Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГБОУ ВО Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия Кафедра «Микробиология, вирусология, биотехнология, радиобиология и безопасность жизнедеятельности» Реферат по дисциплине «Клиническая вирусология» на тему: «Папилломатоз собак» Выполнила: студентка 4 курса Ветеринарного факультета Группы 117а Ф.И.О.: Аверина Ксения Михайловна Проверил: Н. Новгород, 2022 г Содержание Введение ......................................................................................................................... 3 1. Общие сведения .......................................................................................................... 4 1.1 Морфология папилломавируса ...........................................................................................5 1.2 Устойчивость папилломавируса.........................................................................................8 2.Клиноко-эпизоотологические особенности папилломавируса ................................... 8 2.1 Источники и пути передачи папилломавирусной инфекции ..........................................8 2.2 Патогенез папилломавируса .............................................................................................10 2.3 Клиническая картина папилломатоза собак ....................................................................15 2.3.1 Латентная форма ........................................................................................................18 2.3.3 Переходноклеточные папилломы ........................................................................21 2.3.5 Множественные пигментированные бляшки ...........................................................23 2.3.6 Генитальная папиллома собак ...................................................................................24 2.3.7 Папиллома подушечек пальцев собак .......................................................................24 2.4 Патолоанатомические измениения ..................................................................................25 2.5 Гистологические изменения .............................................................................................26 3. Комплексная диагностика ........................................................................................ 28 3.1 Гистологическое исследование ........................................................................................29 3.2 Метод полимеразной цепной реакции .............................................................................30 3.3 Иммуногистохимические исследования..........................................................................31 3.4 Электронная микроскопия ................................................................................................32 3.5 Люминесцентная микроскопия ........................................................................................34 4. Иммунитет и средства профилактики ...................................................................... 36 5. Клиническая эффективность иммунотерапии папилломатоза собак ....................... 37 Заключение ................................................................................................................... 40 Список литературы ....................................................................................................... 42 2 Введение Папилломатоз ― заразное заболевание, которое вызывается ДНК-вирусом. Возбудитель провоцирует рост «бородавок» во рту, на коже или слизистой половых органов. Передается контактно, через предметы ухода, воду, еду. Длительное время сохраняется в окружающей среде. В организм проникает через слизистую, порезы и ссадины. Некоторые штаммы передаются половым путем. Инкубационный период длится от 1 до 3 месяцев. После внедрения в клетку, вирус папилломы меняет ДНК хозяина на свою. В результате клетка делится неправильно и разрастается в папиллому. Папиллома (лат. papillo — сосок; греч. -οma — окончание для опухолей) ― собирательное название доброкачественных образований на ножке или широком основании, которые вырастают из клеток кожи, пораженных вирусом рода Papillomaviridae. Могут быть одиночными, но чаще множественные. Телесного цвета или пигментированные. Появляются и исчезают спонтанно. Обычно имеют витиеватую форму и шероховатую поверхность. Если у собаки крепкий иммунитет, болезнь может протекать без клинических признаков. В случае снижения защитных функций — вирусы активно размножаются и вырастают папилломы. После выздоровления у собаки развивается пожизненный иммунитет, но только на тот тип вируса, которым она переболела. Для человека или других животных папилломатоз собак не опасен. Заболевания, обусловленные и ассоциированные вирусами, вызывающими папилломатоз, в последние годы привлекают внимание, что связано с постоянным ростом заболеваемости папилломавирусной инфекцией, разнообразной локализацией поражений и доказанной онкогенностью вируса. Папилломатоз животных имеет вирусную этиологию, для которого характерно формирование специфических поражений – опухолей, преимущественно папиллом на коже и слизистых оболочках. Массовое проявление папилломатоза связывают со многими факторами, в том числе иммунодефицитными состояниями, как первичного, так и вторичного характера. Наиболее подробно изучены вирусы папилломатоза человека, собак и крупного рогатого скота. Интенсивные исследования папилломавирусной инфекции проводятся в медицине, в ветеринарии эта проблема остается не разрешенной. Клиническое течение заболевания попрежнему не предсказуемо, механизмы инфицирования и особенно причины манифестного течения заболевания остаются неясными. Несмотря на практически повсеместное распространение вируса точных данных об инцидентности инфекции и уровне заболеваемости животных в Самарской области в доступных источниках информации не найдено. В настоящее время практически ничего не известно о морфологических изменениях в процессе дифференцировки клетки и последующей перестройки соединительнотканной структуры под воздействием вируса, участвующего, по сути, в «специфическом преобразовании» ангиогенеза соединительной ткани, формирующей папиллому. Отсутствует информация о патогномоничных морфологических критериях папилломавирусной инфекции у животных. Как правило, ветеринарные врачи при папилломавирусной инфекции используют тактику «ожидания» и самопроизвольного излечения животных от папилломатоза, не используя при этом никаких терапевтических 3 средств, что в дальнейшем увеличивает процент заболеваемости и проявления инфекции в виде характерной клинической картины, с множественными поражениями. Введение вакцин при вирусных инфекциях с лечебной целью в ветеринарии имеет ограниченное использование, что связано в первую очередь с развитием вирусемии, на фоне которой возникают поствакцинальные осложнения в виде поствакцинальных инфекций. Папилломатоз – одно из немногих заболеваний, при котором рекомендована аутовакцинотерапия, особенно при массовом проявлении инфекции в скотоводческих хозяйствах в виде диссеминированной инфекции, характеризующейся формированием множественных папиллом. Эффективность использования подобных вакцин не всегда вызывает клиническое выздоровление и, согласно литературным данным следует обращать внимание на инактивацию возбудителя для исключения возможности генерализации инфекционного при ее введении. Папилломавирусная инфекция в настоящее время одна из перспективных в отношении изучения механизмов вакцинотерапии, не только в ветеринарии, но и в медицине, причем в большинстве случаев это связано именно с терапевтическим направлением в онкологии. Эффективность используемых вакцин можно усилить путем повышения иммуногенности, что достигается различными способами, в том числе при одновременном введении неспецифических иммунотерапевтических препаратов, как самостоятельно, так и в составе биопрепаратов. 1. Общие сведения Паппилломатоз затрагивает жизнь не только животных, но по большей степени людей, так вирус папилломы человека (ВПЧ) являеется наиболее расспространенной инфекцией половых путей, вызывая у женщин рак шейки матки , от которого ежегодно умирает большое количество девушек. Раком шейки матки во всем мире страдают более 1,4 миллиона женщин. Это заболевание является второй по распространенности формой рака у женщин в возрасте 1545 лет и находится на третьем месте среди ведущих причин смерти от рака у женщин, уступая лишь раку груди и раку легких. Наиболее высокая смертность наблюдается в развивающихся странах. У женщин, не проходящих регулярных скрининговых обследований, рак шейки матки может стать незаметным убийцей, так как заболевание часто развивается в течение многих лет без очевидных симптомов. К моменту появления симптомов заболевание часто находится уже на запущенной стадии. Рак шейки матки вызывает вирус папилломы человека (ВПЧ), который передается при половых контактах. К сожалению, презервативы не позволяют полностью защитить женщину от инфекции HPV, так как распространение вируса не обязательно связано с полноценным половым актом, а может возникать даже при кожном контакте в области гениталий. 4 Существует около 100 известных типов ВПЧ, но только 15 из них могут приводить к возникновению рака шейки матки. В совокупности четыре типа вируса, вызывающих развитие рака (16, 18, 45 и 31), являются наиболее распространенными, являясь причиной более чем 80 процентов всех случаев рака шейки матки в мире . HPV 16, 18 и 45 особенно опасны, так как они связаны практически с 90% случаев развития аденокарциномы, очень агрессивной формы рака шейки матки. ВПЧ широко распространен: по оценкам, до 80 процентов женщин в течение жизни заражаются вирусом ВПЧ и до 50% из них заражаются формами вируса, вызывающими развитие рака. К счастью, в большинстве случаев инфекция спонтанно разрешается, однако при хронической инфекции риск развития рака шейки матки резко возрастает. Персистирующая инфекция вызывающего рак вируса приводит к аномальным предраковым изменениям клеток шейки матки, которые со временем могут превратиться в раковые клетки. Лечение вируса HPV представляет трудности, так как естественный иммунный ответ после перенесенной инфекции может быть недостаточным для защиты от инфицирования в последствии. Кроме того, с возрастом иммунитет снижается, инфекции становятся более склонными к персистенции и, таким образом, к прогрессированию до рака. 1.1 Морфология папилломавируса Современная универсальная система классификации вирусов использует иерархические уровни (таксоны), соответствующие порядку, семейству, роду и виду. Первоначально вирус папилломатоза относился к семейству Papovaviridae (от греч. pa – папиллома, po – полиома, va – вакуолизирующий вирус), объединившего два рода: Papillomavirus (papilla – сосок, oma – опухоль) и Polyomavirus (poly – много, oma – опухоль). Семейство Papovaviridae объединяло папилломавирусы, полиомавирусы и агент SV40. Отличительная особенность папилломавирусов - тканевая специфичность. На сегодня выделено 5 типов собачьего папилломавируса и до 8 типов кошачьего папилломавируса, каждый имеет различные клинические признаки и места локализации. У собак - (COPV, CPV2, CPV3, CPV4, CfPV-2). Аббревиатура COPV означает Canine oral papillomavirus (вирус папилломы ротовой полости собак), а CfPV-2 - как Canis familiaris papillomavirus type 2 (папилломивирус собак 2-го типа). С 1 января 2002 года по решению Международного комитета по таксономии вирусов (МКТВ) семейство Papillomaviridae приобрело статус самостоятельного. На сегодняшний день идентифицировано более 300 новых папилломавирусов, еще не вошедших в 5 таксономию. Изоляты папилломавируса традиционно описываются как «типы». Типы папилломавируса