной
стимуляции и возрастает на
границе периодов С1/5
ми в комплекс СОК /циклин, отдавая предпочтение СОК? (см.
обзор: ЗНегг, Кобепз, 1995). В свободном виде р21 отличается
неустойчивостью вторичной и третичной структуры, но приобретает стабильную конформацию при связывании с СОК? и
другими циклин-зависимыми киназами. В его молекуле присутствуют также отдельные участки связывания с циклинами, что
необходимо для подавления киназной активности комплекса
СОК/циклин.
Принципиально
важным
свойством р21 оказалось его учас-
тие в образовании тетрамерных комплексов, в состав которых,
помимо СОК и циклинов, входит уже знакомый нам б-кофактор
ДНК-полимеразы — белок РСМА, являющийся одним из инициаторов репликации ДНК (рис. 57). Для связывания РСМА в
молекуле р21 существуют домены, не зависимые от его взаимодействия с СОК
и циклинами,
что придает большую устойчи-
вость таким комплексам и прочно блокирует вступление клеток
в 5-период. Тетрамерные комплексы могут существовать в
активном
(фосфорилированном)
и неактивном
состояниях
и
распадаться до димеров под влиянием митогенных стимуляторов, а также при неопластической трансформации клеток (Х1опв
е({ а{., 1992; Хвапе её а|., 1994).
Белок р27 проявляет 40%-ную гомологию с белком р21. Он
взаимодействует в болышей или меньшей степени со всеми
основными комплексами СОК/циклин, в зависимости от типа
клеток и условий культивирования. В культуре клеток эпителия
легкого, подвергнутых действию ТОЕ-БВ, р27 связывает и инактивирует комплекс СОК2/циклин Е, а в культуре макрофагов,
пролиферация которых подавлена после обработки сАМР, р27
препятствует фосфорилированию комплекса СОК4/циклин О,
выступая в обоих случаях как медиатор экзогенного ингибиру-
Рис.57.
Образование
димерных
и тетрамерных
комплексов
между
регуляторными молекулами, определяющими прохождение клеточного
цикла.
ющего
сигнала.
В
отличие
от
р21,
он
не
входит
в состав
тетрамерных комплексов с участием РСМА. В культуре клеток,
перешедших в состояние покоя, наблюдается быстрое возрастание количества р27 (Непёз, Вееа, 1996). Это происходит благодаря ускоренной трансляции и многократному увеличению
продолжительности жизни молекул белка, вследствие снижения активности убиквитин-зависимой протеолитической системы. Последний факт заслуживает особого внимания в плане
общей оценки свойств покоящихся клеток. Как известно,
скорость обновления молекул в состоянии пролиферативного
покоя
в целом
выше,
главу
[\). Тем
не менее,
чем
в пролиферирующих
негативные
клетках (см.
эндогенные
регуляторы
обновляются, как мы видим, значительно медленнее, что способствует поддержанию состояния покоя.
Белок р57 изучен не так подробно, как другие представители
семейства СТр/К1р. Он обладаеттканеспецифичностью, присутствуя в больших
количествах в плаценте
и в меньшей
степени
в других тканях.
Представители семейства ПМК. — белок р16 (который изучен
лучше других) и его гомологи выполняют функцию специфических ингибиторов комплекса СОК4,6/ циклин О, препятствуя его сборке (рис. 58) и не допуская тем самым его
фосфорилирование ферментом САК (СОК-аспуайптЕ Ктазе).
Помимо
этого, белку р[6, который
содержаших
рЁКВ,
клеточного
цикла.
принадлежит
активен
и другая
только
роль
в клетках,
в регуляции
Его уровень резко возрастает с началом
периода, что обеспечивает снижение активности
$-
комплексов
СОК4,6/циклин О и препятствует избыточному фосфорилированию рЕВВ, когда клетка уже завершила период С, (регуляция
по принципу отрицательной обратной связи).
Рис.58.
Сборка
комплекса СОК4/циклин О под влиянием
митогена, с последующим фосфорилирова-
Митоген
|
т. Ге
нием ферментом САК.
Р-— циклинО, САК
— киназа, активирующая СОК, РСМА-6 —
кофактор ДНК-полимеразы, р16 — ингибитор циклии-зависимых киназ.
