Подготовила: Мустакимова Руфина Ришатовна Теория по культивированию фенолразрушающих бактерий Культивирование – создание оптимальных условий для обеспечения процессов жизнедеятельности и размножения микроорганизмов в искусственных системах. В пищевой промышленности производные фенола обеспечивают консервирующие свойства в коптильном дыме. Некоторые из них используют в пищевой промышленности для предохранения жиров от прогорания. Многие фенолы являются антиоксидантами и защищают липиды мембран от окислительного разрушения. В составе пластмасс фенол не теряет своих летучих свойств, поэтому использование фенопластов в пищевой промышленности, производстве предметов быта категорически опасно. Таким образом, фенольные загрязнения в пищевой промышленности могут попадать в почву и в водоемы со сточными водами и ливневыми стоками. Растения также продуцируют вещества, подавляющие или тормозящие рост фитопатогенов. Наиболее активными из них являются фенолы. В тканях растений фенолы встречаются в виде эфиров и гликозидов. Это пирокатехин, гидрохинон, пирогаллол, фенольные спирты, альдегиды и кислоты. Стрептомицеты и близкие роды. Это гетерогенная группа, для всех таксонов которой характерны клеточные стенки, содержащие L- диаминопиколиновую кислоту и глицин. Нити мицелия не распадаются на фрагменты и могут образовывать обильный воздушный мицелий с длинными цепочками спор (роды Streptomyces и Streptoverticilium). Для других родов (Intrasporangium, Kineosporia, Sporichthya) характерно слабое развитие воздушного мицелия либо полное его отсутствие и разнообразные по форме споры. В группу Intrasporangium, входит пять Kineosporia, родов: Streptomyces, Sporichthya. Основное Streptoverticillium, местообитание представителей этих родов – почва, но есть патогенные для человека и животных или растений виды. Типовой род – Streptomyces. Все стрептомицеты – облигатные аэробы. Они нетребовательны к питательным субстратам, не нуждаются в факторах роста, преимущественно сапрофиты. Стрептомицеты широко распространены в почвах разных типов и играют большую роль в минерализационных процессах. Их наличие обусловливает специфический запах свежевспаханной почвы. Из стрептомицетов Str. griseus было выделено масло, названное геосмином, обладающее таким запахом. Стрептомицеты хорошо развиваются при низкой влажности почвы, поэтому в почвах засушливых климатических зон они численно преобладают над всеми микроорганизмами. Повсеместное распространение актиномицетов рода Streptomyces связано с наличием у них активных ферментных систем, позволяющих разрушать и использовать самые разнообразные соединения. Так, у актино386 мицетов выявлена способность продуцировать такие гидролитические ферменты, как протеазы, амилазы, кератиназы, хитиназы, активные окислительно-восстановительные ферменты группы полифенолоксидаз, обеспечивающие расщепление устойчивых фенольных соединений, входящих в состав гумуса. Некоторые актиномицеты осуществляют трансформацию полициклических соединений – стероидов – в биологически активные соединения – стероидные гормоны (преднизолон, кортизон). Среди актиномицетов особенно много продуцентов антибиотиков. Например, Str. aureofaciens– продуцент тетрациклина, Str. griseus – продуцент стрептомицина, Str. venezuelae – продуцент хлорамфеникола и др. Одновременно с образованием тетрациклина бактерии вида Str. aureofaciens синтезируют также витамин В12 и его аналоги. Витамины группы В способны продуцировать почти все стрептомицеты. Многие из них образуют каротиноидные пигменты, черно-коричневые меланины и синефиолетовые антоцианы. Средство для деструкции фенола Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для разложения токсичных органических соединений, а именно для разложения фенола. Средство для деструкции фенола в среде, содержащей фенол в концентрации 0,5-2,2 г/л, представляет собой штамм Rhodococcus opacus BKM Ac-2546 D, иммобилизованный на поликапроамидном волокне. Изобретение позволяет повысить деструкцию фенола. 1 ил., 1 табл. Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано для разложения токсичных органических соединений, в частности для разложения фенола. Фенол - одно из токсичных ароматических соединений. Существует два принципиально различных способа очистки сточных вод от фенолов - это химический и микробиологический. Химические методы очистки требуют наличия специального оборудования, реактивов и т.д. Например, метод очистки сточных вод от фенола электрогидравлическим воздействием высоковольтного короткоимпульсного электрического разряда [патент RU 2326055, C02F 1/48, 8.10.2008] требует специальное оборудование, позволяющее получать электрический разряд в 25-30 кВ и включающее источник импульсов, систему охлаждения и термоизоляции. Кроме того, обеззараживание проводится в присутствии перекиси водорода, которая является сильным окислителем и опасна в концентрированном виде. Процесс озонирования водно-фенольных сточных вод (Тенишев Ю.С. Проблема очистки сточных термальных вод от фенолов. - М.: Мингазпром, 1982. - 35 с.) требует строгого контроля за рН и вреден для персонала из-за присутствия озона. Очистка от фенолов с помощью связывания сорбентами (см. Тенишев Ю.С. Проблема очистки сточных термальных вод от фенолов. - М.: Мингазпром, 1982. - 35 с.), требует регенерации носителя при высоких температурах (700-800°С) и биохимической доочистки воды. Биологическая очистка сточных вод не требует сложного оборудования, ее эффективность зависит, в основном, от максимальных концентраций токсиканта, к которым устойчив штамм-деструктор и которые не приводят к ингибированию процесса биоразложения. Известен штамм бактерий Serratia marcescens В-1248 [патент RU 2074254, C12N 1/20, 27.02.1997], осуществляющий деградацию фенола и 2,4дихлорфенола. Недостатком описываемого штамма является низкая концентрация фенола, который разлагается данным штаммом. Авторы приводят пример с концентрацией до 100 мг/л фенола для неиммобилизованой и 0,75 г/л для иммобилизованной культуры. Другой недостаток способа деструкции фенола с использованием известного штамма - большая длительность процесса деградации (7 сут) и иммобилизации данной культуры на носителе (17 дней). Известен штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens ВКПМ В-6489, осуществляющий деградацию фенола [патент RU2077575, C12N 1/20, 20.04.1997]. Он использовался для разложения фенола в концентрации 75 мг/л. Недостаток этого штамма - также длительное предварительное культивирование перед использованием его для очистки. Наиболее близким по техническому решению к изобретению является штамм бактерий Aureobacterium saperdae 6-204 - деструктор фенола, окисляющий в иммобилизованном состоянии на биофильтре фенол в высоких концентрациях (1,5-2,0 г/л) при более низкой температуре (15-20°С) [патент RU 2201446, C12N 1/20, 27.03.2003]. Штамм бактерий Aureobacterium saperdae 6-204 устойчив в длительном непрерывном процессе, не нуждается в дополнительных факторах роста. Недостатком данного штамма является его неспособность осуществлять деструкцию фенола за один этап, биофильтр с использованием Aureobacterium saperdae 6-204 является многоуровневым, на каждом из пяти уровней которого происходит 10-кратная убыль фенола. Задачей изобретения является получение штамма-деструктора фенола, способного осуществлять эффективное разложение фенола в высоких концентрациях за один этап. Задача решается тем, что предлагается штамм бактерий Rhodococcus opacus 1G, способный к разложению фенола. Штамм бактерий Rhodococcus opacus 1G депонирован во Всероссийской коллекции культур микроорганизмов и хранится под номером ВКМ Ас 2546 D. Штамм Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2546 D выделен методом накопительных культур из почв, загрязненных нефтью, в районе г.