Транспортные белки семейства ABC, осуществляющие выброс
реклама
На правах рукописи Горева Ольга Борисовна ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ GSTP1, MDR1 И MRP1 В ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ И В ФОРМИРОВАНИИ УСТОЙЧИВОСТИ К ХИМИОТЕРАПИИ 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2007 Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Гришанова А.Ю. Научный консультант: академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Ляхович В.В. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Поспелова Т.И. доктор медицинских наук, Душкин М.И. Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск) Защита состоится "___" _______ 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. академика Тимакова, 2; тел.: 8-(383)333-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке исследовательского института биохимии СО РАМН ГУ Автореферат разослан "___" ____________ 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник 2 Русских Г.С. Научно- Актуальность темы. В последние десятилетия проблема онкологических заболеваний становится все более актуальной. В структуре смертности населения Земного шара смертность от злокачественных новообразований занимает 2-4-ое место, в высокоразвитых странах этот показатель выходит на 1-2-ое место (Якубовская, 2000), а по данным Госкомстата за 2005 год в России – 2-ое место, уступая только заболеваниям системы кровообращения (http://www.gks.ru/free_doc/2006/b06_13/04-27.htm) Число людей с впервые выявленными злокачественными новообразованиями неуклонно растет (Чиссов и соавт., 1995; Заридзе и соавт, 1998). Новосибирская область и г. Новосибирск входят в число административных территорий, неблагоприятных по заболеваемости злокачественными новообразованиями, в том числе опухолями клеток крови (http://www.sibstat.gcom.ru/Sitr/press21.html, 2006). Опережая по темпам общую онкологическую заболеваемость, заболеваемость опухолями клеток крови с 1987 года по 2005 год увеличивалась примерно в 4,5 раза (с 3,2 до 14,2 на 100 тысяч населения), преимущественно за счет лейкозов и лимфом. (Ковынев и соавт., 2006). Такой рост связывают с всевозрастающим загрязнением окружающей среды чужеродными для организма веществами (ксенобиотиками), и, как следствие, увеличением их поступления в организм человека (Карпенко, 1999; Гуляева и соавт., 2000). Исследование причин повышения заболеваемостью опухолями клеток крови показало, что оно обусловлено неблагоприятной экологической ситуацией в г. Новосибирске и Сибирском федеральном округе в целом и совпадает с пиками промышленных выбросов с отсрочкой эффекта на 7-10 лет (Ковынев и соавт., 2006). Разная предрасположенность к заболеванию может быть обусловлена генетическими факторами, в том числе межиндивидуальными различиями в биоактивации проканцерогенов и выведении канцерогенных веществ из организма. Установление взаимосвязи между определенным генотипом и формой заболевания может приблизить к пониманию механизмов развития различных форм рака, а с учетом предрасполагающих факторов (курение, загрязнители окружающей среды) позволит выявить группы риска, обладающие повышенной чувствительностью к данным заболеваниям. Рост случаев онкологических заболеваний выводит на передний план проблему их лечения. Основным методом лечения онкогематологических заболеваний является интенсивная полихимиотерапия. Однако, несмотря на высокий процент ремиссий (до 80%) после начальной терапии, рецидив бывает очень часто, и только 20% пациентов достигают долгосрочного выживания (Поддубная, 2001; Thomas, 2003). Кроме того, интенсивная химиотерапия является причиной тяжёлых побочных эффектов, особенно у пожилых пациентов (Robak, 2004). То есть недолгосрочная эффективность химиотерапии и токсичность лечения являются главными проблемами, которые необходимо решать. Одним из препятствий для успешной химиотерапии опухолей является множественная лекарственная устойчивость 3 (МЛУ) – невосприимчивость популяции клеток опухоли одновременно к целому ряду химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия на клетку. Феномен МЛУ может быть обусловлен различными механизмами, в частности, снижением накопления лекарственного препарата в клетке, связанным с функционированием Р-гликопротеина, белка множественной лекарственной устойчивости и обезвреживанием препаратов в клетке, обусловленным функционированием систем ферментов метаболизма ксенобиотиков, в частности фермента глутатион-S-трансферазы (Ставровская, 2000). Основными механизмами в метаболизме и распределении ксенобиотиков является функционирование ферментов первой и второй фазы биотрансформации ксенобиотиков, а также АТФ-зависимых транспортных. Фермент второй фазы глутатион S-трансфераза класса Р участвует в процессах детоксикации широкого спектра электрофильных соединений, включая мутагены и канцерогены окружающей среды (Salinas, 1999, Tsuchida, 1992). Многие цитостатики, такие как алкилирующие агенты, антрациклины, препараты платины, стероидные гормоны также являются субстратами глутатион S-трансфераз (Сlandinin, 1994; Pemble, 1994; Ставровская, 2000; Hayes, 2000). Ген GSTP1 является полиморфным: в кодирующем регионе обнаружено две мутации. Известно, что различные полиморфные варианты гена GSTP1 могут обладать различной субстрат-специфичной каталитической активностью (Coles et al., 2000, Allan et al., 2001). Полиморфизм в 5 экзоне гена GSTP1 приводит к замене аминокислоты в активном участке Н-сайта, который отвечает за субстратную специфичность фермента. В связи с этим, межиндивидуальные различия в ферментативной активности GST, опосредуемые полиморфными вариантами генами, могут лежать в основе различной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, связанным с влиянием окружающей среды. Нет данных, связан ли полиморфизм гена GSTP1 с предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям и устойчивостью к химиопрепаратам. АТФ-зависимые транспортные белки Р-гликопротеин и MRP1 (белок ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью) – продукты генов MDR1 и MRP1 осуществляют транспорт веществ из клетки. Их физиологическая роль заключается в защите клеток от токсических соединений. Гены MDR1 и MRP1 являются высокополиморфными, но несмотря на то, что Р-гликопротеин и MRP широко изучаются, пока непонятна функциональная и клиническая значимость открываемых вариантов полиморфизмов этих генов для биодоступности и распределения лекарств в организме человека и, как следствие, формирования лекарственной устойчивости опухолей. Функциональная активность MRP изучена мало и нет сведений о его активности у больных онкологическими заболеваниями. 