Открытие ингибиторов циклин-зависимых киназ позволило
внести ясность во многие нерешенные вопросы регуляции
размножения клеток. СКТ5 обнаружены в большом количестве
в стареющих культурах клеток, причем происходит поэтапное
включение разных ингибиторов с увеличением числа пассажей
(Асома
е{ а1., 1996). Индукция
СК
или близких
гомологов
наблюдается при метаморфозе насекомых, она предшествует
установлению соматического клеточного цикла в эмбриональном развитии лягушки, а также играет определяющую роль в
процессе специализации тканей, предваряя терминальную
дифференцировку. Уже сейчас предпринимаются попытки использовать СК]$ для биотерапии опухолей (втом числе, заместительной
генной
терапии),
однако
это —
предмет будущих
исслело-
ваний.
Существует
ли связь между СК и короткоживущими белками-репрессорами, выявляемыми в опытах по слиянию клеток?
На этот вопрос пока нет определенного ответа, однако наблюдаемые различия в действии СКП на основные компоненты
позитивной регуляции клеточного цикла — комплексы СОК/
циклины, а также флюктуации их внутриклеточного уровня
после стимуляции (см. табл. 14), позволяют предполагать совместное участие ингибиторов циклин-зависимых киназ в подавлении синтеза ДНК в ядрах пролиферирующих клеток в гетерокарионах с покоящимися клетками.
Общие принципы регуляции клеточного цикла
На основании всего вышеизложенного можно сделать некоторые обобщения относительно регуляции клеточного цикла у
эукариотов. Прежде всего, наблюдается участие близких по
структуре молекул — циклин-зависимых киназ и их ингибито-
ров — в прохождении клетками различных контрольных пунктов (сНесКро!1т($) клеточного цикла, определяющих
последова-
тельность его событий (см. обзоры: Мигзе, 1994; ЕПечре, 1996;
Мазтуй, 1996). При этом регуляторные молекулы могут образовывать димерные и тетрамерные комплексы, распадающиеся
по мере необходимости. Процесс активации — инактивации
регуляторных молекул обеспечивается многочисленными реакциями фосфорилирования — дефосфорилирования,
протекаю-
щими по принципу обратной связи, а также убиквитин-зависимым протеолизом молекул, завершивших свою функцию в том
или ином пункте клеточного цикла (Кп8 ег а|., 1996). Такая
система регулирования препятствует осуществлению более поздних событий клеточного цикла, если предыдущие еще не
закончены, и делает невозможным движение процессов в обратном направлении. Сходство регуляторных молекул и образуемых ими комплексов на разных этапах клеточного цикла не
означает их тождественности. В противном случае клетка не
могла бы «помнить», в какой точке цикла она находится.
В отсутствие митогенов клетка прекращает прохождение
цикла и переходит в состояние покоя, где, благодаря особенностям своего метаболизма, она сохраняет жизнеспособность и
пролиферативный потенциал. Важную роль в поддержании
состояния покоя играет белок РЕВ, который в это время
дефосфорилирован и прочно связан с фактором транскрипции
Е?2Е, что препятствует синтезу ДНК. В покоящихся клетках
комплексы СОК/циклин неактивны, а внутриклеточный уровень ингибиторов циклин-зависимых киназ, напротив, возрастает, по сравнению с пролиферирующими клетками. Получив
стимул к пролиферации, покоящаяся клетка вновь начинает
прохождение цикла. Чередование периодов активной пролиферации и пролиферативного покоя — основополагающий принцил регуляции размножения клеток эукариотических организМОВ.
На рис. 59 условно изображено прохождение клеткой пререпликативного периода при воздействии митогеном в свете
современных представлений о функционировании основных
регуляторных молекул, обеспечивающих этот процесс. Для
удобства показано взаимодействие комплексов СОК/циклин
лишьс одним ингибитором — р21. Основным событием пререпликативного периода является фосфорилирование белка рЁВ (в
котором принимают участие все комплексы) и последующее
освобождение фактора транскрипции Е2Ё для осуществления
индукции синтеза ДНК. Этот момент, очевидно, и следует
считать пунктом ограничения, поскольку, пройдя его, клетка
уже необратимо комитирована к переходу в $-период.
В настоящее время нет ясности в вопросе о том, почему
стимулированной митогеном клетке требуется всего около 10
мин для передачи сигнала в ядро и экспрессии генов пролиферативного ответа, в то время как репликация ДНК начинается,
за редкими исключениями, не раньше, чем через несколько
-----------ее
<
г-пункт
Пререпликативный период
Рис.
59.
