«Общая характеристика бактерий рода BACILLUS» Садунова А.В. Дальневосточный федеральный университет Владивосток, Приморский край, Россия "GENERAL CHARACTERISTICS OF BACTERIA OF THE GENUS BACILLUS" Sadunova A.V. Far Eastern Federal University Vladivostok, Russia 1 Оглавление Введение ............................................................................................................ 4 Материалы и методы ........................................................................................... 7 Глава 1 Описание рода Bacillus ........................................................................... 9 1.1 Классификация аэробных спорообразующих бактерий ........................ 9 1.2 Строение клеточной стенки .................................................................. 10 1.3 Строение спор ........................................................................................ 11 Глава 2 Места обитания бактерий рода Bacillus .............................................. 23 2.1 Почва.......................................................................................................... 23 2.2 Вода ............................................................................................................ 24 2.2.1 Морская вода ....................................................................................... 24 2.2.2 Пресная вода ........................................................................................ 25 2.3 Животные и человек ................................................................................. 25 2.4 Насекомые ................................................................................................. 28 2.5 Растения ..................................................................................................... 29 2.6 Краткая характеристика некоторых значимых видов рода Bacillus ....... 30 Глава 3 Биология аэробных спорообразующих бактерий ............................... 37 3.1 Спектр активности пробиотиков на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus (Бакулина, 2001) ......................................... 42 Глава 4 Получение накопительных культур и идентификация рода Bacillus 44 4.1 Традиционный подход к идентификации видов ..................................... 44 4.2 Некоторые способы получения накопительных культур для селективного выделения штаммов Bacillus .......................................................................... 47 Глава 5 Изучение Bacillus в водной среде ........................................................ 49 5.1 Выделение чистых культур из водных образцов .................................... 49 Глава 6 Роль микроорганизмов рода Bacillus в биодеградации сложных органических соединений и растворении соединений кремния ..................... 52 6.1 Деградация углеводородов бактериями рода Bacillus ............................ 52 6.2 Деградация бис-(2-этилгексил)фталата бактериями рода Bacillus ......... 55 6.3 Роль представителей рода Bacillus в растворении соединений кремния56 2 Выводы ............................................................................................................... 58 Список литературы ............................................................................................ 60 3 Введение Бактерии рода Bacillus вызывают большой интерес микробиологов по причине повсеместного распространения представителей этого рода, цикла развития, необычной устойчивости их спор к химическим и физическим агентам и патогенности. Несомненно, споры с момента обнаружения были признаны самой выносливой среди известных форм жизни на Земле. В состоянии покоя у спор метаболизма нет, и они показывают высокую степень устойчивости к инактивации различными физическими факторами, включая влажный пар, высушивание, ультрафиолетовое и гамма-излучение, вакуум и окисляющие агенты. Несмотря на инактивацию метаболизма, споры остаются способными к непрерывному контролю пищевого состояния их среды и быстро реагируют на поступление подходящих питательных веществ, прорастая и возобновляя вегетативный рост (Nicholson et al, 2000). Покоящиеся споры показывают невероятную долговечность и могут быть обнаружены фактически в любом типе среды обитания на Земле. Род Bacillus - это одна из наиболее разнообразных и коммерчески полезных групп микроорганизмов. Способность некоторых штаммов выдерживать высокие или низкие температуры и высокие или низкие значения рН сделала их важными источниками получения коммерческих препаратов ферментов. По изученности генетики и физиологии В. subtilis занимает второе место после Е. coli и, несомненно, будет вторым живым организмом, для которого удастся полностью определить нуклеотидную последовательность. В настоящее время штаммы Bacillus используются для получения продуктов четырех типов: 1) ферментов, 2) антибиотиков, 3) высокоочищенных биопрепаратов, включая усилители запаха и пищевые добавки, и 4) инсектицидов. 4 Изучение Bacillus ведется в разных отраслях, начиная от пищевой промышленности и заканчивая биотехнологией и генной инженерией. Но бактерии рода Bacillus представляют интерес и в экологических исследованиях, так как населяют различные места обитания. Очевидно, что антропогенный пресс, который испытывает современная окружающая среда, так же может влиять на изменчивость этих микроорганизмов. Были проведены исследования, в ходе которых установлено что бактерии рода Bacillus являются одной из доминирующих групп в культивируемом гетеротрофном микробном сообществе оз. Байкал. Так же было установлено, что бактерии исследуемого рода распределены в Байкале неравномерно. Пространственное распределение бактерии рода Bacillus зависит от экологических факторов. Изолированные из воды и донных осадков оз. Байкал бактерии рода Bacillus, показали высокую биохимическую активность таких экзоферментов, как протеаза, амилаза, фосфатаза, фосфолипаза. В ходе исследования было показано, что культивируемые бактерии рода Bacillus, выделенные из донных осадков озера Байкал, способны использовать полициклические ароматические углеводороды в качестве единственного источника углевода и энергии. Так же бактерии рода Bacillus, способны растворять соединения кремния (Суслова, 2007). Но в настоящее время нет данных в литературе, которые бы показали, как изменяются свойства бацилл в зависимости от характера загрязнения морской среды, что и представляет большой интерес для исследования. Цель и задачи исследования: Цель – на основании данных литературы показать распространение, видовой состав и физиолого-биохимическую активность бактерий рода Bacillus в различных экосистемах. 5 Задачи: 1. Дать таксономическую и биологическую характеристику бактерий рода Bacillus; 2. Показать особенности местообитания бактерий рода Bacillus; 3. Охарактеризовать взаимодействие бактерий рода Bacillus с животными, человеком, растениями и с др. микроорганизмами; 4. Описать биологически активные вещества бактерий рода Bacillus; 5. Показать воздействие факторов среды на биологические свойства бактерий рода Bacillus; 6. Дать анализ влияния антропогенного фактора среды на биологические свойства бактерий рода Bacillus. 6 Материалы и методы Информационные источники В работе были использованы: 1) Библиотека ДВФУ (фундаментальная библиотека) около 5 источников; 2) Краевая научно-медицинская библиотека (ст. переливания крови) 5 источников; 3) Библиотека им. Горького 1 источник; 4) Электронная библиотека ВГУЭСа 10 источников; 5) Интернет источники 20 источников; 6) Микробиологические сайты, посвященные Bacillus на русском и английском языках: А) http://microbewiki.kenyon.edu; Б) http://mikrobio.ho.ua/mikro-text12.html; В) http://molbiol.ru/wiki; Г) http://www.scielo.br/scielo.php; Д) http://textbookofbacteriology.net/index.html. Ведущие институты, учреждения занимающиеся изучением Bacillus 1) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук – изучение распространения и разнообразия спорообразующих бактерий рода Bacillus в водных экосистемах; 2) Институт систематики и экологии животных СО РАН (ИСиЭЖ СО РАН), лаборатория патологии насекомых - коллекция энтомопатогенных и непатогенных бактерий рода Bacillus (куратор коллекции: с.н.с. Ходырев В.П.); 3) FEBICO - китайская фармакологическая компания исследованием Bacillus coagulans как производителя пробиотиков; 7 занимается 4) Институт биологии Уфимского научного центра РАН - изучение аэробных спорообразующих бактерии рода Bacillus Cohn. как агентов биологического контроля болезней растений. Исследователи 1) Кох Р. (нем. Heinrich Hermann Robert Koch) - немецкий микробиолог, открыл бациллу сибирской язвы (Bacillus anthracis). 2) Кон Ф. Ю. (нем. Ferdinand Julius Cohn) - известный немецкий ботаник и бактериолог, совместно с Робертом Кохом принял участие в исследовании сибирской язвы. 3) Кавамура Ф. - изучение Bacillus subtilis (геном бактерии). 4) Мелентьев А.И. (доктор биологических наук, профессор - специалист в области микробиологии, биохимии, микробной биотехнологии) - изучение аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus Cohn. как агентов биологического контроля болезней растений. 5) Суслова М. Ю. (к. б. н., Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск) изучение распространения и разнообразия спорообразующих бактерий рода Bacillus в водных экосистемах. Журналы 1) Applied Microbiology and Biotechnology (http://www.springer.com); 2) Microbiology and Molecular biology reviews (http://mmbr.asm.org); 3) Journal of Biotechnology (http://www.journals.elsevier.com). 8 Глава 1 Описание рода Bacillus 1.1 Классификация аэробных спорообразующих бактерий По современным представлениям, аэробные спорообразующие бактерии, или бациллы, объединяются в отдельный род Bacillus семейства Bacillacea (Харвуд, 1992). Особенностями бактерий рода Bacillus, по которым его отличают от других представителей семейства Bacillacea, являются: аэробная природа, которая может быть строгая или факультативная, палочковидная форма и продукция каталазы. Родовое название Bacillus было впервые введено в 1872 г. Фердинандом Коном для палочковидных бактерий, растущих в виде нитей. В 1876 г. Кон (Cohn, 1876) и Кох (Koch, 1876) независимо друг от друга показали, что два из трех известных видов этого рода, В. subtilis и В. anthracis, образуют особые структуры бактериальные - эндоспоры, т.е. высокоустойчивые к нагреванию споры, которые не гибнут при кипячении. Было также продемонстрировано образование из клетки устойчивой к нагреванию споры и из споры - вегетативной клетки. В 1884 г. де Бари (De Вагу, 1884) впервые предложил рассматривать необычную способность образовывать споры в качестве одного из признаков в ключах для классификации бактерий. В ключе, предложенном де Бари, род Bacillus впервые был ограничен бактериями, образующими эндоспоры (Харвуд, 1992). Но так же можно отметить, что по этому признаку можно было группировать вместе многие бактерии, обладающие различными физиологическими признаками и обитающие в разнообразных экологических условиях. Эта гетерогенность по физиологическим, экологическим и генетическим характеристикам затрудняло классификацию бактерий рода Bacillus. В настоящее время в род Bacillus объединены бактерии, характеризующиеся следующими признаками: прямые или почти прямые палочковидные бактерии, размеры которых 0,3 - 2,2 × 1,2 - 7,0 мкм. 9 Большинство подвижно. Жгутики расположены перитрихиально. Образуют термоустойчивые эндоспоры, но не более одной в клетке-спорангии. Спорообразование не подавляется экспозицией на воздухе. Окраска по Граму строго положительна или положительна только при окрашивании молодой культуры. Большинство видов Bacillus - типичные хемоорганотрофы. Они не нуждаются в факторах роста и способны ассимилировать минеральные формы азота в качестве единственного дыхательный, строго одновременно при его бродильный или использовании источника. Метаболизм дыхательный различных и субстратов. строго бродильный Конечным акцептором электронов в дыхательном метаболизме служит молекулярный кислород, который для некоторых видов может быть заменен нитратами. Большинство видов образует каталазу. Они являются облигатными аэробами. Содержание ГЦ пар в ДНК исследованных штаммов варьирует от 32 до 62 мол.%. Типовой вид: Bacillus subtilis (Краткий определитель бактерий Берджи, 1980). Следует отметить, что, несмотря на применение таких современных методов исследования как молекулярная идентификация микроорганизмов, многие штаммы рода Bacillus окончательно не определены до вида и авторы описывают их физиолого-биохимические характеристики. 