Орынбасар Айнур 19-12 ЛПЗ 1 Особенности лаборатории культуры тканей и клеток растений, специализированные комнаты. Общие принципы стерилизации и методы стерилизации растительных объектов. 1. История развития метода культивирования клеток, тканей и органов растений. 2. Организация биотехнологической лаборатории. 3. Асептические технологии, используемые при культивировании растительных клеток и тканей. Таблица 1 - Условия стерилизации питательных сред, инструментов, посуды Материал Режимы стерилизации Питательные среды Стерилизация большинства питательных сред производится в автоклавах при нагревании до 120° С в течение 30 или 45 мин Инструменты Инструменты автоклавировать нельзя, так как они от этого портятся. Инструменты помещают в плотно закрывающийся металлический пенал, в котором их можно переносить из одного помещения в другое, и стерилизуют путем прогревания в сушильном шкафу при температуре 160оС в течение 2-4 час. Вода Фильтрация Ламинар-бокс Перед работой проводится стерилизация ламинар-бокса с помощью встроенных бактерицидных ламп в течение 40 – 60 мин. За 10-15 минут до окончания обработки ламинарбокса ультрафиолетом дополнительно включают активную продувку стерильным воздухом. Бумага бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160°С в течение часа от момента показания термометром данной температуры или в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 минут. Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов нужной величины. После этого каждый вид материала в отдельности по одной или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета стерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается. Посуда Сухим теплом стерилизуют лабораторную стеклянную посуду (колбы, пипетки, пробирки, чашки Петри и пр.) при +160-200 °С. Для стерилизации растительного материала применяют стерилизующие вещества, в состав которых входит активный хлор или ртуть. Время стерилизации определяется конкретно для определенного растительного объекта. Запишите в таблицу 3 режимы стерилизации различных растительных эксплантов. Таблица 2 -Режимы стерилизации растительных эксплантов Растительный объект Временная экспозиция стерилизации Семена гладкие Перекись водорода 10-12% в течение 15 мин. Семена опушенные Концентрированной серной кислотой в течение 5 минут. Семена ребристые Марганцовокислым калием (1%-ный раствор) в течение 30-40 мин. Изолированные почки 5-7%ный раствор гипохлорита натрия в течение 5-8 мин. Молодые побеги В течение 5 мин. 75%-ным спиртом, а затем 15 мин. 1%ным гипохлоритом натрия. Одревесневшие побеги 0,2%-ный раствор сулемы в течение 45 мин. Листья в начале вегетации 2%-ный раствор сулемы. Листья в конце вегетации 6% раствор гипохлорита натрия. Корнеплоды 0,1%-ный раствор сулемы в течение 20 мин; 0,2%-ный раствор диацида в течение 10 мин. Корни Гипохлорит кальция в концентрации 90г/л в течение 15 мин. Цветочные бутоны Промывка мыльной водой в течение 30 мин. (перед следует обработка 70%-ным этиловый спиртом). 1. История развития метода культивирования клеток, тканей и органов растений. Метод культуры клеток и тканей растений был разработан в первой половине прошлого столетия. Однако определенные идеи и предположения, экспериментальные наработки в этом направлении были сделаны более 100 лет назад. В истории развития метода культивирования клеток и тканей растений можно выделить несколько этапов. I этап (1878–1902 гг.) связан с именами таких немецких исследователей, как Габерландт, Фехтинг, Рехингер. В конце XIX – начале XX века они пытались культивировать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув при этом значительных экспериментальных успехов, эти исследователи высказали ряд идей и гипотез, подтвержденных позже. II этап (1902–1922 гг.) ознаменовался созданием первых питательных сред для культивирования тканей животных. Гаррисон и Каррель разработали методику выращивания животных клеток на питательных средах природного происхождения (плазма крови, зародышевая жидкость, лимфа). III этап (1922–1932 гг.). Новый подход к методам культивирования изолированных клеток и тканей растений был заложен в 1922 г. одновременно в Германии Котте и в США Робинсоном. Они постулировали необходимость использования для культивирования меристематических клеток, а также применения более сложных по составу культуральных сред. IV этап (1932–1940 гг.). Начало успешному развитию метода культуры тканей и клеток высших растений положили работы двух исследователей – француза Готре и американца Уайта. Их считают родоначальниками современных методов культивирования изолированных тканей и органов растенийнного направления экспериментальной биологии растений. V этап (1940–1960 гг.). В этот период ученики и последователи Уайта и Готре закрепляют успех. Увеличивается число видов растений, ткани которых культивируются in vitro. Разработаны составы ряда питательных сред, изучено значение макро- и микроэлементов, витаминов и стимуляторов роста растительного происхождения (эндосперм кокосового ореха, каштана, кукурузы, гидролизат дрожжей и т.