Панорама
событий,
развертывающихся
на
протяжении
пререпликативного периода с участием регуляторных молекул, определяощих
прохождение
цикла;
С, — состояние покоя; г-пункт —- пункт ограничения; граница
клеточного
цикла.
С‚, $ — периоды
клеточного
периодов С./З искусственно растянута. СОК — циклин-зависимые
киназы; А, О, Е — циклины, РСМА — 5-кофактор ДНК -полимеразы;
рКВ — продукт гена-супрессора Кё, Е2Е — фактор транскрипции.
часов. Косвенным указанием на причину задержки могут служить данные о сложном взаимодействии сигнальных молекул с
комплексами СОК/циклин и белком рВВ. Например, МАРкиназы р42 и р44 усиливают экспрессию циклина О, вто время
как МАР-киназа р38 подавляет ее. Другая сигнальная молекула
—
продукт
циклина
О,
протоонкогена
однако
га; также
активации
усиливает
комплекса
экспрессию
СРК4,6/циклин
В
при этом не происходит. Оказалось, что медиатором, связывающим функцию белка газ с событиями пререпликативного
периода, служит рВВ, для фосфорилирования которого требу-
ется ряд условий, в частности, снижение уровня некоторых
циклин-зависимых киназ. Таким образом, задержка во времени
при переходе клеток к репликациии ДНК после получения
митогенного сигнала связана, по-видимому, с необходимостью
предварительной
ляторных
ПОДГОТОВКИ
молекул
и
их
И преобразования
комплексов,
основных
обеспечивающих
регу-
прохож-
дение клеточного цикла.
В заключение можно сказать, что сейчас исследователи
клеточного цикла вплотную подошли к разгадке природы таинственных «биологических часов», отсчитывающих время от
одного деления клетки до другого. Их механизм включает в себя
вполне
конкретные
позитивные
и
негативные
регуляторные
элементы. Запуск часов осуществляется митогенами, инициирующими
последовательную сборку, экспрессию и деградацию
комплексов
с киназной
активностью,
вильный ход часов в нужном
что обеспечивает
пра-
направлении.
Литература
Гуревич К.Г. — Биохимия, 1997, 62, 1221-1224,
Епифанова О.И., Полуновский В.А., Терских В.В. — «Регуляция
раз-
множения клеток в процессе специализации, старения и неопластической трансформации»,
М., ВИНИТИ,
Итоги науки и техники, т.
11, 1988.
Асопа О.А., Х1опВУ., РНе]рз О., Наппоп С., ВеасВ О., Ваггей ).С. — Ргос.
Май Асад. $с1. ПОЗА, 1996, 93, 13742-13747.
Вепегегееп
В.Г.., Вегпаг4 К. — Вюсвет.
ВюрпНуз Ас,
1996, 1287, 103-
120.
Сох Г.$., Гапе О.Р. — ВюЕззауз, 1995, 17, 501-508.
ЕПедре 5.]. — Зсепсе, 1996, 274, 1664-1671.
ЕрИапоуа О.Т., ВгооК$ В.Е. — СеН РгоНЕ, 1994, 27, 373-394.
Е2НеузКу $.А., Мававага Н., Уосего-АКбат! А.М., Сиз О.В., \!е! М.С,
Позау $.Е., — Ргос. МаЙ Аса4. $с1. ЧЗА, 1997, 94, 10699-10704.
Раибю М., Меаа Т.Е. — Габ. ТиуезИр., 1989, 60, 4-13.
СонПеь Т.М., Огеп М. — В1осНет. Вюрвуз Аска, 1996, 1287, 77-102.
Нате! Р.А., СаШе В.Г., РЫрз В.А. — Тгеп@$ Сепе!,, 1992, 8, 180-185.
Непрз( [.., Кее4 5.1. — Зсепсе, 1996, 271, 1861-1864.
Кир В.№., Резнаез В.Т., Реегз /.-М., Кизсипег М. — Зс1епсе, 1996, 274,
1652-1658.
|
Гагсеп С.-]. — Опсорепе, 1996, 12, 2041-2044.
Га ТВаприе М.В., — Сит. Орт. Сей Во. 1994, 6, 443-450.
Теопе С., Сгевог! 1., Зеагз В., ТаКо! 1.., Меуиз }.В. — Маше,
422-426.
Мауо! Х., Сагива /., Огайа Х. — Опсовепе,
Мег
В. — Тгепа$ Сепе.,
Мазту!
К. — $с1епсе,
1996,
1995, 11, 173-178.
1996, 276,
1643-1645.
13, 237-246.
1997, 387,