были обнаружены у всех тщательно обследованных млекопитающих и птиц, за возможным исключением лабораторных мышей. Вирусы папилломатоза представляют собой мелкие, ДНК- содержащие вирионы, проявляющие тропизм к коже и слизистым оболочкам. Вирусные частицы имеют сходную безоболочечную икосаэдрическую структуру. Геном папилломавирусов представлен кольцевой двухцепочечной ДНК. Несмотря на небольшие размеры вирусов, около 50-60 нм, их молекулярная биология очень сложна. Есть также убедительные доказательства того, что геномы вируса очень статичны, а изменения последовательности в виде мутаций или рекомбинаций являются очень редкими событиями. В геноме папилломавирусов выделяют несколько основных участков: некодирующий регуляторный участок (upstream regulatory region, URR), участок, кодирующий ранние гены E1 – E5 (E – early genes), и участок, кодирующий поздние гены L1 и L2 (L – late genes). Рамки считывания в вирусном геноме разделяют на ранние и поздние в зависимости от времени начала экспрессии в период нормального вирусного цикла. Гены, кодирующие ранние белки: Е1, Е2, Е4, Е5, Е6 и Е7 (Е3 не экспрессируется, псевдоген) – это неструктурные белки (не входят в состав вириона), задей- ствованные в вирусной репликации и онкогенезе. Ранние гены E1 и E2 вовлечены в контроль вирусной репликации. E1 кодирует вирусоспецифическую ДНК-хеликазу, необходимую для вирусной репликации. E2, который может связываться как с вирусной, так и с клеточной ДНК, является ключевым регулятором вирусной транскрипции и репликации, а также гарантирует правильное распределение вирусных геномов в каждую из дочерних клеток во время деления. Продукт гена E5 обеспечивает механизмы иммунной эвазии и оптимизации эффективности амплификации генома. E6 и E7 являются вирусными онкобелками и играют ключевую роль в период нормального продуктивного вирусного цикла в инфицированном эпителии. Гены Е6 и Е7 всегда обнаруживаются в опухолевых клеткаx. Белок E4 играет важную роль в созревании вирусных частиц и высвобождении вируса с поверхности эпителия. Поздние гены L1 и L2 кодируют структурные белки вириона. Другие фрагменты вирусного генома не выявляются, так как могут быть утеряны в процессе его длительной репликации. Идентифицировано и введено в таксономию более 140 различных его типов, 75 из них молекулярно клонированы и полностью секвенированы. Типирование вирусов папилломатоза основано на ДНК-гомологии. Они классифицируются в соответствии с последовательностью нуклеотидов в ДНК, где каждый тип более чем на 10% отличается от ближайшего генетического родственника. Все вирусы папилломатоза имеют нумерологическую классификацию или типизацию, т.е. типы вирусов папилломатоза 6 пронумерованы в порядке иден- тификации. Классификация вирусов папилломатоза до настоящего времени считается незаконченной и часть изолятов папилломавирусов остаётся неклассифицированной. Полноценный вирион состоит из сердцевины и капсида. В неочищенных препаратах возбудителя наряду с ними обнаруживают сферические вирионы без сердцевины («пустые»), а так же частицы меньшего диаметра или имеющие трубчатую форму. Их образование связано с нарушениями процесса сборки вирионов. В состав вириона папилломавируса углеводы и липиды не входят. Очень небольшую часть вириона составляют внутренние (связанные с ДНК) структурные протеины, имеющие клеточную природу (они не кодируются вирусным геномом). Рис 1. Электронная микроскопия и компьютерная модель Рис 2. Строение папилломавируса 7 Рис 3. Трехмерная модель вируса папилломы собаки 1.2 Устойчивость папилломавируса Папилломавирусы характеризуются достаточно высокой устойчивостью во внешней среде, термостабильностью, устойчивостью к эфиру, хлороформу, детергентам, низким значениям pH и ультрафиолетовому облучению, инактивируются при рентгеновском облучении. Вирус устойчив к растворителям жиров, в т.ч. эфиру. При 58°С он разрушается за 30 мин, при 45°С – в течение 1 ч. В глицерине и лиофилизированном виде может сохраняться годами. В естественных условиях также устойчив к высушиванию и низким температурам. Получают вирус путем измельчения папиллом гомогенизацией с последующим дифференциальным ультрацентрифугированием при 25000 об/мин. Папилломавирусы устойчивы к воздействию внешних факторов и поэтому обладают возможностями для длительного сохранения в водной среде. 2.Клиноко-эпизоотологические особенности папилломавируса 2.1 Источники и пути передачи папилломавирусной инфекции Вирусный папилломатоз распространен среди многих видов млекопитающих. Источник возбудителя — больные животные. Способ распространения – контактный. Чаще всего вирусы передаются при совместном содержании больных животных со здоровыми. Известны многочисленные наблюдения, когда вскоре после появления в питомниках папилломатозного щенка, папилломы начинали развиваться и у других щенят. Обычно вирус проникает в организм через скарифицированные кожу и слизистые оболочки. Возможен перенос возбудителя иглами для инъекций, через одежду и обувь хозяина, предметы ухода за животными, аппорты на площадках для выгула и т. п. Инкубационный период 1–2 месяца. 8 Рис. 4 Пути передачи папилловирусной инфекции Папилломавирусы тропны к эпителию слизистых оболочек и кожи, индуцируя в них развитие доброкачественных новообразований – папиллом и бородавок, соответственно. Как правило, попав в трещину на слизистой оболочке ротовой полости, папилломавирусы сначала проникают в интенсивно размножающиеся клетки базального слоя, из которых в дальнейшем попадают в поверхностный эпителий. Ранние белки вирусов вызывают трансформацию зараженных клеток, которые приобретают способность к бесконечному делению и поддержанию интенсивной репродукции вирусных частиц. После трансформации эпителиальных клеток на слизистой оболочке ротовой полости (губ, языка, щек, десен) развиваются сосочковидные новообразования – папилломы. Лизис зараженных клеток способствует дальнейшему распространению вирионов, однако интегрированный вирусный геном содержат не все опухолевые клетки. Активизация интегрированного генома и переход инфекции из латентной формы в продуктивную наблюдается при старении, стрессах и различных формах иммуносупрессии, например, после химиотерапии или лечения кортикостероидными препаратами. Вирионы папилломатоза передаются при контакте с больным животным. Это особенно характерно для питомников, где все собаки содержатся в ограниченном пространстве. Домашний питомец может получить вирус через нестерильные иглы при инъекции, на площадках массового выгула собак, через общие предметы ухода. У большинства собак вирус присутствует в организме, но не проявляет себя. Выход из латентного состояния может спровоцировать сильный стресс, ослабление иммунитета после приема сильнодействующих лекарств. Кроме того, собачий папилломавирус обладает очень высокой жизнестойкостью и способен длительное время сохраняться на поверхностях. В частности, установлено, что при комнатной температуре на предметах, с которыми контактировало больное животное, спустя трое суток остаются живыми и способными вызвать заражение не менее половины оставленных носителем вирусов, а около 30% от первоначального числе патогенов не 9 погибают даже через неделю. Более того, даже обработка антисептиком, содержащим 75% этанола, убивает не более 16% вирусов, а при использовании чистого спирта (95%) увеличивает этот показатель всего до 86%, т.е. не даёт гарантированной защиты. 2.2 Патогенез папилломавируса На молекулярном и клеточном уровнях вирусы ведут себя совершенно иначе, в отличие от бактерий и простейших. В своем формировании представлений о вирусах схема описания идет от описания морфофизиологических особенностей к оценке индивидуальных. Существует значительное разнообразие типов взаимодействия между вирусом и клеткой, причем исход взаимодействия определяется генетическими характеристиками вируса и клетки. Особенности взаимодействия делятся на три основных типа: а) продуктивная инфекция – разрушение клеток, вызываемое цитоцидными вирусами; б) персистентная инфекция, при которой разрушение клеток не происходит, а вирус можно выделить с помощью генетических методов в) интегративная (онкогенная) инфекция, вследствие которой происходит трансформация пораженных клеток. Подобный тип взаимодействия в настоящее время соединяет некоторые инфекционные болезни с онкологическими. Рис.5 Патогенез папилломавирусов Папилломавирусы проявляют тропизм к эпителию слизистых оболочек и кожи, т.е. обладают высокой тканевой специфичностью в отношении хозяина (тканеспецифичны), индуцируя в них развитие доброкачественных опухолей – папиллом, после проникновения через травмы кожи и слизистой оболочки. Таким образом, в основе патогенеза папилломатоза лежит атипичный рост эпителия, который врастает в основу кожи, с последующей пролиферацией ее клеточных элементов. Подкожный слой никогда не вовлекается в процесс. Вирусы рода Papillomaviridae способны также с помощью бесклеточных фильтратов вызывать соответ- ствующие специфические поражения у соответствующих видов животных и человека. 10 Не все клетки эпидермиса чувствительны к заражению вирусом. Он проникает лишь в те клетки, которые имеют на поверхностной мембране нужные ему рецепторы, т.е. особые молекулы, связывающие частицы вируса. Возбудитель проникает через травмы кожи и слизистой оболочки, так как инфицированными могут быть только недифференцированные клетки, так как все этапы репродукции тесно связаны со степенью дифференциации клеток. Как установлено, вирус способен инфицировать только клетки базального слоя эпителия. При дифференцировке эпителиальных клеток происходит репликация ДНК. Воздействие кислых клеточных ферментов на вирус, проникший в клетки базального слоя эпителия, не только инактивирует его, а повышает его вирулентность. Это связано с тем, что протеолитические ферменты разрушают дисульфидные связи капсомеров вирионов, обеспечивая его «раздевание», т.е. высвобождение инфекционной ДНК. По мере развития и роста клеток базального слоя и перехода его в клетки верхних слоёв эпителия, вирус одновременно проходит все стадии репродукции, продвигаясь при этом в обратном направлении к периферии. Повреждения, захватывающие дерму, сопряжены с разрывом лимфатических сосудов и, следовательно, с возможностью распространения инфекции по лимфатическим путям. В распространении вируса от одной части дермы к другой и от дермы к эпидермису важную роль играют макрофаги. На их подвижность может влиять состояние организма, зависящее от ряда физиологических факторов, в особенности гормональных. Особого внимания заслуживает тот факт, что последовательности вируса папиллом могут быть обнаружены в здоровых тканях. Какова значимость этого факта, сказать трудно, но не исключено, что во многих нормальных клетках, где геном вируса может персистировать, он находится под строгим негативным контролем со стороны клеточных генов и фактически не функционирует. Принципиальная особенность вирусов данного семейства заключается в интеграции (слиянии) вирусного и клеточного геномов, с последующим наследственным изменением клетки. Для интеграции с геномом клетки необходимо наличие кольцевой формы двухцепочечной ДНК-вируса, что характерно для данного семейства. Геном в кольцевой форме прикрепляется к клеточной ДНК в месте гомологии нуклеотидных последовательностей и встраивается в определенный участок хромосомы при участии ряда ферментов (рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз). Замкнутая двухцепочечная ДНК обладает множеством характерных свойств: она стабильна, не способна к редупликации, но, возможно, обуславливает синтез отдельных посредников, необходимых для интеграции ее с клеточным геномом. В настоящее время получены доказательства сохранения генетической информации ДНК-содержащего вируса в трансформированной клетке при отсутствии образования полного вируса. Онкогенный тип взаимодействия отличается вариабельностью. Индуцированная вирусом трансформация клетки может быть как стабильной, так и обратимой. Наследуемой трансформации подвержена, как правило, сравнительно небольшая часть клеток. Обе формы индуцируются вирусным генетическим материалом, однако, как предполагают, трансформирующийся вирусный геном может находиться в клетке либо в интеграции с ее хромосомным аппаратом, либо в свободном состоянии. Онкогенные возможности вируса зависят от наличия в его геноме трансформированных генов, которые кодируют онкопротеины, индуцируя тем самым иммортализацию и пролиферацию кератиноцитов. 