Высшим достижением новейшей биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных (природных или искусственно созданных) донорских генов в клетки-реципиенты растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками. При наличии выделенного гена его надо доставить в клетку, наследственность которой предстоит изменить. Для этой цели в генной инженерии были созданы различные методы, отличающиеся как по своей эффективности, так и по условиям применения. Геном эукариот существенно отличается от генома бактерий, что затрудняет или делает невозможной не только их экспрессию в клетках прокариот, но и их трансформацию методами, разработанными для них. Основная сложность заключается в том, что геном эукариот находится в состоянии сильной компактизации, и кроме того эукариотические промоторы, обеспечивающие считывание гена, отличаются у таковых у эукариот. Кроме того, механизм регуляции транскрипции в их клетках гораздо более сложен. Если же рассматривать в отдельности растения, то у их клеток имеется клеточная стенка, что дополнительно усложняет доставку в них генетического материала. В настоящее время известно около 40 различных способов доставки рекомбинантной ДНК в клетки, по-разному решающих проблему преодоления плазматической мембраны. Каждый из методов доставки чужеродной ДНК в клетки имеет свои особенности, преимущества и недостатки в отношении выживаемости клеток, эффективности введения, универсальности, возможностей технического осуществления. Выбор метода зависит от типа клеток-хозяев и типа использованного вектора, а также от личных предпочтений и возможностей экспериментатора. В общем виде все способы доставки можно разделить на две большие группы: векторные и методы прямой доставки. 1) Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент, встроить ее в геном, позволить идентификацию трансформированных клеток, обеспечить стабильную экспрессию введенного гена. Таким образом, вектор должен быть небольшим, способным поддерживаться в клетке-хозяине (реплицироваться), многократно копироваться (ампфлицироваться), экспрессировать соответствующий ген (содержать соответствующие регуляторные последовательности), должен иметь маркерный ген, позволяющий различать гибридные клетки для эффективной селекции их; должен быть способен передаваться в клетку соответствующего организма. В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. При трансформации эукариот при помощи ДНК бактериальных плазмид необходимо учитывать, что репликаторы бактерий и их плазмид не работают в клетках эукариот. Вследствие этого такая трансформация низкоэффективна. Для того чтобы возник стабильный трансформант, необходимы два последовательных события: проникновение ДНК в клетку и ее рекомбинация с хромосомной ДНК, т. е. интеграция. Такую интегративную трансформацию легче провести у эукариотических микроорганизмов, для которых доступны методы селективных сред, чем у многоклеточных эукариот. Именно так были проведены первые эксперименты по трансформации дрожжей Sacch. cerevisiae. Однако, в качестве векторов могут использоваться опухолеобразующие плазмиды бактерий. В естественных условиях Agrobacterium tumefaciens вызывает в растениях-хозяевах опухоли с названием «корончатые галлы». Корончатые галлы возникают из-за нарушений гормонального баланса, их клетки неограниченно растут даже в отсутствие растительных гормонов и сохраняют свои свойства при элиминации бактерии. Эти отклонения обусловлены наличием в клетке бактерии так называемых Ti-и Ri-плазмид. Ti- и Riплазмиды представляют собой кольцевую 2-нитевую ДНК из 12-22 т.п.о. В состав Ti-плазмиды входят так называемая Т-ДНК (transferred DNA — трансформирующая ДНК, сегмент, встраиваемый в ДНК растения),которая кодирует ферменты синтеза опинов и фитогормонов; Vir-область, кодирующая гены, отвечающие за перенос Т-ДНК в растение; гены утилизации опинов; локусы ori обеспечивают репликацию плазмиды и контролируют поддержание плазмиды в бактериальной клетке, tra — контролируют конъюгацию бактерий. В области Т-ДНК, гомологичной у разных Ti-плазмид, есть 6 генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез гормонов. Эти гены имеют черты эукариотического типа регуляции: 1) имеются 3’ и 5’-фланкирующие последовательности, есть TATA и GAAT-боксы и сигналы полиаденилирования; 2) транскрипция этих генов инициируется РНК-полимеразой II; 3) последовательности генов узнаются транс-действующими факторами, гены имеют тканеспецифичность, сопоставимую с растительной. Инсерция Т-ДНК в растительную хромосому проходит многоступенчато. Существует гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от сайта интеграции и наружным относительно точек вырезания Т-ДНК областям плазмиды. Механизм встраивания сходен с гомологичной рекомбинацией. При переносе могут возникать делеции и инсерции около концевых последовательностей. Гены Т-ДНК имеют собственные промоторы, транскрибируются ферментами хозяина. Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмиды не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удалёнными онкогенами. Вместо последних в вектор можно встроить стандартными методами последовательности клонируемой ДНК. Сайты рестрикции расположены в искусственной Т-области. В качестве селективных маркёров в этих плазмидах используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые позволяют отбирать трансформированные клетки растений. Получение трансгенных однодольных растений с помощью агробактериальной трансформации было долгое время затруднено, поскольку они характеризуются устойчивостью к этому патогену. Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду. Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Tiплазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий. Часто используется бинарная векторная система. В агробактерию вводят 2 модифицированных Tiплазмиды. Одна содержит vir-область (хелперная плазмида, или плазмида-помощник), вторая — Т-ДНК с нужным геном. Vir-гены могут вырезать Т-ДНК в транс-положении (на соседней плазмиде). Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов. Возможно встраивание нескольких копий Т-ДНК. Для введения сконструированных Ti-плазмид в растительную клетку может быть использовано несколько методов. Наиболее простой из них природный способ — это инокуляция сконструированных штаммов в поврежденные (пораненные) области растения. Другой метод состоит в трансформации протопластов путем кокультивирования их с агробактериями Методика кокультивации может рассматриваться как индукция опухолей в искусственных условиях: вирулентные агробактерии временно совместно культивируются с протопластами. Если агробактерии добавляются к свежевыделенным или однодневным протопластам, не наблюдается ни присоединения бактерий, ни трансформации. Существенным условием для трансформации является наличие вновь образуемых клеточных стенок у 3-дневных протопластов. Эффективность кокультивирования может быть повышена применением индукторов слияния клеток (ПЭГ, кальций и др.). Вирусы служат удобным средством доставки генетической информации в клетки. Оболочка вирусов позволяет осуществить перенос генетической информации в клетки-мишени. Векторная ДНК не может реплицироваться и создавать новые вирусные частицы в отсутствие вирусных генов. Структура гена многих векторов содержит вирусную ДНК только на обоих концах, при этом ДНК не кодирует вирусные гены. Структура концов вирусного вектора служит для распознавания векторной ДНК с целью ее включения в инкапсулированные частицы вириона. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую. К таким относятся ДНК- вирусы SV-40 и вирус полиомы. Внедрение некоторых опухолевых РНК- вирусов ведет к отпочковыванию вирусных частиц от клетки без ее лизиса. К таким вирусам относятся, например, ретровирусы. Реже используют аденовирусы, так как они могут вызывать сильный иммунный ответ, кроме того, невозможно их повторное введение. Вирусы являются одними из главных кандидатов на роль векторов для введения чужеродной ДНК. При вирусной инфекции каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем сильных вирусных промоторов, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования. Векторные последовательности, содержащие терапевтический ген, фланкированы структурной последовательностью вируса и упаковочным сигналом. Нуклеотидная последовательность, необходимая для упаковки ДНК вектора в вирион, фланкирует ген экспрессии . Благодаря этому только нуклеотидные последовательности вектора, кодирующие терапевтический ген, упакованы в вирусную частицу. Вектор, геном которого содержит только терапевтический ген при отсутствии вирусных генов, переносится к клеткам-мишеням и осуществляет трансдукцию . Происходит интеграция терапевтических генов, содержащихся в вирусных векторах, в хромосомы клеткимишени. В последние годы сконструированы многочисленные «челночные» векторы и их рекомбинантные производные, способные к репликации в животной клетке. Наиболее распространенные векторы состоят из плазмиды рВR322 и интактного раннего района транскрипции ДНК SV40, а нужный ген встраивается под контроль промотора поздних генов или дополнительного раннего промотора. Недостатком вирусов как векторов является их небольшая емкость. Кроме того, вирусы заражают небольшой круг хозяев. К тому же, существует так же проблема их безопасного использования в качестве вектора для переноса генетической информации. Проблема состоит в том, что любой вектор обладает потенциальной возможностью инициировать инсерционный мутагенез , вызывая инактивацию или гиперактивацию независимых генов клетки, которые могут быть вовлечены в канцерогенез . Трансдукция такого вектора осуществляется только в активно делящиеся клетки. В каждый момент времени большинство клеток ткани находится в неделящемся состоянии. В отсутствие стимуляции клеточного деления эффективность генного переноса низка. Из всех известных в настоящее время инфекционных агентов имеют ранг наименее изученных вироиды. Они представляют собой очень короткую цепь 1 нитевой ковалентно связанной кольцевой РНК, состоящую из 270-300 нуклеотидов (на три порядка меньше самых минимальных вирусов), не заключенную в белковую оболочку. Каким образом вироиды продуцируют симптомы болезни в инфицированных растениях, не известно до сих пор. Установлено, что они реплицируются ферментами клетки-хозяина, не транслируются в видоспецифичные полипептиды, интегрируются в геном клетки-хозяина. Вироиды заражают персиситентно (не происходит выздоровления). Вызывают системную инфекцию, т.