Боже дай отл по Манухову Дорогинин Д.В. et al. Содержание 1. Химическая и биологическая эволюция. Наследственность, изменчивость и естественный отбор. Основные таксономические группы живых систем. Строение клетки про- и эукариот (сходства и различия). Единство молекулярных механизмов живых систем (примеры). Организация генома живых существ: хромосомы, ДНК пластид и митохондрий, плазмиды. 2. 1 Основные классы биологических молекул: липиды, углеводы, аминокислоты, нуклеотиды (привести примеры, уметь нарисовать). А-форма, В-форма и Z-форма ДНК. Особенности геномной организации про- и эукариот (цистронная и оперонная организация, форма хромосомы). Генетический код. Понятие гена, пронятие аллеля. Понятие митоза и мейоза. Редукционное деление, кроссинговер. 3. 5 Репликация ДНК: репликация линейных и кольцевых молекул ДНК, затравка для ДНК-полимеразы, праймирование, фрагменты Оказаки. Ферменты, необходимые для репликации ДНК (полимеразы I и III, топоизомеразы, хеликаза, лигаза, праймаза, ssb). Теломеры и центромеры эукариот. Ориджины репликации бактерий. Белки определяющие начало репликации бактерий (DnaABC, ssb, SeqA, dam). Репликация кольцевых молекул ДНК по Тета типу и по типу катящегося колеса. 4. 8 Транскрипция. РНК-полимеразы, информационная РНК и генетический код, транспортные РНК, рибосомальные РНК Промоторы и терминаторы транскрипции прокариот, RBS сайт. Транскрипция эукариот (процессинг мРНК, сплайсинг, Cap сайт, polyA), промоторы эукариот, энхансеры, сайленсеры. 11 5. Трансляция. Структура рибосомы. Рибосомная РНК и белки. Функциональные активности и функциональные участки рибосомы. Информационные и транспортные РНК. Аминоацил-тРНК-синтетазы. Энергетика биосинтеза белка, использование АТФ и ГТФ. Инициация трансляции у прокариот, последовательность Шайна – Далгарно. Инициация трансляции у эукариот, кэп-сайт. Терминация трансляции. 6. 13 Репликоны. Инициация раунда репликации ДНК Escherichia coli. Белки участвующие в регуляции инициации репликации (DnaABC, ssb, SeqA, dam). Топологические проблемы репликации. Сегрегация репликонов по бактериальным клеткам. Репликация плазмид, мобильных элементов, фагов и вирусов. Особенности репликации в эукариотах. Теломеры и центромеры. Сегрегация хромосом. 7. 15 Мутагенез. Спонтанный мутагенез. Скорость мутагенеза. Индуцированный мутагенез. Репарация димеров тимина с помощью фотолиазы и эксцизионной репарации. Понятие сайт-специфического мутагенеза. 8. Гомологичная рекомбинация. Модель Холлидея. Гены рекомбинации (recA, ssb, ruvABC). RecA и SOS-ответ. Сайт-специфическая рекомбинация. Рекомбинация в эукариотах. Кроссинговер. 9. 18 20 Промоторы прокариот и регуляторные элементы. Лактозный оперон. Аттенюация на примере триптофанового оперона. Quorum sensing регуляция luxR/luxI типа. Промоторы эукариот. Энхансеры и сайленсеры. Альтернативный сплайсинг. 26 10. Репарация ДНК. Эксцизионная репарация NER и BER. Белки эксцизионной репарации (гликозилазы, АП-нуклеазы, UvrABCD, ДНК-полимераза II). SOS-ответ бактерий. Роль генов: recA, lexA, umuCD, uvrABCD. 30 11. Классификация белков по фунции. Ферменты, классификация ферментов (примеры для основных групп по EC). Хроматографические методы разделения белков: гель-фильтрация, ионообменная хря, обращённая фаза, аффинная хр-я. 31 12. Реакции гликолиза. Основные реакции цикла Кребса, глиоксилатный шунт. Цикл Кальвина. RuBisCo и пируваткарбоксилаза для фиксации CO2. Различия С3 и С4 фотосинтеза. 34 1. Химическая и биологическая эволюция. Наследственность, изменчивость и естественный отбор. Основные таксономические группы живых систем. Строение клетки про- и эукариот (сходства и различия). Единство молекулярных механизмов живых систем (примеры). Организация генома живых существ: хромосомы, ДНК пластид и митохондрий, плазмиды. Можно сказать, что всё создал Бог и как бы на этом закончить ответ про эволюцию. Для любителей надуманных теорий: Химическая эволюция – это этап, предшествовавший появлению жизни, в ходе которого органические, пребиотические вещества возникли из неорганических молекул под влиянием внешних энергетических и селекционных факторов и в силу развертывания процессов самоорганизации. Ступени химической эволюции. Процесс химической эволюции начался минимум за 1 млрд лет до образования первых организмов. Этот процесс подразделяют