11 По мере формирования папиллом вирус взаимодействует с клеткой, как по продуктивному, так и по интегративному типу. Интегративная форма не приводит к гибели клетки. Интегративный тип взаимодействия характеризуется встраиванием вирусного генома в геном клетки, и геном вируса функционирует как составная часть клетки . У ДНКсодержащих вирусов интеграция обеспечивается ковалентной встройкой генома в геном поражаемой клетки и в определенном участке хромосомы происходит фиксация кольцевой вирусной ДНК. При этом клетка приобретает опухолевые свойства, но сохраняет свои нормальные функции, и при ее делении вирусные последовательности переходят в геном дочерних клеток. Трансформированные клетки округляются, делятся, нарушается процесс контактной ингибиции, в результате чего деление клеток не прекращается даже при контакте с другими клетками, то есть клетки приобретают способность к неограниченному делению, что не свойственно нормальным клеткам организма. У папилломавирусов интегративное взаимодействие с клеткой является альтернативой к продуктивной вирусной инфекции и интегрированный в хромосому геном может под влиянием разных воздействий «вырезаться», а свободная вирусная ДНК может начать обычный цикл репродукции. Это может произойти только в том случае, если в состоянии интеграции находился полноценный вирусный геном, что является характерным для вируса папилломатоза. Есть вероятность, что папилломы могут возникать из одной зараженной клетки базального эпителия. Клетки делятся, и клональные потомки исходной зараженной клетки образуют папиллому, последующее распространение вируса с вовлечением соседних базальных клеток, по-видимому, не происходит. Эти данные хорошо согласуются с отсутствием инфекционного вируса в глубоких слоях эпидермиса, т.к. вирусные антигены и созревающие вирионы обнаруживаются лишь в наружных кератинизированных клетках кожи. Отмечено, что определенная флюоресценция наблюдается в ядрах клеток внешних слоев папилломы. При сопоставлении фотографий идентичных областей, предварительно окрашенных гематоксилин-эозином и обработанных флуоресцирующими сыворотками, антиген вируса обнаруживался в ядрах поверхностных слоев. В некоторых случаях, флуоресценция ядер наблюдалась в более глубоких слоях шиповидного слоя, но никогда в нижних, представленных клетками соединительной ткани. Отсутствие специфической флуоресценции в базальных клетках объясняется пребыванием в них вируса в «маскированной форме». Долгое время не было объяснения, почему вирус обнаруживается не во всех инфицированных клетках. Объяснялось это тем, что при новообразованиях вирусного происхождения генетическая информация инфекционного агента включается в генетический аппарат клетки и становится частью ее наследственного аппарата. Эта интеграция двух геномов приводит к стойким наследственным изменениям клетки. При этом гены вируса несут наследственную информацию, осуществляющую трансформацию клетки. При каждом последующем делении клетки гены провируса также «размножаются», переходят в дочерние клетки и начинают действовать в кооперации с клеточными генами. Возможно, что вирусный геном в форме провируса присутствует в делящихся клетках глубоких слоев папилломы, а образование инфекционных зрелых вирионов происходит только тогда, когда клетки начинают кератинизироваться. Провирусная ДНК становится неотличимой от других клеточных генов и так же, как и гены реплицируется и распределяется в дочерние клетки. 12 Провирус – это внутриклеточная форма опухолеродного вируса, которая передается от родительской клетки дочерним при митозе и содержит информацию, необходимую для образования нового вируса и поддержания клетки в трансформированном состоянии. Дополнительная генетическая информации при вирогении сообщает клетке новые свойства, что, по сути, является причиной развития опухолевого процесса. Сохранение вирусной информации в виде провируса в составе клеточного генома и передача ее потомству лежит в основе персистенции вируса с развитием латентной инфекции в организме. Инфекция папилломатоза протекает в двух измерениях: пространстве и времени. В нормальных условиях роста эпителия фактор пространства определяется количеством слоев клеток, а время – интервалом, проходящим с момента деления клеток базального слоя до слущивания отмирающих ее потомков на поверхности эпителия. Чтобы получить максимальное потомство, вирус стремится изменить оба измерения: пространство – непосредственно за счет формирования новообразований, превосходящих по величине и слоистости нормальный эпителий, а время – косвенно, путем индукции митотической активности клеток. Таким образом, вирус провоцирует митотическую активность клеток тех слоёв эпителия, которые в норме её утрачивают. Происходит индуцирование гиперпластических доброкачественных изменений в эпителии кожи и слизистых оболочках. Это обуславливает формирование трансформированными клетками папиллом. Одно из наиболее характерных свойств трансформированных клеток – способность их к многослойному трехмерному хаотическому росту, в отличие от упорядоченного строения исходной ткани. Способность к хаотическому росту и размножению, т.е. отсутствие контактного торможения, свойственна и клонам, полученным от одной трансформированной клетки, что позволяет легко и с высокой степенью достоверности проводить количественный учет процесса трансформации. Отсутствие контактного торможения, обусловленное изменением свойства поверхности, характерное качество трансформированной вирусом клетки, наследственно закрепленное, связанное со свойствами каждой отдельной клетки, а не популяции в целом. Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой позволяет получить потомство и заканчивается образованием дочерних вирионов. Активизация, ведущая к переходу латентной формы на фоне интегративной в продуктивную, возможна при воздействии факторов, приводящих к снижению иммунитета. Продуктивная форма инфекции завершается двумя важнейшими событиями: образование дочерних вирионов и лизис инфицированной клетки. Прерывание данного цикла на первом этапе интеграции вирусного генома с клеточным приводит к латентной инфекции. В трансформированных клетках сборка дочерних вирионов не происходит, или она нарушена и приводит к образованию дефектных вирусных частиц. Продуктивная форма инфекции папилломатоза включает несколько этапов. 1. Проникновение генома вируса в ядро клетки. Знания об этом этапе весьма ограниченны и до сих пор не определены рецепторы, к которым прикрепляется вирус. Но характер вызываемой им инфекции указывает на то, что ими обладают только недифференцированные клетки базального слоя. В процессе дифференциации клеток эти рецепторы, по всей видимости, утрачиваются, а вместе с ними исчезает возможность заражения вирусом дифференцированных клеток. 2. Первичная транскрипция. Вирусная ДНК временно интегрирует с геномом, вслед за чем 13 начинается транскрипция. Это первый этап реализации генетической информации в клетке, в процессе которого кодируется белок. Данный этап характеризуется процессом синтеза РНК-катализируемой РНК-полимеразой, в котором в качестве матрицы используется одна из цепей ДНК вируса папилломатоза. Транскрипция мРНК ранних белков происходит под контролем ферментов инфицированной клетки. Синтез мРНК поздних белков начинается после образования дочерних ДНК и контролируется ранними вирусными белками. Деление на ранние и поздние вирусные белки основано на времени начала их синтеза – до или после начала репликации вирусной ДНК соответственно. 3. Трансляция ранних вирусных протеинов. Это второй этап передачи генетической информации в клетке, в процессе которого синтезируется белок. Экспрессия ранних вирусных протеинов усиливает синтетические процессы инфицированной клетки, нарушает процессы инфицированной клетки, нарушает течение нормального клеточного цикла, вызывает трансформацию. Последняя поддерживается до тех пор, пока синтезируются ранние белки. Структурные (поздние) вирусные протеины синтезируются на основе поздних вирусных мРНК после начала образования дочерних вирусных геномов. Синтезированные структурные протеины транспортируются в ядро, так как синтез протеинов папилломавируса происходит в цитоплазме, а сборка вирионов в ядре инфицированной клетки. 4. Репликация вирусной ДНК. Репликация ДНК вируса носит полуконсервативный характер – она протекает с участием клеточных ферментов (ДНК-полимеразы, метилазы и т.д.), а так же вирусной АТФ-зависимой ДНК-геликазы. При репликации ковалентно замкнутых кольцевых молекул ДНК следует ожидать образования сверхспиральных витков, ведущих к затруднению выстраивания на них комплементарных цепей дочерних ДНК. Для объяснения механизмов, которыми пользуются для избежания этого папилломавирусы, предложена модель «шарнира». Согласно ей в начале реплицирующего участка генома образуется временный шарнир, обеспечивающий вращение цепей ДНК относительно оси спирали. Являются ли этим шарниром специфические клеточные белки или цикличное разрезание и сшивание молекулы ДНК, осуществляемые ферментами эндонуклеазой и лигазой, соответственно, пока не ясно. По результатам детальных исследований популяций клеток, в которых наблюдается синтез вирусной ДНК уже в стадии развитой инфекции, а не при первичном инфицировании, клетки шиповато- го слоя эпидермиса при переходе в зернистый оказываются наиболее активными в синтезе вирусной ДНК. 5. Сборка и выход вирионов из клетки. Сборка вирионов протекает в ядре, где они появляются уже через 24 часа после заражения. При интенсивном процессе репродукции иногда происходит агрегация вирионов в кристаллические скопления. Накопление вирусных частиц, ДНК и белков ведет к дегенерации ядра и выходу вирионов в цитоплазму клеток. Обычно это происходит через 40-48 часов после заражения. Репликативная диссеминация внутри эпидермиса наступает только на конечной стадии дифференцировки в ороговевающем слое, где и наблюдается активная сборка зрелых вирусных частиц, их выделение из клеток и почкование прямо на поверхности кожи. Эти участки кожи инфекционно опасны в отношении контактного заражения. Впоследствии после репродукции вируса, его последующее выделение происходит из наружного ороговевшего слоя опухоли. Благодаря высокому сродству к клеточным мембранам вирионы находятся преимущественно не в свободном состоянии, а в комплексе 14 с ядерными и цитоплазматическими мембранами. Однако это не препятствует вновь образованным вирусным частицам вызывать заражение чувствительных клеток. Высвобождение вирусных частиц происходит в результате дегенерации десквамированных клеток. Лизис поверхностных клеток дочерними вирионами обеспечивает их попадание в окружающую среду и новый восприимчивый организм. В процессе патогенного воздействия вируса содержимое инфицированной клетки «выбрасывается» в межклеточное пространство вместе с вирусными частицами, которые попадают в макрофаги, проникают в дерму, сосуды капиллярного сплетения, являясь резервуаром папилломавирусной инфекции. Организм ограничивает распространение папилломавирусной инфекции гуморальными и клеточными иммунными ответами. Иммунитет обеспечивает в большинстве случаев регресс, исчезновение новообразований и продолжительную защиту от рецидивов. Папилломавирусы в стратегии своей репродукции стремятся достичь оптимального баланса между интенсивностью образования дочерних вирионов и необходимостью ограничивать экспрессию своих белков, чтобы избежать воздействия иммунной системы организма. Экспрессия поздних белков в базальном слое эпителия дает возможность папилломавирусам дать значительно большее количество вирионов, чем, например, папилломавирусам, передающимся половым путем, и поэтому не нуждающимся в высокой кратности репродукции. У животных с иммунодефицитами заболевание протекает тяжелее и может принимать диссеминированный характер. В таких случаях новообразования длительно не исчезают и могут появляться даже при интенсивной терапии. Таким образом, последовательное размножение вируса папилломатоза в отдельных слоях эпидермиса, с окончательным почкованием в отживающих клетках ороговевающего слоя, представляет собой особый случай тесного сопряжения жизненного цикла вируса с физиологическим процессом дифференцировки и смены эпителиальных клеточных элементов эпидермиса или слизистых оболочек соответствующей локализации. Доказано, что вирус папилломатоза способен трансформировать не только эпителиальные, но и соединительнотканные клетки, при этом выделить вирус из элементов соединительной ткани не всегда удается. Процесс трансформации in vivo и in vitro для ДНК- содержащих онкогенных вирусов семейства Papillomaviridae проходит ряд стадий. Изучение этого процесса долгое время было затруднительным и достаточно достоверные результаты получены для вирусов папилломы Шоупа. 