4 Целью настоящей работы было исследование полиморфных вариантов генов GSTP1, MDR1, MRP1 и анализа взаимосвязи полиморфизмов этих генов с предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям и устойчивостью к химиотерапии у больных с такими заболеваниями, а также исследование связи полиморфизмов генов MDR1 и MRP1 с функциональной активностью кодируемых ими белков Pгликопротеина и MRP. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать распределение полиморфных вариантов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (C341T) экзонах у здоровых европеоидов Западной Сибири и больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. 2. Исследовать распределение полиморфных вариантов гена MDR1 в 6 интроне (Ex6+139C/T), 12 (C1236T), 21 (G2677T), 26 (C3435T) экзонах у здоровых европеоидов Западной Сибири и больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. 3. Исследовать распределение полимофрных вариантов гена MRP1 в 13 экзоне (T1684C), 9 (A1218+8G), 18 (C2461-30G) интронах у здоровых европеоидов Западной Сибири и больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. 4. Проанализировать взаимосвязь полиморфизмов исследуемых генов с предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям у европеоидов западной Сибири в исследованиях «случайконтроль». 5. Провести анализ взаимосвязи полиморфизмов исследуемых генов с риском развития лекарственной устойчивости у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. 6. Определить функциональную активность Р–гликопротеина и MRP в лимфоцитах здоровых европеоидов Западной Сибири и больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями и оценить связь с результатами химиотерапии. 7. Исследовать роль полиморфизмов генов MDR1 и MRP1 в функциональной активности P-гликопротеина и MRP соответственно. Научная новизна Впервые охарактеризована частота встречаемости полиморфизмов A313G и C341T гена GSTP1, С6+139T, C1236T, G2677T, C3435T гена MDR1, T1684C, A1218+8G и C2461-30G гена MRP1 в популяции европеоидов Западной Сибири. Показано, что распределение частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов GSTP1, MDR1 и MRP1 у европеоидов Западной Сибири соответствуют частотам в других европеоидных популяциях. Впервые показано, что полиморфные варианты 341СС гена GSTP1 и 3435ТТ гена MDR1 ассоциированы с устойчивостью к хроническим 5 лимфопролиферативным заболеваниям, а 341СТ и 3435СС генотипы – с предрасположенностью. Впервые показано, что полиморфные варианты 313AG гена GSTP1 и 2677ТТ, 3435ТТ гена MDR1 ассоциированы с устойчивостью, а генотипы 313АА, 3435СТ – с чувствительностью к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. Комбинация генотипов 2677ТТ/3435ТТ в 21 и 26 экзонах гена MDR1 у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями увеличивает в 17 раз риск возникновения лекарственной устойчивости к проводимой химиотерапии в сравнении с больными, имеющими другие генотипы. При исследовании полиморфизмов T1684C, A1218+8G и C2461-30G гена MRP1 не выявлено достоверно значимых ассоциаций полиморфных вариантов гена с риском возникновения лимфопролиферативных заболеваний и развитием устойчивости к химиотерапии у больных с этими заболеваниями. Впервые показано, что функциональная активность Р-гликопротеина у больных неходжкинскими лимфомами ассоциирована со степенью злокачественности опухоли: достоверно более высокий уровень активности показан для больных с высокой степенью злокачественности. Показано также, что уровень функциональной активности Р-гликопротеина в лимфоцитах периферической крови не зависит от применяемых химиопрепаратов и не является показателем для прогноза устойчивости к химиотерапии у больных неходжкинскими лимфомами. Показано, что уровни функциональной активности Р-гликопротеина и MRP1 не связаны с полиморфизмами С6+139T, С1236T, G2677T, C3435T гена MDR1 и T1684C, A1218+8G, C2461-30G гена MRP1 ни у здоровых европеоидов Западной Сибири, ни у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. Научная и практическая значимость работы Настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных знаний о роли полиморфизмов генов MDR1, MRP1, GSTP1 и функциональной активности транспортных белков Р-гликопротеина и MRP1 в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям и в формировании лекарственной устойчивости у больных с такими заболеваниями. Полученные данные могут быть использованы для оценки как индивидуального, так и популяционного риска развития онкогематологических заболеваний, а так же разработки дифференцированных программ их первичной профилактики. Выявление полиморфных вариантов генов, ассоциированных с устойчивостью к химиотерапии позволит выработать рекомендации по оптимизации химиотерапии 6 Основные положения выносимые на защиту: 1. С предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям связаны полиморфизмы C341T в 6 экзоне гена GSTP1 и C3435T в 26 экзоне гена MDR1. 2. С формированием устойчивости к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями связаны полиморфизмы A313G в 5 экзоне гена GSTP1, G2677T в 21 экзоне и C3435T 26 экзонах гена MDR1. 3. Уровень функциональной активности Р-гликопротеина в лимфоцитах периферической крови у больных неходжкинскими лимфомами связан со степенью злокачественности опухоли. 4. Эффективность химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями не зависит от уровня функциональной активности Ргликопротеина. 5. Уровни функциональной активности P-гликопротеина и MRP1 у здоровых европеоидов Западной Сибири и у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями не связаны с полиморфными вариантами генов MDR1 (С6+139T, C1236T, G2677T и C3435T) и MRP1 (T1684C, A1218+8G и C2461-30G) соответственно. Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 17th Meeting of Europe Association for Cancer Research, Granada, Spain, 2002; 1 Международный симпозиум «Стресс и экстремальные состояния», Феодосия, Украина, 2002; 18th International Cancer Congress, Oslo, Norway, 2002; European Scientific Conference: Understanding the Genome: Scientific Progress and Microarray Technology, Genova, Italy, 2002; 37thAnnual Scientific Meeting: European society for clinical investigation. The pathophysiology of diseases: from bench to bedside, Verona, Italy, 2003; 8th Congress of the European Hematology Association, Lyon, France, 2003; Российско-Норвежская конференция по вопросам гематологии, СанктПетербург, 2003; III Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004; 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2004; 9th Congress of the European Hematology Association, Geneva, Switzerland, 2004; 15th European Students' Conference for future doctors and young scientists, Berlin, Germany, 2004; XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2005; Региональная конференция молодых ученых-окологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 2006; 13th International Student Congress of Medical Sciences, Groningen, the Netherlands, 2006; Совместная российскоамериканская конференция по проблемам гематологии и трансплантации костного мозга, 2006. 