п.). Это позволило получать длительные пересадочные культуры из разных органов и тканей растений. Их список, приведенный в классической монографии по культуре тканей, написанной Готре (1959), включал уже 142 вида высших растений. VI этап (1960–1975 гг.). Одним из наиболее важных достижений в этот период явилась разработка профессором Коккингом (1960) метода получения изолированных протопластов из корней и плодов томата ферментативным путем и культивирования их в контролируемых условиях. VII этап (1975 г. – по настоящее время). Этот период характеризуется быстрым развитием техники in vitro, изучением биологии культивируемых растительных объектов и созданием биотехнологий на их основе. [1] ПОМЕЩЕНИЯ, ОБОРУДОВАНИЕ И ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ РАБОТ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ Для проведения работ с культурой клеток растений требуются лабораторные комнаты: для мытья и стерилизации посуды и инструментов; приготовления и стерилизации питательных сред; цитологических исследований; получения, пассирования и других манипуляций с клеточными культурами; культивирования клеток растений, а также боксовая или грунтовая теплица с искусственным освещением. В комнате для мытья посуды, как правило, имеется аквадистиллятор (аквабидистиллятор). Дистиллированная вода необходима для приготовления питательных сред, полоскания вымытой посуды, эксплантатов после их обработки стерилизующими агентами. Вымытую посуду просушивают в суховоздушном шкафу при 80–100 °С. Высокая температура также обеспечивает ее стерилизацию. Для работ по культуре клеток растений используют: посуду стеклянную химическую различного типа и объема для приготовления питательных сред и хранения запасных растворов, получения и манипуляций с культурами (вычленения и стерилизации эксплантатов, пассирования культур, черенкования пробирочных растений и др.); для культивирования: колбы, стаканы, чашки Петри, пробирки, мензурки, мерные цилиндры, пипетки. В последнее время широкое применение нашла разнообразная пластиковая посуда для культуры клеток растений разового использования. Однако во многих случаях удобнее и дешевле использовать стеклянную посуду. В комнате для мытья посуды нередко размещают автоклавы, которые необходимы для стерилизации питательных сред и посуды, а также отдельный суховоздушный шкаф для стерилизации инструмента. Инструменты стерилизуют при 160 °С в течение 4 ч,помещая их в металлические пеналы. Минимальный набор инструментов включает в себя: пинцеты разной длины с тупыми и острыми концами, скальпели, ножницы и щипцы медицинские (рис. 1.1, а). В процессе работы инструменты размещают на специальном штативе или стерилизованных чашках Петри, после каждой операции их погружают в 96 % спирт и прожигают в пламени спиртовки, затем охлаждают (рис. 1.1, б). А Б Рис. 1.1. Набор инструментов для работы с культурой клеток растений: а – набор инструментов: 1 – пинцет глазной (офтальмологический) 5–7 см с острыми концами; 2 – пинцет короткий (5–7 см) с тупыми концами; 3 – пинцеты длиной 10–14 см; 4 – скальпели хирургические; 5 – длинный пинцет; 6 – щипцы уретральные; 7 – ножницы; б – инструменты на штативе и стеклянной чашке Петри в процессе работы в ламинар-боксе В комнате для приготовления питательных сред должны быть различные весы, лабораторный рН-метр, электроплита и водяная баня для приготовления агаризованных питательных сред (для небольших объемов можно использовать микроволновую печь), холодильник, морозильник, магнитная мешалка, вытяжной шкаф. В этой же комнате или отдельном помещении могут располагаться микроскопы (обычные и/или инвертированные), бинокулярные лупы, счетчики клеток и другое оборудование и инструменты, необходимые для цитологических исследований, манипуляций с протопластами. Все работы, непосредственно связанные с культурой клеток растений (вычленение и стерилизация эксплантатов, пассирование культур, черенкование пробирочных растений и др.), проводят в ламинар-боксах, которые размещают в отдельном помещении или в комнате для приготовления питательных сред и проведения цитологических исследований. Ламинар-бокс (камера обеспыливания) представляет собой стол с поверхностью из нержавеющей стали, изолированный от окружающей среды сверху, сзади, слева и справа. В рабочее пространство ламинар-бокса (над столом) поступает под давлением стерильный воздух, что обеспечивает условия асептики, необходимые для работ по культуре клеток растений. Воздух засасывается в ламинар-бокс из помещения с помощью специального насоса и пропускается через фильтры грубой и тонкой очистки, которые задерживают не только частицы пыли, но и клетки микроорганизмов. Различают ламинар-боксы горизонтальные и вертикальные (в зависимости от направления движения стерильного воздуха в рабочем пространстве), в равной степени эффективные. Перед началом работы поверхность стола ламинар-бокса обеззараживают с помощью бактерицидной УФ-лампы, встроенной над поверхностью стола (в течение 30–60 мин), затем стол протирают 70 % раствором этилового спирта. В качестве культуральной комнаты обычно используют изолированное помещение, оборудованное кондиционером. В нем размещают термостаты (культивирование клеток растений в темноте). Однако во многих случаях при культивировании клеток растений требуется освещение.