на следующие этапы: ∙ абиогенное образование низкомолекулярных химических соединений; ∙ абиогенное образование высокомолекулярных соединений; ∙ образование полимерных агрегатов; ∙ возникновение первичных организмов (протобионтов). Гипотеза абиогенеза: после появления нашей планеты как твердого тела и ее постепенного остывания происходила конденсация водяного пара в первичной атмосфере Земли. Дождевая вода с растворенными в ней веществами накапливалась в углублениях рельефа. В первичной атмосфере в значительных количествах присутствовал углекислый газ. сероводород, метан, аммиак, пары воды и почти полностью отсутствовал кислород (следовательно, не было озонового слоя). Земля была подвержена жесткому ультрафиолетовому излучению Солнца. Среда в целом была насыщена энергией. Для образования или разрыва химических связей были важны следующие источники: ∙ жесткое ультрафиолетовое излучение; ∙ электрические разряды; ∙ естественная радиоактивность; ∙ солнечный ветер; ∙ вулканическая деятельность. Эксперименты показали, как в далеком прошлом могли появляться биологически важные химические соединения. Были подобраны разные газы в соотношении, близком к составу древней атмосферы, и через эту смесь пропускали искровые разряды. В результате получались такие биологически важные соединения, как муравьиная и молочная кислоты, мочевина и аминокислоты – глицин, аланин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота. Последующие экспериментаторы, варьируя условия и совершенствуя методы анализа, расширили набор продуктов в таком синтезе. Ими были получены многие аминокислоты, пуриновые основания — аденин и гуанин (они получаются, если в смесь газов добавить синильную кислоту), четырех- и пятиуглеродные сахара. Образование полимерных агрегатов. Органические полимеры, содержащиеся в «первичном бульоне», как полагают, имели свойство агрегироваться в более или менее стабильные комплексы. О природе этих комплексов существуют различные гипотезы ∙ Коацерватные капельки. В растворах состоящих из двух или несколько высокомолекулярных ве- ществ (например, желатина или гуммиарабака; РНК и гистона) образуются частицы микроскопического размера (коацерватные капельки). В них процессы полимеризации происходят быстрее, чем в окружающем растворе. Эти капельки способны накапливать растворенные вещества, преобразовывать их и вновь высвобождать в раствор. Они стабильны в разной степени. Это зависит от состава веществ, образующих коацерваты, и от реакционной среды. 1 ∙ Микросферы. При введении протеиноидов в теплую воду образуются шарики геля размером от 1 до 5 мкм. Эти шарики стабильны, имеют более плотный, чем коацерваты, поверхностный слой, дополнительно абсорбируют протеиноиды из раствора, путем почкования образуют новые микросферы, обладают ферментативной активностью. ∙ Образование агрегатов таже может происходить путем: – – – адсорбции полимеров на частицах глины; заполнения полимерами пор в песке; заполнения полимерами пор в иле. Гипотеза РНК-мира: Как пробионты приобрели способность к саморепродукции, то есть способность к воспроизводству структуры макромолекул? Точно сказать невозможно, однако есть гипотезы, объясняющие формирование самовоспроизводящихся систем на основе нуклеиновых кислот. Открытие в 1982 г. каталитической активности некоторых молекул РНК (рибозимов) позволяет предполагать, что именно молекулы РНК были первыми биополимерами, в которых способность к репликации сочеталась с ферментативной активностью. Искусственно получены самовоспроизводящиеся РНК (правда, небольшой длины), то есть РНК, способные катализировать синтез своих копий. Более того, именно РНК играет важную роль во всех основополагающих и, как предполагается, древнейших процессах в клетке. Так, при биосинтезе белка на рибосомах каталитическая роль принадлежит именно рибосомной РНК. Безбелковая рибосома в настоящее время не существует — белки являются неотъемлемой частью этого комплекса, но она вполне могла существовать в прошлом. Все эти факты говорят в пользу того, что именно РНК когда-то выполняла все биологически значимые функции в первых живых системах, а уже затем часть функций перешла к ДНК (хранение наследственной информации) и белкам (катализ, структурные функции и др.). Это предположение называется гипотезой РНКмира и пользуется широкой