7 Публикации. По материалам диссертации имеется 18 печатных работ (из них 3 в рецензируемой печати). Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 22 таблицы и 28 рисунков и состоит из шести разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 206 ссылок. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Описание клинического материала. Работа выполнена на образцах периферической крови пациентов, которые наблюдались в гематологическом кабинете Новосибирской областной консультативной поликлиники и проходили лечение в отделении гематологии Государственной Новосибирской областной клинической больницы с 1998 по 2006 гг. Исследовано 240 больных, из них 79 хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), 161 больной неходжкинскими лимфомами (НХЛ). Группа больных включала 135 мужчин (56,0%) и 105 женщин (44,0%) в возрасте от 17 до 86 лет (средний возраст 56,64) Лечение больных проводилось по протоколам, которые включали следующие препараты: циклофосфамид, лейкеран, адриамицин, онковин, винкристин, преднизолон. Эффективность химиотерапии оценивалась врачами ГНОКБ через 6 месяцев после установления диагноза и начала лечения. Наличие ответа на лечение определялось при полной или частичной клинико-гематологической ремиссии у больных НХЛ и ХЛЛ и в случае стабилизации у больных ХЛЛ. Отсутствие ответа на лечение определялось при прогрессировании заболевания или в случае смерти больного. Контрольную группу составили пациенты травматологического отделения 3-й Муниципальной клинической больницы скорой помощи в период проведения контрольных анализов перед выпиской. Она включала 100 человек, из них 54 мужчины (54,0%) и 46 женщин (46,0%) в возрасте от 17 до 86 лет (средний возраст 53,47). Основным критерием отбора в контрольную группу было отсутствие каких бы то ни было онкологических заболеваний. Методы исследования. Выделение ДНК из цельной крови проводили с помощью стандартного набора производства ООО «Лаборатория Медиген» (г. Новосибирск). Анализ полиморфных вариантов специфических участков генома проводился с использованием методов полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, используя структуру праймеров и соответствующие ферменты рестрикции, которые были описаны в литературе (Harries et al.., 1997; Harris et al., 1998; Cascorbi et al., 2001; Ito et al., 2001). Подбор эндонуклеаз рестрикции для гена MRP1 проводился с спользованием программы Vector NTI 8.0. Для обнаружения 8 полиморфных вариантов MRP1 использовали следующие эндонуклеазы рестрикции: T1684C – AspS9I, A1218+8G – AspLEI, C2461-30G – BtrI («СибЭнзим», Россия). Продукты ферментативного гидролиза разделяли разделяли вертикальным электрофорезом в 7% полиакриламидном геле в трис-боратном буфере. Визуализацию бандов и сканирование геля проводили в проходящем УФ свете с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва). Функциональная активность Р-гликопротеина была определена на проточном цитофлюориметре FACS Calibur фирмы «Becton Dickinson» с использованием субстрата родамина 123 и ингибитора верапамила в лимфоцитах в контрольной группе, которая включала здоровых европеоидов (n=49), и у больных НХЛ (n=76). Активность Р-гликопротеина (E Rh123, отн.ед.) оценивали по выбросу родамина 123, определяемому как отношение геометрических средних флюоресценции родамина 123 в присутствии верапамила и без него (Huet et al., 1998). Исследование функциональной активности MRP проводилось у здоровых (n=29) и больных НХЛ (n=31) с использованием 5(6)-диацетат карбоксифлюоресцеина в присутствии ингибитора циклоспорина А (Dogan et al., 2003). Активность MRP1 (ECFDA, отн.ед.) оценивали по выбросу карбоксифлуоресцеина, определяемому как отношение геометрических средних флюоресценции карбоксифлуоресцеина в присутствии циклоспорина А и без него. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных статистических программ «Statistica v.6» (StatSoft Inc., 1995) и программы EpiInfo 6 (1993). Распределение генотипов исследованных полиморфных локусов проверяли на соответствие равновесию ХардиВайнберга с помощью точного теста Фишера (Вейр, 1995). Об ассоциации аллелей, генотипов и комбинаций генотипов с лимфопролиферативными заболеваниями и устойчивостью к лечению судили по величине отношения шансов (ОШ) (Флетчер и др., 1998). Достоверность различий в частотах встречаемости изучаемых признаков между анализируемыми группами оценивали по критерию χ2 с поправкой Йетса на непрерывность или двухстороннему точному критерию Фишера, когда в группе сравнения было менее 5 наблюдений. Для оценки достоверности различий между выборками с различными физиологическими и клиническими параметрами по уровню, функциональной активности P-гликопротеина и MRP использовались непараметрический критерии Манна-Уитни. В случае сравнения более чем двух групп, для оценки использовали критерий Крускалля-Уоллиса с последующим попарным сравнением по критерию Манна-Уитни, в случае, если уровень значимости различий р≤0,05. Корреляцию между возрастом и уровнем функциональной активности оценивали по критерию Спирмена. 9 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Распределение частот генотипов и аллелей генов GSTP1, MDR1 и MRP1 у здоровых европеоидов Западной Сибири и у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями Полиморфизм A313G в 5 экзоне гена GSTP1, приводящий к замене Ile105Val, был исследован в контрольной группе (n=57) и у больных ХЛПЗ (n=163). Анализ распределения частот полиморфных вариантов гена и аллелей GSTP1 в 5 экзоне в группе контроля и у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями показал отсутствие статистически значимых различий. В группе без онкопатологии частота мутантного аллеля (0,30) была сопоставима с описанными частотами для других европеоидов 0,28-0,36 (Harries et al., 1997; Landi, 1998), ниже, чем у афроамериканцев 0,420,45, но выше, чем у африканцев (χ2=8,89, р=0,003), азиатов 0,14-0,27 (Harries et al., 1997). Полиморфизм C341T в 6 экзоне гена GSTP1, приводящий к замене Ala114Val, был исследован у 60 индивидуумов контрольной группы и 146 больных ХЛПЗ. Анализ распределения частот полиморфных вариантов гена GSTP1 в 6 экзоне в контрольной группе и у больных ХЛПЗ показал статистически значимые различия: χ2=6,79, р=0,03 для ХЛПЗ, χ2=6,00, р=0,05 для НХЛ и χ2=6,40, р=0,04 для ХЛЛ (рис. 1). Частота встречаемости Т341T генотипа не отличалась у больных ХЛПЗ и НХЛ от контрольной группы, а в группе больных ХЛЛ этот генотип отсутствовал. 