Для этого в простейшем случае в культуральной комнате размещают стеллажи с лампами дневного света (рис. 1.2, а). Лампы могут располагаться сверху над полками или по центру между двумя полками (культуры освещаются в этом случае в основном сбоку). Лампы включаются и выключаются автоматически в определенное время. Для культивирования клеток растений могут использоваться также различные климатические камеры с регулируемым режимом освещения, температуры и влажности (рис. 1.2, б). А Б Рис. 1.2. Установка для культивирования клеток растений на свету: а – стеллаж с верхним освещением культуры in vitro люминесцентными лампами; б – выращивание культуры in vitro в климатической камере с боковым освещением люминесцентными лампами специального спектрального состава Для работ по культуре клеток растений необходима боксовая или грунтовая теплица с искусственным освещением. Во-первых, в ней могут выращиваться растения, с которых берут эксплантаты. Эксплантаты, полученные с таких растений, как правило, менее инфицированы, чем с растений, выращиваемых в поле. Кроме того, успех культивирования клеток растений и получения растений-регенерантов в некоторых случаях в значительной степени зависит от условий выращивания (температура, режим и способ освещения) растений-доноров эксплантатов (например, при получении гаплоидов в культуре пыльников). Во-вторых, теплица необходима для высадки в грунт полученных растенийрегенерантов, так как их перенос в условия in vivo из пробирок требует специальной адаптации. ОБЕСПЕЧЕНИЕ АСЕПТИКИ ПРИ РАБОТЕ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ Как отмечалось выше, культура клеток растений может быть получена и успешно поддерживаться только при условии соблюдения асептики. Это достигается благодаря использованию различных методов стерилизации помещений, лабораторной посуды, инструмента, питательных сред. Особо тщательно стерилизуют поверхность эксплантатов, предназначенных для получения культуры клеток. Все работы, при которых открывают культуральные сосуды (разлив стерильной питательной среды по пробиркам, чашкам Петри, колбам, вычленение эксплантатов и их перенос на питательную среду, перенос части культуры на свежую питательную среду и др.), проводят в стерильных условиях в рабочем пространстве ламинар-бокса с соблюдением правил асептики. Вся посуда (за исключением пластиковой одноразовой) перед употреблением должна быть стерилизована автоклавированием с последующим подсушиванием в сушильном шкафу или с использованием вакуумной сушки при наличии ее в автоклаве. Перед автоклавированием посуду заворачивают в крафт-бумагу или помещают в биксы, чтобы исключить их повторное заражение при транспортировке. Режим автоклавирования: давление 1,5 атм, время стерилизации 40– 60 мин. Подсушивание в сушильном шкафу проводят при температуре около 100 °С в течение 30–40 мин. Инструменты автоклавировать нельзя, так как они от этого портятся. Их помещают в плотно закрывающийся металлический пенал, в котором они переносятся из одного помещения в другое, и стерилизуют путем прогревания в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 2–4 ч. При работе в ламинар-боксе, чтобы избежать контакта инструментов с рабочими поверхностями, инструменты размещают на специальном, термостойком и огнеупорном (металлическом) штативе. Инструменты в процессе работы (после каждого акта использования) стерилизуют погружением в 96 % этанол и последующим обжиганием в пламени спиртовки (или газовой горелки, если ламинар-бокс ею оборудован). Поскольку горячие инструменты могут повредить растительные ткани, необходимо иметь, как минимум, двойной набор инструментов для проведения одной операции (один набор в работе, второй остывает). В некоторых лабораториях для стерилизации инструмента в ходе работы используют специальные нагреватели, например инфракрасные. Перед работой проводится стерилизация ламинар-бокса с помощью встроенных бактерицидных ламп в течение 40–60 мин. За 10–15 мин до окончания обработки ламинар-бокса ультрафиолетом дополнительно включают активную продувку стерильным воздухом. Для этого устанавливают режим продувки ламинар-бокса 80–100 % мощности. После окончания стерилизации выключают бактерицидные лампы, снижают поток воздуха до 40–60 % мощности. Непосредственно перед исследованием рабочие поверхности ламинар-бокса протирают 96 % этанолом. Сотрудник, проводящий работы в ламинар-боксе, должен протирать руки этиловым спиртом в начале работы и периодически в ее процессе. Стерилизация поверхности растительных тканей перед вычленением эксплантатов