МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВОХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ Национальный фармацевтический университет Кафедра промышленной технологии лекарств Курсовая работа по теме: «Ферменты» Выполнила: Студентка 4к. 16гр. Специальность «Фармация» Горина Надежда Проверила: Доц. Крикливая И. А. 0 СОДЕРЖАНИЕ Введение Классификация ферментов Препараты ферментов в медицине Производство ферментов из сырья животного происхождения. Стадии производства ферментов Ферменты, улучшающие процессы пищеварения Процесс производства Панкреатина Процесс производства Пепсина 8 Ферменты для биологического очищения гнойно – некротических ран Процесс получения Рибонуклеазы Процесс получения Коллагеназы Производство ферментов из сырья растительного происхождения Процесс получения Папаина Оборудование для получения ферментных препаратов. Ферментаторы. Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов Глубинный метод производства ферментов Иммобилизация ферментов Общая характеристика иммобилизованных ферментов Классификация носителей для ферментов Методы иммобилизации ферментов Заключение Список литературы 2 3 3 4 5 5 6 9 10 11 13 13 14 17 19 20 20 22 23 28 29 1 Введение Ферменты, являясь высокоэффективными и высокоспецифичными биологическими катализаторами, играют важную роль в регуляции жизненно важных процессов, происходящих в организме. Существует тесная связь между состоянием организма и работой его ферментных систем. Нарушение их согласованной деятельности является одним из основных факторов возникновения заболеваний. Результаты исследований по биохимии ферментов и терапии с их участием с каждым годом все больше привлекают внимание врачей, а ферменты занимают все больше места в арсенале средств практической медицины. 2 Классификация По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на 6 классов: КФ 1: Оксидоредуктазы, катализирующие окисление или восстановление. Пример: каталаза, алкогольдегидрогеназа КФ 2: Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ. КФ 3: Гидролазы, катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза КФ 4: Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов. КФ 5: Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата. КФ 6: Лигазы, катализирующие образование химических связей между субстратами за счет гидролиза АТФ. Пример: ДНК-полимераза(1) Будучи катализаторами, ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакции, поэтому, например, лиазы способны катализировать и обратную реакцию — присоединение по двойным связям. Подавляющее количество препаратов, выпускаемых различными фирмами мира, является комплексными, содержащими помимо основного фермента еще значительное количество сопутствующих ферментов и белков. Поэтому в технологии ферментов препараты чаще классифицируют по основному компоненту в смеси ферментов, присутствующих в данном препарате: амилолитические, протеолитические, липолитические, целлюлозолитические и др. Сейчас отечественная промышленность заметно отстает по объему производства ферментных препаратов от таких стран, как США, Япония, Дания, Нидерланды. Однако быстрые темпы ее развития вселяют уверенность в успешном преодолении этого отставания.(3) Препараты ферментов в медицине Наиболее перспективными и наиболее широко распространенными ферментами медицинского назначения на мировом фармацевтическом рынке в настоящее время являются протеолитические ферменты. Помимо протеаз, основную массу выпускаемых за рубежом ферментных препаратов составляют амилазы, липазы, целлюлазы и лекарственные формы на их основе, главным образом используемые для противовоспалительной и заместительной терапии. В меньших объемах выпускаются нуклеазы, L – аспарагиназа, коллагеназа, эластаза, бета – галактозидаза. Широко практикуется выпуск комплексных препаратов, включающих несколько ферментов с другими лекарственными средствами.(2) 3 Исторически традиционным сырьем для ферментных препаратов, улучшающих процессы пищеварения является панкреатин. Фармацевтическая промышленность экономически развитых стран выпускает ряд высокоактивных препаратов на основе панкреатина: Креон, Панцитрат, Пангрол – 400, Нутризим, Комбизим – композитум, Комбизим – форте – фирмы Германии; Фестал ( Германия, Индия); Панзинорм – форте ( Германия и Словения); Илозим, Виоказа, Панкреаза (США), Котазим (Великобритания). Кроме препаратов с высоким содержанием гидролаз, ширако применяются и менее активные препараты на основе панкреатина: Мексаза (Югославия), Пролипаза ( Швейцария), Трифермент ( Румыния), Энтозим ( США), Панкреатин ( Финляндия). Ферменты растительного происхождения также применяют в заместительной ферментной терапии. В состав комбинированных препаратов часто включают растительные протеазы: бромелин ( из плодов аниса) и папаин ( из плодов дынного дерева). Бромелин входит в состав Мексазы, Нутризима, Дигензима, Лимазы; папаин – в состав Дамагала, Озима, Вобэнзима и Панкреаля Киршнера. Известно применение нигедазы – препарата липазы из семян чернушки дамасской, препарата из латекса дынного дерева, преимущественно с протеолитической активностью. Широкое применение в последние десятилетия находят ферменты из микробного сырья. Указанное объясняется возрастающим спросом на ферментные препараты, который уже не может быть удовлетворен только за счет традиционного сырья животного происхождения, а также возможность получения ферментов с необходимыми характеристиками – большей устойчивостью к животным ингибиторам, строго стандартизованной активностью. В настоящее время за рубежом до 35% всех ферментных препаратов получают из микробного сырья. Область применения ферментов, разрабатываемых в научном центре, представлена 3 направлениями: Использование ферментов для улучшения процессов пищеварения; Использование для энзимного очищения гнойно – некротических ран; Использование иммобилизованных ферментов в экстракорпоральной перфузии биологических жидкостей, содержащих токсические метаболиты с последующим освобождением и возвратом в организм.(1) Производство ферментов из сырья животного происхождения. Органы и ткани животного происхождения до настоящего времени являются важным источником сырья для производства ферментов. При этом используются отходы мясоперерабатывающей промышленности (поджелудочная железа, слизистые оболочки кишечника свиней, сычуги крупного рогатого скота, молочных телят, семенники половозрелых животных). Накоплен значительный опыт по их переработке, разработаны рациональные технологические схемы получения 4 нескольких препаратов из одного сырьевого источника. Однако использование сырья животного происхождения сопряжено с рядом трудностей, обусловленных переработкой больших количеств тканевых материалов убойного скота для получения необходимого количества ферментов, создание специальных условий для его хранения. Стадии производства ферментов 1. Заготовка сырья в зависимости от источника: сушка, консервация, ферментация; 2. Измельчение клеточного материала; 3. Экстракция; 4. Центрифугирование; 5. Фракционное осаждение; 6. Избирательная адсорбция и элюция; 7. Хроматография; 8. Электрофорез; 9. Диализ; 10. Кристаллизация и лиофилизация.(4) Ферменты, улучшающие процессы пищеварения Анализ ассортимента ферментных препаратов для улучшения процессов пищеварения, которые находятся на фармацевтическом рынке Украины, показал, что среди них 17,8% составляют лекарственные средства отечественного производства ( препараты, производимые на данный момент), 17,8% поступают на рынок из стран ближнего зарубежья и 64,3% из стран Европы и Азии. Основными отечественными производителями ферментных препаратов для улучшения процессов пищеварения являются: ПО «Биостимулятор» ( г. Одесса), ОАО « Технолог» ( г. Умань), ОАО « Витамины» ( г. Умань), Опытный завод ГНЦЛС ( г. Харьков).(5) Панкреатин - ферментный препарат, получаемый из поджелудочной железы убойного скота; применяют при хронических панкреатитах с недостаточной функцией поджелудочной железы, заболеваниях печени, гипацидных и анацидных гастритах, хронических энтероколитах; выпускается в таблетках, драже; входит также в состав комплексных препаратов, содержащих, кроме того, ферменты, продуцируемые слизистой оболочкой желудка (панзинорм форте), а так же компоненты желчи, гемицеллюлазу (фестал, дигестал, энзистал); Желудочный сок натуральный. Представляет собой бесцветную или желтоватого цвета жидкость со слабым специфическим запахом, содержащую пепсин и другие 5 ферменты, продуцируемые железами желудка. Выделяется здоровыми собаками через фистулу желудка при мнимом кормлении. Применяется при нарушении процессов пищеварения, обусловленных уменьшением выработки пищеварительных ферментов, либо снижением их активности. Выпускается во флаконах по 100 мл. Пепсин - один из основных протеолитических ферментов желудочно-кишеч¬ного тракта; его получают из слизистой оболочки желудка свиней; применяют при ахилии, гипо и анацидных гастритах, диспепсии; выпускают в смеси с сахарной пудрой в порошке и таблетках; Липаза - гидролаза эфиров глицерина, липолитический фермент, эстераза. Основная функция липазы в пищеварительном процессе — расщепление поступающих с пищей жиров. Второе название — стеапсин. Является активным компонентам во многих ферментных препаратах.