3 100% 90% р=0,03 р=0,05 р=0,04 3 4 0 С 11 15 33 32 35 64 64 65 Контроль ХЛПЗ НХЛ Генотипы ХЛЛ 80% Т р=0,055 р=0,049 19 20 18 TT CT СС 70% 60% 50% 40% 30% 89 82 80 82 Контроль ХЛПЗ НХЛ Аллели ХЛЛ 81 20% 10% 0% Рис. 1. Распределение генотипов и частот аллелей полиморфного варианта C341T гена GSTP1 у больных ХЛПЗ и в контрольной группе. Частота встречаемости мутантного T аллеля была выше в общей группе больных ХЛПЗ по сравнению с группой контроля (р=0,055) и 10 статистически достоверно выше у больных НХЛ (р=0,049). В группе ХЛЛ также наблюдалось более высокая частота валинового аллеля, но эти различия не являлись статистически достоверными (рис. 1). Сравнение частот генотипов C341T гена GSTP1 в нашей контрольной выборке с описанными в различных популяциях и этнических группах не выявило достоверных отличий от австралийских европеоидов и индийской популяции (Harris et al., 1998). Частота мутантного аллеля в контрольной группе (0,11) была сопоставима с таковой у австралийских европеоидов (0,07) и индийцев (0,05), но достоверно выше, чем у других среди азиатов (0,0-0,01) (Ishii et al., 1999; Harris et al., 1998). К настоящему времени открыты и охарактеризованы более 50 однонуклеотидных замен в гене MDR1, большинство из которых является молчащими мутациями или расположены в интронных областях (Mickley et al., 1998; Ito et al., 2001; Kerb et al., 2001; Saito et al., 2002; Marzolini, 2004). Мы исследовали наиболее часто встречающиеся полиморфизмы в гене MDR1: в 6 интроне (Ex06+139C/T), 12 (C1236T), 21 (G2677T) и 26 (C3435T) экзонах. Полиморфизм G2677T приводит к замене Ala893Ser, а мутации C1236T и C3435T, являются синонимичными. Анализ распределения полиморфных вариантов гена MDR1 в 6 интроне, 12 и 21 экзонах в группе контроля и у больных ХЛПЗ не выявил статистически достоверных различий в частотах встречаемости генотипов и аллелей. В группе без онкопатологии частоты мутантных аллелей в 6 интроне (0,44), 12 экзоне (0,47) и 21 экзоне (0,43) значимо не отличались от описанных в литературе для европеоидов Германии и России (Cascorbi et al. 2001; Hoffmeyer et al., 2000; Siegmund et al., 2002; Gaikovitch et al 2003). Анализ распределения полиморфных вариантов гена MDR1 в 26 экзоне показал, что частоты распределения генотипов статистически значимо отличаются от контрольных в группе ХЛПЗ (χ2=7,15, р=0,03) и ХЛЛ (χ2=5,93, р=0,05), в группе ХНЛ эти отличия не достигают значимого уровня (рис. 2). Частота встречаемости мутантного аллеля в группах больных ниже по сравнению со здоровыми, причем эти различия являются статистически достоверными для всех групп (p=0,02 для ХЛЛ и НХЛ и р=0,006 для ХЛПЗ). Частоты встречаемости мутантного аллеля в группе без онкопатологии (0,65) в 26 экзоне близки к частотам генотипов в популяции России (0.54) (Gaikovitch et al., 2003), европеоидов Англии (0.52), Португалии (0,57) (Ameyaw et al., 2001), но значительно превышают частоты мутантного аллеля у европеоидов Польши (0.38) (Jamroziak et al., 2002), Германии (0.48) (Hoffmeyer et al., 2000). 11 р=0,03 р=0,05 100% 90% 80% 44 32 30 р=0,006 TT 50% 53 48 47 46 CT СС 54 44 42 43 30% 20% 0% 52 65 60% 10% р=0,02 0 70% 40% р=0,02 26 27 НХЛ ХЛЛ 26 54 33 13 Контроль ХЛПЗ Контроль ХЛПЗ Генотипы НХЛ ХЛЛ Аллели Рис. 2. Распределение генотипов и частот аллелей полиморфного варианта C3435T гена MDR1 у больных ХЛПЗ и в контрольной группе. При исследовании частот генотипов и аллелей MRP1 в 13 экзоне (T1684C), а также в 9 (A1218+8G) и 18 (C2461-30G) интронах в контрольной группе и у больных ХЛПЗ не было выявлено статистически значимых отличий. Частота встречаемости мутантного аллеля 1684С в 13 экзоне в группе без онкопатологии (0,83) была достоверно выше частоты этого аллеля в японской популяции 0.19 (Ito S. et al., 2001) и незначительно выше частоты 1684С аллеля европеоидов Германии 0.80 (Oselin K. Et al., 2003). Частоты встречаемости мутантного аллеля в группе без онкопатологии в 9 интроне (0,33) совпали с частотой данного аллеля в японской популяции (0.34) (Ito S. et al., 2001) и европеоидов Германии (0.35) (Oselin K. et al., 2003). Частота встречаемости мутантного аллеля в контрольной группе в 18 интроне (0,78) была достоверно выше частоты данного аллеля в японской популяции 0.30 (Ito S. et al., 2001). Роль полиморфизмов генов GSTP1, MDR1 и MRP1 в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям При анализе полиморфизма A313G гена GSTP1 у здоровых и больных ХЛПЗ не выявлено статистически значимых ассоциаций различных генотипов с риском развития ХЛПЗ (табл. 1). Это свидетельствует о том, что ни один из генотипов A313G не является фактором предрасположенности к ХЛПЗ. Наши данные согласуются с опубликованными ранее исследованиями больных с НХЛ и ХЛЛ, где не было выявлено ассоциаций полиморфных вариантов A313G гена GSTP1 с риском развития заболеваний (Sarmanova et al., 2001). При анализе ассоциации разных генотипов C341T GSTP1 с риском развития ХЛПЗ выявлено, что носители «дикого» генотипа 341СС 2,44 раза 12 более устойчивы к возникновению ХЛПЗ (ОШ=0,41, р=0,02), в частности к НХЛ носители данного генотипа будут устойчивее других индивидуумов в 2,5 раза (ОШ=2,5, р=0,03) (табл. 1). Для ХЛЛ также показана ассоциация дикого генотипа с вероятностью устойчивости к заболеванию в 2,38 раза, однако необходимая статистическая достоверность не показана (р=0,09). Это можно объяснить малой выборкой исследованных больных с ХЛЛ. Генотип 341CT ассоциирован с предрасположенностью к лимфопролиферативным заболеваниям: риск заболеть ХЛПЗ у носителей этого генотипа по сравнению с остальными индивидуумами повышен в 2,78 раза (р=0,014), риск заболеть НХЛ – в 2,68 раза (р=0,026), а ХЛЛ – в 3,05 раза (р=0,037) (табл. 1). Это свидетельствует о том, что генотип 341СТ является фактором предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям, а «дикий» генотип – фактором устойчивости к ХЛПЗ, в частности к НХЛ. Анализ ассоциаций генетических вариантов MDR1 с предрасположенностью к лимфопролиферативным заболеваниям показал, что в 6 интроне, 12 и 21 экзонах статистически значимых ассоциаций наличия мутантного аллеля с риском развития ХЛПЗ не выявлено, т.