поддержкой среди современных ученых. Отличительные особенности протобионтов: ∙ поглощение органических веществ из окружающего водного раствора и способность превращать их в соединения собственной полимерной системы (гетеротрофное питание); ∙ стабильность по отношению к повреждающим воздействиям; ∙ в комплексе с нуклеиновыми кислотами и белком самостоятельно восстанавливали свои составные части. С возникновением протобионтов химическая эволюция переходит в эволюцию биологическую. Вместе с первыми, сначала очень примитивными живыми системами возникают и отдельные образования, отличающиеся индивидуальностью, обменом веществ и обменом энергией, способностью к обмену информацией с окружающим миром; ростом и воспроизведением. С этого момента дальнейшее существование этих живых систем стало определяться мутациями, селекцией и отбором. Биологическая эволюция — естественный процесс развития живой природы, сопровождающийся изменением генетического состава популяций, формированием адаптаций, видообразованием и вымиранием видов, преобразованием экосистем и биосферы в целом. Наследственность – способность организмов передавать свои признаки и особенности развития потомству. Благодаря этой способности все живые существа сохраняют в своих потомках характерные черты вида. Такая преемственность наследственных свойств обеспечивается передачей генетической информации. Изменчивость – разнообразие признаков среди представителей данного вида, а также свойство потомков приобретать отличия от родительских форм. Естественный отбор – основной фактор эволюции, в результате действия которого в популяции увели- чивается число особей, обладающих более высокой приспособленностью к условиям среды (наиболее благоприятными признаками), в то время как количество особей с неблагоприятными признаками уменьшается. Естественный отбор – единственная известная причина закрепления адаптаций, но не единственная причина эволюции. К числу неадаптивных причин относятся генетический дрейф, поток генов и мутации. Основные таксономические группы живых систем, вот они, слева направо от самых больших к самым маленьким: домен (бактерии, археи, эукариоты), царство, тип, класс, отряд, семейство, род, вид. Примеры единства молекулярных механизмов: ∙ Все клетки хранят генетическую информацию в виде ДНК, кодируют одинакого, транслируют через РНК по одному механизму; 2 Признак Прокариоты Размер От Ядро Отсутствует ядерная Истинное ядро с ядерной мембра- мембрана, нуклеоид ной 0.2 до 2 Эукариоты мкм в диаметре От 10 до 100 мкм в диаметре и ядрышками Мембранные органеллы Отсутствуют Много (лизосомы, аппарат Гольджи, ЭПР, митохондрии, хлоропласты) Фагоцитоз Нет Иногда есть Гликокаликс Присутствует в качестве капсулы Присутствует или слизистого слоя имеющих у некоторых, не клеточной стенки Плазматическая мембрана Отсутствуют углеводы, почти у Стерин и углеводы есть всех отсутствует стерин Цитоплазма Нет цитоскелета Есть цитоскелета Рибосомы 20 От Жгутики Состоят нм из двух блоков строи- тельных белков Хромосомы, размещение Одна 25 до 30 нм Имеют сложное строение, состоят из множества микротрубочек циркулярная хромосома, белки, связанные с ДНК, негисто- Множество линейных хромосом с гистоновыми белками новые Деление клеток Нет мейоза Клеточная стенка Обычно есть, Митоз и мейоз химический плекс (пептидогликан) ∙ У всех оранизмов 20 общих основных аминокислот; ∙ Все используют фосфолипиды как компоненты мембран. ком- Когда есть, устроена просто (без пептидогликана) Организация генома живых существ: Хромосома эукариот образуется из единственной и чрезвычайно длинной молекулы ДНК, которая содер- жит линейную группу множества генов. Необходимыми функциональными элементами хромосомы эукариот являются центромера, теломеры и точки инициации репликации. Точки начала репликации (сайты инициации) и теломеры, находящиеся на концах хромосом, позволяют молекуле ДНК эффективно реплицироваться, тогда как в центромерах сестринские молекулы ДНК прикрепляются к митотическому веретену деления, что обеспечивает их точное расхождение по дочерним клеткам в митозе. (размер генома человека 3 млрд пар оснований) Плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК, физически обособленные от хромосом и способные к автономной репликации (размеры от 1 до 600 килобаз). Митохондриальная ДНК – ДНК, находящаяся в митохондриях (∼15 килобаз). У большинства многоклеточных организмов митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии. Яйцеклетка содержит на несколько порядков больше копий митохондриальной ДНК, чем сперматозоид. Митохондриальная ДНК имеет высокую скорость мутирования, поэтому она является хорошим объектом для изучения эволюции живых организмов. Для этого определяют последовательности митохондриальной ДНК у разных видов, сравнивают их и получают эволюционное древо для изученных видов. Исследование митохондриальных ДНК собак позволило проследить происхождение собак от диких волков. Исследование митохондриальной ДНК в популяциях человека позволило вычислить «митохондриальную Еву», гипотетическую прародительницу всех живущих в настоящее время людей. 3 2. Основные классы биологических молекул: липиды, углеводы, аминокислоты, нуклеотиды (привести примеры, уметь нарисовать). А-форма, В-форма и Z-форма ДНК. Особенности геномной организации про- и эукариот (цистронная и оперонная организация, форма хромосомы). Генетический код. Понятие гена, пронятие аллеля. Понятие митоза и мейоза. Редукционное деление, кроссинговер. Липиды – это молекулы, которые хорошо растворяются в неполярных растворителях и плохо растворя- ются в воде, почти всегда имеют длинные неполярные карбоновые хвосты. В этом хвосте могут быть двойные связи, циклы, могут быть навешаны сахара, фосфоты, глицерины и разные нестандатрные элементы вроде хлора, брома или мышьяка. (a) Разнообразие липидов. (b) Разнообразие углеводов. Углеводы - это соединения, имеющие общую формулу C𝑛 (H2 O)𝑚 . Часто встречающиеся углеводы наиболее устойчивы в циклической форме; в зависимости от числа колец, которые они могут образовать, их классифицируют на моносахариды, дисахариды и полисахариды. Аминокислоты – это соединения, одновременно содержающие карбиксильную группу и аминогруппу. В генетическом коде используются всего двадцать основных аминокислот. Нуклеотиды – группа органических соединений, представляют собой фосфорные эфиры нуклеозидов (ти- мина, аденина, урацила, гуанина и цитозина). Пространственная организация ДНК, предложенная Уотсоном и Криком, также называется B-формой ДНК (B-ДНК). Образование B-формы наиболее вероятно для случайной последовательности молекулы ДНК при физиологических условиях. Два других варианта, хорошо охарактеризованных в кристалле, называются Aи Z-формами. А-форма образуется в средах с низким содержанием воды. Реагенты, используемые при кристаллизации ДНК, как правило, дегидрируют ее, поэтому большинство коротких молекул ДНК кристаллизуются именно в А-форме. Z-форма ДНК очень сильно отличается от B-структуры; самое главное отличие заключается в том, что это — левозакрученная спираль. На один ее оборот приходится 12 оснований, сама молекула более узкая и удлиненная. Остов ДНК принимает зигзагообразную форму. Левозакрученную спираль образует чаще всего вполне определенная последовательность нуклеотидов. Наиболее известные примеры таких последовательностей — это чередующиеся пиримидиновые и пуриновые основания, особенно чередующиеся остатки C и G или 5-метил-C и G. При образовании левозакрученной спирали в Z-ДНК пуриновые остатки принимают син-конформацию и чередуются с пиримидинами в анти-конформации. Большая бороздка в Z-ДНК едва заметна, а малая бороздка узкая и глубокая. 4 (a) Основные аминокислоты. (b) Нуклеотиды. Встречается ли A-ДНК в клетках — неизвестно, но по некоторым данным, короткие фрагменты Z-ДНК могут быть и у прокариот, и у эукариот. Эти фрагменты Z-ДНК могут играть роль (пока неизвестно какую) в регуляции экспрессии некоторых генов или в генетической рекомбинации. Про организацию почти всё уже было сказано в прошлом билете, но повторимся где надо: ДНК прокариот находится в цитоплазме, в то время как у эукариот оно в ядре; у прокариот это кольцевая молекула, в то время как у эукариот линейная, к тому же у эукариот она сильно больше. Сильно больше она ещё за счёт того, что у прокариот нет интронов – некодиру- ющих участков, а у эукариот их много. Кодирующие участки называются экзоны. Особенностью прокариот является объединение генов в опероны – крупные функциональный единицы генова из несколькоих генов, которые таким образом регулируются и транслируются совместно и обычно относятся к одному процессу. Подробнее