1.2 Строение клеточной стенки Основным полимером в составе клеточных стенок большинства бактерий является пептидогликан. Он представляет собой гетерополимер, состоящий из цепей гликана, соединенных короткими пептидами. Цепи гликана состоят из Nацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, представляющей собой эфир N-ацетилглюкозамина и молочной кислоты. К карбоксильной группе молочной кислоты может присоединяться пептидная цепь. Соседние пептидные цепи в пептидогликане могут соединяться между собой поперечными сшивками, образованными пептидными связями. Пептидные цепи всегда 10 состоят из чередующихся L- и D-аминокислот, причем наиболее часто встречается последовательность кислота/L- L-аланин/D-глутаминовая диаминокислота (обычно м-диаминопимелиновая кислота или L-лизин). Если у грамотрицательных бактерий химический состав и структура пептидогликана достаточно однообразны, и, следовательно, имеют небольшую ценность для целей классификации, то у грамположительных бактерий обнаруживается большое разнообразие состава и структуры пептидных цепей, которые могут соединяться межпептидные поперечными мостики. сшивками Было непосредственно описано около 100 или через различных типов пептидогликанов. Поскольку структура и состав пептидогликанов, образуемых различными бактериями, обычно стабильны и не зависят от условий культивирования, то состав клеточной стенки у многих грамположительных бактерий часто служит важным хемотаксономическим признаком. У большинства видов Bacillus муреин представлен вариантом с пептидами, непосредственно соединенными через мезодиаминопимелиновую кислоту (mDpm или mА2pm) (Харвуд, 1992). 1.3 Строение спор Поверхность наружной оболочки спор разнообразна у аэробных бактерий: либо гладкая, либо с выростами, выступами и почками. Оболочка составляет значительную часть споры. Основными ее компонентами являются белки (60-90%) и липиды. Состав аминокислот в белках оболочки неодинаков у бактериальных спор разных видов, однако большая часть цистина, содержащегося в значительном количестве в спорах, обнаруживается именно в оболочке. 11 Рис 1. Схемотическое строение споры: 1 -экзоспориум; 2 -слои споровой оболочки; 3 - внешняя мембрана споры; 4 - кора; 5 внутренняя мембрана споры; 6 — сердцевина. Под оболочкой располагается кора споры, состоящая в основном из муреина, который является нерастворимым структурным материалом коры. В течение многих лет покоящаяся спора рассматривалась как почти инертное тело, обладающее несколькими ферментами или вовсе лишенное их. Некоторых ферментных систем, имеющихся в вегетативной клетке, например цитохромов и ферментов цикла трикарбоновых кислот, ничтожно мало в споре. Это указывает на то, что в спорах аэробный энергетический метаболизм осуществляется иным путем, чем в клетках. Аналогичные ферменты спор и вегетативных клеток в спорах более термоустойчивы. Споры аэробных бактерий обладают различной термоустойчивостью, что обусловлено как видовыми особенностями, так и условиями их образования. Установлено, что споры, образующиеся при высокой температуре, а также полученные на средах с высоким содержанием кальция, парааминобензойной кислоты и некоторых жирных кислот, более жароустойчивы. Споры более устойчивы, чем вегетативные клетки, от которых они образовались, к воздействию проникающей радиации, ультразвука, гидростатического давления, замораживания, разрежения и др. Устойчивость спор к кислотам и щелочам во многом зависит от их принадлежности к различным видам бактерий. Споры некоторых культур бактерий остаются жизнеспособными даже при кипячении в концентрированной соляной кислоте в течение 20 мин. При этом резистентность спор во много раз повышается при 12 их обезвоживании (Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. - кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова, 1974). К спиртам и другим органическим растворителям устойчивость спор намного выше, чем у вегетативных клеток. Споры менее устойчивы к действию алкилирующих агентов. При воздействии комплекса определенных ферментов удается достигнуть растворения спор. Механизм устойчивости спор к действию высокой температуры, проникающей радиации и других физико-химических факторов полностью еще не выяснен. Термоустойчивость спор объясняется наличием кальция, дипиколиновой кислоты и в некоторой степени диаминопимелиновой кислоты. Эти вещества определяют в значительной мере и резистентность спор к действию радиации. Полагают, что споры содержат комплекс особых веществ, подобных хелатным соединениям, которые предохраняют жизненно важные структурные элементы от губительного воздействия физико-химических факторов. Важным фактором, приводящим к образованию спор, является отсутствие для данного вида аэробных бактерий благоприятных условий для роста и развития. Способствует спорообразованию обеднение питательной среды. У аэробных бактерий анаэробные условия выращивания подавляют как спорообразование, так и рост. Спорообразование аэробных бактерий протекает лишь в условиях доступа кислорода. Интенсивность споруляции подавляется в разной степени при выращивании бактерий в неблагоприятных условиях - при температуре выше оптимальной или реакции среды менее подходящей для обильного развития. Неблагоприятные условия роста, ускоряющие споруляцию бактерий, как правило, не обусловливают обильного «урожая» спор (Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. - кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова, 1974). 13 Разные виды аэробных бактерий отличаются расположением и формой спор. Эти признаки имеют важное систематическое значение. У некоторых видов расположение спор строго определенное - центральное, околоконцевое и концевое. У других видов не наблюдается строгой локализации. Высокое содержание в питательной среде источников азотного и углеродного питания, обеспечивающих максимальный рост бактерий, может подавлять индукцию спорообразования. Так, потребность в глюкозе - основном энергетическом источнике вегетативного роста аэробных бактерий - является несущественной для спорообразования некоторых видов, а в отдельных случаях она угнетает процесс споруляции. Культуры определенных видов бактерий более интенсивно спорулируют при уменьшении в среде аланина, валина, лейцина и изолейцина. У других бактерий отсутствие в среде лейцина и серосодержащих аминокислот угнетает спорообразование. Интенсивность процесса образования спор в значительной мере обусловлена наличием в среде минеральных солей, содержащих ионы кальция, магния, калия, марганца, железа, цинка, меди и некоторых редких металлов (кобальта, лития, кадмия, никеля). Оптимальная концентрация минеральных солей и металлов различна в зависимости от вида выращиваемой культуры бактерий, условий ее роста. Роль минеральных солей и отдельных ионов металлов настолько велика, что в их отсутствии спороношение может вовсе не наблюдаться. Изменения концентраций их в питательной среде могут оказать иногда резко различное действие. Спорообразование отдельных культур бактерий настолько зависит от наличия минимальных концентраций некоторых металлов, что эта особенность используется в аналитических целях. Роль минеральных солей различных металлов в образовании бактериальных спор установлена недавно, и многие вопросы механизма их действия пока не выяснены. Полагают, что их специфическое действие связано с активированием различных ферментативных систем. Значение таких элементов, как кальций, заключается также и в том, что они способствуют 14 образованию разнообразных низкомолекулярных веществ в спорах, обеспечивающих их термостабильность. Сравнительно слабо изучено влияние на образование спор различных витаминов и других ростовых веществ. Некоторое усиление этих процессов отмечено под влиянием парааминобензойной и фолиевой кислот. В результате всестороннего изучения биохимии спорообразования показано, что при споруляции не образуются новые ферментные системы. Аналогичные ферменты, обнаруживаемые в вегетативной клетке и споре, имеют одинаковые молекулярный вес, аминокислотный состав и другие физико-химические свойства. Теплоустойчивость ферментов спор вызвана присутствием в них ионов кальция, марганца и других металлов (Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. - кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова, 1974). Данные исследований свидетельствуют о том, что природа и функция ферментативного аппарата, осуществляющего синтез белков в споре и материнской вегетативной клетке, одинаковы. Основной системой транспорта электронов в спорах является растворимая флавопротеиноксидаза. При споруляции выявлена высокая активность ряда ферментов, например аргиназы, некоторых нуклеаз. Основная масса белков споры синтезируется заново в период споруляции. Одновременно отмечается процесс распада белков, причем многими авторами активности с обнаружена функцией тесная взаимосвязь спорообразования у протеолитической бактерий. Из вновь синтезированных белков лишь незначительная часть используется для создания структурных элементов споры. В целом споруляцию можно охарактеризовать как процесс интенсивного распада белков и всех основных типов РНК материнской клетки с одновременным образованием новых белковых компонентов. Различия в составе белков споры и вегетативной клетки выявляются серологическими методами. По антигенной структуре спорулирующая и 15 аспорогенная формы культур одного и того же вида различны. Не установлено существование какого-либо антигена, общего для спор бактерий разных видов. Наоборот, по антигенной структуре имеется достаточно отчетливая дифференциация между спорами разных видов. В способе прорастания споры и продолжительности процесса также отмечается определенное постоянство, характерное для различных видов бактерий. Старые споры прорастают в течение более длительного периода, чем молодые. Время прорастания молодых спор является довольно постоянным у различных бактерий и может служить видовым признаком. Если перенести только что сформировавшиеся споры в благоприятную питательную среду, то прорастание их начинается не сразу, а по истечении 2-3 ч. Установлено, что на начальной стадии прорастания спор происходит выделение в среду так называемого экссудата прорастания, характеризующегося специфическим поглощением ультрафиолетовых лучей. Вещество это было выделено и идентифицировано как кальциевая соль дипиколиновой кислоты (пиридин - 2,6-дикарбоксиловая кислота). Дипиколинат кальция составляет приблизительно половину сухой массы экссудата прорастания, что соответствует 15% от общей сухой массы покоящихся спор. Остальная часть экссудата прорастания представлена свободными аминокислотами, высокомолекулярными и низкомолекулярными белковыми веществами. Обнаружено особенно большое количество не диализируемого гексозаминсодержащего пептида с молекулярным весом порядка 10 000, в состав которого входят диаминопимелиновая кислота, аланин, глютаминовая кислота и гексозамины. Условно это соединение названо ДАП-гексозаминпептид. Это соединение входит в состав оболочки спор, в отличие от дипиколиновой кислоты, обнаруживаемой внутри спор. Среди факторов, способствующих процессу прорастания спор, большое внимание уделяется тепловой активации, действие которой более выражено при наличии в среде некоторых химических соединений. Тепловая активация 16 достигается предварительным кипячением суспензии спор при 97-100° C в течение 10-15 мин или при 65° C в течение 2 ч. Иногда этот эффект достигается при обычной пастеризации. Тепловая активация прорастания спор носит общий характер для разных видов спороносных бактерий, хотя она более специфична для аэробов, чем анаэробных видов. Обычно тепловое воздействие усиливает и ускоряет прорастание спор в течение короткого промежутка времени. Действие подобной обработки спор, как правило, преходяще, хотя при этом отмечается и некоторое изменение условий, необходимых для течения процесса прорастания спор. Так, для лучшего прорастания спор сенного бацилла без предварительной тепловой обработки необходимо присутствие в среде L-аланина, аденозина, глюкозы и тирозина, тогда как после тепловой обработки оптимальные условия прорастания спор обеспечивают наличие лишь глюкозы и аденозина. Установлено также, что сохранение в течение длительного времени спор при 37° C после их тепловой активации ведет к деактивации. Тепловая обработка этих спор после длительного хранения вновь ведет к реактивации прорастания. Имеются данные о некотором активирующем влиянии на прорастание спор умеренного воздействия ультразвука. Исследования последних лет показали, что интенсивность прорастания спор специфически повышается в присутствии некоторых веществ, в первую очередь L-аланина, пуриновых нуклеозидов и глюкозы. Иногда необходимо наличие, помимо L-аланина, ряда других аминокислот. Из рибозидов наиболее эффективным оказался аденозин. Аланин является наиболее специфическим активатором процесса прорастания спор из всех известных соединений, обладающих подобным действием. Оптимальные условия для прорастания спор анаэробных бактерий несколько более сложны, хотя факторы, активирующие процессы прорастания спор аэробных видов, и в этом случае оказывают активирующее действие. Наряду с активаторами выявлен ряд веществ, угнетающих процесс прорастания спор. Прорастание спор у аэробных видов угнетается в 17 присутствии оксина, некоторых мышьяковистых соединений, углекислого натрия, высоких концентраций ряда аминокислот - глицина, метионина, цистеина и валина. Характерно угнетающее действие D - аланина в отличие от L-аланина. Механизм активирующего и угнетающего действия ряда факторов на прорастание спор остается неясным. Одни авторы приписывают активаторам определенную роль в процессах деполимеризации различных составных элементов в спорах, высвобождении и активации ряда ферментных систем, обусловливающих начало прорастания спор. Другие считают их энергетически активными соединениями, стимулирующими биохимические процессы в момент прорастания спор. Обычно не все споры, вносимые в благоприятную среду, прорастают сразу. Некоторое их количество остается не проросшими в течение различного времени, не теряя, однако, своей жизнеспособности. Установлено, что при длительном хранении процент прорастающих спор постепенно снижается. Причина этого явления и природа подобных «дремлющих» спор остаются неясными. В покоящейся споре имеются ферментные системы, выявляемые лишь после их активации под влиянием определенных факторов и химических соединений, которые, однако, исключают прорастание спор. К таким системам относятся прежде всего окислительные ферменты. Активация их достигается обработкой спор незначительными количествами L-аланина, аденозина и некоторыми другими веществами, а также кипячением или пастеризацией суспензий спор. Перевод неактивной ферментной системы в активную без признаков прорастания спор считается первым этапом биохимических изменений в спорах, ведущих в дальнейшем к началу процесса их прорастания. Полагают, что связывающая под действием окислительные активаторов и другие дипиколиновая ферменты, деполимеризации с освобождением ферментных систем. 