е. полиморфизмы C6+139T, C1236T и G2677T в 6 интроне не являются предрасполагающими факторами к развитию этих заболеваний (табл. 1). При анализе ассоциаций полиморфных вариантов гена MDR1 с риском развития ХЛПЗ для мутации в 26 экзоне С3435T было установлено, что индивидуумы с 2 аллелями «дикого» типа в 26 экзоне в 2,26 раза более чувствительны к ХЛПЗ (р=0,035), а носители 2 мутантных аллелей более устойчивы к развитию ХЛПЗ по сравнению с другими индивидами (р=0,04), а по сравнению с гомозиготами дикого типа в 2,86 раза (р=0,01). Для НХЛ и ХЛЛ прослеживается аналогичная связь (табл. 1). Гомозиготные по «дикому» аллелю индивиды в 2,24 раза более чувствительны к НХЛ (р=0,046) и в 3,36 раза – к ХЛЛ по сравнению с другими индивидами. Однако для ХЛЛ этот риск не является достоверным (р=0,13), вероятнее всего это обусловлено маленькой выборкой. Статистическая достоверность ассоциации мутантного генотипа с НХЛ достигается только по сравнению с «дикими» гомозиготами (ОШ=0,38, р=0,03). Для ХЛЛ устойчивость к заболеванию в 3,23 раза выше у индивидов с мутантным генотипом по сравнению с остальными (р=0,04) и в 4,55 раза выше по сравнению с индивидами с диким генотипом (р=0,03). Таким образом, полиморфизм С3435Т гена MDR1 является значимым фактором, предрасполагающим к лимфопролиферативным заболеваниям. При анализе ассоциаций разных генотипов MRP1 в 13 экзоне, 9 и 18 интронах с риском развития ХЛПЗ было показано отсутствие статистически значимых ассоциаций. Следовательно, полиморфизмы T1684C, A1218+8G и C2461-30G гена MRP1 не являются факторами предрасположенности к развитию этих заболеваний (табл. 1). 13 Таблица 1 Ассоциация полиморфных вариантов GSTP1, MDR1 и MRP1 с предрасположенностью к ХЛПЗ ГеноК Общая группа ХЛПЗ НХЛ ХЛЛ n n ОШ p n ОШ p n ОШ p тип A313G (экзон 5 гена GSTP1) AA 26 77 1,07 0,95 59 1,07 0,97 18 1,07 0,97 AG 28 71 0,8 0,57 52 0,56 0,16 19 1,04 0,89 GG 3 15 1,82 0,41 14 2,27 0,32 1 0,49 0,65 C341T (экзон 6 GSTP1 ) CC 49 94 68 26 0,42 0,09 0,41 0,02 0,4 0,03 CT 9 48 2,78 0,014 34 2,68 0,026 14 3,05 0,037 TT 2 4 0,2 0,21 4 1,14 1 0 0,73 0,73 C6+139T (интрон 6 MDR1 ) CC 28 47 1,15 0,74 33 0,95 0,98 14 2,35 0,09 CT 43 71 1,17 0,66 62 1,41 0,29 9 0,53 0,25 TT 18 18 0,6 0,23 14 0,58 0,23 4 0,69 0,73 С1236T (экзон 12 MDR1 ) CC 23 35 1,05 0,99 25 0,9 0,87 10 1,79 0,31 CT 49 76 1,13 0,77 64 1,27 0,49 12 0,7 0,56 TT 17 20 0,76 0,57 16 0,76 0,6 4 0,77 0,78 G2677T (экзон 21 MDR1 ) GG 28 42 0,88 0,77 32 0,82 0,63 10 1,15 0,94 GT 45 82 1,25 0,48 67 1,31 0,41 15 1,05 0,92 ТТ 16 22 0,81 0,69 18 0,83 0,76 4 0,73 0,78 C3435T (экзон 26 MDR1 ) CC 12 36 7 3,36 0,13 2,26 0,035 29 2,24 0,046 CT 38 61 1,06 0,93 47 0,97 0,97 14 1,15 0,93 TT 39 41 36 0,61 0,12 5 0,54 0,04 0,31 0,04 TT/CC 0,35 0,01 0,38 0,03 0,22 0,03 A1218+8G (интрон 9 MRP1) AA 39 43 0,63 0,14 34 0,6 0,13 9 0,77 0,77 AG 37 68 1,58 0,14 56 1,61 0,14 12 1,44 0,58 GG 10 14 0,96 0,9 12 1,01 0,84 2 0,72 1 T1684C (экзон 13 MRP1) TT 0 0 0 0 TC 30 38 0,75 0,4 30 0,81 0,61 8 0,57 0,35 CC 56 95 1,34 0,4 69 1,23 0,61 26 1,74 0,32 C2461-30G (интрон 18 MRP1 ) CC 2 0 0,34* 0,56 0* 0,39 0,58 0* 2,47 0,98 CG 34 49 0,99 0,92 44 1,05 0,98 5 0,64 0,62 GG 50 76 1,12 0,81 64 1,05 0,99 12 1,73 0,49 К – контрольная группа, n – число наблюдений, *– ОШ при допущении единицы в ячейке «дикой» гомозиготы 14 Роль полиморфизмов генов GSTP1, MDR1, MRP1 в формировании устойчивости к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями Об ассоциации разных генотипов с устойчивостью к химиотерапии судили по величине отношения шансов, показывающей во сколько раз выше вероятность быть устойчивым к химиотерапии (ОШ>1), чем чувствительным (ОШ<1) для индивида с данным генотипом. Данные по ассоциации различных генотипов GSTP1, MDR1 и MRP1 с устойчивостью к химиотерапии представлены в таблице 2. При анализе взаимосвязи между полиморфным вариантом гена GSTP1 в 5 экзоне и эффектом от лечения в общей группе больных ХЛПЗ было выявлено, что дикий генотип 313АА ассоциирован с чувствительностью к проводимому лечению. Вероятность не иметь эффекта от лечения у больных с этим генотипом ниже по сравнению с другими больными (ОШ=0.43, р=0,04) (табл. 2). Для генотипа 313AG выявлена обратная ассоциация: наличие данного генотипа приводит к увеличению шанса в 2,39 раза не отвечать на химиотерапию (р=0,04) (табл. 2). Поэтому A313G генотип можно считать фактором устойчивости к лечению. Для полиморфизма в 6 экзоне гена GSTP1 не было выявлено достоверных ассоциаций различных полиморфных вариантов с устойчивостью к химиотерапии (таблица 2). Анализ ассоциаций генетических вариантов MDR1 с ответом на химиотерапию представлен в таблице 2. Для полиморфизмов в интроне 6 и экзоне 12 у больных ХЛПЗ не было выявлено достоверных ассоциаций полиморфных вариантов С6+139T и C1236T с эффектом от химиотерапии (табл. 2). Больные ХЛПЗ с генотипом 2677ТT в 21 экзоне имеют вероятность формирования устойчивости к химиотерапии в 6.8 раза выше по сравнению с больными, имеющими один или оба аллеля 2677G (р=0,008). Аналогичная связь прослеживается для больных с генотипом 3435ТT: вероятность устойчивости к химиотерапии у них в 6.3 раза выше (р=0,02), чем у больных с генотипом 3435СC и еще более высокая по сравнению с больными, имеющими один или оба аллеля 3435С в генотипе (ОШ=10,08, р=0,002). Кроме того, если больной имеет гаплотип 2677TТ/3435ТT, то риск быть устойчивым к лечению у него в 10.5 раз выше (р=0,007), чем у больных с комбинацией генотипов 2677GG/3435CC, а по отношению к больным с другими комбинациями генотипов – в 17 раз (ОШ=17,73, р=0,00045). Известно, что полиморфизм С3435Т в 26 экзоне находится в неравновесии по сцеплению с полиморфизмами 21 экзонах, который в свою очередь приводит к аминокислотной замене (Kim et al., 2001). Поэтому выявленные различия в формировании устойчивости к химиотерапии у больных ХЛПЗ с разными генотипами в 26 экзоне могут быть результатом сцепления с полиморфизмами, приводящими к изменению структуры и функции белка. 