(8) Процесс производства Панкреатина Сырье, измельчение и производство суспензии. После ветеринарной инспекции на мясоперерабатывающих предприятиях у здоровых свиней изымаются поджелудочные железы и хранятся при температуре 20°С. Впоследствии сырье доставляется на фармацевтические предприятия и хранится там в холодильных камерах. Замороженные железы измельчаются и суспензируются в растворе бикарбоната натрия с изопропиловым спиртом для предотвращения потери ферментативной активности. Гидролиз. Далее суспензия перемещается в гидролизные камеры, где в течение нескольких часов перемешивается. После завершения гидролиза, концентрация изопропилового спирта возрастает, а температура снижается для прекращения процесса гидролиза. Полученная суспензия перемешивается для лучшего удаления волокон и нерастворимых компонентов. Впоследствии волокна отделяются из суспензии с помощью фильтрации. Преципитация Полученная суспензия помещается в камеру для перемешивания, увеличивается концентрация изопропилового спирта для преципитации ферментов, которые отделяются от жидкой фазы. Твердая фаза обрабатывается чистым изопропиловым спиртом для удаления остатков и уменьшения содержания воды. Финальная стадия процесса 6 Панкреатин высушивается в вакуумной сушке для удаления остаточной жидкости (изопропилового спирта и воды). Сухой продукт помещается в контейнеры из нержавеющей стали. Вакуумная сушка Завод по производству 7 препарата Креон® Процесс производства Пепсина Пепсин изготовляется несколькими методами. Для получения пепсина служат свежие или мороженые свиные желудки и сычуги рогатого скота. Последние дают препарат более низкого качества и с незначительным выходом. Очистка сырья. Слизистую оболочку отделяют от посторонних тканей и моют теплой водой при темрературе не выше 40° С (при более высокой температуре пепсин теряет свою активность). Измельчение. Слизистую оболочку желудка вместе с подслизистой измельчают на мясорубкеволчке (крупность 2—3 мм). После измельчения полученную слизь сразу же подвергают экстрагированию. Экстрагирование. Одну часть измельченной слизи помещают в эмалированный или фарфоровый сосуд и заливают четырьмя частями 0,5% раствора соляной кислоты. Экстрагирование производят в продолжение 8—18 ч при температуре 40—42° С при частом перемешивании, затем извлечение пропускают через полотно. Профильтрованную жидкость обезжиривают. Обезжиривание. Профильтрованную жидкость наливают в медную луженую делительную воронку, куда добавляют около 20% бензина или эфира, считая от веса взятой слизи. Смесь взбалтывают и отстаивают, после чего внизу, в водной кислой среде, остается пепсин, а в верхнем слое — жир, который сливают. К водному слою добавляют еще бензин или эфир, опять все перемешивают, отстаивают и верхний слой сливают. Упаривание. Водный раствор пепсина упаривают под вакуумом при температуре не выше 40° С. Упаривание считается оконченным после того, как остаток приобретает вид густой массы, по консистенции приближающейся к консистенции патоки или свежего меда. Смешение с молочным сахаром. Густую массу пепсина смешивают с молочным сахаром; получается порошок белого или желтого цвета, иногда гигроскопический. 8 Пепсин с водой дает мутноватый раствор слабокислой реакции; 95° спирт выделяет хлопьевидный осадок. Недостатком этого метода является то, что в полученном пепсине оказывается в виде примеси много отсыревающих пептонов; последние образуются здесь вследствие того, что пепсин переваривает белки, попадающие в него при обрабетке. Для получения лучшего препарата извлечение подвергают специальной очистке, например диализу или высаливанию. Стандартизация (по Фармакопее IX издания). 10 г измельченного куриного яйца, варенного в продолжение 10 мин в кипящей воде, смешивают с 85 мл воды при 45° С, 0,9 мл соляной кислоты и 0,1 г испытуемого пепсина в 15. мл воды. Смесь оставляют при температуре 40—45° С при частом помешивании. Через три-четыре часа весь белок должен раствориться, образуя слабомутный раствор, содержащий небольшое количество полупрозрачных желтоватых пленок. Пепсин сохраняют в хорошо закрытых банках при температуре от 2 до 15° С. Срок хранения — один год, после чего препарат подвергают повторной проверке.(4) Ферменты для биологического очищения гнойно – некротических ран В состав ферментных препаратов , применяемых для местного лечения гнойно – некротических процессов входят протеазы различного происхождения: 1. Животного – трипсин, химотрипсин, плазмин, дезоксирибонуклеаза, выделяемые из плазмы и поджелудочной железы крупного рогатого скота; 2. Растительного – папаин, получаемый из плодов папайи; 3. Микробного – коллагеназы, трипсинподобные протеазы, продуцируемые различными культурами микроорганизмов, например, Clostridium hystolyticum, Aspergillus tericoba.(12) Выпускаются такие ферментные препараты в виде порошков, взвесей, мазей, а также ферменты, закрепленные на перевязочном материале. Трипсин кристаллический, химотрипсин кристаллический, рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза, коллагеназа - ферментные препараты, получаемые из поджелудочной железы крупного рогатого скота; применяются местно и парентерально для разжижения вязких секретов, экссудатов с мокротой, сгустков крови при воспалительных заболеваниях дыхательных путей, тромбофлебитах и др., для расщепления некротизированных тканей при лечении ожогов, пролежней, гнойных ран и др.; выпускаются в виде стерильных порошков во флаконах и ампулах.