18 кислота, подвергается С помощью высокочувствительного микрореспирометра у бактериальных спор установлена дыхательная активность. При изучении химического состава клеточной стенки спор различных видов аэробных бактерий обнаружены характерные различия в содержании ДАПгексозаминпептида и других веществ - полисахаридов, липидов. ДАПгексозаминпептид высвобождается из стенки спор под действием литического агента, уподобляемого по своим свойствам лизоциму (Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. - кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова, 1974). Стадии споруляции. Бактерии достаточно сложно принять решение о начале споруляции, поскольку этот процесс, будучи запущенным, уже необратим. А поскольку это решение коренным образом меняет метаболизм клетки, ошибка может иметь для нее печальные последствия. Поэтому для принятия этого решения бактерия должна проанализировать множество сигналов от внешней среды от внутриклеточных метаболических систем, от клеточного цикла. Сигналы могут происходить от нехватки питательных веществ, плотности популяции, синтеза ДНК, повреждений ДНК, цикла Кребса (Hoch,1978). Споруляция разделяется на семь стадий, различия между которыми основаны на образования цитологических споры. Стадия изменениях, 0, являющаяся происходящих в подготовительной процессе стадией споруляции, наблюдается в конце логарифмической фазы роста, или в период То (Т1, Т2, Т3 и т. д. соответствуют времени, в часах, по отношению к концу логарифмической фазы). В лабораторных условиях процесс споруляции обычно занимает около 6-8 ч, и, таким образом, порядковый номер стадии развития и время, выраженное в часах, почти совпадают: например, стадия IV наблюдается в периоде Т4. 19 Рис 2.Стадии споруляции у В. sublilis. Последовательность событий приведена в направлении по часовой стрелке от начальной стадии 0 в конце логарифмической фазы роста. На стадии 0 никаких морфологически различимых споруляционных структур нет, и клетки имеют вид, характерный для вегетативной стадии. В настоящее время на стадии не I идентифицированы какие-либо морфологические изменения, характерные для процесса споруляции; таким образом, можно считать, что развивающиеся клетки переходят от стадии 0 к стадии II. Стадия II - это первая стадия споруляции, распознаваемая морфологически. Она характеризуется появлением проспоровой перегородки, которая асимметрично делит клетку на маленькую проспору и большую материнскую клетку. Это критический шаг, так как образование асимметрично расположенной мембраны является ключевым этапом споруляции. В течение стадии III материнская клетка поглощает проспору. Проспора, которая теперь находится в цитоплазме материнской клетки, имеет на периферии двойную мембранную структуру, и молекулы, перемещающиеся из цитоплазмы материнской клетки в цитоплазму проспоры, должны пройти через эту двойную мембрану по следующему пути: Цитоплазма материнской клетки→ Внешняя мембрана проспоры (изнутринаружу)→пространство между мембранами Внутренняя мембрана проспоры (снаружи внутрь) → цитоплазма проспоры 20 Внешняя мембрана проспоры имеет ориентацию, противоположную ориентации внутренней мембраны проспоры. Ориентация внешней мембраны проспоры «изнутри - наружу» была продемонстрирована с помощью изолированных проспор, которые могут легко окислять NADH и гидролизовать ATP, если эти субстраты добавляются в среду. После поглощения проспоры процесс споруляции становится необратимым, и обогащение среды уже не способно его остановить (Freese et al, 1970). На стадии IV начинается образование кортекса между внутренней и внешней мембранами проспоры. В это время спора начинает сильно преломлять свет, что хорошо заметно при микроскопировании. Такую спору называют рефрактильной. Развитие кортекса, вероятно, продолжается и на следующей стадии. За стадией IV, в течение стадии V, происходит конденсация белков внутренней споровой оболочки на поверхности внешней мембраны проспоры. Внутренняя оболочка споры представляет собой сложно организованную многослойную структуру. Внешняя оболочка споры конденсируется на поверхности внутренней оболочки в течение стадии VI. Итак, споровая оболочка - это сложная структура, состоящая из белкового внешнего слоя (внешняя оболочка споры) и пластинчатого внутреннего слоя (внутренняя оболочка споры). По мере развития споровой оболочки спора становится все более устойчивой к химическим реагентам и нагреванию. Созревание споры происходит на стадии VI, и за ним, на стадии VII, следует освобождение зрелой споры от материнской клетки. Были выделены мутанты, у которых блокировалось наступление различных морфологических стадий. Эти мутанты обозначены как spoO, spol, spoIII, spoIV, spoV и spoVI в зависимости от номера последней морфологической стадии развития, которая у них имеет место. Точное время начала споруляции в лабораторных условиях зависит от штамма Bacillus и используемой среды. Для штамма В. subtilis Marburg на 21 модифицированной среде Шеффера (Leighton et al, 1971). Споруляция инициируется в период То и к периоду Т5 в материнской клетке можно видеть рефрактильные споры. Аналогичная картина споруляции наблюдается, когда клетки переносят с богатой ростовой среды на минимальную среду более определенного состава. Споруляция происходит наиболее синхронно и эффективно, если клетки до инициации споруляции выращивали в богатой среде минимум шесть или семь генераций. С определенными стадиями споруляции связано появление конкретных ферментов и функций; в настоящее время ясно, что некоторые из этих ферментов не вовлечены непосредственно в споруляционный процесс. Для того чтобы убедиться в этом, были получены делеционные мутанты по генам, кодирующим такие ферменты, и у этих мутантов изучена способность к споруляции. В случае субтилизина и нейтральной протеазы споруляция не нарушается при полном отсутствии этих ферментов (Kawamura et al, 1984). Возможно, что не все внеклеточные ферменты, которые синтезируются в процессе споруляции, требуются для этого процесса, хотя их синтез может частично быть под тем же контролем, что и синтез истинных споруляционных продуктов. Все же полезно использовать эти ферменты и их функции как легко идентифицируемые маркеры споруляционного процесса. 22 Глава 2 Места обитания бактерий рода Bacillus 2.1 Почва Главной средой обитания бактерий, принадлежащих к видам Bacillus, является почва - штаммы этих бактерий были выделены даже из образцов почвы, взятых в местообитаниях с экстремальными условиями - в пустыне и в Антарктике. Обычно разнообразие бактерий в почвах с низким содержанием органических веществ достаточно ограничено. В них доминируют В. subtilis, В. licheniformis и В. cereus. Однако по мере повышения плодородия почвы разнообразие видов увеличивается. Особенно успешным для изучения почвенных бактерий в различных почвах было применение метода нумерической таксономии (Goodfellow et al, 1985). Отбирая образцы почвы, следует помнить, что термофильные бактерии, например, не обязательно обитают только в термальных источниках, а алкалофильные бактерии - в почвах с высокими значениями рН. Из обычной почвы можно выделить разнообразные штаммы бацилл, способных расти при значениях рН, превышающих 10 (Aunstrup et al, 1972), а клетки В. stearothermophilus могут быть выделены из почв районов с умеренной температурой. В то же время экстремальные термофилы, а также ацидофильные штаммы В. acidocaldarius встречаются исключительно в термальных источниках и окружающих их почвах (Логинова и др., 1978). Некоторые галоалкалофильные бациллы обитают, скорее всего, исключительно в щелочных соленых озерах. Поэтому бактерии с экстремальными свойствами, такими как устойчивость к высокой температуре или рН, лучше искать в образцах, взятых в экзотических условиях. Тем не менее, если использовать соответствующие условия обогащения и выделения, то и из обычной почвы также можно выделить большое количество различных таксонов. Об этом говорит и частота выделения новых видов из обычных почв (цитир. Харвуд, 1992). 23 2.2 Вода 2.2.1 Морская вода Клетки бацилл могут составлять до 20% общей численности гетеротрофной микрофлоры морской воды. Хотя имеются сообщения о еще более высоких цифрах, но в среднем численность бацилл составляет около 9%. Более высокая численность бацилл характерна для прибрежных вод, причем она возрастает с увеличением температуры и глубины и уменьшается с удалением от берега. Это, по-видимому, отражает «вымывание» почвенных бактерий в море. Береговое происхождение этих бактерий подтверждается выделением термоактиномицетов из морских течений, эстуариев, прибрежных участков морей и районов открытого моря (Cross, 1981; Attwell, Colwell, 1984). В морской воде преобладают, по-видимому, клетки В. licheniformis, вторыми по численности идут клетки В. subtilis и, в незагрязненных образцах, В. pumilus. К другим видам, встречающимся более редко и в основном в незагрязненных районах, относятся В. brevis, В. firmus и В. sphaericus. В морских осадочных отложениях обычно наблюдается большее разнообразие бацилл по сравнению с водной толщей, и процентное содержание их там составляет от 14 до 80% суммарного количества гетеротрофных бактерий. В этом случае частота встречаемости зависит также от расстояния до берега и от уровня загрязненности: В. subtilis и В. pumilus преобладают в загрязненных прибрежных водах, а в незагрязненных районах встречается еще В. cereus. В океанических осадках обнаружено большое, разнообразие бацилл; кроме перечисленных видов из них были выделены В. firmus и В. licheniformis (Bonde et al, 1981). Количественные исследования осадков из Северного моря, проведенные Буайе и Хертцом, показали, что в них преобладают штаммы В. subtilis, В. licheniformis и В. firmus. Большинство морских штаммов Bacillus, судя по всему, соответствуют стандартным видам и не имеют каких-либо особых признаков. Однако 24 некоторые виды характерны только для этой среды, таковы, в частности, организмы, близкородственные В. firmus и классифицированные Бонде как штаммы «М» (Bonde, 1981). Другие морские бактерии, такие как «В. epiphytus», «В. filicolonicus» и «В. не cirroflagellosus», имеют определенного таксономического положения (Zobell et al, 1944). Со штаммами, выделенными из соленых маршей и ила эстуариев, возникает в настоящее время таксономическая проблема. Колонии этих бактерий часто окрашены в оранжевый, желтый или розовый цвет, вероятно, они являются вариантами В. firmus и В. lentis. Хотя они были описаны как «спектр» штаммов, однако недавние исследования методом нумерической таксономии позволили предположить, что они относятся к нескольким отдельным таксонам, родственным В. firmus (Logan, Berkeley, 1981; Priest et al, 1988). 2.2.2 Пресная вода Бациллы, обнаруживаемые в пресной воде, в основном имеют, вероятно, почвенное происхождение. Бактерии рода Bacillus встречаются чаще всего в осадках и представляют собой типичные почвенные организмы, такие как В. megaterium, В. cereus, В. firmus и В. pumilus (Allen et al, 1983). Особый интерес представляют термофильные бациллы, выделенные из горячих источников и других термальных пресных вод. К ним относятся В. acidocaldarius и чаще встречающиеся В. stearothermophilus, «В. thermodenitrificans», В. coagulans и «В. thermocatenulatus» (Головачева и др., 1975; Wolf, Sharp, 1981). 