15 Таблица 2 Ассоциация полиморфных вариантов GSTP1, MDR1 и MRP1 с эффектом от лечения у больных ХЛПЗ Полиморфизм ГеноНО* на ХТ, ЕО* на ХТ, ОШ p тип n n AA 19 36 0,43 0,04 A313G AG 26 19 2,39 0,04 (экзон 5) GG 5 6 1,02 1 CC 18 32 0,88 0,95 C341T CT 6 11 0,92 0,88 (экзон 6) TT 1 0 1,79* 1 CC 4 5 3,6 0,18 C6+139T CT 5 14 1,38 0,74 (интрон 6) TT 3 22 0,29 0,16 CC 4 5 3,6 0,18 С1236T CT 5 14 1,38 0,74 (экзон 12) TT 3 22 0,29 0,16 GG 4 18 0,64 0,74 GT 1 16 0,14 0,08 G2677T (экзон 21) ТТ 7 7 6,8 0,0084 TT/GG 0,92 0,99 CC 4 18 0,64 0,74 CT 1 18 0,12 0,04 C3435T (экзон 26) TT 7 5 10,08 0,002 TT/CC 6,3 0,02 AA 5 5 2,4 0,42 A1218+8G AG 5 11 0,55 0,68 (интрон 9) GG 0** 1 1,6 1 TT 0 0 T1684C TC 1 6 0,26 0,37 (экзон 13) CC 9 14 3,86 0,37 CC 0 0 C2461-30G CG 2 6 0,58 0,68 (интрон 18) GG 8 14 1,71 0,68 * НО на ХТ – нет ответа на химиотерапию, ЕО на ХТ – есть ответ на химиотерапию; **– ОШ при допущении единицы в ячейке мутантной гомозиготы в группе чувствительных к химиотерапии Частоты исследованных аллелей гена MRP1 достоверно не отличались в группе с наличием ответа на лечение и в группе больных, устойчивых к 16 лечению. При анализе ассоциации различных генотипов с формирование устойчивости к лечению у больных ХЛПЗ не было выявлено каких-либо достоверно значимых ассоциаций (табл.2). На сегодняшний день существуют лишь предположения о том, каким образом однонуклеотидные замены могут влиять на развитие предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Одной из гипотез является предположение о том, что аллель - специфические различия в укладке РНК могут влиять на экспрессию генов, участвуя, например, в транскрипции, сплайсинге или процессинге (Le Hir H., et al., 2003). Возможно, также, что некоторые однонуклеотидные замены повышают стабильность мРНК, что в последствие приводит к повышенной экспрессии белка. Но, тем не менее, молекулярные механизмы влияния однонуклеотидных замен на функцию Р-ликопротеина и MRP до сих пор остаются неизвестными. Однако, полиморфизм в индивидуальных генах незначительно увеличивает риск развития заболевания или формирования устойчивости к химиотерапии. Комбинация вариантов аллелей, в том числе и с аллелями других генов, учавствующих в детоксификации ксенобиотиков, вероятно, увеличит эффективность оценки риска. Такой пример увеличения риска не ответить на лечение был продемонстрирован для комбинации генотипов 21 и 26 экзона гена MDR1. Кроме того, неправильно было бы рассматривать полиморфизм гена как единственный механизм формирования различной чувствительности к заболеваниям. Также нужно исследовать экспрессию генов и функциональную активность изучаемых белков, таким образом формируя системный подход к проблеме. Функциональная активность P-гликопротеина в лимфоцитах контрольной группы и у больных неходжкинскими лимфомами и анализ ассоциации с полиморфизмом гена MDR1 Была проанализирована связь функциональной активности Ргликопротеина с различными физиологическими и клиническими параметрами: полом, возрастом, степенью злокачественности, схемами лечения, чувствительностью к химиотерапии, а также с наиболее распространенными полиморфизмами гена MDR1. Не было получено статистически достоверной ассоциации функциональной активности Р-гликопротеина с полом и корреляции с возрастом ни в контрольной группе (r=0.03, p=0.86), ни у больных НХЛ (r=0.07, p=0.56). При анализе активности Р-гликопротеина у больных НХЛ выявлена достоверно (р=0,02) более высокая активность по сравнению с группой здоровых. 17 9 8 p = 0,02 6 5 4 E Rh123, отн.ед. 7 3 2 1 0 Контроль НХЛ Рис. 3. Функциональная активность Р-гликопротеина (ЕRh123) в лимфоцитах в контрольной группе (n=49) и у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями (n=76). При анализе активности Р-гликопротеина у больных НХЛ с разной степенью злокачественности, определенной на основании результатов гистологического исследования биоптатов лимфоузлов, была выявлена связь повышения уровня функциональной активности с увеличением степени злокачественности опухоли (р=0,01) (рис. 4). Попарное сравнение групп показало, что в группе больных с высокой степенью злокачественности уровень активности Р-гликопротеина достоверно (р=0,009) выше, по сравнению с группой больных с низкой степенью злокачественности. 7 p = 0,01 НСЗ – низкая степень злокачественности, ПСЗ – промежуточная степень злокачественности, ВСЗ – высокая степень злокачественности. 6 E Rh123, отн.ед. 5 4 3 p = 0,07 2 1 Медиана 25%-75% Min-Max p = 0,009 0 НСЗ ПСЗ ВСЗ Рис. 4. Функциональная активность Р-гликопротеина (ЕRh123) в лимфоцитах больных неходжкинскими лимфомами с разной степенью злокачественности опухоли. Данные об активности Р-гликопротеина у леченых больных НХЛ были проанализированы в зависимости от схемы лечения. Была выявлена тенденция к увеличению функциональной активности Р-гликопротеина при усилении агрессивности химиотерапии (рис. 5). 18 5 1- алкилирующие агенты Rh123, отн.ед. E (циклофосфан и/или лейкеран), p = 0,11 4 3 2- алкилирующие агенты и 2 винкристин, 1 Медиана 25%-75% Min-Max 3- алкилирующие агенты, винкристин и доксорубицин Рис. 5. Функциональная активность Р-гликопротеина (ЕRh123) у больных лимфопролиферативными заболеваниями в зависимости от схемы лечения. 0 1 2 3 При анализе взаимосвязи между активностью Р-гликопротеина и эффектом от лечения больные были разделены по клиническим признакам на две группы. В группу больных, чувствительных к химиотерапии, были включены больные НХЛ, у которых наблюдалась стабилизация, частичная ремиссия или продолжительная ремиссия. В группу больных, устойчивых к химиотерапии, были включены больные НХЛ, у которых ответ не достиг уровня стабилизации (имелось прогрессирование).Больные, чувствительные к химиотерапии, имеют более низкий уровень функциональной активности Ргликопротеина по сравнению с больными, которые устойчивы к химотерапии (рис. 6), хотя различия не были достоверными 6 p = 0,59 Уст. к ХТ – группа больных, устойчивых к химиотерапии, n=13 4 3 Чувств. к ХТ – группа больных, чувствительных к химиотерапии, n=38 E Rh123, отн.ед. 5 2 1 0 Уст. к ХТ Чувств. к ХТ Медиана 25%-75% Min-Max Рис. 6. Функциональная активность Р-гликопротеина (ЕRh123) у больных лимфопролиферативными заболеваниями в зависимости от эффекта от лечения (в группах чувствительных и устойчивых к химиотерапии ). При анализе связи функциональной активности Р-гликопротеина и полиморфизмов гена MDR1 не было выявлено достоверных ассоциаций ни с одним генотипом ни у больных НХЛ, ни в контрольной группе здоровых (рис. 7-10). Интересно отметить, что несмотря на отсутствие достоверных связей, все носители гетерозигот как здоровые, так и больные НХЛ имели более низкий уровень активности Р-гликопротеина. 19 p = 0,81 7 6 6 6 6 4 5 4 E 5 E Rh123, отн.ед. 7 Rh123, отн.ед. 7 E Rh123, отн.ед. 5 4 4 3 3 3 2 2 2 2 1 1 Медиана 25%-75% Mi n-Max 0 w /w w /m w /w m/m w /m w/w w /w m/m 8 8 p = 0,27 p = 0,07 7 6 6 6 6 E 4 E Rh123, отн.ед. 7 E Rh123, отн.ед. 7 5 4 5 4 5 4 3 3 3 3 2 2 2 2 1 1 1 1 0 0 w /w w /m m/m w /w w /m m/m Медиана 25%-75% Min-Max Рис. 9. Ассоциация полиморфизма G2677T гена MDR1 с функциональной активностью Р-гликопротеина в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами. p = 0,22 8 7 5 m/m 9 9 p = 0,37 w /m НХЛ Контроль 9 8 w/m Рис. 8. Ассоциация полиморфизма C1236T гена MDR1 с функциональной активностью Р-гликопротеина в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами. НХЛ 9 Медиана 25%-75% Min-Max 0 0 Рис. 7. Ассоциация полиморфизма C6+129T гена MDR1 с функциональной активностью Р-гликопротеина в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами. Контроль 1 1 mm p = 0,14 5 3 E Rh123, отн.