(9) 9 Процесс получения Рибонуклеазы Известны способы получения рибонуклеаз из микроорганизмов, включающие культивирование продуцентов на соответствующих питательных средах и очистку целевого продукта хроматографическими методами последовательно на нескольких сорбентах. Недостатками этих способов являются многостадийность и низкий выход целевого продукта. Кроме того, применение микробных рибонуклеаз в качестве медицинских препаратов часто осложняется их иммуногенностью, обусловленной чужеродностью их для организма человека. Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности, достигаемому результату и свойствам продукта прототипом является способ получения рибонуклеазы панкреатической аморфной, включающий следующие стадии: измельчение поджелудочной железы крупного рогатого скота; экстрагирование рибонуклеазы 0,25 н раствором серной кислоты, отделение экстракта от осадка; высаливание балластных белков сульфатом аммония; очистка рибонуклеазы с применением кизельгура; повторная очистка солевым фракционированием, обработкой фенолом, ацетоном, этанолом; получение готовой формы продукта. Недостатками прототипа является: низкий выход целевого продукта, составляющий 1 г рибонуклеазы из 1480 г поджелудочной железы; сложность и многостадийность процесса; использование легковоспламеняющихся и токсичных веществ (фенола, ацетона, этанола); использование дефицитных импортных реагентов (кизельгур); использование поджелудочной железы, являющейся ценным дефицитным сырьем для получения других препаратов (инсулина). Технической задачей изобретения является упрощение известного способа получения рибонуклеазы панкреатической аморфной и увеличение выхода целевого продукта. Для решения поставленной задачи в качестве исходного животного сырья используют спиртовой шрот поджелудочной железы, являющийся неутилизируемым в настоящее время отходом производства инсулина, а очистку рибонуклеазы панкреатической аморфной осуществляют ультрафильтрацией на полых волокнах с последующей обработкой активированным углем. 10 Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Рибонуклеазу панкреатическую экстрагируют из спиртового шрота поджелудочной железы 0,25 н раствором серной кислоты в соотношении 1:4 в течение 24 ч при перемешивании. Отделяют экстракт, содержащий рибонуклеазу, от шрота стандартными методами, Очищают рибонуклеазу ультрафильтрацией на полых волокнах с помощью установки УПЛ-6, скомплектованной аппаратами разделительными типа АР-2,0 (ТО 17 216.00.00.00). Для удаления пирогенных примесей очищенную РНКазу пропускают через колонку с гранулированным активированным углем. Полученный раствор рибонуклеазы панкреатической подвергают концентрированию, стерилизации, розливу и сушке стандартными методами, предусмотренными для лекарственных препаратов.(4) Процесс получения Коллагеназы Известен способ получения очищенной коллагеназы из коммерческого комплексного препарата протеолитических ферментов из гепатопанкреаса крабов Paralithodes Camtschatica . По предлагаемому автоpами методу после осаждения фермента сульфатом аммония коллагеназу отделяют с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе CL 6B ("Pharmacia", Швеция) с последующим диализом и лиофилизацией. Полученный препарат очищен в 40 раз. К недостаткам способа следует отнести его неэкономичность вследствие использования дорогостоящего импортного сорбента, а также то, что в приведенном варианте способ является аналитическим, количественный выход не указан, процесс невозможно воспроизвести в условиях масштабного производства. Известен также способ получения коллагеназ из гепатопанкреаса камчатского краба из препарата Дигестаза , включающий гель-фильтрацию на сефадексе G-75 ("Pharmacia"), ионообменную хроматографию на колонке с Моно-Q ("Pharmacia") в режиме FPLС, с последующими обессоливанием и лиофилизацией. Способ также является аналитическим, количественный выход не указан, используются дорогие импортные сорбенты и оборудование. Степень очистки в 2-20 раз в зависимости от способа определения активности. Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ получения препарата из гепатопанкреаса краба Fiddler Crab, Uca pugilator путем гомогенизации сырья, осаждения комплекса ферментов сульфатом аммония и его очистки на ионообменном сорбенте. Способ включает следующие стадии: приготовление ацетонового порошка из гепатопанкреаса, центрифугирование, осаждение сульфатом аммония 70% насыщения рН 7,5 с добавлением 5 мМ CaCl2, центрифугирование, гель-фильтрация на сефадексе G-150 ("pharmacia", Швеция), хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматография на гидроксиапатите, гель11 фильтрация на сефадексе G-75, диализ с последующей лиофилизацией. Выход целевого продукта 7% . Степень очистки в 32 раза. К недостаткам способа следует отнести использование дорогостоящих импортных реактивов и оборудования, трудоемкость процесса, многостадийность, незначительный выход целевого продукта. Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса, а также повышение выхода целевого продукта без уменьшения его удельной активности. Это достигается тем, что гепатопанкреас крабов гомогенизируют, осаждают комплекс ферментов сульфатом аммония, который в отличие от прототипа подвергают очистке на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,5, элюируя коллагеназу 1 М NaCl с 15-25% изопропанола при рН 7,0-8,5, а затем фермент выделяют из элюирующего раствора при насыщении его сульфатом аммония до 60% , достигая при этом дополнительной очистки. Предлагаемый способ является более экономичным за счет использования аминированных силикатных материалов - аминосилохромов, аминоаэросилов, амино- силикагелей, выпускаемых отечественной промышленностью, что способствует значительному удешевлению процесса очистки. Кроме того, скорость протекания растворов через сорбенты на основе макропористых силикатов на порядок выше, чем в случае сорбентов на основе сефарозы и целлюлозы. Повышение выхода целевого продукта достигается за счет сокращения времени очистки и числа стадий, т. к. коллагеназа может при длительном процессе разрушаться протеиназами, присутствующими в ферментном растворе. Проведение ионообменной хроматографии при рН 5,2-6,4 более целесообразно, чем при рН 7,5 (прототип), т. к. коллагеназы имеют изоэлектрические точки около рН 3,0, и проведение процесса в более низком интервале рН способствует более полной сорбции фермента из раствора. Для дополнительной очистки и концентрации фермента коллагеназу высаливают из элюирующего раствора, насыщая его сульфатом аммония до 60% . Эта операция, не снижая выхода фермента, приводит к кристаллическому продукту. Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. В качестве источника коллагеназы используют гепато- панкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделяют экстракт центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения, осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 5,2-6,4 с добавлением 0,1-1,0 мМ Са2+. Затем наносят на макропористый кремнезем, содержащий ковалентно присоединенные алифатические аминогруппы, и промывают. Десорбцию проводят 1 М NaCl в присутствии 15-25% изопропилового спирта на буфере рН 7,0-8,5. Для усиления положительного эффекта к элюату, содержащему 12 активный фермент, добавляют сульфат аммония до 60% насыщения. Слой, содержащий активную коллагеназу, отделяют, диализуют и лиофильно высушивают. В результате получают очищенный ферментный препарат, обладающий коллагенолитической активностью, которую определяют известными методами. Выход 50% .(4) Производство ферментов из сырья растительного происхождения Для получения ферментов используется также и сырье растительного происхождения. В ряде случаев преимущества растений существенны: — заготовка их технологически более проста; — высушенный материал можно компактно упаковывать и хранить продолжительное время в условиях, не требующих специального технологического оборудования. Для выделения ферментов часто используют семена растений, которые богаты белками, могут сохранять ферментативную активность на протяжении ряда лет. К недостаткам растительного сырья можно отнести сезонность его заготовки и неодинаковое содержание ферментов в различных частях растения. Фармацевтические предприятия нашего государства растительные протеиназы не производят, так как большинство растений, их продуцирующие, в основном произрастают в тропических странах.(7) В лаборатории ферментных препаратов ГНЦЛС, являющейся единственной по профилю своей деятельности в странах СНГ, впервые получены препараты из сырья растительного происхождения медицинского назначения различной специфики действия. Процесс получения Папаина Папаин содержится в незрелых плодах папайи, в составе млечного сока (латекса), который обильно выделяется, если сделать на кожице таких плодов надрезы. Такие надрезы достаточно глубокие, но они не затрагивают внутренних слоев мякоти плодов . Их делают ножом из нержавеющих материалов (иногда применяют ножи из слоновой кости). Вытекающий белый густой сок собирают в чашки . Истечение сока продолжается несколько часов. Когда оно прекращается, растение со всеми 13 надрезанными, но не снятыми плодами, оставляют на 3—5 дней отдохнуть, после чего можно производить вторичное надрезание тех же или соседних плодов и получить новую порцию сока. Выход млечного сока — около 0,1 % от массы сырого плода. Его из чашек выливают на плоские листы и в тонком слое высушивают обычно на солнце (что нежелательно, так как получается готовый продукт посредственного качества), или же — в воздушных сушилках при температуре не выше 38 °С в течение суток. Полученный сухой продукт как полуфабрикат для получения готового фермента передается промышленности. Выход сухого млечного сока от одного достаточно развившегося плодоносящего растения папайи в год может достичь 0,5 кг при среднем содержании в нем влаги 5-8 %. Требования. Материал должен быть однородным: от светлодо темно-кремового во втором сорте цвета, не иметь постороннего запаха. Не допускается наличие песка, грязи, фрагментов насекомых. Влажность папаина не выше 10 %, содержание общего азота в первом сорте не менее 8,5 % (во втором — 7,5 %). Зольность не выше 11 %, зола нерастворимая в кислотах не более 0,2%, спиртонерастворимых экстрактивных веществ не более 30%. Важный показатель стандарта — протеолитическая активность — в см3 0,1 н NaOH — для первого сорта не менее 6,0, для второго сорта — 4,5.