2.3 Клиническая картина папилломатоза собак Первые проявления вируса регистрируются у собак не старше 4 лет. Папилломы развиваются на губах, а при отсутствии лечения распространяются по всей полости рта. В редких случаях возможно появление опухолей в глотке. В начальной стадии развития папулы имеют гладкую ровную поверхность розового цвета и округлую форму. Со временем патологически измененные клетки разрастаются, образуя большие неровные «бородавки». Дальнейшее развитие болезни характеризуется появлением одиночных папиллом на веках, конъюнктиве глаза и на коже собаки. В клинической практике зафиксированы случаи поражения слизистой пищевода и кожи вокруг носа. 15 При множественных высыпаниях во рту собаке больно жевать и пить. Владелец может заметить следы крови на пище, отказ пса от твердой еды, потерю веса. Когда папилломы достигают внушительных размеров, собаке трудно сомкнуть челюсти, новообразования постоянно травмируются и становятся воротами для проникновения новых вторичных инфекций. Часто папилломатоз осложняется присоединением бактерий и грибков (кандидамикоз). Папиллома у собаки на лапе мешает ей двигаться. В этом случае животное старается не опираться на конечность и заметно прихрамывает, так как испытывает болевые ощущения. Стоит обратить внимание на то, что на опухолях не растёт шерсть. У старых и ослабленных животных папилломы способны перерождаться в чешуйчато-клеточную карциному – злокачественное новообразование. Инкубационный период составляет 1-3 месяца. Для вирусов характерен медленный цикл развития, поэтому инфекция, как правило, протекает хронически. Точная продолжительность инкубационного периода не определена – предположительно от нескольких недель до нескольких месяцев. Инкубационный период при искусственном заражении составляет от 3 до 8 недель. Длительный инкубационный период при папилломатозе обусловлен также медленным размножением вируса и трансформацией клеток или, возможно, медленным ростом клона трансформированных клеток. В естественных условиях заболевание телят проявляется через 3-4 месяца при их совместном содержании с больными животными. Течение болезни хроническое. Основным клиническим признаком папилломатоза является формирование папиллом, структура которых зависит от таксономической принадлежности вируса и вида инфицированного животного. Папилломы различаются по форме, плотности, величине. В зависимости от локализации различают кожные (papilloma corneum) и слизистые (papilloma mucosum) папилломы. Полагают, что разнообразные поражения на коже и слизистых оболочках вызываются различными папилломавирусами. Клиническая диагностика при папилломатозе не вызывает сомнений и является основанием для постановки окончательного диагноза. Первым признаком инфекционной болезни является утолщение кожи в различных участках туловища. Затем через 4-5 дней, возникают единичные бугорки-папилломы, вначале небольшого размера, склонные к увеличению, при этом общее состояние животных не ухудшается. Папилломы имеют вид бородавчатых или сосочковых разрастаний различной формы – плоских бугристых, в форме цветной капусты, висящих на ножке, нитевидных. Папилломы так же бывают твердые и мягкие, единичные и множественные. Для новообразования характерна форма кустиков, выступов, деревца. Твердая папиллома, или бородавка (verruca), встречается на коже головы, шеи, губ, вымени или на слизистых оболочках ротовой полости, желудка, кишечных, дыхательных или мочеполовых путей. Ее величина от мелкой горошины до 15-20 см. Может ороговевать, трескаться и кровоточить. Мягкая папиллома (кондилома, полип) развивается главным образом на слизистых оболочках, имеет мягкую, рыхлую консистенцию, богата сосудами, может изъязвляться, давать кровотечение. У собак папилломавирус индуцирует образование одиночных или множественных фибропапиллом или диспластических разрас- таний, обычно более 1 см в диаметре, на любых участках тела. Папилломы локализуются на конъюнктиве, в области ноздрей. 16 Выделяют так же оральный папилломатоз, в этом случае папилломы обнаруживаются в ротовой полости. В подавляющем большинстве случаев заболевание проявляется возникновением мелких папиллом, которые в результате разрастания со временем по внешнему виду начинают напоминать цветную капусту. Экзофитные папилломы кожи собак обычно единичные, приподнятые, имеющие форму сосочков, растущие от зауженного основания. Чаще папилломы локализуются на губах, постепенно распространяясь по языку, деснам, слизистой оболочке щек, а иногда по гортани и глотке. Отмечается усиленное отделение слюны, нарушается прием корма. Наблюдается травмирование папиллом зубами, кровоизлияния. Папилломы также встречаются на коже собак в различных частях тела, но чаще на голове, спине и конечностей. Результатом этого может стать кровотечение, а в более отдаленный период – интенсивное разрастание поврежденной опухоли. Имеются наблюдения относительно того, что в таких случаях через некоторое время у животного в других местах появляются новые папилломы. У старых собак папилломатоз сопровождается большим количеством папиллом не только в ротовой полости, но и на коже. В этом случае папилломавирус вызывает развитие единичных или множественных образований на конъюнктиве и веках. В зависимости от расположения и размера папилломы могут не вызывать у животного дискомфорта, либо становятся причиной слезотечения, заворота век и нарушения зрения различной тяжести. Папилломатоз собак чаще регистрируется в собачьих питомниках. Данных о восприимчивости других животных к вирусу папилломатоза собак нет. Количество папиллом может достигать несколько десятков, особенно при иммунодефицитных состояниях, вызванных демодекозом и заболеваниями другой этиологии, а так же при лечении собак кортикостероидными препаратами. Инвертированная папиллома растет в виде эндофитной массы шириной 1-2 см и распространяются внутрь воронкообразного углубления. Папилломы мочеполового тракта у собак относятся к кондиломам и вызываются венерическим папилломавирусом. У собак описаны случаи развития эзофагитов папилломавирусного происхождения, вследствие проникновении возбудителя в подслизистый слой, после повреждений, вызванных проглатыванием едких веществ (кислот, щелочей, разъедающих препаратов) или инородных тел, а так же после анестезии, эндоскопии или введения носо-пищеводных зондов. Эпидермальный невус, вызванный отличным от вируса папилломатоза собак, клинически проявляется появлением на коже живота, реже других частей тела, многочисленных, имеющих черную пигментацию округлых папул. В детально описанном случае заболевания, возникшем на фоне длительного применения кортикостероидных препаратов, отмена последних повлекла за собой спонтанное выздоровление животного в течение трех месяцев. Таким образом, следует отметить преимущественную локализацию папиллом на открытых участках кожи и слизистых оболочках, подверженных травмированию. Но некоторые авторы считают, что ротовая полость, слизистая оболочка глаз и кожа не являются местами, где папилломавирус может индуцировать развитие новообразований. Скорее всего, такая локализация считается наиболее типичной, поскольку в этом случае папилломы доступны для визуального осмотра, и появление на них новообразований 17 бросается в глаза владельцам животных и ветеринарным специалистам. Считается, что вирус не вызывает поражений половых органов, тем не менее папилломы довольно часто, хотя и случайным образом, при проведении хирургических операций или постмортально, обнаруживают в мочевом тракте. 2.3.1 Латентная форма Для большинства видов Papillomaviridae характерен длительный латентный период. У собак он может длиться от месяца до двух. За это время носитель, проникнув через рану или микротрещину в нижние слои эпидермиса, пробирается сначала в базальный слой кожи, а оттуда — в ядро клетки, вызывая её необратимую трансформацию. Благодаря тому, что базальным клеткам свойственно интенсивное размножение, происходит массовое создание заражённых вирусом клонов, которые, в свою очередь, начинают бесконтрольно делиться благодаря воздействию на них патогенного влияния паразита. Если иммунитет у собаки ослаблен в силу возрастных изменений или других негативных факторов, интегрированный геном папилломавируса активизируется, клонированные клетки попадают в поверхностный эпителий и, за счёт продолжения постоянного репродуцирования, создают сосочковидные бляшки. Таким образом, инфекция переходит из латентной формы в открытую. Таким образом, понять, что в организме собаки присутствует Papillomaviridae, без специальных анализов можно только в том случае, если носитель проявил себя клиническими признаками — папилломами на слизистых оболочках (прежде всего в ротовой полости) или бородавками на коже. 2.3.2 Оральный папилломатоз собак Папилломы полости рта, вызванные CPV-1 (ранее вирусом папилломы полости рта собак) и, возможно, CPV-13, являются наиболее распространенным заболеванием собак, вызванным вирусом папилломы. Пораженные собаки, как правило, молоды и имеют множественные экзофитные поражения полости рта. Бородавки обычно сначала развиваются на губах, но могут распространяться на слизистую оболочку щек, язык, небо и глотку. Папилломы полости рта, вызванные CPV-1 (ранее называвшиеся собачьим оральным PV), часто встречаются у молодых собак. Эпидемиология заражения CPV-1 плохо изучена. Имеются отдельные сообщения о вспышках папилломатоза полости рта у собак, что позволяет предположить, что заболевание может быть приобретено при контакте с больными собаками. Однако, поскольку собаки обычно инфицируются CPV-1 непреднамеренно, избегания собак с папилломами может быть недостаточно для предотвращения заболевания . Развитие папилломатоза полости рта приводит к выработке антител, которые предотвращают новые инфекции, вызванные CPV-1. Тем не менее, вполне вероятно, что некоторые собаки остаются явно инфицированными CPV-1 после разрешения начальных папиллом . Сообщения о папилломатозе у собак старшего возраста с ослабленным иммунитетом согласуются с реактивацией врожденной инфекции . Папилломатоз полости рта проявляется в виде множественных экзофитных вегетативных бородавок, поражающих губы и полость рта. У большинства собак нет никаких системных 18 признаков заболевания, хотя есть редкие сообщения о обширном заболевании, которое мешает приему пищи или дыханию. Гистопатология выявляет экзофитную массу, состоящую из утолщенного складчатого эпителия, часто с многочисленными изменениями клеток, вызванными PV. Рис. 6 Папиллома на внешней поверхности языка у собаки Рис.7 Папиллома на губе у собаки Рис.8 Папиллома на губе у собаки 19 По мере прогрессирования заболевания папилломы появляются на небе, слизистой глотки, на носу. Изначально папулы имеют светло-розовый цвет, гладкую структуру, а затем постепенно количество поражений увеличивается, происходит постепенное неровное разрастание слизистой оболочки, новообразования по внешнему виду и структуре напоминают цветную капусту (Рис.9). Рис.9 Множественные папилломы ротовой полости Количество папиллом постоянно увеличивается, и они покрывают полностью щеки, десна, внешнюю и внутреннюю поверхность языка (Рис.10) . Рис.10 Множественные папилломы ротовой полости у семимесячного веймаранера 20 Папилломы вызывают дискомфорт, в особенности при поедании корма (Рис.11). Рис.11 Множественные папилломы на губах у молодой собаки У больных особей отмечают незначительное повышение температуры, обильное слюноотделение (гиперсаливацию), отказ от корма, незначительные кровотечения в ротовой полости, которые являются «воротами» для проникновения в организм бактерий и вирусов, также возможны приступы рвоты. Животные становятся вялыми, снижается активность, быстро устают. 