2.3 Животные и человек За исключением сибиреязвенной бациллы, бациллы не обладают большой патогенностью для млекопитающих. Bacillus cereus вызывает ряд оппортунистических инфекций (осложняющих другие заболевания) - чаще 25 всего мастит у коров, образование абцессов, септицемию, эндокардиты, а также инфекции уха, глаз и ран (Gilbert et al, 1981). Самое распространенное заболевание, вызываемое В. cereus - отравление, связанное с потреблением пищи, большей частью риса, в котором размножились клетки токсикогенных штаммов В. cereus. Штаммы В. cereus выделяют два токсина - рвотный и диаррейный, вызывающие симптомы отравления. Диаррейный тип интоксикации связан, по-видимому, с употреблением такой зараженной пищи, как мясо, овощи, пудинги и соусы, а рвотный тип обычно связан с употреблением риса. Используя систему API, можно отличить патогенные штаммы В. cereus от других штаммов (Logan et al, 1979). Bacillus subtilis и В. licheniformis также рассматривали как причину пищевых отравлений, и клетки этих бактерий выделяли в большом количестве из фекалий пациентов, однако патогенность редко подтверждалась (Gilbert et al, 1981). Из фекалий здоровых людей и животных были выделены различные бациллы, однако эти микроорганизмы являются временными обитателями кишечного тракта, попавшими туда с пищей. В пищеварительном тракте животных встречаются различные крупные бактерии, образующие эндоспоры. Многие из них имеют две или более спор на клетку, некоторые растут в виде септированных нитей, другие образуют спирали. Таксономия этих бактерий неясна, неизвестно также, образуют ли они типичные эндоспоры, содержащие дипиколиновую кислоту (Gibson, Gordon, 1974). Бациллы являются, вероятно, важными компонентами экосистемы рубца жвачных животных. Штаммы, выделенные из рубца коровы, овцы и козла, идентифицированные как В. ticheniformis, В. circulans, В. coagulans, В. laterosporus, а также не идентифицированные факультативные анаэробы, напоминающие В. pumilus, способны гидролизовать гемицеллюлозу и, возможно, играют важную роль в питании их хозяев (Williams, Withers, 1981, 1983). Кроме того, клетки В. macerans участвуют в фиксации азота в рубце (Jones, Thomas, 1974). 26 Бациллы сибирской язвы, как правило, заболевание травоядных животных (млекопитающих), но также вызывают заболевание у человека. Инфекция у людей встречается реже, чем инфекции у животных. Заболевание возникает у людей, при контакте с животными или продуктами животного происхождения. Раньше это было профессиональным заболеванием, обычно болели ветеринары, люди, которые разводили скот, и люди, которые изготавливали изделия из шерсти, кожи и волос животных. Продукция из стран, где сибирская язва у животных распространена по - прежнему является проблемой. У человека есть три возможные формы заболевания сибирской язвой. Исторически сложилось, что наиболее распространенной формой была кожная форма сибирской язвы, при которой в организм сибирская язва поступает через повреждения на коже. Кожная форма начинается с папулы в начале, которая прогрессирует в течение нескольких дней, а затем после истечении определенного периода, развиваются характерные черные струпы. У пациента может быть лихорадка, недомогание и головная боль (Friedlander, 1999). Более серьезная форма - легочная форма сибирской язвы. При этой форме развивается тяжелое заболевание дыхательных путей. Системная инфекция в результате вдыхания бациллы сибирской язвы имеет смертность 100%. Первоначальными симптомами являются симптомы как при гриппе, прогрессирующих к артериальной гипотензии, шока и массивной бактериемии и токсикоз. Раннее лечение антибиотиками является абсолютной необходимостью и должно быть начато в течение инкубационного периода, если человек подвергся заражению. После того, как острые симптомы появились, антибиотики могут убить микроорганизмы, но не уничтожить мощные токсины, которые уже попали в организм, и человек обычно умирает через 2-3 дня от дыхательной недостаточности, сепсиса и шока (Dixon et al, 1999). Третья форма, кишечные язвы, от употребления зараженного мяса. В странах, где голод является серьезной проблемой, употребление зараженного мяса 27 приводит к серьезным последствиям. Заболевание сибирской язвы начинается с тяжелой ангины или язвы в полости ротоглотки, шеи, сопровождается отеком и лихорадкой. Желудочно-кишечная язва начинается анорексией, тошнотой, рвотой и болями в животе. Кишечная язва может стать системной и привести к смерти (Human ingestion of Bacillus anthracis - contaminated meat Minnesota, August 2000. CDC and Prevention / Morb. Mortal. Weekly Rep., 2000). 2.4 Насекомые Несколько видов бацилл патогенны для насекомых. Бактерии вида Bacillus popilliae и близкородственные бактерии В. lentimorbus облигатно патогенны для различных представителей семейства Scarabaeidae (Coleoptera). Поскольку эти бактерии спорулируют в гемолимфоживых скарабеев, их обычно выделяют из зараженных личинок или из почвы инфицированных районов (Bulla et al, 1978; Milner, 1981). Клетки Bacillus tkuringiensis образуют в процессе споруляции кристаллы белка, токсичного для личинок разных насекомых. Различные штаммы имеют разные спектры действия: некоторые (например, varisraelensis) патогенны для личинок комаров и москитов, другие (vartenebrionsis и varSanDiego) - для некоторых жесткокрылых, включая колорадского жука и хлопкового долгоносика (Hernstadt et al, 1986). Эти бактерии широко распространены в почве; выделяют их и из зараженных насекомых. Было показано, что для личинок москитов и комаров патогенны некоторые штаммы В. sphaericus, B. larvae вызывает американский гнилец у медоносной пчелы и может быть выделен из зараженных насекомых и мест их обитания. Существуют и другие штаммы Bacillus, связанные с пчелами, но они не патогенны. К ним относятся В. alvei, «В. apiarius», В. laterosporus и В. pulvifaciens (Bucher, 1981). Из некоторых насекомых были выделены бактерии Bacillus circulans. Однако для большинства бацилл, в особенности для 28 аэробных видов, таких как В. megaterium, В. subtilis и ряда других, такая среда обитания, как насекомые, не характерна (Bucher, 1981; Breznak, 1982). 2.5 Растения Бактрии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растений в силу их широко распространенного природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам. В последнее десятилетие во многих ведущих агропромышленных странах были созданы и испытаны некоторые препараты на основе бациллантагонистов. Однако зачастую, применение таких биопрепаратов оказывалась мало - или абсолютно неэффективным. Причина неудач в этих случаях кроется в недостаточной изученности жизнедеятельности почвенных бацилл при их взаимодействии с растениями и фитопатогенной микрофлорой. Бактерии рода Bacillus не относятся к типично ризосферным. Вместе с тем, при искусственной инокуляции посевного материала они способны длительное время развиваться и доминировать в прикорневой зоне растений, выдерживая конкуренцию со стороны аборигенной и фитопатогенной микрофлоры. На способность бактерий приживаться в ризосфере и осуществлять жизнедеятельность оказывают влияние как биогенные факторы так и условия внешней среды. Продукты жизнедеятельности бацилл могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие метаболитов, так и на растения. секретируемых Состав, как ферментов, продуцируемых определяющих взаимоотношения интродуцированных бацилл с растениями и патогенной микрофлорой исследован недостаточно. Не достаточно исследованы воздействия антибиотических веществ, продуцируемых бациллами различной видовой принадлежности на характер воздействия на фитопатогенные грибы. Не установлена роль миколитических ферментов в проявлении антагонизма бацилл к мицелиальным грибам. Решение 29 этих проблем позволит ускорить внедрение в практику биологических методов защиты растений от болезней и создание высокоэффективных биопрепаратов на основе бацилл-антагонистов (Меленьтев, 2000). 2.6 Краткая характеристика некоторых значимых видов рода Bacillus Bacillus amarus – грамположительные спорообразующие бактерии (0,71,3 х 3,6-5,6 мкм). Обитают в морской воде на глубине 750 м. Участвуют в круговороте азота. Bacillus angulans – грамположительные подвижные палочковидные бактерии (1,8 х 4,7 мкм). Образуют центральную спору. Клетки располагаются цепочкой. Аэробы. Обитают в морской воде на глубине 1500 м. Участвуют в круговороте азота. Bacillus anthracoides – грамположительные подвижные палочки (0,7-1,3 х 5,3-12,9 мкм). Образуют центральную спору. Клетки располагаются цепочкой. Аэробы. Обитают в почве, в воде пресных водоемов, в морской воде на глубине 100-1000 м. Участвуют в круговороте азота (аммонификатор). Bacillus anthracis – грамположительные крупные палочки с обрубленными концами (0,5-2,5 х 1,2-10 мкм). Клетки располагаются цепочкой. Неподвижные. Аэробы. При неблагоприятных условиях образуют центральную спору, по диаметру не превышающую диаметр клетки. В макроорганизме клетки окружены капсулой, в одной капсуле находятся 2-4 особи (зооглея). Температурный оптимум 37оС. Вызывают у человека и животных острое инфекционное заболевание - сибирскую язву (антракс). К сибиреязвенным бациллам чувствительны все травоядные животные, в том числе, крупный и мелкий рогатый скот, лошади, олени. Сибирской язвой болеют свиньи, собаки, волки, лисы, дикие и домашние птицы. Заражение человека и животных осуществляется алиментарно, аэрогенно, контактно через поврежденную кожу или слизистую. Источник заражения - больные животные, трупы погибших. Факторами передачи возбудителя могут быть контаминированные корма, вода, 30 воздух, мясные полуфабрикаты и другие пищевые продукты, щетина, шерсть, обсемененные спорами пастбища. У человека различают кожно-бубонную, кишечную, легочную, септическую форму, у животных – карбункулезную и септическую. Летальность до 100%. Bacillus bombycus – грамположительные спорообразующие аэробы. Клетки палочковидной формы. Обитают в почве, на листьях тутового дерева. Вырабатывают токсин, вызывающий повреждение куколки тутового шелкопряда. Bacillus bombycepticus – грамположительные палочки, образующие споры. Факультативные анаэробы. Обитают в почве, на листьях тутового дерева. У тутового шелкопряда вызывают болезнь известную под названием «фляшерия» (дизентерия) со смертельным исходом. Заражение происходит при поедании шелкопрядом листьев, зараженных этими микробами. Bacillus brevis – грамположительные спорообразующие палочки. Обитают в почве, в зоне ризосферы растений. Ингибируют рост растений. Bacillus buccalis – грамположительные спорообразующие палочковидные клетки. Аэробы. Выделены из ротовой полости при абсцессе зуба. Bacillus cellulosaehydrogtnicus – грамположительные спорообразующие клетки. Анаэробы. Сбраживают клетчатку (целлюлозу) до масляной и уксусной кислот и до водорода. Используются при биологической очистке нечистот. Bacillus cellulosaemethanicus – грамположительные спорообразующие клетки. Анаэробы. Разлагают клетчатку (целлюлозу) до масляной и уксусной кислот, метана и других газообразных продуктов. Bacills cereus – грамположительные спорообразующие палочки (0,5-2,5 х 1,2-10 мкм). Подвижные, перитрихи. Располагаются цепочкой. Аэробы или факультативные анаэробы. Обитают в почве. Являются условно – патогенными микроорганизмами. У человека вызывают пищевую токсикоинфекцию, кератит, эндокардит, менингит, остеомиелит, пневмонию. 31 Bacillus crasus – крупные грамположительные палочки. Похожи на вагинальную палочку B. doderleini. Могут явиться причиной возникновения острой язвы вульвы. Bacillus danicus – грамположительные неподвижные палочки (0,6-1,0 х 2,9-6,0 мкм). Спорообразующие. Выделены из морского грунта. Восстанавливают нитраты в нитриты. Bacillus dentalis – грамположительные спорообразующие палочковидные бактерии. Выделены из ротовой полости, вызывают кариес зубов. Bacillus fusiformis – вызывают язвенный стоматит, язвенную ангину, кариес зубов, язвенные поражения половых путей, конъюнктивит, некротические поражения глубоких тканей рта и лица, бронхит, пневмонию, абсцесс легких, гангрену легких, раневые инфекции, язвы кожи, сепсис. Нередко выделяются в ассоциации со спирохетой Spirochaeta vincenti. Bacillus gangraenae – вызывает гангрену пульпы. Bacillus gingivae – вызывают стоматит. Bacillus glutinosa и B. idosus – обитают в ризосфере. Bacillus larvae – грамположительные спорообразующие палочки. Вызывают инфекционную болезнь пчелиного расплода, известную под названием «американский гнилец». Больные личинки погибают в запечатанных сотах, превращаясь в тягучую гнилостную массу. Bacillus macerans – в аэробных условиях разлагают пектиновые вещества, которые склеивают клетки древесных растений. Их деятельность проявляется при замачивании стеблей льна, конопли и других подобных растительных культур. Bacillus megathеrium – грамположительные спорообразующие палочковидные клетки, располагающиеся цепочкой (стрептобациллы). Аэробы. Обитают в почве. Нормальные обитатели кишечника человека и теплокровных животных. Обнаруживаются в почвах, загрязненных фекалиями и навозом. Вызывают гниль капусты. Восстанавливают железо. амонификаторами, участвуют в процессах круговорота азота. 