Самара. Штамм Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D обладает следующими свойствами. Культурально-морфологические свойства штамма: неподвижный актиномицет, грамположительный, аэробный, основные сахара в составе клеточной стенки - арабиноза и галактоза. На богатой среде образует колонии светло-розового цвета. На минеральной агаризованной среде с фенолом в качестве единственного источника углерода и энергии образует мелкие, практически бесцветные колонии. Физиолого-биохимические свойства штамма: аэроб, температурный оптимум +30°С до +37°С, оптимум рН нейтральный или слегка щелочной: 78, каталазоположительный, не требует для роста тиамина, хорошо растет на стандартных лабораторных средах. На минеральной среде в качестве ростовых субстратов использует маннозу, D-галактозу, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, бензоат, п-гидроксибензоат, п-толуилат, п-крезол, фталат, терефталат, дизельное топливо, ацетат, бутират, этанол, цитрат, изопропанол, ацетамид, анисовую и феруловую кислоты. Не растет на минеральных средах с L-рамнозой, D-целлобиозой, L-серином, L-аланином, L-аспаргином, нафталином, монохлорфенолами, 2,4-ди-, 2,3,5- и 2,4,5-трихлорфенолами. Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D отличается от известных штаммов-бактерий, являющихся деструкторами фенола. При хранении на агаризованной среде с фенолом в качестве единственного источника углерода и энергии штамм длительное время сохраняет жизнеспособность. Способность разлагать фенол не исчезает при пересевах на неселективных средах. В неиммобилизованном состоянии он способен разлагать фенол в концентрациях, равных 0.75 г/л. Штамм легко иммобилизируется на носителях различного типа. Иммобилизация клеток приводит к увеличению концентраций фенола, разлагаемых данным штаммом, до 2.2 г/л. Деградация фенола проходит с образованием пирокатехина и его последующим орто-расщеплением. Установлено, что ключевой фермент этого пути - пирокатехин 1,2-диоксигеназа - характеризуется высокой избирательностью к субстрату - пирокатехину. Афинность к фенолу и замещенным фенолам и бензоатам у этого фермента низкая, что указывает на перспективность использования штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546D для очистки стоков от фенольных загрязнений. Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2546D способен к росту на феноле. На чертеже показан рост штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ас-2546 D на феноле (г/л): 1-0.3, 2-0.5, 3-0,75, 4-1,0. Из данных, представленных на чертеже, понятно, что при росте штамма штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D на феноле продолжительность лаг-фазы составляет около 6 ч. При концентрации фенола 0.3 г/л фенол полностью исчезает менее чем за 12 часов, максимальная величина оптической плотности D545 равняется 0.35 о.е. Это говорит о способности штамма Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D эффективно разлагать умеренновысокие концентрации токсиканта за короткий период времени. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-160 (Япония). При концентрации субстрата 0.5 г/л культура достигает максимальной величины D545 0.5 за 14 часов. Удельная скорость роста (µ) равняется 0.05. Время удвоения (td) - 1.4 ч. За 14 ч инкубации культура использует практически весь субстрат. Дополнительное внесение субстрата в тех же количествах через 6-8 ч голодания сопровождается дальнейшим ростом культуры без какой-либо задержки. При концентрации фенола 0.75 г/л максимальное значения D545 достигается за 20 ч и равняется 0.7 о.е. Рост при более высоких концентрациях фенола отсутствует. Тем не менее, дробное внесение фенола (по 0.25-0.5 г/л) приводит к росту культуры до D545 0.8-1.0 о.е., суммарное потребление субстрата увеличивается до 2 г/л. Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D разлагает фенол как в виде нативных, так и в виде иммобилизованных клеток. Штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D может быть иммобилизован вермикулите. на поликапроамидном волокне или на вспененном В таблице показано влияние типа носителя на биодеградативную способность штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D. Из данных таблицы можно сделать вывод о том, что поликапроамидное волокно является лучшим носителем для иммобилизации данного штамма, нивелируя отрицательное влияние фенола. Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими. Пример 1. Разложение фенола клетками предлагаемого штамма Для культивирования штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ас2546 D используют минеральную среду следующего состава (г/л): Na2HPO4 0.73; КН2РО4 0.35; MgSO4×7H2O 0.1; NaHCO3 0.25; MnSO4 0.002; NH4NO3 0.75; FeSO4×7H2O 0.02. Культуру для посевного материала выращивают в колбах объемом 750 мл с рабочим объемом 200 мл на минеральной среде с фенолом (0.2 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. Клетки выращивают при перемешивании на качалке при 220 об/мин до плотности 0.5-0.7 оптических единиц, при этом проводят дробное внесение фенола (по 0.2 г/л) по мере его потребления. Данный пример подтверждает, что штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D способен использовать фенол в качестве единственного источника углерода и энергии при культивировании в жидкой среде. Пример 2. Разложение фенола иммобилизованными клетками штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D на поликапроамидном волокне Для иммобилизации клеток штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D на поликапроамидном волокне используют суспензию клеток с D545 0.648 о.е. 200 мл этой суспензии добавляют к 2.5 г волокна, вносят 0.2 г/л фенола и инкубируют при перемешивании 24 ч. Неиммобилизованные клетки отмывают стерильной средой. Фенол добавляют в трех концентрациях: 0.5, 1.0 и 1.5 г/л. В качестве контроля используют носитель с 200 мл среды, указанной в Примере 1, содержащей 0.5 г/л фенола. При всех концентрациях токсиканта получают 100% убыль фенола иммобилизованными клетками за 24 часа инкубации. Убыль в контрольном варианте (носитель и фенол в среде) не происходит. Из данного примера можно сделать вывод, что штамм легко иммобилизуется, при этом в два раза увеличиваются концентрации токсиканта, которые не ингибируют метаболическую активность штамма. Пример 3. Разложение фенола иммобилизованными клетками штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D на вспененном вермикулите Процесс проводят, как описано в Примере 2, используя в качестве носителя для иммобилизации 5 г вспененного вермикулита. Получают 100% убыль фенола иммобилизованными клетками, взятого в концентрации 0.5 и 1 г/л за 24 часа и 1.5 г/л - за 48 часов. Из данных примеров 2 и 3 следует, что штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D можно иммобилизовать на различных носителях. Пример 4. Разложение фенола иммобилизованными клетками штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D в условиях проточного культивирования. Процесс ведут в колонке объемом 600 мл, заполненной поликапроамидным волокном с иммобилизованными клетками штамма бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D, в которую снизу подают воздух, сверху, в противоток - минеральную среду, содержащую фенол. Концентрацию фенола в подаваемой на колонку среде варьируют с 0.5 г/л до 2.2 г/л. Скорость протока увеличивается с 18 мл/ч до 25 мл/ч. Система активно функционирует в течение 20 дней при колебаниях температуры от 18 до 24°С. Фенол в стоке отсутствует. Из данного примера следует, что штамм бактерий Rhodococcus opacus BKM-Ac-2546 D относится к лучшим культурам бактерий, способных разлагать фенол в высоких концентрациях. Таким образом, показано, что предлагаемый штамм бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D обеспечивает разложение фенола как нативными клетками, так и иммобилизованными при его концентрациях от 0.5 до 2.2 г/л, что в 2.9 (для иммобилизованной культуры) и 5 (для нативных клеток) раз больше, чем у известного штамма бактерий Serratia marcescens В1248. Разложение 2.2 г/л фенола штаммом бактерий Rhodococcus opacus ВКМ Ac-2546 D происходит за один этап, что отличает его от известного штамма бактерий Aureobacterium saperdae 6-204, работающего в пятиуровневом биофильтре. Средство для деструкции фенола в среде, содержащей фенол в концентрации 0,5-2,2 г/л, представляющее собой штамм Rhodococcus opacus BKM Ac-2546 D, иммобилизованный на поликапроамидном волокне.