2.3.3 Переходноклеточные папилломы Наиболее часто встречаются у молодых собак (от 8 мес. до 3 лет). Они проявляются как самоограничивающееся заболевание с поражениями, которые наиболее часто обнаруживаются на вентральной поверхности живота и подмышечной зоне. Поражения единичные или множественные,1-2 см в диаметре, округлые, возвышенные с центральным углублением (Рис.12). Новообразования единичные или множественные, 1-2 см в диаметре, круглые, приподнятые массы (чашеобразные) с центральным вдавлением. Вероятная породная предрасположенность отмечена у биглей, кокера спаниеля, дога, ирландского сеттера, кери блю терьера и виппета. Рис.12 Множественные папилломы на животе у собаки 21 2.3.4 Кожные (экзофитные) папилломы собак Они наиболее часто встречаются у возрастных собак. Могут быть предрасположены кокер-спаниели и керри-блю-терьеры. Поражения захватывают обычно голову, веки и ступни лап. Папилломы представляют собой одиночные или множественные, телесного цвета или пигментированные, имеющие ножки, бесшерстные, гладкие или листовидные массы, которые обычно меньше 0,5 см в диаметре (Рис.13,14,15). Рис.13 Папиллома на голове у собаки Поражения чаще единичные (изредка множественные), характерная локализация– голова, веки и конечности. Внешне, образования менее 0,5 см в диаметре, на ножке, гладкие или дольками, от обесцвеченных до гиперпигментированных. Отмечена предрасположенность у животных пожилого возраста, с породной предрасположенностью у кокер спаниелей и кери блю терьера. Рис.14 Папиллома на нижнем веке у собаки Распространённость относительно небольшая. Бородавки обычно располагаются на голове, животе, в паховой или подмышечной области, на пальцах лап. Представляют собой небольшие твёрдые образования, покрытые кожей. Иногда шероховатые, с порами или 22 небольшим отверстием посередине. Породную предрасположенность отмечают у кериблю-терьеров, кокер-спаниелей. Рис.15 Папиллома на лапе у собаки 2.3.5 Множественные пигментированные бляшки Они наиболее часто встречаются у молодых миниатюрных шнауцеров и мопсов; они, возможно, являются врожденными, наследуясь по аутосомно доминантному пути. Они выглядят как непрогрессирующие поражения, которые находятся на нижней части туловища и медиальных поверхностях бедер (Рис.16). Поражения начинаются как пигментированные макулы и бляшки, которые прогрессируют до чешуйчатых и гиперкератотических плоских масс. Некоторые поражения могут подвергаться злокачественной трансформации в сквамозно-клеточные карциномы. Рис.16 Большая папилломавирусная бляшка на латеральной части грудной клетки у взрослой немецкой овчарки 23 2.3.6 Генитальная папиллома собак Это нечасто сообщаемая и неполностью описанная венерическая форма папилломавирусной инфекции. Поражения выглядят как возвышенные папилломатозные бляшки на пенисе или слизистой вагины. Рис. 17 Паппиллома в области препуция собаки 2.3.7 Папиллома подушечек пальцев собак Это нечасто сообщаемое заболевание взрослых собак. Не полностью доказано, что оно имеет вирусную причину. Поражения являются твердыми, кератотическими массами на нескольких подушечках пальцев. Межпальцевые поражения описаны у грейхаундов. Может встречаться хромота и вторичная бактериальная инфекция. Рис. 18 Две вирусные папилломы на подушечке лапы у собаки Достаточно редкая форма поражения молодых собак, средний возраст развития заболевания составляет 1-2 года. Поражения в виде твердых, гиперкератических масс на множественных подушечках, зачастую в виде рога. Также, описаны поражения между пальцами. Вероятна хромота вторичная к бактериальной инфекции или формировании папиллом на несущей поверхности подушечек. Течение заболевания нарастающее и убывающее по тяжести, вероятен как некоторый регресс так и формирование новых 24 поражений. Гистологически, поражения имеют черты сходные с папилломатозом, однако попытки выделить вирус не принесли успеха. Иногда папилломы может покрывать кожный рог. Кожным рогом называют эпителиальное новообразование, состоящее из клеток шиповатого слоя кожи. Внешне это образование напоминает рог животного, поэтому заболевание и получило такое название (Рис.19). Рис.19 Кожные рога выпячиваются из папилломы на животе у этой шестимесячной собаки 2.4 Патолоанатомические измениения Макроскопически папиллома обычно представляет собой отграниченную, диам. до 1-2 см, плотную или мягкую на ощупь опухоль на тонкой длинной или короткой ножке, реже - на широком основании. В редких случаях папилломы достигают больших размеров. При папилломатозе поверхность кожи или слизистой оболочки бывает на значительном протяжении покрыта сосочковыми разрастаниями. Поверхность папилломы неровная, мелко- или крупнозернистая, напоминает цветную капусту или петушиные гребешки. Папиллома кожи может иметь различную окраску - от белой до грязно-коричневой (в зависимости от кровенаполнения сосудов стромы и содержания пигмента в базальном слое эпителия); папиллома слизистой оболочки чаще бывает бесцветной или жемчужно-белой, но иногда приобретает багровый или черный цвет в связи с кровоизлияниями в ее ткань. Папиллома мочевого пузыря может быть уплотнена за счет отложений солей кальция. Микроскопически папиллома (цветн. рис. 20) состоит из двух тканевых компонентов - соединительнотканной стромы и эпителия. По характеру эпителия различают плоскоклеточную (покрытую многослойным плоским эпителием) и переходно-клеточную (покрытую переходным эпителием) папилломы. Соединительная ткань стромы опухоли может быть рыхлой или плотной, часто отечной, иногда с явлениями ослизнения, большим или меньшим количеством сосудов и, как правило, с признаками воспаления. В тех случаях, когда строма папилломы развита значительно и склерозирована, говорят о 25 фибропапилломе. В эпителии, покрывающем папиллому, обычно увеличено число клеточных слоев, клетки эпителия более крупные, чем в норме. При этом в папилломе кожи наблюдается заметный гиперкератоз; в папилломах, возникающих на слизистых оболочках, ороговение обычно выражено слабее (цветн. рис. 21), клетки поверхностного слоя эпителия бледно окрашены. Рис. 20 и 21 Иногда встречаются папилломы слизистых оболочек, покрытые многослойным плоским ороговевающим эпителием, развившимся в результате метаплазии. В некоторых папилломах могут быть выражены явления акантоза, сопровождающиеся обычно высокой митотической активностью клеток базального слоя эпителия. Различные папилломы кожи могут отличаться друг от друга особенностями гистологического строения. Так, для обычных папиллом кожи характерно наличие вакуолизированных эпителиальных клеток в базальном слое и участков паракератоза, при старческом кератозе возникают папилломы с атипией и полиморфизмом эпителиальных клеток, в базально-клеточной папилломе характерно наличие однотипных темных клеток и роговых кист. 2.5 Гистологические изменения В некоторых местах гистологическая поверхность эпителия представляет собой слой, состоящий из мертвых кератинизированных клеток, что соответствует нормальным этапам кератинизации кожи. Отличительной особенностью эпидермиса на фоне папилломавирусной инфекции является наличие измененных эпителиоцитов на терминальной стадии койлоцитарной активности, с выраженной вакуолизацией, формированием околоядерных зон просветления и разрушением клеточной структуры. Таким образом, согласно гистологической классификации папилломы имеют фиброэпителиальное происхождение, с преобладанием стромальных элементов. Диагностическим гистологическим критерием вирусного папилломатоза является наличие койлоцитов, локализованных преимущественно в шиповатом слое паренхимы папилломатозных новообразований. Характерной особенностью гистологического строения всех папиллом является четкое ограничение паренхимы от стромы базальной мембраной эпидермиса, которая остается интактной независимо от стадии роста опухоли. Паренхима всех исследованных папиллом обладает общим свойством, присущим эпидермису в норме – это образование многослойного пласта с выраженной вертикальной анизоморфностью клеток. 26 Для кожных новообразований, даже на первых этапах формирования, характерно отсутствие волос. Но при этом следует отметить разную степень ороговения поверхностных слоев поверхности новообразований, что гистологически выявляется в виде признаков паракератоза и гиперкератоза. У папиллом первого типа отсутствуют признаки паракератоза и гиперкератоза, их поверхность имитирует поверхность кожи и выглядит вполне естественно. При пальпации она практически соответствует плотности кожи, но отмечается незначительное уплотнение под паренхимой новообразования. Впоследствии папилломы увеличиваются, при этом общее состояние животных не ухудшается. В базальном слое клетки находятся в состоянии активной пролиферации, что увеличивает количество слоев, формирующих ростковый слой паренхимы. Активизация ангиогенеза не отмечена, но происходит формирование койлоцитов в паренхиме папилломы. Койлоцитарная атипия наблюдается в шиповидном слое, цитоплазма клеток светлая, ядро располагается эксцентрично. Пролиферация клеток соединительной ткани на фоне размножения клеток паренхимы обеспечивает формирование стромального компонента опухоли, но при этом паренхиматозностромальное соотношение у данного типа практически приближено к равенству обоих значений и составляет около 580 мкм. У папиллом второго типа также выявлена усиленная пролиферация базалиоцитов, которые формируют эпителиальные гребешки, врастающие в образующуюся строму. На конце эпителиальных гребешков располагается регенерирующий клин, постоянно увеличивающий эпителиальный пласт в процессе роста папиллом (рис. 22)). Рис. 22 Гиперплазия базального слоя эпидермиса, с врастанием эпителиального пласта в строму. Окраска гематоксилин-эозин, ув. об. ×40, ок. ×10 (ред При врастании в строму базальный слой принимает однослойный характер, но данная однослойность временная и впоследствии заменяется многослойностью, что приводит к утолщению эпителиальных отростков и паренхимы в целом, но при этом паренхима не является основным компонентом опухоли. Паренхиматозностромальное