32 Являются Bacillus megatheriumvar.bombycus – попадая и развиваясь в кишечнике шелкопряда, вызывает гибель шелковичного червя. Bacillus mеgatheriumvar.phosphaticus – разлагают органические соединения, содержащие фосфор, с образованием фосфорной кислоты и углекислого газа. Как обитатели ризосферы, продуцируя фосфобактерин, способствуют повышению урожайности свеклы, капусты, картофеля, кукурузы, пшеницы. Bacillus mesentericus – грамположительные прямые палочки с закругленными концами (0,5-0,9 х 2,0-3,0 мкм). Подвижные, перитрихи. Образуют центральную спору. Факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы. Температурный оптимум 28-30оС. Входят в состав нормальной микрофлоры человека и животных. Обнаруживается в почве, на поверхности листьев, в воде (пресной и морской). Является аммонификатором. Участвует в процессах аммонификации на более поздних этапах разложения органических соединений в почве, загрязненной фекалиями или навозом. Преобладая в окультуренных почвах, является индикатором азотного режима почв. Способствует превращению нерастворимых фосфатов в минеральные фосфорнокислые, восстановлению железа, ацетоноэтиловому брожению. Активирует депелирование кожевенного сырья. Может быть продуцентом мочевины (как продукта метаболизма) при избыточном азотистом питании и отсутствии углеводов. Как обитатель ризосферы, может ингибировать рост растений. Участвует в гнилостных процессах. Является одним из возбудителей картофельной гнили. При попадании на хлеб, вызывает изменения крахмала и белковых веществ, в результате чего хлеб портится. Это проявляется в том, что появляются желто-бурые пятна, тонкие блестящие нити, хлеб тянется. Вызывает ферментацию молочного белка, в результате чего образуются вещества с горьким вкусом и продукт теряет свои вкусовые качества. При снижении иммунной защиты у человека и животных могут вызвать гнойновоспалительные процессы эндогенного и экзогенного характера. Выделяются при обследовании больных с кишечной 33 инфекцией, остеомиелитом, пародонтозом, флегмонами, при заболеваниях легких, инфицированных ожогах и конъюнктивитах, при гнойно-септических осложнениях после хирургических и иных манипуляций, при урологических и травматолого-ортопедических поражениях и при других заболеваниях. Bacillus methanicus – осуществляют окисление метана, входящего в состав рудничного или болотного газа, до углекислоты и воды. Температурный оптимум 30-37оС. Bacillus murisepticus – грамположительные прямые или слегка изогнутые неподвижные палочки (0,2-0,3 х 0,5-1,5 мкм). Температурный оптимум 36-37оС. Является возбудителем септицемии мышей. Bacillus mucilaginosus – грамотрицательные палочки (1,2-1,4 х 4,0-6,0 мкм). Образуют центральную спору, имеют капсулу. Температурный оптимум 25-30оС. Обитают на скальных породах. Участвуют в процессах разложения силикатов. Bacillus mycoides – грамположительные палочки (2,0-2,5 х 3,4-5,2 мкм). Располагаются цепочкой, образуют овальную центральную спору. Входят в состав нормальной микрофлоры кишечника человека и теплокровных животных. Обнаруживаются в морской воде, в грунте дна, в почве (особенно загрязненной фекалиями и навозом), на листьях. Являются обитателями ризосферы. В аэробных условиях обуславливают процессы гниения белковых субстратов. Восстанавливают железо, продуцируют биологически активные вещества – ауксины. Патогенны для гусениц тутового шелкопряда – вызывают кишечный токсикоз. У человека выделяются из раневого экссудата, могут способствовать возникновению и развитию остеомиелита. Bacillus oligonitrophilus – обитатель ризосферы. Bacillus paraalvei – возбудитель инфекционной болезни пчел. Инфекционная болезнь – парагнилец поражает открытый и запечатанный расплод, пчел, а также и куколок пчел. Погибшие личинки открытого расплода мягкие, запечатанного – тестообразные, иногда тягучие, издающие запах гнили. 34 Bacillus pasteurii – грамположительные спорообразующие аэробные палочки. Перитрихи. Относятся к уробактериям, разлагают мочевину до аммиака и углекислого газа. Bacillus (Clostridium) perfringens – грамположительные крупные палочки. Неподвижные, образуют центральную спору. Анаэробы. Постоянные обитатели кишечника человека и животных (жвачных). Внутри макроорганизма клетки окружены капсулой. Участвуют в процессах круговорота азота и гниении белковых субстратов. Продуктами гнилостного распада являются аммиак, сероводород, триметиламин, меркаптан, индол, скатол, креатинин, триптофан. Bacillus phytophtorus – вызывает у картофеля заболевание известное под названием «черная ножка картофеля». У больных растений чернеет и загнивает корневая ножка. Клубни или не образуются или бывают мелкие. Ткань внутри клубня загнивает. У людей и животных возбудитель вызывает пищевое отравление. Bacillus polymixa – в аэробных условиях разлагает пектиновые вещества, которые склеивают клетки деревенеющих растений. Деятельность этих микробных клеток проявляется при замачивании льна, конопли и других подобных растительных культур. Бациллы участвуют в процессах восстановления марганца, являются азотфиксаторами. Bacillus probatus – грамположительные образующие споры палочковидные аэробы. Являются аммонификаторами, как уробактерии разлагают мочу до аммиака и углекислого газа. Bacillus putrificus – возбудитель анаэробного гниения белкового субстрата до азотистых и безазотистых соединений. Участвует в процессах круговорота азота. Способствует быстрому разложению трупа, сопровождающемуся зловонным запахом. Является обитателем кишечника человека и животных, в окружающуюся среду выделяется с испражнениями. Bacillus sporogenes (Cl.sporogenes) – облигатные анаэробные грамположительные палочки. Нормальные обитатели кишечника человека и животных. Обитают в почве загрязненной фекалиями и навозом. Участвуют в 35 круговороте азота. Разлагают белковый субстрат в анаэробных условиях, способствуют быстрому зловонному разложению трупа. Восстанавливают железо. При снижении иммунной защиты организма вызывают гнойновоспалительные процессы эндогенного или экзогенного характера. Как обитатели ризосферы могут ингибировать рост растений. Bacillus subtilis (сенная палочка) – грамположительные крупные палочки с закругленными концами (1,0-1,3 х 4,6-5,5 мкм). Подвижные (перитрихи), образуют центральную овальную спору. Хемоорганотрофы. Факультативные анаэробы. Являются нормальными обитателями кишечника человека и животных. Широко распространены в природе. Обнаруживаются в пресной и морской воде, в почве (особенно в загрязненной фекалиями и навозом). Участвуют в процессах аммонификации (разложении белков и нуклеиновых кислот), минерализуют органические соединения азота, обеспечивают пополнение запасов минерального азота в почве. Являясь обитателями ризосферы, могут ингибировать рост растений. Являются продуцентами биологически активных веществ - ауксинов. Используются при биологической переработке и обеззараживании фекальных нечистот и сточных вод на полях ассенизации, орошения. Восстанавливают железо. Патогенны для гусениц тутового шелкопряда - вызывают кишечный токсикоз. При снижении иммунной защиты у человека и животных вызывают гнойно-воспалительные процессы. Способствуют ферментации молочного белка, в результате которой образуются вещества с горьким вкусом и продукт теряет свои вкусовые качества. Bacillus грамположительные thurigiensis – палочки. Вызывают бациллярный кишечный токсикоз и гибель гусениц тутового шелкопряда. Bacillus vigratus – грамположительные спорообразующие палочки (0,50,8 х 2,0-4,0 мкм). Обнаруживаются в морской воде на глубине 1-250 м. Восстанавливают нитраты в нитриты, (http://mikrobio.ho.ua/mikro-text12.html). 36 усваивают минеральный азот Глава 3 Биология аэробных спорообразующих бактерий Спорообразующие бактерии обладают активными протеолитическими ферментами. Они разлагают сложные белковые соединения на аминокислоты, а затем и на более простые азотистые вещества и аммиак. Способность спорообразующих бактерий к энергичному разложению сложных органических соединений до простых продуктов распада стала основой для физиологической характеристики этой группы бактерий как активных аммонификаторов. Однако различные виды спорообразующих бактерий по - разному относятся к источникам азотистого питания. Так, например, культуры группы сенного и картофельного бацилла более энергично сбраживают углеводы с образованием разнообразных промежуточных соединений. Для наиболее распространенных видов спорообразующих бактерий лучшими источниками азотного питания оказались пептон, гидролизат казеина, автолизат дрожжей, и мочевина. Среди почвенных аэробных спорообразующих бактерий имеются виды, которые довольно хорошо развиваются на безазотистой среде. К ним относятся олигонитрофильные атмосферный азот. бактерии, Эти обладающие микроорганизмы способностью характеризуются усваивать слабой азотфиксирующей способностью, однако их накопление в почве может значительно содействовать обогащению ее азотом. В этом отношении всестороннее изучение данной группы микроорганизмов представляет большое значение для повышения плодородия почв (http://molbiol.ru/wiki). Большинство видов спорообразующих бактерий, широко распространенных в почве, обладает способностью использовать в качестве источника азота нитраты. Благодаря этому они вызывают процессы восстановления нитратов (денитрификацию) и переводят их в состав органических азотистых соединений. Таким образом, спорообразующие бактерии усваивают азот из различных источников в неодинаковой степени. Одни предпочитают аммонийный азот, другие - азот аминокислот; многие 37 хорошо потребляют азот нитратов, тогда как некоторыми он не усваивается или используется слабо. Активная аммонифицирующая деятельность спорообразующих бактерий имеет важное значение для повышения плодородия почв. Некоторые авторы отметили заметное увеличение урожайности растений при внесении в почву активных аммонификаторов. Спорообразующим бактериям принадлежит важная роль в превращениях фосфора. Многими авторами было показано, что культуры различных видов спороносных бактерий активно переводят нерастворимые фосфорные соединения в растворимые. В Советском Союзе с применением культуры спорообразующих бактерий, активно минерализующей сложные органические соединения фосфора, было налажено промышленное производство бактериального удобрения - фосфобактерина. Этот препарат широко и успешно применялся для повышения урожайности многих сельскохозяйственных культур. Установлено несколько механизмов разложения фосфорных соединений спороносными бактериями. В одном случае происходит растворение трикальций фосфата, в другом - перевод фосфоритов в апатиты или фосфитов в фосфаты. Более распространенным является минерализация органофосфатов в результате ферментативной деятельности бактерий и выделения ими кислот. Результаты исследований показывают, что отмеченные свойства не приурочены к особым видам, обнаруживаются у культур многих видов и разновидностей спороносных бактерий, а также других микроорганизмов. Отечественными авторами были выделены и изучены культуры спорообразующих бактерий, способные разрушать полевые шпаты, каолин и другие формы силикатов. Среди спорообразующих бактерий обнаружены виды и разновидности, характеризующиеся выраженной специализацией биохимической активности. Так, культуры B. pasteurii обладают уреазной активностью и хорошо развиваются в сильно щелочной среде. Редкой формой бациллярных 38 организмов является B. fastidiosus, который не способен усваивать сахара, аминокислоты, белковые и другие соединения. Бактерии этого вида потребляют лишь мочевую кислоту и аллантоин. В качестве источника углеродного питания спорообразующие бактерии могут использовать как простые сахара, так и полисахариды. Из моносахаридов лучше всего они усваивают глюкозу, а из дисахаридов - сахарозу. Отношение разных видов спорообразующих бактерий к углеводам различное, что широко используется в исследованиях по систематике для определения видовой принадлежности микроорганизмов. При развитии на простых сахарах, в особенности на глюкозе, спорообразующие бактерии синтезируют ряд продуктов - молочную, уксусную и пропионовую кислоты, ацетилметилкарбинол и т. п. Газообразование отмечается только у культур нескольких видов. Многие виды спорообразующих бактерий сравнительно хорошо усваивают различные органические кислоты и спирты. В группе аэробных спорообразующих бактерий немало видов и разновидностей, которые для своего роста и развития нуждаются в различных витаминах, аминокислотах и других ростовых факторах. Так, для культур сибиреязвенного бацилла наряду с аминокислотами необходим тиамин. Культуры облигатных энтомопатогенных видов - возбудителей молочной болезни японского жука, американского гнильца медоносной пчелы и других болезней насекомых - нуждаются во многих аминокислотах и витаминах. Культуры сапрофитных спорообразующих бактерий также в ряде случаев проявляют специфические потребности в витаминном и аминокислотном питании. Наиболее характерной для подобных организмов является зависимость их роста и развития от наличия в среде тиамина, биотина, фолиевой и никотиновой кислот. В качестве обособленного нового вида описаны культуры спорообразующих бактерий, нуждающиеся в пантотеновой кислоте. Термофильным формам спороносных бактерий присуща более выраженная 39 зависимость роста и развития от аминокислот, витаминов и других дополнительных факторов роста. Спорообразующие бактерии - активные продуценты многих ферментов. Бактерии группы сенного и картофельного бацилла обладают выраженной протеолитической и амилолитической активностью. В настоящее время культуры этих видов спороносных бактерий широко используются во многих странах для промышленной выработки амилазы и различных протеаз (http://molbiol.ru/wiki). Амилаза - фермент, действующий на гликозидные связи в полисахаридах. Амилазы разделены на α-амилазы и β-амилазы, так называемые эндоамилазы и β-амилазы - экзоамилазы, так как α-амилаза может расщеплять гликозидные связи в середине полисахаридных цепей, тогда как β-амилаза действует на не редуцирующий конец цепи, последовательно отщепляя остатки мальтазы. Липаза - фермент, участвующий в процессах гидролиза триглицеридов, в результате которого освобождаются глицерин и