и помещением их на питательную среду является одним из наиболее важных этапов получения культуры клеток растений, так как во многих случаях добиться полной их стерильности очень сложно. Успех стерилизации зависит от целого ряда факторов. Как правило, эксплантаты от растений, выращенных в условиях закрытого грунта, намного чище по сравнению с экс плантатами от растений, выращиваемых в поле. Сильно загрязнен растительный материал подземных органов растений (клубней, луковиц и т. п.). Их перед стерилизацией необходимо тщательно вымыть в мыльном растворе и прополоскать дистиллированной водой. Сложно стерилизовать растительный материал густо опушенных тканей (покрытых волосками), что затрудняет контакт стерилизующих агентов с поверхностью из-за образующихся пузырьков воздуха. Для их стерилизации применяют специальные приемы, описанные ниже. Наконец, решающим может быть выбор стерилизующих агентов. Для поверхностной стерилизации растительного материала используют растворы гипохлорита кальция или натрия (5–10 %), раствор перекиси водорода (10– 12 %), бромную воду (1–2 %), растворы нитрата серебра (1 %), сулемы (хлорида ртути 0,1 %) и другие агенты, которые можно найти в каталогах фирм, производящих реактивы для культуры клеток растений. В особо трудных случаях в питательную среду добавляют антибиотики. Рис. 1.3. Стерилизация растительного материала с использованием вакуумного насоса Камовского: а – обработка среза побега (генеративный побег картофеля с бутонами, из которых предполагается вычленять пыльники) клеем БФ-6 для предотвращения попадания стерилизующего агента в срез побега в условиях вакуума; б – упаковка побегов в марлевый мешочек, позволяющий стерилизующему агенту свободно проникать к стерилизуемому материалу, а также быстро извлекать растительный материал из колбы после стерилизации; в – мешочек с упакованным растительным материалом; г – мешочек с растительным материалом, помещенный в колбу Бунзена, подсоединенную к вакуумному насосу через боковой отводок (экспериментатор заливает одной рукой в колбу стерилизующий агент, в другой руке держит пробку для укупоривания колбы) (фото Т. В. Никонович) Высокая эффективность стерилизации эксплантатов была достигнута нами при использовании 70 % этанола и диацида.Диацид представляет собой 0,1 % водный раствор этанолмеркурихлорида C2H5ClHg и цетилпиридинилхлорида C21H38NCl · H2O. Его можно использовать многократно: при правильном хранении он сохраняет эффективность в течение одного года и более. Стерилизуемый растительный материал погружают сначала в спирт (30–40 с), затем в раствор диацида (7–10 мин). После этого его тщательно промывают в 4–5 порциях проавтоклавированной дистиллированной воды. Для того чтобы улучшить смачивание стерилизуемых опушенных поверхностей эксплантатов, применяют так называемую вакуумную стерилизацию. Для ее проведения растительный материал помещают в колбу Бунзена, в которую заливают стерилизующий раствор. Колбу плотно укупоривают с помощью плотно прилегающей к горлышку пробки, подсоединяют через отводок к вакуумному насосу, и с его помощью откачивают из нее воздух (рис. 1.3). Вычленение эксплантатов и перенос их в культуральные сосуды на питательную среду производят непосредственно после стерилизации растительного материала. Эту процедуру выполняют в ламинар-боксе, тщательно соблюдая правила асептики. В простейшем случае стерилизованный растительный материал помещают в открытые проавтоклавированные чашки Петри и стерильным инструментом (скальпелем или ножницами) вырезают фрагменты растительного материала нужного размера. Пробирки открывают в пламени спиртовки и с помощью стерильного длинного пинцета или уретральных щипцов эксплантат переносят на поверхность питательной среды. Для каждой очередной такой операции используют новые автоклавированные чашки Петри и простерилизованный (погружением в 96 % этанол с последующим прожиганием в пламени спиртовки) и охлажденный инструмент. В некоторых случаях эксплантаты весьма мелкие, их необходимо освободить от покровных тканей (например, пыльники, которые извлекают из простерилизованных цветочных бутонов, колосков). Для такого случая удобно использовать проавтоклавированную подложку из двойных листов целлофана, переложенных крафт-бумагой. Растительный материал, например цветочные бутоны, помещают ближе к краю, между двух листов целлофана и, придерживая их сверху пальцем (через целлофан), извлекают стерильным инструментом пыльники, не опасаясь их контаминации. Одной пары целлофановых листов размером 15×15 см хватает для извлечения пыльников из 8–12 бутонов (по 2–3 с каждой стороны целлофанового листа). [2] Источники литературы: 1. 2. Т.И. Дитченко КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ КУРС ЛЕКЦИЙ 3. Сорокина И.К. и др. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей Ермишин, А. П. Биотехнология растений и биобезопасность : пособие / А. П. Ермишин, Е. В. Воронкова. – Минск : БГУ, 2015. – 359 с. : ил. ISBN 978-985-566-195-6.