соотношение при максимальных размерах папиллом смещается в сторону стромы, обеспечивающей основу для роста эпителиального пласта с сохранением его непрерывности. Если обратить внимание на данный тип папиллом, то на первый план выступает цикл развития клеток фибробластического ряда. Увеличение массы 27 соединительной ткани способствует увеличению площади окружающей кожи. Эти два процесса прямо- пропорциональны друг другу до момента достижения опухоли критической массы. В строме папилломы наблюдаются кровеносные сосуды, при этом непосредственно под базальной мембраной паренхимы активность ангиогенеза сопровождается формированием мелких сосудов, стенка которых представлена эндотелиальными клетками, расположенными в один слой. Поверхность папиломы с признаками паракератоза, в клетках поверхностного эпителия отмечается наличие палочковидных ядер. Третий тип папиллом обладает максимальными размерами, они достаточно плотные и гистологически диагностируются как фибропапилломы. Поверхность новообразования в состоянии гиперкератоза, его толщина составляет около 32 мкм, варьируя при этом от 20 мкм до 50 мкм. Паренхиматозно-стромальное соотношение при данных размерах папиллом смещается существенно в сторону стромы. Строма имеет особенности в зависимости от ее расположения относительно паренхимы. У основания папилломы строма состоит из плотных коллагеновых волокон, кровеносные сосуды спавшие, ближе к паренхиме соединительная ткань рыхлая и содержит фибробласты. Ядро койлоцитов деформировано, контуры его неровные. При анализе морфометрических показателей отмечены изменения со стороны койлоцитов, являющихся основным критерием дифференциальной диагностики папилломатоза от других новообразований эпителиального происхождения. При активизации роста папиллом, за счет пролиферации клеток базального слоя, появляются первые койлоциты, размеры которых значительно ниже койлоцитов, отмеченных у папиллом второго и третьего типов. Увеличение площади клеток на 55,43% и на 104,4% соответственно, с увеличением площади ядра койлоцитов на 5,24% и 20,97% относительно показателей ядра койлоцитов папиллом первого типа, позволяют утверждать об увеличении койлоцитов за счет изменений ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону цитоплазмы Исходя из выше изложенного, можно сделать следующие выводы: 1. Морфологические изменения при онкопрогрессии сопровождаются изменением плотности и размеров новообразований, разной степенью ороговения поверхностного слоя паренхимы, представленной клетками поверхностного эпителия; 2. Активизация клеток фибробластического ряда стромы папилломы определяет последующую гистологическую структуру, в виде фибропапиллом, с усилением признаков паракератоза и гиперкератоза поверхности паренхимы, при этом увеличение массы соединительной ткани способствует увеличению площади окружающей паренхимы опухоли; 3. Койлоцитарная атипия отмечена во всех исследуемых новообразованиях, при этом размеры койлоцитов варьируют в зависимости от типа папиллом, что является следствием продвижения данного вида клеток от шиповидного слоя к поверхности паренхимы папиллом. 3. Комплексная диагностика Как правило, диагноз папилломатоз ставится на основе внешнего осмотра питомца и дальнейшего проведения лабораторного исследования образца новообразования на теле пса. Диагностике может препятствовать наличие густой шерсти. Поражённые участки в 28 труднодоступных местах, например, среди подушечек лап или на половых органах также бывает очень сложно заметить. Для подтверждения диагноза проводятся лабораторные исследования: - иммуногистохимические; - гистологическое исследование; - ПЦР, которая окончательно подтверждает наличие или отсутствие папилломавируса. Бактериологические методы исследования папилломы при папилломатозе у собак неэффективны, поскольку возбудитель не размножается в культурах клеток. 3.1 Гистологическое исследование Ветеринарный врач может диагностировать папилломатоз по их характерному внешнему виду. Для уточнения диагноза папиллома может быть взята биопсия и направлена на гистологическое исследование. Лишь биопсия служит одним из наиболее эффективных и качественных способов, дающих возможность наиболее точно изучить вирус. Заключается он в заборе небольшого участка ткани, формирующей папиллому, и ее дальнейшего изучения. На сегодняшний день существует несколько вариаций проведения биопсии, отличающихся по принципу взятия материала. Выглядят они следующим образом: - инцизионная - подразумевает взятие части нароста; - эксцизионная - заключается в изъятии новообразования целиком при помощи хирургического метода; - пункционная - забор материала производится путем прокола иглой папилломы. Гистологическое исследование папилломы позволяет выявить структурную неоднородность: выделяют соединительнотканную основу, дермальные сосочки, часто сглаженные, эпителиальный слой и слой кератоза. Местами в межклеточных промежутках определяются мелкогранулярные образования слабобазофильной окраски. Клетки многорядного базального слоя, как правило, отличаются полиморфизмом, встречаются двухядерные клетки и ядра больших размер. Митотическая активность повышена, отмечаются патологические митозы. Базальная мембрана не везде четко выражена, иногда размыта клетками инфильтрата. Строма во всех случаях резко отечна, отмечены пролиферация сосудов и воспалительная реакция, выраженная в различной степени. Воспалительные инфильтраты лимфоцитарного характера с примесью нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов. В некоторых случаях выявляются группы плазматических клеток (Рис.23). Рис.23 Гистология папилломы 29 При делении заражённых клеток базального слоя эпителия геном вируса передаётся в дочернюю клетку. После заражения, вирус усиливает пролиферацию клеток, вызывая разрастание эпителия и появление новообразований (продуктивная стадия). Время, проходящее от момента первичного инфицирования до стадии клинических проявлений, может варьировать и определяется, главным образом, титром инфекционных частиц. Низкий титр, как правило, приводит к формированию латентной инфекции (носительство). 3.2 Метод полимеразной цепной реакции Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаруживать единичные бактериальные клетки или вирусные частицы. Более чувствителен и менее трудоемок. Достоинства ПЦР: а) Быстрота анализа. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня при параллельной обработки 10-12 образцов; б) Надежность; в) Чувствительность; г) Специфичность; д) Для ПЦР пригоден любой материал, даже гистопрепараты. Основные компоненты ПЦР: а) термостабильный фермент ДНК-полимера; б) пара олигонуклеотидных праймеров; в) четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов; г) копируемая ДНК; д) ионы Mg2+ необходимые для функционирования ДНК-полимеразы; е) буферные растворы для поддержания рН во время ПЦР между 6,8 – 7,8 и минеральное масло для предотвращение испарения. Амплификатор – это прибор для проведения реакции в автоматическом режиме, обеспечивающем поддержку в реакционной смеси заданной температуры в течение заданного времени. Технология идентификации ДНК-содержащих вирусов заключается в следующем: 1) Из исследуемого материала выделяется ДНК-матрица 2) Смешивают ДНК, праймеры, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер и ДНКполимеразу 3) Пробирку со смесью нагревают до температуры денатурации ДНК (940С), при этом две цепи ДНК расходятся 4) Затем пробу инкубируют при температуре гибридизации праймеров с ДНКматрицей (40-600С) 5) ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание нитей ДНКматрицы с помощью дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (720С). В результате проведенного цикла происходит удвоение искомого генетического материала 30 6) В последующем цикле синтез осуществляется с 4 копий, далее с 8 и т. д., до 20-30 циклов. В результате получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови. Индикация амплифицированного генетического материала проводится выше изложенным способом. В ПЦР любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации. ПЦР применяют для обнаружения ДНК вируса папилломы, что позволяет практически с самой максимальной вероятностью найти этот микроорганизм. Для исследования требуются биологические жидкости – кровь, слюна, моча, околоплодные воды или соскоб со слизистого слоя шейки или уретры. ДНК диагностика также помогает установить тип микроорганизма и количественное его соотношение на момент забора материала. Результат метода достигается за счет многократного избирательного копирования нуклеотидов ДНК вируса папилломы. Ошибки практически исключены, потому что типирование автоматизировано, а программу настраивают на поиск участков ДНК, схожих по строению с ВП. Для достоверности результата очень важно соблюсти технику забора соскоба, поэтому при данной процедуре их берут несколько: основной и КВМ (контроль взятия мазка). Количественное определение провести довольно сложно, потому что основное скопление вирусных клеток может не попасть в биологический материал, отобранный для исследования. Современные возможности диагностики папилломавирусной инфекции значительны, но малодоступны ветеринарным специалистам. Зарубежными исследователями предложен арсенал методов, позволяющих выявлять вирус и диагностировать развитие вирусассоциированных папилломатозных новообразований. К таким методам относится выявление ДНК вируса с помощью ПЦР в режиме реального времени с типированием и определением количества геномных эквивалентов вируса, выявление мРНК, кодирующих структуру онкопротеинов Е6 и Е7, определение наличия онкопротеинов Е6 и Е7, иммуногистохимические методы. Последние исследования направлены на изучение молекулярной характеристики выделенных из папиллом вирусов различных видов животных. 3.3 Иммуногистохимические исследования Иммуногистохимия (ИГХ) – метод выявления точной локализации клеточного или тканевого компонента (антигена) с помощью иммунологических и гистохимических реакций; при этом иммунологический анализ срезов тканей или цитологического материала проводится в условиях сохранения морфологии клеток. Особую ценность иммуногистохимия приобретает в том случае, когда имеются трудности в определении гистогенетической принадлежности опухолевой ткани на основании изучения рутинных срезов, окрашенных гематоксилин-зозином, при этом морфологи нередко используют термин «недифференцированные опухоли».Выявление 31 гистогенеза опухоли необходимо для решения вопроса о тактике лечения заболевания и прогностической оценке. Выявление антигенов в клетках и тканях с помощью иммуногистохимии осуществляется в несколько этапов. Исследуемые образцы замораживаются или заключаются в парафин, режутся на микротоме и помещаются на предметные стекла. Затем срезы освобождаются от парафина, на них проводят демаскирование антигенов, блокируют неспецифическое связывание белков и эндогенную пероксидазную активность и затем проводят инкубацию с первичными антителами. Связавшиеся первичные антитела выявляют, добавляя вторичные антитела, конъюгированные при помощи полимера с пероксидазой, и осуществляют визуализацию вторичных антител при помощи субстрата – диаминобен-зидина. После достижения максимальной интенсивности окрашивания, срезы промывают водой для прекращения реакции, докрашивают гематоксилином и заключают в заливочную среду. Для ИГХ пригоден практически любой материал: цитологические мазки, свежезамороженная или фиксированная ткань. Выбор исследуемого материала должен определяться свойствами изучаемого антигена: так, большинство цитоплазматических антигенов выявляются на фиксированных формальдегидом срезах; поверхностные клеточные антигены, как правило, разрушаются или маскируются при обычной фиксации могут быть выявлены только на свежезамороженных тканях либо в культуре клеток. Важными условиями проведения иммуногистохимической реакции является подбор титра антител. Титром антител называют максимальное разведение сыворотки, при котором наблюдается выраженное специфическое окрашивание без неспецифического фонового окрашивания окружающих тканей. 