е. мигрируют из сайта внедрения в другие части растений, переносятся механически или через клеточный сок, через семена, пыльцу. Вироиды также связаны с ядерными фракциями растений и могут размножаться в ядрах. Однонитевые и двунитевые ДНК способны инициировать репликацию вироида в механически инокулированных растениях табака. Энзиматически in vitro синтезированы также РНК вироидов, высокоинфекционные для растений. Векторные системы могут быть разработаны на основе самих РНК, на основе вироидоспецифичных ДНК, а также в комбинации вироидоспецифичных ДНК с Tiплазмидами. Вироиды инфицируют своих хозяев в течение всего их жизненного цикла, поэтому в случае использования вироидных векторных систем можно ожидать постоянной экспрессии чужеродного гена в растении. Плазмиды слишком малы, чтобы переносить большой генетический материал, а вирусные векторы, как мы только что обсуждали, трудно контролировать. Эти проблемы с векторами можно было бы решить, если бы мы могли создавать хромосомы с необходимым генетическим материалом. Эти хромосомы сосуществовали бы с естественным генетическим материалом клетки таким же образом, как ДНК митохондрий. Ученые обнаружили, что двухцепочечная ДНК с теломерами на концах, центромерой и сайтами связывания ДНК-полимеразы для репликации будет вести себя в клетке, как хромосома. Это открытие позволило создать искусственные хромосомы. Искусственная дрожжевая хромосома была впервые создана в 1987 году Дэвидом Берком. Искусственная дрожжевая хромосома имеет теломеры, центромеру и элементы, участвующие в репликации. Инженерная искусственная дрожжевая хромосома вводится в клетку с помощью химических методов, которые индуцируют клетку поглощать генетический материал. Синтетическая хромосома остается независимой от другого генетического материала в клетке-хозяине и функционирует исключительно как дополнительная хромосома. Она может нести в себе намного больший фрагмент ДНК, до 1 млн пар оснований. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. 2) Для прямого введения ДНК в клетку существует множество методов. Эти методы включают введение изолированной ("голой") ДНК и применение сложных химических соединений, включающих ДНК. Перспективность применения невирусных векторов обусловлена отсутствием риска вирусной контаминации с возможностью их получения в более контролируемых условиях. К их основным недостаткам относится низкая скорость переноса генов, по крайней мере по сравнению с большинством вирусных векторов. При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза. Для повышения эффективности трансформации к специфической ДНК, содержащей ген, по которому будет производится селекция, добавляется неспецифическая ДНК-носитель. Обычно для этой цели берут ДНК из тимуса теленка или спермы лосося. Часть ДНК связывается с мембраной и не попадает в клетки. ДНК акцептируют от 15 до 90% клеток. Через несколько суток после введения небольшая доля клеток способны экспрессировать чужеродные гены, но затем уровень экспрессии падает и более или менее стабильную трансформацию претерпевает 10-3 - 10-5 клеток. Для трансфекции используется и ДЭАЭ-декстран, полимер, адсорбирующий ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии высоки, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании преципитата кальция. К недостаткам метода стоит отнести токсичность ДЕАЕдекстрана для некоторых типов клеток, зависимость эффективности от качества препарата, очень малую частоту получения стабильных трансфектантов. Частоту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 минуты в 15% растворе глицерина в НEPES-буфере). Кальций-фосфатный метод более эффективен и дешев, но вызывает разрыв молекул ДНК, что переводит кольцевые молекулы в линейную форму, иногда неинфекционную в случае трансфекции вирусов. Кроме того, условия кальций-фосфатной трансфекции приходится подбирать для каждых клеток-мишеней индивидуально. --Микроинъекция ДНК клеточная мембрана прокалывается микроиглой и раствор, содержащий ДНК, вводится в цитоплазму клетки или напрямую в ядро, если ядро достаточно большое (например, ядро яйцеклетки). Этот метод внедрения генов в клетки млекопитающих стал возможным с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора. Метод введения ДНК с помощью микроинъекций был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и Диакумакосом. В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за 1 ч инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших 106 экспериментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Метод очень эффективен, доля клеток со стабильной интеграцией и экспрессией инъецированных генов может достигать 50 %. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления. -- «Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток митозе колцемидом. При продолжительной обработке клеток колцемидом в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к образованию мини-клеток, представляющих микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Полученные мини-клетки очень чувствительны к разного рода воздействиям, поэтому для слияния подбирают специальные мягкие условия. Метод трудный, капризный, эффективность низкая – 10-6 – 10-7. -- Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Липосомы - сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам. Революцией явилось введение в практику первого низкотоксичного катионного липида ДОТМА (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезированного Фелгнером. Эффективность трансфекции с использованием катионного липида (рис. 2.10) была приблизительно в 100 раз больше относительно любого другого химического реагента, причем с большой долей стабильных трансгенных клеток. Одновременно был введен в практику новый термин «липофекция», подчеркивающий высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липид-катионные комплексы к инфекционным вирусным частицам. Развивая успех, были разработаны многочисленные вариации этих соединений (липофектин, липофектамин, селлфектин и др.). Параллельно разрабатывались средства доставки на основе фосфолипидных липосом, начиненных ДНК или РНК. Маленькие сферы из искусственных мембран могут сливаться с плазматическими мембранами клеток или поглощаться эндоцитозом, высвобождая содержимое внутрь клетки. Небольшую эффективность липосомной трансфекции повысило введение в структуру липосом фосфолипидов, способные инициировать слияние мембран. Однако, липосомный метод достаточно капризен и требует тщательного подбора всех условий для эффективной трансфекции конкретных клеток. Кроме того, процедура инкапсулирования, связана обычно с обработкой ультразвуком, часто повреждает крупные молекулы ДНК. Новым этапом в развитии трансфекционных реагентов стала разработка более эффективной и адресной доставки в специфические клетки-мишени нуклеиновых кислот путем введения в структуру синтетических трансфекционных реагентов и липосом различных лигандов для связывания с мембранными белками-рецепторами. Наличие таких адресных групп (лигандов), узнаваемых клеточными рецепторами, позволяет использовать механизмы лиганд-опосредованного эндоцитоза. В качестве таких лигандов используют белки и пептиды, узнаваемые рецепторами; олигосахариды, поскольку на поверхности многих животных клеток присутствуют лектины -белкирецепторы, специфически их связывающие; полисахариды. Процессы взаимодействия с клетками таких адресных комплексов ДНК(РНК)-трансфекционный реагент имеют сходство с проникновением в клетку вирусных частиц. Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно однодольных. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама или золота, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика - до 1 мм, однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить гены, например, в волокна поперечно-полосатых мышц. Баллистическая трансфекция очень эффективна даже там, где толстые клеточные стенки (дрожжи, растения) являются препятствием для многих других методов доставки, и применяется в том числе для тканей, органов и даже целых организмов. В настоящее время широко используется в генотерапии, для получения трансгенных животных и растений. Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в то время как в зоне 0,6—1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растениятрансформанты. Кроме успехов в получении трансгенных однодольных, биолистическая трансформация применяется для прямого переноса ДНК в эмбриогенную пыльцу и дальнейшего быстрого получения трансгенных дигаплоидных растений, которые являются важным этапом в селекционной работе. Такое разнообразие средств и методов трансфекции обусловлено различными задачам, широким спектром используемых клеток-мишеней и типов доставляемых в клетки нуклеиновых кислот, а также потребностями общества в получении все более эффективных средств доставки генетической информации в клетки, ткани и целые организмы. Особое внимание уделяется развитию трансфекционных реагентов и методов в связи с поразительными перспективами генной терапии человека, для которой необходимы адресные высокоэффективные и безопасные средства генной доставки. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клеткимишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем - стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность — все еще нуждаются в серьезных доработках. Поэтому разработке методов введения ДНК в клетки, ведущих к получению большей доли стабильных трансформантов, уделяется особое внимание. Кроме того, большой процент стабильных трансформантов, также позволяет отказаться от селективных и маркерных генов, являющихся балластными при создании трансгенных организмов.