(6) Оборудование для получения ферментных препаратов. Ферментаторы. Устройство ферментатора: барбатер петлеобразный, продуктопровод с опуском до дна сосуда и выводом через верхний пояс после рубашки, пробоотборник отражательные перегородки (отбойники) – 4 шт., начинающиеся от дна. Мешалка: торцевое уплотнение вала, быстроходная, лопастная (6 лопастей), с возможностью регулирования мешалки по высоте на вале Выход воздуха через верхнюю крышку ферментатора. В верхней крышке установить два смотровых окошка, посевной люк с быстросъемной крышкой. Пульт управления аппаратом IP65, включая управление режимами нагрева и охлаждения ферментатора, мешалкой с интерфейс-выходами с возможность подключения к промышленному компьютеру.(15) 14 Ферментатор периодического действия (1 — турбинная трсхярусная мешалка, 2 — охлаждающий змеевик. 3 — секционная рубашка. 4 — отражательная перегородка. 5 барботер. П-пар); I—XI — материальные и вспомогательные трубопроводы с запорнорегулирующими устройствами (I — посевная линия. I —подача стерильного сжатого воздуха. III — подача пара, IV — удаление отработанного воздуха. V — загрузочная линия, VI — линия введения добавок, VII подача пеногаситсля, VIII — подача моющего раствора. IX — пробоотборник. X -выдача 15 продукта, XI — выдача в канализацию через нижний спуск). Ферментатор с эрлифтом В аппарате отсутствует механическое перемешивание, поэтому проще поддерживать асептические условия. Воздух для аэрации среды подастся по трубе, расположенной вертикально в ферментаторе. Аэратор, конструкция которого обеспечивает вихревое движение выходящего воздуха, расположен в нижней части диффузора и насыщает питательную среду воздухом. Газожидкостная смесь поднимается по диффузору и перемешивается через его верхние края. В этой же зоне часть воздуха уходит из аппарата, и более плотная среда опускается вниз в кольцевом пространстве между корпусом ферментатора и диффузором. Так происходит многократная циркуляция среды в ферментаторе. Для отвода биологического тепла внутри ферментатора установлен змеевик, а также аппарат снабжен секционной рубашкой 1 — штуцер для слива, 2 — аэратор, 3 — змеевик, 4 — штуцер для загрузки. 5 — люк, 6 — корпус аппарата, 7 — диффузор, 8 — рубашка, 9 — труба передавливания. Ферментатор с самовсасывающей мешалкой непрерывного действия Широкое распространение в фармацевтическом производстве получили ферментаторы с самовсасывающими мешалками. Ферментатор представляет собой вертикальный цилиндрический аппарат, снабженный циркуляционными, теплообменными и аэрирующими устройствами. В качестве циркуляционных устройств использованы системы направляющих диффузоров, разграничивающих 16 восходящие и нисходящие потоки. Теплообменные устройства выполнены в виде трубок, установленных в трубных решетках диффузоров. (15) 1 — корпус, 2 — диффузор, 3 — самовсасывающая мешалка. 4 — теплообменник, 5 — фильтр. Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим. Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования. Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды, поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму. Посевной материал может быть трёх видов: - культура, выросшая на твердой питательной среде; - споровый материал; - мицелиальная культура, выращенная глубинным способом. 17 В три этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды. Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов. Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%). Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде - в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки. Схема очистки сводится к следующему: - освобождение от нерастворимых веществ; - освобождение от сопутствующих растворимых веществ; - фракционирование (как правило, хроматографическими методами). Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности. 1 — пневмотранспорт сыпучих компонентов; 2 — бункера; 3— ворошители; 4— шнек; 5 — пневмотранспорт отрубей; 6 — циклоны для очистки отходящих газов; 7 — вентилятор; в — автоматический дозатор отрубей; 9 — стерилизатор сыпучих компонентов; 10 — стерилизатор воды; 11—теплообменник; 12— мерник 18 стерильной воды; 13 — дозатор; 14 — емкость для концентрированной соляной кислоты; 15—мерник разбавленного раствора соляной кислоты; 16 — емкость для посевной суспензии; 17 — стол; 18 — кювета под загрузкой; 19 — передвижная этажерка для перемещения кювет; 20 — растительная камера; 21— кондиционер; 22 — фильтр предварительной очистки; 23—фильтр очистки от микробного загрязнения; 24 — этажерка с готовой культурой; 25 — мойка этажерок; 26 — стерилизация этажерок; 27— кювета на разгрузке; 28 — грязная кювета; 29 — мойка кювет; 30 — чистая кювета; 31 — камера для стерилизации кювет; 32 — стерильная кювета; 33 — дробилка. Глубинный метод производства ферментов В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.