высшие жирные кислоты. С давних времен в Японии большой популярностью пользуется национальное блюдо «натто», которое изготовляют из соевых бобов при их обработке культурой сенного бацилла (Суслова, 2007). Некоторые виды спорообразующих бактерий вырабатывают ферменты, разлагающие пектин и протопектин растений. Этим бактериям приписывается определенная роль в создании комковатой структуры почв и в образовании клубеньков у бобовых растений. Выраженные ферментативные свойства некоторых видов спорообразующих бактерий обусловливают развитие гнилей и побурение плодов, фруктов и других растительных продуктов. При благоприятных условиях размножения некоторых видов бацилл - продуцентов фосфолипаз и других ферментов - вызывается порча пищевых продуктов, которые могут служить причиной гастроэнтеритов и других пищевых отравлений. Среди бактериальных организмов группа аэробных спорообразующих бактерий известна своими сильно 40 выраженными антагонистическими свойствами в отношении большого числа микроорганизмов. Спороносные бактерии можно поставить в один ряд с лучистыми грибками, пенициллами и аспергиллами, представляющими собой основные источники получения антибиотических веществ. Подавляющее большинство антибиотиков бактериального происхождения выделено из группы спорообразующих бактерий. Первый антибиотический препарат - грамицидин - выделен из культуры спороносной бактерии. Советскими учеными был получен антибиотик грамицидин С, который успешно используется при лечении многих инфекций. Из различных видов бацилл получены антибиотики альвеин, бациллин, бацитрацин, лихениформин, субтилин, циркулин и др. Особый интерес вызвало открытие полимиксинов - антибиотиков бациллярного происхождения, которые оказались высокоактивными против грамотрицательных бактерий. В ряде стран организовано промышленное производство отдельных препаратов антибиотиков: полимиксина В, колистина, бацитрацина. Кроме терапевтического использования, бацитрацин применяется в качестве стимулятора роста животных. В настоящее время из различных видов спорообразующих бактерий выделено более 60 антибиотиков, из которых некоторые были испытаны в клинической практике. Однако антибиотики, полученные из спорообразующих бактерий, изучены недостаточно. За некоторыми исключениями, антибиотики из спорообразующих бактерий представляют собой вещества белковой природы - полипептиды. Они состоят из различных аминокислот, причем наиболее характерным является то, что в состав полипептидных антибиотиков входят неестественные аминокислоты с правой оптической конфигурацией. Некоторые антибиотики полипептидной природы имеют сравнительно более простой состав и несложную формулу, представляя весьма удобную модель для изучения строения белка. С другой стороны, полипептидные антибиотики привлекают большой интерес биохимиков, так как эти вещества могут быть использованы при изучении 41 одной из центральных проблем современной биологии - выяснении причин, обусловливающих специфичность биологически активного белка. По механизму действия продуцируемые спорообразующими бактериями антибиотики разделяются на три группы. Группа эдеинов, представляющих собой пептиды с сильно основными свойствами, специфически подавляет синтез ДНК. Группа бацитрацинов и родственных им антибиотиков представляет собой циклические пептиды, которые угнетают синтез оболочки клеток. В грамицидины, обширную группу полимиксины и бациллярных родственные антибиотиков им соединения, включают которые специфически блокируют синтез структурных компонентов или функцию клеточной мембраны. Характерной особенностью этих антибиотиков является то, что они образуются после активного размножения бактерий в процессе спорообразования. Результаты генетических исследований свидетельствуют, что биосинтез бациллярных антибиотиков тесно связан с образованием протеазы, характерной для процессов спорообразования. Поэтому синтез антибиотиков отражает особенности биохимической дифференциации клеток спорообразующих бактерий (http://molbiol.ru/wiki). 3.1 Спектр активности пробиотиков на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus (Бакулина, 2001) Действие Процессы, обеспечивающие это действие Подавление роста патогенных и условнопатогенных микроорганизмов Синтез веществ, обладающих антибиотическими свойствами, снижение рН среды, высокая конкурентная способность в процессе размножения. Нормализация пищеварения Синтез пектолитических, протеолитических ферментов, липазы Стимуляция лимфоцитов, макрофагов, индукция эндогенного α− и - интерферона, увеличение содержания гамма – глобулиновой фракции крови. Стимуляция неспецифической резистентности макроорганизма 42 Антитоксическое действие Дезинтеграция высокомолекулярных белков. Способность связывать тяжелые металлы. Антиаллергическое действие Расщепление аллергенов на биологически инертные субъединицы. Филогенетическая общность представителей нормальной симбионтной микрофлоры. Восстановление эндогенной микрофлоры, коррекция микробиоценоза Синтез заменимых и незаменимых аминокислот и витаминов Экзоцеллюлярная продукция треонина глутаминовой кислоты, аланина, валина, тирозина, гистидина, орнитина и др. Выведение тяжелых металлов и радионуклидов Способность к повышенной сорбции тяжелых металлов и рдионуклидов в сочетании с быстрой элиминацией. Противоопухолевая и антиметастотическая активность Стимуляция естественных киллерных клеток и Т-лимфоцитов, стимуляция макрофагов. 43 Глава 4 Получение накопительных культур и идентификация рода Bacillus 4.1 Традиционный подход к идентификации видов Традиционный подход к идентификации видов Bacillus в значительной степени основывается на морфологии спор. Вид относят к одной из трех групп в зависимости от того, являются ли споры: I) овальными и того же диаметра, что и спорангий; II) овальными, но большего диаметра, чем спорангий, что вызывает его «разбухание», или III) круглыми. Для правильной идентификации на основе такого разделения необходимо хорошо знать эти типы бактерий, однако большую помощь могут оказать отличные микрофотографии. К бактериям группы I относятся группа В. subtilis и некоторые другие, часто встречающиеся бациллы. Существуют трудности с разграничением В. amyloliquefaciens и В. subtilis, но обычно их можно различить по признаку синтеза ДНКазы, а также по способности сбраживать лактозу и ксилозу. У В. amyloliquefaciens первый признак отсутствует, второй имеется, третий отсутствует, тогда как у В. subtilis характеристики противоположные (Priest et al, 1987). Однако наиболее надежным способом различения этих таксонов является гибридизация ДНК. Вид Bacillus megaterium считается гетерогенным, но клетки В. megaterium sensustricto обычно можно отличить по их крупным размерам. Клетки В. cereus, В. anthracis, В. thuringiensis и В. mycoides трудно отличимы друг от друга и их ДНК действительно обнаруживают высокую степень гомологии. В. thuringiensis можно распознать по наличию параспорального тела, а В. mycoides - по ризоидному росту. Группа II представляет собой гетерогенное собрание видов. Для Bacillus macerans и В. polymyxa характерно выделение газа в процессе сбраживания сахаров, а штаммы В. alvei, как правило, образуют подвижные колонии. Распознавание B. circulans представляет определенные трудности, так как на основе данных по гомологии ДНК в пределах этого, таксона различают по крайней мере 10 групп. Попытки решить эту проблему привели к созданию 44 видов В. pabuli, В. lautus, В. amylolyticus и В. validus (Nakamura, 1984). В эту группу включены патогенные для насекомых В. larvae (вызывает американский гнилец медоносной пчелы), В. lentimorbus и В. popilliae (вызывает молочную болезнь личинок жука-навозника), которые не выживают при последовательных пересевах в питательном бульоне и не содержат каталазы. Наконец, к этой группе относится гетерогенный таксон В. stearothermophilus включающий, вероятно, по крайней мере три таксона в ранге вида (Sharp et al, 1980). Для штаммов группы III характерна сферическая форма спор. Из бактерий этой группы наиболее распространенной является, вероятно, B. sphaericus, но опять-таки это название относят к бактериям, которые можно разделить по гомологии ДНК примерно на семь групп. Дифференцировать эти таксоны по фенотипическим признакам в настоящее время практически невозможно. Другие организмы, образующие сферические споры - это психрофилы (цитир. Харвуд, 1992). В настоящее время используют определенный набор тестов для определения штаммов. Пример: Штамм №7, относится к роду Bacillus, грамположительные палочки (1.86×0.81 мкм), эллипсовидные споры при окраске по Граму имеют грамотрицательную окраску (1.38×0.65), спорангий немного раздутый, расположение споры центральное. Аэробы, каталазоположительные. По идентификационной таблице предложенной Норрисом (Norris et al, 1981) штамм №7 был отнесён к виду Bacillus pumilus, по признакам перечисленным в таблице ниже: 45 Признак B.pumilus Каталаза + Реакция Фогес-Проскауэра + Рост в анаэробномагаре - Рост при 50°С + Рост при NaCl 7% + Образование кислоты и газа в результате расщепления глюкозы - Редукция NO3 до NO2 - Гидролиз крахмала - Рост при 65°С - Ширина клеток шире 1,0 мкм - рН в реакции Фогес – Проскауэра < 6.0 + Образование кислоты в результате расщепления глюкозы + Гидролиз казеина + Параспоральные тела - Кроме того, в международном генном банке зарегистрирован 3779 фрагмент последовательностей гена 16S рибосомальной РНК, которые отнесены к роду Bacillus. Так же получены полные геномы для 38 штаммов бацилл (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 46 4.2 Некоторые способы получения накопительных культур для селективного выделения штаммов Bacillus Способ получения Среда с рН 4, инкубация при 600С Высев на питательный агар с рН 8,5-11 Агаризованная среда, не содержащая N, с тиамином и биотином Среда с пептоном, инкубация в атмосфере N2O Накопительная культура в питательном бульоне с глюкозой при рН 5,5 и 500С. Инкубация чашек Петри с той же средой при 500С Минимальная среда с мочевиной или аллантоином в качестве единственного источника С и N Среда с агаром на морской воде, инкубация при 220С в течение 7 дней Накопительная культура на среде с пептоном и нитратом в анаэробных условиях Минимальная среда с глюкозой и нитратом в качестве единственного источника N Накопительная культура в питательном бульоне, содержащем 4% NaCI, инкубация при 30С Среда, содержащая дрожжевой экстракт, (NH4)SO4 и 5% мочевины, рН 9. Инкубация в аэробных Организм B. acidocaldarius B. alcalophilus B. azotofixans B. azotoformans B. coagulans B. fastidiosus B. firmus B. licheniformis B. megaterium B. pantothenticus B. pasteurii 47 условиях. Среда с пептоном и крахмалом в пробирках с дюрхемовскими трубками. Должно наблюдаться выделение газа Среда, содержащая аргинин в качестве единственного источника углерода и азота. Стрептоцин используется как селективный фактор для выделения патогенных для насекомых штаммов Различные среды, инкубация при 650С B. polymyxa B. sphaericus B. stearothermophilus 48 Глава 5 Изучение Bacillus в водной среде 5.1 Выделение чистых культур из водных образцов Для выделения бацилл из водных образцов используют метод прямого глубинного посева 1-2 мл. исследуемой воды (Родина, 1965); из донных осадков образцы обрабатывают согласно следующей методике. Образец исследуемого донного осадка в количестве 0,5 гр. берут лопаткой, обработанной спиртом, и стерильно вносят в колбу емкостью 100 мл. с 50 мл. стерильной дистиллированной воды. В течение 30 мин. грунт встряхивают на качалках со скоростью 150 об./мин. при амплитуде 5. После этого суспензии дают отстояться и используют ее для разведений. При выделении и учете количества бактерий исследуемой группы используют чашечный метод Коха. Сущность данного метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. Полученную суспензию и разведения в количестве 1 мл. вносят в чашки Петри, заливают стерильной питательной средой РПА:10 с добавлением сульфата марганца. Культивирование посевов проводят при температурах 40, 250 и 370С. Выделение споровой стадии бацилл. Для выделения споровой стадии бацилл перед посевом водные образцы и суспензии донных отложений пастерилизуют (10 мин. при 60-750С), чтобы убить вегетативные клетки и оставить жизнеспособные споры. Посев осуществляют на РПА:10. Отбор колоний проводят по морфологическим признакам, характерным для представителей рода Bacillus. Выделение термофильных бацилл. При выделении термофильных бацилл используют метод накопительной культуры. Термофильные бактерии культивируют и выделяют, применяя селективные среды, при температуре 530С. 49 Идентификация культур. Морфологический Штаммы анализ. микроорганизмов идентифицируют согласно методике, предложенной Дж. Р. Норрисом с соавторами (Norris et al, 1981). Суточные чистые культуры окрашивают по Граму. При обычных способах окраски по Граму споры либо не прокрашиваются, либо прокрашиваются очень слабо, т.