3.4 Электронная микроскопия Электронная микроскопия – совокупность методов исследования с помощью электронных микроскопов микроструктуры тел (вплоть до атомномолекулярного уровня), их локального состава и локализованных на поверхностях или в микрообъёмах тел электрических и магнитных полей (микрополей). Метод электронной микроскопии: Данная технология стала основой в создании электронных микроскопов – приборов, в которых для построения изображения используется не световой луч, а поток электронов в вакуумной среде. Роль оптических линз, которые используются в обычных микроскопах, здесь отведена электронному полю. Именно оно и фокусирует электроны. Электромагнитное поле формируется электромагнитными катушками. Изображение передается на флюоресцирующий экран, где его можно сфотографировать и рассмотреть детально. К изучаемым объектам предъявляется ряд требований: Необходима предварительная фиксация и обработка. Объекты в процессе работы будут находиться в глубоком вакууме. 32 Маленькая толщина. Поток электронов будет сильно поглощаться объектом. И большую толщину он не «пробьет». В качестве объектов используются срезы, толщиной от 20 до 50 нм. Для удобства работы их размещают на тонкие прозрачные пленки. Равномерность слоя. Перед началом исследования проводится механическая обработка. Она способна обеспечить постоянную толщину образца. Разрешающая способность у электронных микроскопов значительно выше, чем у оптических. Величина 0,15 нм (15 А) позволяет получать увеличение в миллионы раз, что идеально подходит для изучения микроскопических объектов. Основные особенности: Суть метода электронной микроскопии в том, что через исследуемый образец подается электронный пучок разной энергии. Под воздействием электромагнитного поля он фокусируется на поверхности в виде пятна, в диаметре не превышающего 5 нм. Это пятно и выполняет «изучение» объекта. Соприкасаясь с поверхностью, электронный пучок частично проникает в нее, вытесняя не только электроны, но и фотоны. Они попадают на лучевую трубку, где и из них и формируется изображение. В сравнении со световыми (оптическими) микроскопами, электронные обладают преимуществами: Можно получать очень большое увеличение (вплоть до 300000) с сохранением высокого разрешения, вплоть до атомов. Такой результат достигается при прямом наблюдении объекта. То есть не требуется дополнительных увеличений. Позволяют изучать химический состав образца по точкам. Используется спектральный анализ рентгеновского излучения, которое возбуждается электромагнитным потоком. Пользователь получает прямую электронно-оптическую информацию об исследуемом объекте. При необходимости ее можно будет дополнить сопутствующими данными, основываясь на электронной дифракции электронов с веществом. Как пример: при помощи дифракционного контраста изображений определяются кристаллографические показатели. Обеспечивает возможность дополнительного воздействия на объект в ходе исследования. Его можно нагревать, облучать, деформировать, намагничивать. Наблюдение за процессами будет динамическим. Есть возможность фото- и видеофиксации происходящего. Качество изображения будет достаточно высоким. Есть возможность наблюдать за рельефом поверхности, анализируя катодолюминесценцию. Такую возможность предоставляет электронная растровая разновидность микроскопии 33 Рис. 24 Строение электронного микроскопа При помощи электронной микроскопии могут быть выявлены внутриклеточные частицы папилломавирусов в кератинизированных клетках. Поставить точный диагноз такой метод диагностики может, но, к сожалению, дорогостоящим оборудованием для ее проведения оснащена далеко не каждая ветеринарная клиника. 3.5 Люминесцентная микроскопия Люминесцентная микроскопия — это фиксация при помощи микроскопа первичного либо вторичного люминесцентного свечения объектов. Принцип люминесцентной микроскопии Довольно большое количество веществ биологического происхождения имеют такую способность, как свечение, при воздействии на них света. Такое свечение формируется по причине того, что объекты поглощают лучистую энергию, которая попадает на их поверхности. Длина волны при люминесценции больше, чем у поглощенного света. Чем люминесцентный микроскоп отличается от обычного светового микроскопа? Строение светового микроскопа отличается от люминесцентного. Дело в том, что люминесцентный микроскоп оснащен специальной осветительной системой, которая излучает свет, вызывающий соответствующее свечение объектов. Провоцировать подобное свечение объектов рекомендуется либо ультрафиолетом, либо сине-фиолетовыми лучами. Таким образом можно получить цветное изображение. Используются разновидности ламп, как, например, ртутно-кварцевая или галогенная кварцевая лампа. Ими оснащается все флуоресцентный микроскоп, они излучают свет в синем спектре. Также используются специальные светофильтры, которые пропускают только ту часть света, которая способна возбудить люминесцентное свечение объекта. Также используются теплофильтры, которые противостоят перегреву остальных фильтров, оптической конструкции и самого исследуемого объекта. 34 Есть и объекты, которые не обладают люминесцентным свечением. Однако, это не проблема. Ведь есть возможность обработки их флюорохромами, специальными веществами, которые могут поглощать свет и являются люминесцентными. Именно по этому принципу люминесценцию разделяют на первичную и вторичную, соответственно, первичной называется та люминесценция, которой объекты обладают без какого-либо внедрения, а вторичной – при окрашивании их флюорохромами. Применение люминесцентной микроскопии позволяет увеличить контрастность объекта, в микробиологии именно такая методика позволяет отчетливо рассмотреть органеллы и другие клеточные структуры. Довольно большое значение имеет реакция иммунофлюоресценции в вирусологии, так как при помощи данной технологии меченные флюорохромом антитела идентифицируют антигены чужеродных организмов. Такая технология может значительно помочь в экспресс- идентификации вирусных заболеваний. Люминесцентная микроскопия имеет широкое распространения в современной науке и технике. Рис. 25 Строение люминесцентного микроскопа Метод флуорохромирования: По своей технике этот метод почти ничем не отличается от методов обычной окраски мазков, применяемых при световой, обычной микроскопии. Для этих целей используют анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски называются флуорохромами, а окраска ими - методом флуорохромирования. К флуорохромам относят такие красители, как аурамин, корифосфин, родамин, трипафлавин, риванол, флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) и другие. Разведения для большинства красителей обычно готовят 1:1000, 1:10000. Для исследований можно готовить мазки из патматериала, мазки-отпечатки, гистосрезы, зараженные культуры ткани, выращенные на покровных стеклах. 35 В мазках-отпечатках при вирусных инфекциях наблюдают свечение в ядрах или цитоплазме пораженных вирусом клеток в виде различных гранул и телец-включений, а если клетка поражена вся и антиген содержится как в ядре, так и в цитоплазме, может светиться вся клетка. Непораженные вирусом клетки обычно не светятся и создают темный фон. Метод флуорохромирования широко применяется при диагностике бактериальных болезней, и вирусных – на наличие в исследуемом материале телец-включений. В. А. Комаровский предложил для установления вирусной природы папиллом использовать метод флуорохромирования. Отмечая при этом, что для окончательной постановки диагноза это может быть достаточным, поскольку известно, что образование папиллом вызывают ДНК-содержащие вирусы, а метод флуорохромирования может быть использован для определения типа нуклеиновой кислоты вируса. Таким образом, люминесцентная микроскопия гистосрезов подтверждает вирусное происхождение новообразований, а учитывая клиническую картину заболевания и тип нуклеиновой кислоты вируса, можно считать подтвержденным диагноз на папилломатоз. Следует отметить, что данный метод диагностики можно использовать в сомнительных случаях папилломатоза у различных видов животных (кошек, собак и др.). 4. Иммунитет и средства профилактики В случае выздоровления собаки, кошки у них формируется устойчивый иммунитет к папилломатозу, хотя она продолжает быть носителем вируса и является потенциально опасной в плане заражения. Для приобретения пассивного иммунитета животным вводят сыворотку с антителами собаки, переболевшей папилломатозом. Когда новообразование становится злокачественным, есть предпосылки говорить о недостаточности иммунной системы животного. Одним из основных методов предупреждения папилломатоза на сегодняшний день является вакцинирование животных. Также огромную роль играет гигиена питомца и чистота всех приспособлений по его уходу. Правильно подобранные условия содержания и сбалансированный рацион, богатый на витамины и минералы значительно снизят риск заболевания животного. Методы профилактики: - систематический осмотр тела животного на наличие новообразований; - ограничение контакта питомца с чужими незнакомыми собаками; - прогулки на свежем воздухе; - при обнаружении бородавок минимизация риска расчесывания или срывания их псом. Важно помнить, что качественную эффективную терапию может обеспечить только профессионал, поэтому не стоит пытаться самостоятельно лечить животных сомнительными методами. При обнаружении папилломы у питомца нужно обратиться к ветеринару как можно раньше, а также следует своевременно проводить профилактические осмотры. 36 5. Клиническая эффективность иммунотерапии папилломатоза собак Терапевтический подход в инфекционной онкологии достаточно сложен, в этом случае необходимо ориентироваться в первую очередь на этиотропную терапию, но при вирусных инфекциях она ограничена. Использование патогенетических средств и использование инвазивных хирургических методов не решают проблему последующего развития рецидива. Папилломавирусная инфекция – одна из наиболее удачных моделей вирусного онкогенеза, которая может быть использована для изучения эффективности многих терапевтических схем, как с использованием противовирусных, так и специфических средств. Цель исследования – оценить клиническую эффективность аутогенной вакцины и противовирусных препаратов в лечении диссеминированного папилломатоза кожи и слизистых оболочек собак. Исследования проводились с 2010 по 2017 гг. по мере выявления животных с клинической картиной инфекции. Предварительно проводились эпизоотологическое и клиническое обследования, с последующей гистологической дифференциацией, позволяющей поставить окончательный диагноз на папилломатоз. В программу исследований были включены 12 собак независимо от локализации новообразований. Животные были разделены на 2 группы: в первой группе животным для лечения использовалась монотерапия вакциной (специфическая терапия); вторая группа – животные, в отношении которых использовалась общепринятая схема иммунотропным препаратом (ронколейкин). В клинических исследованиях, как в первой, так и во второй группе использовался подкожный метод введения биопрепаратов. Режим вакцинации в первой группе включал в себя 5 вакцинаций с интервалом в 3 дня, при этом продолжительность лечения составляла не более 3 недель. Ронколейкин вводился собакам в рекомендованных дозах также с интервалом в 3 дня, количество инъекций – 5. Лечение проводилось в условиях ветеринарных клиник по месту обращения владельцев животных. Исследования проводили в несколько этапов. На первом этапе отслеживалось поступление собак в ветеринарные клиники с клинической картиной папилломатоза. После сбора анамнестических данных прописывалась терапевтическая схема с использованием иммунопрепаратов. На втором этапе исследований от каждого подопытного животного хирургически удалялись материнские папилломы, которые в дальнейшем использовались для постановки гистологического диагноза и для изготовления животным первой группы аутогенной вакцины. Заключительным этапом являлось наблюдение за животными в процессе лечения, при этом учитывалось как общее состояние собак, так и клиническая эффективность предложенных вариантов терапии. При эпизоотологическом исследовании выявлено, что папилломатоз собак встречается на территории повсеместно, без преимущественного поражения каких-либо пород, что объясняется его инфекционной природой. Как правило, выделяют две основные клинические формы папилломатоза собак: папилломатоз кожи и папилломатоз слизистых оболочек. У 7 собак наблюдалась кожная форма инфекции, у 1 собаки папилломатоз слизистых оболочек, для 4 собак характерно одновременное поражение, как кожи, так и слизистых оболочек (смешанная форма) (рис. 26). 