(10) При глубинном культивировании продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов. 1. Приготовление питательных сред зависит от состава компонентов. 19 Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента. 2. Получение засевного материала. Для засева питательной среды материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается только вегетативно, он резко возрастает (до 5-20%). Если же происходит обильное спороношение - сокращается до 1%. 3. Производственное культивирование. Биосинтез ферментов в глубинной культуре протекает в течение 2-4 суток при непрерывной подаче воздуха и перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-32оС. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в компьютер, который определяет стратегию коррекции процесса и автоматически регулирует его. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов. 4. Выделение. В мицелии трёхсуточной культуры обычно остается не более 15% ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы. 4. Получение товарной формы.(10) Иммобилизация ферментов Общая характеристика иммобилизованных ферментов Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут 20 быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 году, когда Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.(13) Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может иметь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно иметь большую поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1—0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер.(14) Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками: 1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт. 2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта. 3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям. 4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру.(11) 21 Классификация носителей для ферментов Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и неорганических носителей. К носителям предъявляются следующие требования (Дж.Порат, 1974): высокая химическая и биологическая стойкость; высокая химическая прочность; достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность; возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран); легкая активация; высокая гидрофильность; невысокая стоимость.(13) Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического происхождения. Природные полимерные органические носители делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные. Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные. Для иммобилизации ферментов наиболее широко используются природные полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, остальные применяются значительно реже. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп, легко вступающих в химические реакции. Характерной особенностью этой группы носителей также является их 22 высокая гидрофильность. Недостаток природных полимеров - неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость. Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко превратить в различные ионообменные производные. Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под названием "сефадексы". При высушивании они легко сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Водорастворимые препараты на основе декстрана часто применяются как носители лекарственных средств в медицине. Хорошим носителем считается агар. Его свойства улучшаются после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар становится устойчивым к нагреванию, прочен, легко модифицируется. Белки в качестве носителей обладают рядом достоинств: вместительны, способны к биодеградации, могут применяться в качестве тонкой (толщиной 80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов на белковых носителях можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов. Белки используются и в фундаментальных биологических исследованиях, и в медицине. К недостаткам белков в качестве носителей относят их высокую иммуногенность (за исключением коллагена и фибрина). Наиболее для иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген), двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки. Синтетические полимерные носители применяются для ковалентной и сорбционной иммобилизации ферментов, для получения гелей, микрокапсул. Полимеры на основе стирола применяются сорбционной иммобилизации. Они могут иметь макропористую, изопористую структуру, а также гетеропористую структуру.(13) Методы иммобилизации ферментов Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический. 23 Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов: - адсорбция на нерастворимых носителях; - включение в поры геля; - пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны); - включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз. Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б – включение в поры геля, в – отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны, г – использование двухфазной реакционной среды.(11) Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов, начало ей было положено еще в 1916 г. Этот способ достаточно прост и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный 24 фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора может сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя. Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Важным фактор - простота применяемых методик. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента. Некоторых из перечисленных затруднений можно избежать при иммобилизации ферментов путем включения в гели. Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и его природы содержат от 50 до 90% воды. Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В 25 другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем какимлибо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще. Общий принцип иммобилизации ферментов с использованием мембран заключается в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для крупных молекул фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента. Через некоторое время растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. К модификациям метода иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек относятся также включение в волокна ( при этом вместо капель, содержащих ферменты, получаются нити) и включение в липосомы. Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием фермента. Метод, как и предыдущий, достаточно универсален, т.е. применим как ферментам, так и к клеткам, а также их фрагментам. Благодаря высокому отношению поверхности к объему и малой толщине мембраны удается избежать значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций. Основной недостаток мембранных систем - невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов. 26 При иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается благодаря его способности растворяться только в одной из фаз. Субстрат и продукт ферментативного превращения распределяются между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор. Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Химическая иммобилизация ферментов является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При химической модификации фермента его активный центр желательно защищать. При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. В промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации.(10) 27 ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Ферменты это белки, катализирующие определённые химические реакции, входящие в процессы обмена веществ, отличаются чрезвычайно высокой эффективностью и специфичностью своего действия. По своему составу ферменты разделяют на простые ферменты, состоящие только из молекул белка, и сложные ферменты, состоящие из белка и небелкового компонента (простетические группы, коферменты). Каталитическое действие ферментов определяется главным образом, частью молекулы - активным центром. Действие всех ферментов происходит через стадию образования промежуточного соединения с молекулой субстрата. Ферменты играют важную роль в организме, в науке, в хозяйственной деятельности человека. Открытие разнообразных наук позволяет шире использовать ферменты.Изучение ферментов и ферментативных процессов позволит в дальнейшем расширить сферу их применения и откроет дополнительные возможности, а в дальнейшем, возможно, поможет избавиться от многих болезней. 28 Сипсок литералуры 1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1. М.: Мир, 1994. 2. Мосс Д. В., Баттерворт П. Дж. Энзимология и медицина. – М.: Медицина, 1978.- 288с. 3. Номенклатура ферментов. Рекомендации Международного биохимического союза по номенклатуре и классификации ферментов, символам кинетики ферментативных реакций./ Под редакцией А.Е. Браунштейна.-1979.- 322с. 4. Калунянц К. А. Голгер Л.И. Микробные фермнтные препараты ( технология и оборудование). –М.: Пищевая прм-ть, 1979.-304с. 5. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов.- 2-е изд., перераб. и доп. – 1987.-335с. 6. Активность фермента инвертазы в семенах овса//Фармацевтический журнал.1992.-N 3. С.81-83. 7. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов.-М.: Мир, 1980- 432с. 8. Березин И.В. Мартинек К. Химическая энзимология. -1983.- 277с. 9. Березин И.В. Мартинек К. Введение в прикладную энзимологию.-1982.-384с. 10.Биотехнология/Под ред. А.А. Баева.-М.: Наука, 1984.-309с. 11.Биотехнология/Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. М.: Высшая школа, 1987.-143с. 12. Николаев А.Я. Биологическая химия.- М.: МИА, 1998.-495с. 13. Гриненко Т.В. Иммобилизация стрептокиназы на носителях, свойства иммобилизованного белка//Укр. биохим. журнал.-1973.- N 3- с. 307-310. 14. Москвичева Б.В. Ферментотерапия: состояние и перспективы.- 1986.- с.19-20. 15. http://www.google.com.ua. Оборудование для получения ферментов. Ферментаторы. 29