к. оболочка споры состоит из нескольких покровов и кортекса и имеет вид светлых включений на фоне окрашенной плазмы (Суслова, 2007). Биохимические тесты. Идентификацию бактерий до вида проводят после изучения следующих микроорганизмов амилазы, признаков: наличие нитратредуктазы, у чистых протеазы, культур выявление пигментообразования, способность роста при 650С, при 500С, на РПА с 7% NaCl, а также в анаэробных условиях. Обязательным признаком в идентификации является V-P реакция. Необходимо учитывать наличие параспоральных тел в спорангии, которые определяют принадлежность к энтопотагенным видам рода Bacillus (Краткий определитель Берджи, 1980). Определение ферментативной активности. Каталаза. Каталазную активность выявляют следующим образом: исследуемую культуру выращивают на поверхности плотной питательной среды, на которую затем наносят каплю 10% раствора перекиси на колонию. Выделение кислорода, хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о продукции клетками каталазы (Практикум по микробиологии, 1976). Фосфотаза. Для определения фосфатазной активности используют стандартный набор реагентов ALKALINE PHOSPHOTASE «FL». Стандартный набор реагента, содержащий n-нитрофенилфосфат, капают в планшетки по 0,25 мл. в каждую лунку, когда вносят биомассу исследуемых культур в размере 1 бактериальной петли. При положительной реакции, т.е. при действии бактериальной щелочной фосфотазы, n-нитрофенилфосфат расщепляется на nнитрофенол и фосфат, о чем свидетельствует желтая окраска индикатора. Фосфотазную активность оценивают по интенсивности желтой окраски 50 полученной суспензии. Суспензии выдерживают при комнатной температуре, результаты учитывают через 1 час или 24 часа инкубирования. Протеаза. Способность бактерий минерализовать белки является таксономическим признаком и определяется по разложению желатина или пептонизации казеина. Тестирование на протеолитическую активность проводят на молочном агаре. Гидролиз желатина изучают на чашках Петри, которые предварительно заливают голодным агаром, а затем – 25% мясопептонным желатином. Амилаза. Для определения амилолитической активности используют крахмальный агар, который после стерилизации разливают в чашки Петри. В готовую среду уколом наносят исследуемые культуры. Продолжительность культивирования от 3 до 5 дней. Гидролиз крахмала выявляется по зоне просветления вокруг укола, которая четко видна после обработки раствором Люголя. Липаза. Активность липазы определяют на трибутириновом агаре, который готовят из расчета 20 гр. на 1 л. воды. После стерилизации среду охлаждают до 800С, добавляют трибутирин и перемешивают на магнитной мешалке в течение 2-3 часов до полной гомогенизации. Затем сразу заливают в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки уколом наносят культуры. Время инокуляции составляет 5 дней. В результате по зонам просветления судят о липазной активности. Нитратредуктаза. Восстановить нитраты до нитритов способны микроорганизмы, образующие фермент нитратредуктазу и использующие нитраты в качестве источника азота. В среду засевают клетки исследуемого организма, выдерживают в термостате 7-10 дней. При добавлении реактива Гисса происходит окрашивание клеточной суспензии в красно-розовый цвет за счет того, что в кислой среде в присутствии нитратов и ароматических аминов происходит образование азотистых соединений (Суслова, 2007). 51 Глава 6 Роль микроорганизмов рода Bacillus в биодеградации сложных органических соединений и растворении соединений кремния 6.1 Деградация углеводородов бактериями рода Bacillus В последние десятилетия возрос интерес к микроорганизмам деструкторам различных окружающей среды ароматическими высокомолекулярных нефтью, углеводородами соединений. нефтепродуктами, является (ПАУ) Загрязнение полициклическими проблемой мирового масштаба и в настоящее время остается одной из сложных и многоплановых в экологии и охране окружающей среды. Разрабатываются различные методы очистки от нефтяных загрязнений: механические, физико-химические, биологические. В настоящее время подготавливаются микробиологические методы, основанные микроорганизмов соединения в - на использовании деструкторов, качестве ферментативной использующих единственного источника активности высокомолекулярные углерода (Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах, 2004). Микробиологическая деградация ПАУ является основным процессом, приводящим к очистке от этих соединений водоемов и почв. Катаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Bacillus. Бациллы способны полностью утилизировать или частично трансформировать такие соединения, как нафталин, салицилат, ортофталат, октан и др., наряду с псевдомонадами, артробактериями и родококками (Звягинцева, 2001; Плотникова и др., 2001; Zhuang et al, 2002). Полициклические ароматические углеводороды - большая группа широко распространенных загрязнителей окружающей среды. Эти соединения обладают мутагенными и канцерогенными свойствами и представляют значительную потенциальную опасность для здоровья человека. Именно поэтому изучение биодеградации, микробного метаболизма и детоксикации 52 этой группы химических соединений привлекло внимание большого количества ученых во многих странах. Углеводороды и аналогичные им битуминозные вещества поступают в водоемы вместе с растительными остатками, а также в виде нефтяных и других промышленных загрязнений (анионные ПАУ). Распад их в водной массе и донных отложениях возможен лишь при участии микроорганизмов (Андрусенко, 1967) Как показывают высокомолекулярных исследования, соединений биодеструкторами являются бактерии различных рода Bacillus. Способность к биодеградации описана для многих штаммов данного рода: Bacillus naphtovorans (Zhuang et al, 2002), B. benzoevorans, B. gordanae. Полициклические ароматические углеводороды представляют большой разнообразный класс органических соединений, молекулы которых состоят из трех и более ароматических колец в различных структурных конфигурациях. Стабильность углеводородов зависит от числа ароматических колец. Например, в почве молекула фенантрена с тремя кольцами может сохраняться от 16 до 126 дней, в то время когда с пятью - от 229 до 1400 дней (Kanaly et al, 2002). Нефтяные углеводороды в основном, относятся к парафиновому ряду с прямой, незамкнутой цепочкой или к нафтеновому с насыщенным водородом циклическим ядром. Анионные ПАУ, как известно, характеризуются выраженным антибактериальным действием и могут вызывать лизис клеток. Однако некоторые бактерии не только проявляют высокую устойчивость к этим веществам, но и способность разрушать и использовать их. Также известно, что ферменты, участвующие в процессах разложения высокомолекулярных веществ, защищены от температурного воздействия как низких, так и повышенных температур (7, 37 и 500С). Так, например, большинство штаммов B. stearothermophilus, способных окислять фенол, было изолировано из мест, прогреваемых паротермальными газами (56-580С), в которых из органических соединений присутствуют фенолы и смолы (Головачева и др., 1975). 53 Среди основных факторов, влияющих на доступность углеводородов для бактериального окисления, необходимо выделить следующие: относительная растворимость углеводорода в среде, пригодность углеводорода к активному транспорту через клеточную мембрану, отсутствие специфического токсического действия на цитоплазму самого углеводорода или продуктов его окисления, а также наличие у микроорганизмов соответствующей системы ферментов. Процесс самовосстановления биоценозов, загрязненных нефтью, по мнению большинства исследователей, идет более 10-25 лет. Являясь сложной многокомпонентной системой, нефть доступна для полной утилизации только микроорганизмам, обладающим уникальными ферментными системами. Пример: экспериментальная работа по биодеградации полициклических ароматических углеводородов, природных компонентов нефти, была проведена для культур Bacillus, выделенных из воды и донных осадков озера Байкал. Было установлено, что «байкальская нефть» представляет собой сложную смесь неразделяемых полициклических углеводородов. Она представлена только высококипящими фракциями и содержит 70,26% углеводородов. В составе последних преобладают насыщенные углеводороды, они составляют 48,14%, ароматические - 22,12%. Изучение распространения углеводородокисляющих микроорганизмов показало, что их распространение в исследованном районе пятнистое. Количество культивируемых углеводородокисляющих микроорганизмов в районе самого нефтяного пятна незначительно - до 100 кл/мл, число гетеротрофов, в основном представленных бактериями рода Bacillus, достигло 300 кл/мл. Возможно, это объясняется токсическим действием нефти на клетки микроорганизмов и сохранением спор бацилл, устойчивых к неблагоприятным условиям. По мере удаления от места нефтепроявления количество нефтеокисляющих бактерий увеличивается от 200 до 1000 кл/мл. Также установлено, что в поверхностных пробах воды в районе нефтепроявления численность бактерий, 54 разрушающих углеводороды, колеблется от 13 до 2608 кл/мл. В придонных слоях численность возрастает до 20 тыс. кл/мл. Выделенные микроорганизмы были отнесены к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus и в этой экологической нише бациллы становятся доминирующей группой. Для пяти штаммов Bacillus, был проведен эксперимент по деградации трех ПАУ (пирена, финантрена и флуорантена). Эти полициклические углеводороды преобладают в твердой фазе аэрозоля, собранного в зимний период. В результате проведенных исследований установлено, что в присутствии бактерий рода Bacillus, в условиях модельного эксперимента, биодеградация ПАУ составляла 18-30% за исключением штамма № 38 отнесенного к Bacillus sp., где конверсия не превышала 2%, причем фенантрен в данных условиях сохранился полностью (Суслова, 2007). 6.2 Деградация бис-(2-этилгексил)фталата бактериями рода Bacillus Диэфиры орто-фталевой кислоты (фталаты) - широко распространенные продукты крупнотоннажных химических производств, применяющихся в основном в качестве пластификаторов при изготовлении полимерных материалов. Начиная с 50-х годов прошлого столетия, производство фталатов в мире непрерывно росло, и в последнее десятилетие достигло уровня миллионов тонн в год. Из нескольких десятков производимых в промышленных масштабах фталатов ведущее место принадлежит бис-(2-этилгексил)фталату (БЭГФ). БЭГФ является внешним пластификатором и не образует химических связей с полимером, поэтому он способен постепенно мигрировать из пластмасс в окружающую среду. Это соединение отличается термо- и фотостабильностью, устойчивостью к химическому гидролизу и относительно высокой для гидрофобных веществ растворимостью в воде (до 1 мг/л) (Giam et al, 1984). 55 Пример, для изучения способности чистых культур Bacillus к деградации фталата были взяты пять штаммов микроорганизмов, выделенных из донных осадков Байкала в районе Посольской бани. Два штамма были определены до вида как Bacillus pumilus и B. рolymyxa и три штамма - Bacillus sp.; изучение физиолого-биохимических свойств показало, что все штаммы разные. Результаты эксперимента показали, что бактерии рода Bacillus более активно деградируют фталаты, чем псевдоманады. Приведенные исследование показали, что бактерии рода Bacillus, изолированные из донных осадков озера Байкал, способны эффективно разрушить сложные высокомолекулярные органические вещества. Данные микроорганизмы, несомненно, обладают большим потенциалом в биодеградации органополлютантов, обеспечивая чистоту байкальских вод (Суслова, 2007). 6.3 Роль представителей рода Bacillus в растворении соединений кремния Некоторые бактерии и грибы играют важную роль в мобилизации оксида кремния и силикатов в природе. Часть этого микробного участия подтверждается выветриванием горных пород, состоящих из силикатов и алюмосиликатов. Установлена зависимость этого процесса от кристаллохимических особенностей минералов. Действие растворения может включать расщепление структурных связей силоксана Si-O-Si или Al-O, либо удаление катионов из кристаллической решетки силикатов, которые вызывает последующее разрушение. Способ влияния может выражаться: 1 – в микробиально полученных лигандах для катионов, 2 – в микробиально полученных органических или неорганических кислотах, 3 – в микробиально полученных щелочах (аммиак или амины), 4 – в микробиально полученных внеклеточных полисахаридах, работающих (гликокаликс). 56 при кислых значениях рН Показано, что микробиально полученные лиганды двухвалентных катионов вызывают растворение кальций-содержащих силикатов. Полимерные силикаты могут трансформироваться бактериями в мономерные силикаты, как было показано при изучении Proteus mirabilis или B. сaldoliticus. Культура Proteus способна усваивать некоторые мономерные силикаты. Механизмы деполимеризации не выяснен. В случае B. сaldoliticus, способность трансформировать силикаты, по видимому, является зависимой от роста, даже учитывая, что организм не накапливает Si. При разрушении кварца деградация полимеров кремния до мономерной стадии, по-видимому, происходит через промежуточное звено олигомерной стадии. Органосиликаты могут также образовываться в качестве промежуточной стадии. Детальные механизмы, посредством которых эти преобразования происходят, не известны. Однако ясно, что эти процессы биодеградации имеют фундаментальную важность в биологическом цикле оксида кремния (Erlich, 1996). 57 Выводы 1. Бактерии рода Bacillus являются убиквистами, то есть распространены повсеместно. 2. Классификация Bacillus еще до конца не изучена и требует дальнейшего исследования. 