ед. E Rh123, отн.ед. 8 7 0 Rh123, отн.ед. p = 0,77 8 p = 0,76 8 9 9 9 8 НХЛ Контроль НХЛ Контроль 9 0 0 w /w w /m m/m w /w w /m m/m Медиана 25%-75% Min-Max Рис. 10. Ассоциация полиморфизма C3435T гена MDR1 с функциональной активностью Р-гликопротеина в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами. Функциональная активность MRP в лимфоцитах контрольной группы и у больных неходжкинскими лимфомами и анализ ассоциации с полиморфизмом гена MRP1 Анализ связи функциональной активности MRP с полом не выявил ассоциации активности с возрастом, а также показал отсутствие достоверных корреляций с возрастом как в контрольной группе: так и у больных неходжкинскими лимфомами Не было получено статистически достоверной ассоциации функциональной активности MRP1 с полом и корреляции с возрастом ни в контрольной группе: r=0.002, p=0.99 (n=29), ни у больных НХЛ: r=0.12, p=0.51 (n=31). Анализ функциональной активности MRP1 в контрольной группе и у больных НХЛ показал достоверно (р=0,01) более высокий уровень активности в группе больных (рис.11). Изучить связь уровня функциональной активности MRP с эффектом от лечения и прогрессией опухоли не представлялось возможным, так как большую часть исследованых больных составляли нелеченые больные. При анализе связи функциональной активности MRP1 и полиморфизма гена MRP1 ни с одним генотипом не было выявлено достоверных ассоциаций ни у больных, ни в контрольной группе (рис. 12-14), хотя было выявлено, что уровень функциональной активности белка снижается с увеличением количества мутантных аллелей в гене MRP1 во всех изученных полиморфизмах. Таким образом, результаты исследования показали, что генетический полиморфизм может быть важным фактором, определяющим как предрасположенность к лимфопролиферативным заболеваниям, так и устойчивость к лекарственной терапии. Различные однонуклеотидные замены в гене могут приводить к изменению уровня экспрессии генов, структуры и функции белков, поэтому важно изучать связь полиморфизмов генов GSTP1, MDR1 и MRP1 с функциональной активностью белков, кодируемых этими генами. В нашем исследовании не было выявлено достоверной ассоциации уровня активности Ргликопротеина и MRP с исследованными полиморфизмами их генов. Также не получено связи активности Р-гликопротеина с ответом на лечение. Известно, что в формировании лекарственной устойчивости принимают участие и другие транспортные белки. Совместное функционирование нескольких белков может приводить к увеличению выведения химиопрепаратов из клетки и, как следствие, к возникновению устойчивости к лечению. Сочетание различных механизмов лекарственной устойчивости в одних и тех же клетках, влияние индивидуального генотипа больного и разнообразие методов исследования определяют необходимость дальнейших исследований роли различных механизмов в возникновении множественной лекарственной устойчивости опухолей различной этиологии. Выделение групп риска по устойчивости к химиотерапии в соответствии с полученными данными поможет разработать индивидуализированные схемы фармакологической терапии с учетом известной устойчивости к используемым лекарственным средствам. НХЛ Контроль 3,0 3,0 3,0 p = 0,01 0,5 0,0 Контроль Медиана 25%-75% Min-Max НХЛ Рис. 11. Функциональная активность MRP (ЕCFDA) в лимфоцитах в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами 1,5 E 1,5 1,0 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 w/w w/m m/m Контроль m/m НХЛ p = 0,34 p = 0,38 2,5 2,0 2,0 2,0 1,5 E CFDA, отн.ед. 2,5 E CFDA, отн.ед. 2,5 1,5 p = 0.93 2,0 1,5 1,5 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,0 m/m 0,0 w/w w/m m/m Медиана 25%-75% Min-Max Рис. 13. Ассоциация полиморфизма T1684C гена MRP1 с функциональной активностью MRP в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами p = 0.25 2,5 1,0 w/m w/m 3,0 3,0 3,0 w/w w/w Рис. 12. Ассоциация полиморфизма A1218+8G гена MRP1 с функциональной активностью MRP в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами НХЛ Контроль 3,0 E CFDA, отн.ед. CFDA, отн.ед. 2,0 1,5 p = 0,35 2,0 E CFDA, отн.ед. 1,0 2,5 p = 0,38 2,5 E CFDA, отн.ед. CFDA, отн.ед. 2,0 E 2,5 0,0 0,0 w /w w /m m/m w /w w /m m/m Медиана 25%-75% Min-Max Рис. 14. Ассоциация полиморфизма C2461-30G гена MRP1 с функциональной активностью MRP в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами 1. 2. 3. 4. 5. ВЫВОДЫ: У европеоидов Западной Сибири полиморфизмы гена GSTP1 в 6 экзоне (C341T) и гена MDR1 в 26 экзоне (C3435T) сязаны с хроническими лимфопролиферативными заболеваниями: – с предрасположенностью к развития заболеваний ассоциированы генотипы 341СТ (ОШ=2.78, р=0.01) и 3435СС (ОШ=2.26, р=0.04); – с устойчивостью к заболевания ассоциированы генотипы 341СС (ОШ=0.41, р=0.02) и 3435ТТ (ОШ=0.54, р=0.04). Для формирования лекарственной устойчивости у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями значимыми являются полиморфизмы в 5 (A313G) экзоне гена GSTP1, 21 (G2677T) и 26 (C3435T) экзонах гена MDR1: – с устойчивостью к химиотерапии ассоциированы генотипы 313АG (ОШ=2.39, р=0.04), 2677ТТ (ОШ=6.8, р=0.008) и 3435ТТ (ОШ=10.08, р=0.002), и комбинация гентипов 2677ТТ/3435ТТ (ОШ=17.73, р=0.00045); – с чувствительностью к химиотерапии ассоциированы генотипы 313АА (ОШ=0.43, р=0.04) и 3435СТ (ОШ=0.12, р=0.04). Уровни функциональной активности Р-гликопротеина и MRP в лимфоцитах периферической крови у больных неходжкинскими лимфомами выше, чем в контрольной группе, и активность Р-гликопротеина связан со степенью злокачественности опухоли: достоверно более высокий уровень активности имеют больные с высокой степенью злокачественности. Уровень функциональной активности Р-гликопротеина в лимфоцитах периферической крови не является показателем для прогноза устойчивости к химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями: результат химиотерапии не зависит от активности Р-гликопротеина. Ассоциации уровней функциональной активности P-гликопротеина и MRP1 с полиморфизмами С6+139T C1236T, G2677T, C3435T гена MDR1 и T1684C, A1218+8G, C2461-30G гена MRP1 соответственно не выявлены ни в контрольной группе и ни у больных неходжкинскими лимфомами. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. 2. 3. Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Горева О.Б., Сафронова О.Г., Мухин О.В., Домникова Н.П., Ляхович В.В. Полиморфизм гена GSTP1 у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями: оценка связи с экспрессией GST и лекарственной устойчивостью. // Бюлл. эксп. биол.мед. – 2002. – Прил.1. – С.65–67. Горева О.Б., Гришанова А.Ю., Мухин О.В., Домникова Н.П., Ляхович В.