37 Рис. 26 Собака первой группы (порода бигль) до вакцинотерапии При оценке времени до момента полной регрессии папиллом показатель у животных первой группы составил от 12 до 18 дней, при этом процесс регрессирования зависел от локализации и размеров новообразований. При кожных поражениях регрессирование папиллом проявлялось уменьшением в диаметре, потемнением и подсыханием (рис. 27). Рис. 27. Собака первой группы (порода бигль) в период вакцинотерапии При пальпации отмечалось уплотнение новообразований и сглаживание сосочковой структуры (рис. 28). Папилломы слизистых оболочек эпителизировались, размягчались и как бы «сливались» со слизистой оболочкой в месте локализации. 38 Рис. 28 Собака первой группы (порода бигль), уменьшение папилломы Использование ронколейкина часто сопровождалось частой аллергической реакций в месте подкожного введения. При этом при введении ронколейкина у 4 собак отмечалась выраженная местная реакция, из них одна собака была исключена из опыта вследствие развития отеков в области головы и подгрудка, сопровождающихся признаками аритмии и асфиксии. Достаточно хороший лечебный эффект наблюдался при кожной форме папилломатоза. Новообразования на фоне неспецифической иммунотерапии размягчались и уменьшались в объеме. Папилломы, локализованные на слизистых оболочках, медленно поддавались терапии, и у одной собаки второй опытной группы (собака No3) регрессирование не наблюдалось. Таким образом, при оценке эффективности лечения иммунопрепаратами, клиническое выздоровление у животных первой группы наблюдалось в среднем через 15,5 дней, у второй группы – через 20 дней, без учета двух собак под номерами 3 и 5. Вакцинотерапия способствовала клиническому выздоровлению всех животных, задействованных в опыте, при этом за весь период последующего наблюдения рецидивов инфекции не наблюдалось. При лечении ронколейкином у собаки породы китайская хохлатая через 7 месяцев новообразования стали появляться вновь. Исходя из вышеизложенного, хотелось бы отметить, что особенностью вакцинотерапии является то, что вакцина индуцирует в первую очередь специфический противоопухолевый иммунный ответ у больных животных, таким образом обеспечивая антирецидивную терапию. Непопулярность данного вида лечения связана в первую очередь с отсутствием технической базы, необходимой для изготовления биопрепаратов в некоторых городах, и этот вопрос решается путем сотрудничества с научными исследовательскими ветеринарными станциями и институтами. 39 Заключение Прогноз в основном благоприятный. Большинство случаев спонтанно регрессирует. Злокачественная трансформация в плоскоклеточный рак возможна при пигментированных бляшках собак и множественной вирусной папилломе кошек и в редких случаях оральной и корнеальной папилломы. Папилломатоз у собак и кошек не является тяжелой болезнью и, тем не менее, ветеринарные врачи многих стран ищут самые эффективные способы лечения этого недуга. Если хозяин решает лечить собаку самостоятельно, то ему следует наблюдать за динамикой болезни очень внимательно. Если лечебные меры не оказывают должного эффекта, папилломы разрастаются и поражают новые участки, нужно обратиться за помощью к ветеринару. Опасные новообразования буду вызывать беспокойство у собаки: пес попытается счесать или сгрызть папулу. Не стоит переоценивать свои силы и в лечении папиллом, расположенных под ошейником. При внимательном отношении и грамотном лечении папилломы исчезнут быстро, и никогда больше не будут беспокоить питомца. Для роста опухоли характерна стадийность и мультицентричность. Опухолевый рост начинается с пролиферации нескольких клеток мишений. В случае их близкого расположения друг к другу формируется один опухолевый узел, а в случае удаленного – множественные опухоли. Изучая морфологическое и гистологическое строение папиллом необходимо отметить, что строма представлена неопухолевыми элементами сосудисто-соединительнотканного происхождения. Развитие стромы подчинено росту опухоли, чем быстрее растет последняя, тем больше в ней стромы, хотя для многих опухолей процесс идет в обратном направлении, т.е чем быстрее растет опухоль, тем меньше в ней стромы. Для современной иммунологии и практической ветеринарной медицины важное значение имеет создание биопрепаратов, которые открывают возможность лечения и профилактики целого ряда инфекционных заболеваний, а последующее изучение подобных препаратов позволит получить новые данные для изучения закономерностей функционирования и регуляции иммунной системы Наряду со специфической профилактикой с помощью вакцин, их широко используют как неспецифические иммуностимуляторы. Многие вакцины, в том числе из условно-патогенных бактерий не только повышают к ним резистентность, но и обладают мощным неспецифическим иммуномодулирующим, обычно стимулирующим эффектом. Рассматривая большое разнообразие предложенных методов лечения папилломатоза, все они, как правило, сводятся к минимальному набору терапевтических средств, обладающих местным действием в отношении папиллом. Таким образом, тактика ветеринарных специалистов представлена устранением клинического проявления или симптома инфекционной болезни. Эпизоотологическое исследование показало, что в развитии эпизоотического процесса ведущим звеном являются животные – источники инфекции со скрытым носительством. Поэтому необходим контроль над перемещением животных, так как вновь поступившие или родившиеся являются пусковым механизмом развития диссеминированного 40 папилломатоза, так как провоцируют скрытое носительство в клиническую картину. Таким образом, инфекция чаще всего носит эндогенный характер. Проведенные гистологические исследования эпидермиса и стромы различных папиллом показали, что общими для них являются акантоз, гиперкератоз и дискератоз в различных сочетаниях, а также пролиферация клеток не только базального слоя, но и фибробластов, формирующих строму новообразований. Основой папиллом является фиброзная ткань (строма), покрытая многослойным эпителием. В папилломах по мере их роста соотношение между стромой и паренхимой варьирует и изменяется как в количественном, так и качественном отношении, что указывает преимущественно на тканевой атипизм. Дисплазия характеризуется атипией клеток эпителия, с умеренной пролиферацией клеток базального слоя и формированием койлоцитов, являющихся результатом нарушения дифференцировки эпителиоцитов. Таким образом, исходя из вышеизложенного, выявлены некоторые структурные и гистоморфологические дифференциально-диагностические признаки, к которым относятся: паренхимально-стромальное строение, наличие койлоцитов и выраженная митотическая активность клеток базального слоя. Эпидермис, формирующий паренхиму папилломы, растет по поверхности соединительной ткани (стромы) и стелется по ней в виде пласта. Базальный слой врастает в толщу соединительной ткани, инфильтрируя ее, при этом базальная мембрана сохранена. Суммируя, можно заключить, что индукция и стимуляция клеток предшественников опухоли, накопление генетических изменений опухолевой клеткой вместе с образованием стромы, способствующей опухолевому росту и необходимой для него, создают новую надежную мишень для противоопухолевой терапии – мишень, специфичную для каждой опухоли, часто выявляемую серо- логическими маркерами или по патофизиологическим признакам, мишень понятную и надежную, характеризующую самое возникновение опухоли, а не уже сформированный опухолевый клон 41 Список литературы 1. Бородавки и папилломы у собак. URL: https://pets2.me/bok/sobaki/zdorovesob/bolezni-sob/virusnye-z/2763-borodavki-i-papillomy-u-sobak.html# (дата обращения: 11.09.2022г) 2. Гордеева, Е. В. Лечение папилломатоза ротовой полости у собак / Е. В. Гордеева, И. К. Васильев, А. Н. Наровлянский [и др.] // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. – 2008. 3. Карачевцев, Ю. В. Некоторые этиологические факторы опухолей у собак в условиях города Белогорска / Ю. В. Карачевцев, М. Н. Кочерга // Сб. науч. тр. молодых ученых. – Благовещенск : Изд-во ДальГАУ, 2001. 4. Криохирургия кожных образований. URL: http://vmvet.ru/kriohirurgiyakozhnyh-obrazovanij/ (дата обращения: 08.09.2022г) 5. Кудачева, Н. А. Папилломатоз животных : монография / Н. А. Кудачева. – Кинель : РИО Самарского ГАУ, 2019. – 158 с. 6. Кузнецов, А.Ф. Справочник ветеринарного врача / А.Ф. Кузнецов. – М.: Лань, 2002. – 896 с. 7. Люминесцентная микроскопия. URL: https://intergen.ru/blog/lyuminesczentnaya-mikroskopiya (дата обращения: 08.09.2022г) 8. Онкологические заболевания мелких домашних животных / Под ред. Ричарда А. С. Уайта. – М. : Аквариум ЛТД, 2003. – 352 с. 9. Патерсон, С. Кожные болезни собак / С. Патерсон. – пер. с англ. Е. Осипова. – М. : «АКВАРИУМ ЛТД», 2000. – 176 с. 10. Папилломатоз (папилломы у собак): причины, виды, лечение. URL: https://allaboutdogs.ru/papillomatoz-papillomy-u-sobak-prichiny-vidy-lechenie (дата обращения: 11.09.2022г) 11. Папилломы собак (папилломатоз). URL: https://veterinarbalakovo.ru/papillomy-sobak-papillomatoz/ (дата обращения: 08.09.2022г) 12. Папилломатоз ротовой полости собак – новый подход к лечению. URL: https://www.gama-market.ru/articles/mdj/papillomatoz-rotovoy-polosti-sobak-novyy-podhod-klecheniyu (дата обращения: 15.09.2022г) 13. Папилломы у собак и кошек. URL: https://veter96.ru/dermatologicheskij-atlas/papillomy-u-sobak-i-koshek2 (дата обращения: 11.09.2022г) 14. Родинки и папилломы: причины появления, способы удаления, отличия родинки от папилломы.URL: https://paracels66.ru/info/interesnoe/rodinki-i-papillomyprichiny-poyavleniya-sposoby-udaleniya-otlichiya-rodinki-ot-papillomy ( дата обращения: 12.09.2022г) 15. Салимов, В. А. Практикум по патологической анатомии жи- вотных / В. А. Салимов. – М. : КолосС, 2003. – 189 с. 16. Семенов, Д. М. Папилломавирусная инфекция (клинико- патогенетические особенности, лечение, профилактика) : учебно- методическое пособие / Д. М. Семенов, С. Н. Занько, Т. И. Дмит- раченко. – Минск, 2008. – 73 с. 17. Старченков, С.В. Заразные болезни собак и кошек / С. В. Старченков. – СПБ.: 2001, 368 с. 42 18. Nicholls, P. K. Naturally occurring, non regressing Canine oral Papillomavirus infection: host immunity, virus characterization and Experimental infection / P. K. Nichols, B. A. Klaunberg, R. A. Moore // Virology. - 1999. - No 265. - P. 365-374. 19. Zaugg, N. Detection of novel papillomaviruses in canine mucosal, cutaneous and in situ squamous cell carcinomas / N. Zaugg, G. Nespeca, B. Hauser // Vet. Dermatol. – 2005. – No 16 (5). – Р. 290-298. 43