3. Благодаря способности к спорообразованию, бактерии рода Bacillus могут выживать в экстремальных условиях среды обитания, а также проявлять устойчивость к различным химическим веществам, различным физическим факторам, включая влажный пар, высушивание, ультрафиолетовое и гаммаизлучение, вакуум и окисляющие агенты. 4. Главной средой обитания бактерий, принадлежащих к видам Bacillus, является почва. Так же клетки бацилл могут составлять до 20% общей численности гетеротрофной микрофлоры морской воды. 5. За исключением сибиреязвенной бациллы, бациллы не обладают большой патогенностью для млекопитающих. Эндоспоры могут сохранятся в почве в течение многих лет. Это делает их опасными для млекопитающих, в частности для человека. 6. Бактрии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растений в силу их широко распространенного природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам. 7. Спорообразующие бактерии обладают биологической активностью таких ферментов как протеаза, амилаза, липаза и др. 8. Установлено, что бактерии рода Bacillus способны разрушать сложные высокомолекулярные органические вещества. Бактерии рода Bacillus активно развиваются в районе нефтепроявлений и активно участвуют в ее биодеградации. 9. По данным литературных источников, исследование бактерий рода Bacillus в морской среде, их способность изменять свойства в зависимости от характера 58 загрязнения, еще не проводилось. Что, несомненно, вызывает интерес для дальнейшего изучения данного объекта в морской среде. 59 Список литературы 1. Андрусенко, М. Я. Об окислении углеводородов различными физиологическими группами углеводородокисляющих микроорганизмов / М. Я. Андрусенко, Б. И. Бильмес // Биология и физиология микроорганизмов: сб. научн. тр. АН УССР отдел микробиологии. - Ташкент, 1967. - С. 41-45. 2. Аэробные спорообразующие бактерии. Род бациллус (Bacillus) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://molbiol.ru/wiki. 3. Бакулина, Л. Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рада Bacillus и их использование в ветеринарии / Л. Ф. Бакулина, И. В. Тимофеев, Н. Г. Перминова, А. Ф. Полушкина, Н. И. Печоркина // Биотехнология. - 2001. - № 2. - С. 48-56. 4. Биологическая роль бактерий [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://mikrobio.ho.ua/mikro-text12.html. 5. Головачева, Р. С. Новый вид термафильных бацилл - Bacillus thermocatenulatus nov. sp. / Р. С. Головачева, Л. Г. Логинова, Т. А. Салихов, А. А. Колесников, Г. Н. Зайцева // Микробиология. - 1975. Т XLIV - Вып. 2. - С. 265- 268. 6. Головачева, Р. С. Окисление фенола некоторыми штаммами Bacillus stearothermofillus / Р. С. Головачева, А. Е. Орешкин // Микробиология. - 1975. Т XLIV - Вып. 3. - С. 470-475. 7. Жизнь растений. Энциклопедия в шести томах. Том 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Под ред. чл. -кор. АН СССР, проф. Н. А. Красильникова и проф. А. А. Уранова. - М.: Изд. «Просвещение», 1974. - 487 с. 8. Звягинцева, И. С. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями / И. С. Звягинцева, Э. Г. Суровцева, М. Н. Поглазова, В. С. Ивойлов, С. С. Беляев // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 3. - С. 321-328. 9. Интернет Учебник Тодора в бактериологии [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://textbookofbacteriology.net/index.html. 60 10. Краткий определитель бактерий Берджи: [под ред. Дж. Хоулт]: [пер. с англ.] / Под ред. чл.-кор. АНН СССР Г. А. Заварзина. - Изд. 7-е, - М.: Изд. «Мир», 1980. - 495 с. 11. Логинова Л. Г. Ацидофильная облигатно термофильная бактерия Bacillus acidocaldarius, выделенная из горячих источников и почв ост. Кунашир / Л. Г. Логинова, Г. И. Кравцова, Л. А. Егорова, Т. И. Богданова // Микробиология. 1978. - № 47. - С. 771-775. 12. Мелентьев А. И. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn. как агенты биологического контроля болезней растений: дис… доктор биол. наук: 03.00.07, 03.00.04 / А. И. Мелентьев - Уфа, 2000. - 302 с. 13. Национальный центр биотехнологической информации достижений науки и здравоохранения путем обеспечения доступа к медико- биологических и геномной информации (NCBI) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 14. Плотникова, Е. Г. Бактерии - деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработки / Е. Г. Плотникова, О. В. Алтынцева, И. А. Кошелева, И. Ф. Пунтус, А. Е. Филонов, Е. Ю. Гаврилов, В. А. Демаков, А. М. Боронин // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 1. - С. - 61-69. 15. Практикум по микробиологии: учеб. пособие / Под ред. профессора Н. С. Егорова. - М.: Изд. Мос. Университета. - 1976. - 307 с. 16. Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах. Теоретические подходы / СИФиБР СО РАН, под ред. канд. биол. наук А. В. Колесниченко. М.: «Промэкобезопасность», 2004. - 194 с. 17. Родина, А. Г. Методы водной микробиологии. Практическое руководство / А. Г. Родина АН СССР. Зоологический ин-т. – М.; Л.: Изд. «Наука», 1965. - 363 с. 18. Суслова, М. Ю. Распространение и разнообразие спорообразующих бактерий рода Bacillus в водных экосистемах: дис... канд. биол. наук: 03.00.16, 61 03.00.07 / М. Ю. Суслова ; Рос. акад. наук, Сиб. отд-ние, Лимнол. ин-т. - УланУдэ: [б. и.], 2007. - 163 с. 19. Харвуд, К. Бациллы. Генетика и биотехнология / К. Харвуд. - М.: Изд. «Мир», 1992. - 472 с. 20. Allen, D. A. et al. Numerical taxonomy of bacterial isolates associated with a freshwater fishery / D. A. Allen, В. Austin and R. R. Colwell // J Gen. Microbiol. 1983. - № 129. - р. 2043-2062. 21. Attwell, R. W. and Colwell, R. R. Thermoactinomyces as terrestrial indicators for estuarine and marine waters, in: Biological, Biochemical and Biomedical Aspects of Actinomycetes (L. Ortiz-Ortiz, L. F. Bojalil, and V. Yakoleff, eds.) / R. W. Attwell, and R. R. Colwell // Academic Press. - London. 1984. - p. 453-372. 22. Aunstrup, H. et al. Proteases from alkaliphilic Bacillus species, in: Fermentation Technology Today (G. Те-mi, ed.) / H. Aunstrup, O. Andersen and C. Dambmann // Society of Fermentation Technology. - Osaka. - 1972. - p. 299-306. 23. Bonde, G. I. Bacillus from marine habitats: Allocation to phena established by numerical techniques, in: The Aerobic Endospore-Forming Bacteria: Classification and Identification (R. C. W. Berkeley and M. Goodfellow, eds.) / G. I. Bonde // Academic Press. - London. - 1981. - p. 181-215. 24. Breznak, J. A. Intestinal microbiota of termites and other xylophagus insects / J. A. Breznak // Annu. Rev. Microbiol. - 1982. - № 36. - р. 323-343. 25. Bucher, G. E. Identification of bacteria found in insects, in: Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980 (H. D. Burgess, ed.) / G. E. Bucher // Academic Press. - London. - 1981. - p. 7-34. 26. Bulla, Jr. et al. Biology of Bacillus popilliae / Jr. Bulla, L. A. Costilow and E. S. Sharpe // Adv. Appl. Microbiol. - 1978. - № 23. - р. 1-18. 27. Cohn, F. Untersuchungen uber Bacterien, IV / F. Cohn // Beitrage zur Biologie der Bacillen, Beitr. Biol. Pflanz. - 1876. - № 2. - р. 249-277. 62 28. Cross, Т. Aquatic actinomycetes: A critical survey of the occurrence, growth and role of actinomycetes in aquatic habitats / Т. Cross // J. Appl. Bacteriol. 1981. - № 50. - р. 597-424. 29. Dixon, T.C. et al. Anthrax / T.C. Dixon, M. Meselson, J. Guillemin, P.C. Hanna // N. Engl. J. Med. - 1999. - vol. 141, № 11. - p. 815-826. 30. Erlich, F. G. Geomicrobial Interactions with Silicon / F. G. Erlich // Gem. Geol. - 1996. - vol. 132. - p. 217-239. 31. Freese, E. et al. Commitment to sporulation and induction of glucosephosphoenolpyruvate-transferase / E. Freese, W. Krofat and E. Galliers // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - № 222. - р. 265-289. 32. Friedlander, A. M. Clinical aspects, diagnosis and treatment of anthrax / A. M. Friedlander // J. Appl. Microbiol. - 1999. - vol. 87, № 2. - p. 303. 33. Giam, C. S. Phthalic Acid Esters / C. S. Giam, E. Atlas, M. A. Powers, J. E. Leonard // The Handbook of Environmental Chemistry. O. Hutzinger (Ed.). Anthropogenic Compounds. Berlin: Springer-Verlag. - 1984. – vol. 3, Part C. - p. 67142. 34. Gibson, Т. and Gordon, R. E. Bacillus, in: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (R. E. Buchanan and N. E. Gibbons, eds.) / Т. Gibson and R. E. Gordon // Academic Press. - Baltimore. - 1974. - p. 529-560. 35. Gilbert, R. et al. Bacillus cereus and other Bacillus species: Their part in food poisoning and other clinical infections, in: The Aerobic Endospore-Forming Bacteria: Classification and Identification (R. С W. Berkeley and M. Goodfellow, eds.) / R. Gilbert, P. С. Turnbull, J. M. Parry and J. M. Kramer // Academic Press. - London. - 1981. - p. 207-314. 36. Goodfellow, M. et al. Delineation and description of microbial populations using numerical methods, in: Computer Assisted Bacterial Systematics (M. Goodfellow, D. Jones and F. G. Priest, eds.) / M. Goodfellow and С. Н. Dickinson // Academic Press. - Orlando. - 1985. - p. 166-226. 63 37. Hernstadt, C. et al. A new strain of Bacillus thuringiensis with activity against coleopteran insects / C. Hernstadt, G. C. Soares, E. R. Wilcox and D. L Edwards // BioTechnol. - 1986. - № 4. - р. 305-308. 38. Hoch, J. A. Initiation of bacterial development / J. A. Hoch // Current Opinion in Microbiology. - 1978. - № 1. - р. 170-174. 39. Human ingestion of Bacillus anthracis - contaminated meat Minnesota, August 2000. Centers for Disease Control and Prevention / Morb. Mortal. Weekly Rep. 2000. - vol. 49, № 36. - p. 813-816. 40. Jones, K. and Thomas, J. G. Nitrogen fixation by the rumen contents of sheep / K. Jones and J. G. Thomas // J. Gen. Microbiol. - 1974. - № 85. - р. 97-101. 41. Kanaly, R. et al. Biodegradation of High Molecular – Weight Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Bacteria / R. Kanaly, S. Harayama // J. Bacteriology. 2000. - vol. 182, № 8. - р. 2059-2067. 42. Kawamura, F. et al. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases / F. Kawamura and R. H. Doi // J. Bacteriol. 1984. - № 160. - р. 442-444. 43. Koch, R. Die Aetiologie der Milzbrandkrankheit / R. Koch // Вeitr. Biol. Pflanz. - 1876. - № 2. - р. 277-310. 44. Leighton, T. J. et al. The stability of messenger ribonucleic acid during sporulation in Bacillus subtilis / T. J. Leighton and R. H. Doi // J. Biol. Chem. 1971. № 246. - р. 3189-3195. 45. Logan, N. A. et al. Classification and identification of members of the genus Bacillus using API tests, in: The Aerobic Endospore-Forming Bacteria (R. С W. Berkeley and M. Goodfellow, eds.) / N. A. Logan and R. С. W. Berkeley // Academic Press. - London. - 1981. - p. 105-140. 46. Logan, N. A. et al. Distinction between emetic and other strains of Bacillus cereus using the API system and numerical methods / N. A. Logan, B. J. Capel, J. Melling and R. С. W. Berkeley // FEMS Microbiol. Lett. - 1979. - № 5. - р. 373375. 64 47. Milner, R. J. Identification of the Bacillus popilliae group of insect pathogens, in Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980 (H. D. Burgess, ed.) / R. J. Milner // Academic Press. - London. - 1981. - p. 45-60. 48. Nakamura, L. K. Bacillus amylolyticus sp. nov., nom. rev., Bacillus lautus sp. nov., nom. rev., Bacillus pabuli sp. nov., nom. rev. and Bacillus validus sp. nov., nom. rev. / L. K. Nakamura // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1984. - № 34. - р. 224-226. 49. Nicholson, W. L. Resistence of Bacillus Terrestrial and Extraterrestrial Environments / W. L. Nicholson, N. Munakata, G. Horneck, H. J. Melosh and P. Setlow // Microbiology and Molecular biology reviews. - 2000. - vol. 64, № 3. - р. 584-572. 50. Norris J. R. et al. The Genera Bacillus and Sporalactobacillus / J. R. Norris, R.C.W. Berkeley, N.A. Logan and A.G. O’Donnell // The Prokaryotes, Berlin: Springer-Verlag. - 1981. - Vol. 2. - р. 1711-1742. 51. Priest, F. G. et al. Numerical classification of the genus Bacillus / F. G. Priest, M. Goodfellow and C. A. Todd // J. Gen. Microbiol. - 1988. - № 134. - р. 1847-1882. 52. Williams, A. G. and Withers, S. E. Hemicellulose degrading enzymes synthesized by rumen bacteria / A. G. Williams and S. E. Withers // J. Appl. Bacteriol. - 1981. - № 51. - р. 375-385. 53. Williams, A. G. and Withers, S. E. Bacillus sp. in the rumen ecosystem. Hemicellulose depolymerases and glycoside hydrolases of Bacillus sp. and rumen isolates grown under anaerobic conditions / A. G. Williams and S. E. Withers // J. Appl. Bacteriol. - 1983. - № 55. - 283-292. 54. Wolf, J. and Sharp, R. J. Taxonomic and related aspects of thermophiles within the genus Bacillus, in: The Aerobic Endospore-Forming Bacteria: Classification and Identification (R. C. W. Berkeley and M. Goodfellow, eds.) / J. Wolf and R. J. Sharp // Academic Press. - London. - 1981. - p. 251-296. 55. Zobell, С. E. et al. A list of marine bacteria including descriptions of sixty new species / С. E. Zobell and R. C. Upham // Bull. Scripps. Inst. Oceanography, University of California. - 1944. - № 5. - р. 239-292. 65 56. Zhuang, W. Q. Bacillus naphtovorans sp. nov. from Oil - Contaminated Tropical Marine Sediments and its Role in Naphthalene Biodegradation / W. Q. Zhuang, J. H. Tay, A. M. Maszenan and S. T.-L. Tay // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2002. - № 1. - р. 356-370. 66