В. Возможный прогноз эффективности химиотерапии больных лимфопролиферативными заболеваниями в зависимости от G2677T и C3435T полиморфизмов гена MDR1. // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2003. – Т. 136. – № 8. – С. 209–212. Горева О.Б., Гришанова А.Ю., Мухина О.В., Домниковой Н.П., Ляхович В.В. «Полиморфизмы C1236Т и C6+139Т гена MDR1 в Российской популяции: исследование ассоциаций с предрасположенностью к лимфопролиферативным 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. заболеваниям и устойчивостью к химиотерапии».// Бюлл. экспер. биол. мед. 2004. – Т. 138. – № 10. – С. 454–457. Grishanova A.Y., Vorontsova E.V., Goreva O., Lyakhovich V.V GSTP1 gene polymorphism and expression in patients with lymphoproliferative disease: relation to drug resistance. // International J. Cancer. – 2002. – Suppl 13. – P.403–404. Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Горева О.Б. Полиморфизм и экспрессия гена GSTP1 у больных лимфопролиферативными заболеваниями. // Труды 1 международного симпозиума «Стресс и экстремальные состояния», Сателлитный симпозиум «Новые технологии в медицине и биологии третьего тысячелетия» Кара-Даг, Феодосия (Крым), Украина, 5-14 июня 2002 года, С. 99–100. Grishanova A.Yu., Vorontsova E.V., Goreva O.B., Lyakhovich V.V. GSTP1 gene polymorphism and expression in patients with lymphoproliferative disease: relation to drug resistance. // 18th International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo, Norway, Abstr. N 854. Goreva O., Grishanova A., Vorontsova E., Lyakhovich V. GSTP1 gene polymorphism and expression in patients with non-Hodgkin's lymphoma and chronic lymphocytic leukaemia: relation to drug resistance. // European Scientific Conference: Understanding the Genome: Scientific Progress and Microarray Technology, November 29 - December 1 2002, Genova, Italy, Abstr. Goreva O., Grishanova A., Vorontsova E., Lyakhovich V. Genetic polymorphism of glutathione S-transferase P1 and sensitivity to chemotherapy of patient with lymphoid malignances. // 37thAnnual Scientific Meeting: European society for clinical investigation. The pathophysiology of diseases: from bench to bedside, 2 – 5 April 2003, Verona, Italy, Abstr. Goreva O.B., Grishanova A.Yu., Lyakhovich V.V. Allelic frequency of single nucleotide polymorphisms in MDR1 gene in patients with Non Hodgkin’s Lymphomas. // 8th Congress of the European Hematology Association, 2003, Lyon, France, http://eurocongres.com/eha2003/eha_scientific.html, Poster session 1: Non Hodgkin’s Lymphoma, abstract nr.: 0330. 12-15 June, 2003. Горева О.Б., Гришанова А.Ю., Мухин О.В., Домникова Н.П., Ляхович В.В. Полиморфизмы G2677T и C3435T гена MDR1 и устойчивость к химиотерапии больных лимфопролиферативными заболеваниями. // Российско-Норвежская конференция по вопросам гематологии, 2003, г. Санкт-Петербург, 4-7 сентября 2003 года, С. 71-72, 133-134. Горева О.Б., Гришанова А.Ю., Мухин О.В., Домникова Н.П., Ляхович В.В. Генетический полиморфизм MDR1 у здорового населения Западной Сибири и у больных лимфопролиферативными заболеваниями. // III Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и пргресс клинической медицины», Москва, 20-24 января 2004, с.75. Горева О.Б., Гришанова А.Ю. Анализ полиморфизма гена MRP1 у европеоидов Западной Cибири. // 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 17-21 мая 2004, с. 7. Goreva, O.B., Grishanova, A.Yu., Mukhin O.V., Domnikova N.P., Lyakhovich, V.V. Association of MDR1 polymorphisms with drug resistance risk in patients with lymphoproliferative disorders. // 9th Congress of the European Hematology 24 14. 15. 16. 17. 18. Association, 2004, Geneva, Switzerland http://eurocongres.com/eha2004/eha_scientific.html, Poster session 1: Non Hodgkin’s Lymphoma, abstract nr.: 517, 10-13 June, 2004. Goreva, O.B., Grishanova, A.Yu., Lyakhovich, V.V. Frequency of MRP1 genetics polymorphisms in Russian population. // 15th European Students' Conference for future doctors and young scientists, Berlin, Germany, http://esc-berlin.com, 19-23 October, 2004, p.97. Шмелева А.В., Горева О.Б. Роль генетического полиморфизма GSTP1, MDR1, MRP1 в предрасположенности к острому лимфобластному лейкозу у детей. // Международный молодежный научный Форум «Ломоносов-2005», Москва, 1215 апреля 2005, сборник тезисов XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» - Т. II. – С. 494 – 495. Горева О.Б., Мельникова Е.В., Шмелева А.В. «Полиморфизм GSTP1, MDR1, MRP1 и функциональная активность Р-гликопротеина и MRP у детей с острым лимфолейкозом». // Региональная конференция молодых ученых-окологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», 20 апреля 2006 , Томск, с. 14-15. Goreva O.B., Grishanova, A.Y., Shmeleva A.V., Lyakhovich, V.V. Genetic polymorfhism of glutathione S-transferase P1 in childhood acute lymphoblastic leukemia. // 13th International Student Congress of Medical Sciences, Groningen, the Netherlands, 14-17 June, 2006, p.232. Goreva O.B., Grishanova A.Yu., Lyakhovich V.V Genetic polymorphism of GSTP1, MDR1, MRP1 and susceptibility to lymphoid malignancies. // Совместная российско-американская конференция по проблемам гематологии и трансплантации костного мозга, 21-23 июня 2006, рабочее совещание по проблемам клеточной терапии 24 июня, 2006, с. 92. Список используемых сокращений: CYP – цитохром Р450 GSTP1 – ген, кодирующий глутатион-S-трансферазу P1 MDR1 – ген, кодирующий Р-гликопротеин MRP1 – белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью MRP1 – ген, кодирующий белок MRP1 p – уровень значимости различий АВС – семейство АТФ связывающих белков АТФ - аденозинтрифосфат МЛУ – множественная лекарственная устойчивость НХЛ – неходжкинские лимфомы ОШ- отношение шансов ПАУ-полициклические ароматические углеводороды ХЛЛ – хронический лимфобластный лейкоз ХЛПЗ – хронические лимфопролиферативные заболевания ХТ- химиотерапия Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту, директору НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, академику РАМН Ляховичу 25 Вячеславу Валентиновичу и руководителю Гришановой Алевтине Юрьевне за руководство работой на всех ее этапах Автор благодарит Мельникову Евгению Владимировну и Воронцову Елену Владимировну за помощь в проведении экспериментальной части работы, а также зав. гематологического отделения с блоком асептических палат для трансплантации костного мозга Новосибирской областной клинической больницы Мухина Олега Викторовича и д.м.н., проф. НМГУ Домникову Наталью Петровну за предоставление клинического материала, а также весь коллектив НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН. Соискатель Горева О.Б. 26