остановимся на генетических терминах: Генетический код – это правило перевода цепочки нуклеотидов в цепочку аминокислот. Ген – это участок ДНК который кодирует некоторый полипептид или функциональную РНК. Гомологичные хромосомы – это хромосомы имеющие похожую длину, одинаковое положение центромеры. При двуполом размножении одна гомологичная хромосома наследуется организмом от матери, а другая — от отца. Не вздумайте определять гомологичные хромосомы как хромосомы, содержащие аллели одних генов, потому что тогда определять аллели вы будете рекурсивно. Аллели – это разные версии одного гена, находящегося в одинаковых участках гомологичных хромосом. Они бывают рецессивные и доминантные. В конце клеточного цикла клетка делится. Это называется М-фазой цикла, в ней происходит две важные вещи: митоз – деление ядра – и цитокинез – деление пополам самой клетки. двое. Перед М-фазой молекулы ДНК каждой пары (уже) удвоенных хромосом переплетены и удерживаются вместе специализированными белковыми мостиками. В начале митоза две молекулы ДНК постепенно расплетаются и конденсируются в пару жестких и компактных палочек — сестринских хроматид, которые остаются связанными. Потом разбирается ядерная оболочка, пары сестринских хроматид присоединяются к веретену деления так, что сестринские 5 хроматиды связаны с противоположными полюсами веретена, и в конце концов все «сестры» выстраиваются по экватору веретена. Связь между сестринскими хроматидами разрушается и они растаскиваются к противоположным полюсам веретена. Затем веретено разбирается, и разошедшиеся хромосомы упаковываются в отдельные ядра. Наконец, цитокинез разделяет клетку надвое таким образом, что каждая из дочерних клеток наследует по одному ядру. В результате митоза обе получившиеся клетки имеют полный набор хромосом, что не верно для любого деления. Существует второй вариант, называемый конце остаётся только половина хромосом или мейоз. редукционным делением, в ходе которого у клеток в гаплоидный набор. Механизм этого деления получил название Как и в митозе, в мейоз хромосомы приходят удвоенными и связанными. Дальше происходят последовательно два деления, первое повторяет митоз, а второе уже образует четыре клетки с гаплоидным набором хромосом, но «митоз» не обычный. При обычном митозе удвоенные хромосомы выстраиваются случайным образом в экваториальной плоскости веретена деления, после чего сестринские хроматиды, отделившись друг от друга, расходятся по разным клеткам, причем каждая дочерняя клетка, унаследовавшая полный диплоидный набор хромосом, генетически идентична родительской клетке. В первом делении мейоза, похожем на митоз, напротив, удвоившиеся отцовские и материнские гомологичные хромосомы (в том числе две дуплицированные половые хромосомы) соединяются друг с другом и обмениваются генетической информацией (этот процесс называется генетической рекомбинацией). Затем они выстраиваются по экватору мейотического веретена, после чего именно дуплицированные гомологи, а не сестринские хроматиды, расходятся по разным дочерним клеткам. Хроматиды расходятся лишь во втором делении мейоза, в результате которого образуются гаплоидные клетки, поскольку между двумя делениями репликации ДНК не происходит. Таким образом, каждая диплоидная клетка, вступающая в мейоз, дает начало четырем гаплоидным клеткам, каждая из которых наследует лишь одну копию каждой хромосомы — либо материнскую, либо отцовскую. Процесс генетической рекомбинации начинается по мере спаривания и сопровождается образованием двухцепочечных разрывов ДНК хроматид: некоторые из этих событий в дальнейшем приведут к кроссинговеру – обмену участками гомологичных хромосом. Механизм тезисно расписан на картинке ниже. Подробнее он будет описан в билете 8, поэтому здесь останавливаться на этом не будем. Механизм репликации. 6 3. Репликация ДНК: репликация линейных и кольцевых молекул ДНК, затравка для ДНК-полимеразы, праймирование, фрагменты Оказаки. Ферменты, необходимые для репликации ДНК (полимеразы I и III, топоизомеразы, хеликаза, лигаза, праймаза, ssb). Теломеры и центромеры эукариот. Ориджины репликации бактерий. Белки определяющие начало репликации бактерий (DnaABC, ssb, SeqA, dam). Репликация кольцевых молекул ДНК по Тета типу и по типу катящегося колеса. Теперь обсудим то, что происходит, чтобы к моменту митоза или мейоза в клетке были удвоенные хромо- сомы. Процесс, в ходе которого это происходит, называется репликация. Респликация делится на три этапа: инициация, элонгация и терминация. Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много. С понятием сайта инициации репликации тесно связано понятие репликон. Репликон — это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий, как правило, представляют собой один репликон, это значит, что репликация всего генома является следствием всего одного акта инициации репликации. Геномы эукариот (а также их отдельные хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значительно сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы. Молекулярные механизмы, которые контролируют количество актов инициации репликации в каждом сайте за один цикл деления клетки, называются контролем копийности. В бактериальных клетках помимо хромосомной ДНК часто содержатся плазмиды, которые представляют собой отдельные репликоны. У плазмид существуют свои механизмы контроля копийности: они могут обеспечивать синтез как всего одной копии плазмиды за клеточный цикл, так и тысяч копий. Тезисно распишем процесс элонгации по мере прихода разных ферментов: ДНК-гираза садится на двухце- почечную спираль ДНК и вносит временные двуцепочечные разрывы в ДНК, облегчая её разматывание. Далее хеликаза разделяет цепи двухцепочечной молекулы ДНК на одинарные цепи. После этого SSB-белки связывают одноцепочечные фрагменты ДНК и предотвращают комплементарное спаривание. Специальный фермент праймаза синтезирует РНК-затравку (праймер) — короткий фрагмент РНК, который является иниДНК-полимеразы, так как полимераза не способна синтезировать ДНК с нуля, но может циатором в работе добавлять нуклеотиды к уже имеющимся. Собственно, ДНК-полимераза синтезирует ДНК, связываясь с праймером. Полимераза всегда достраивает нить в направлении от 5’ к 3’, поэтому при репликации существует лидирующая и отстающая цепи. Лидирующая достраивается в направлении от 3’ конца, начиная с ориджина репликации. Отстающая цепь достраивается по частям: сначала ДНК праймаза устанавливает короткие РНК праймеры на отстающую цепь. Эти праймеры синтезируются с определенными интервалами на матрице для отстающей цепи; затем их наращивает ДНК-полимераза, начиная, таким образом, всякий раз новый фрагмент Оказаки. Молекула ДНК-полимеразы продолжает это наращивание до тех пор, пока она не достигнет РНК-затравки, присоединенной к 5’-концу предыдущего фрагмента ДНК. Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, быстро удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. Завершает процесс ДНК-лигаза, соединяющая 3’-конец нового фрагмента ДНК с 5’-концом предыдущего фрагмента. Так как у бактерий 1 не возникает проблемы «Где стоять ДНК, чтобы достраивать последние нуклеотиды», а вот ДНК кольцева, у эукариотов с линейными молекулами эта проблема есть. Она решается теломерами. Это некодирующие участки на концах хромосомы, укорачивающиеся после каждого деления как раз за счёт того, что не достраиваются до конца. Ещё у эукариотической хромосомы есть участки, называемые цетромерами, за которые хромосомы держаться во время деление. Центромеры не имеют определённых последовательностей, обычно это куча повторов. Теломеры это тоже куча посторов, но уже весьма определённых по таксонам эукариот. Например, у насекомых это TTAGG, у большинства растений – TTTAGGG. Ориджин репликации это место, с которого начинается репликация. Обычно он один на плазмиду, а у хромосом их может быть много. Это АТ-богатая последовательность, отличающаяся от организма к организму. Репликация с неё может идти в любом направлении. Ориджины бактерий сильно отличаются по размерам, 1 А как известно у кольца нет начала и конца. 7 Механизм репликации. последовательностям и организации, но в любом случае должны содержать консенсус-последовательности для присоединения DnaA для начала репликации. Что такое DnaA и как вообще происходит инициация репликации подробно описано в шестом билете. Наконец, рассмотрим два механизма репликации кольцевых плазмид: по колеса. Тета репликация тета типу и по типу катащегося это по сути репликация в две стороны на плазмиде с двумя ориджинами репликации. На каждой образуется своя репликационная вилка, сверху это дело выглядит как буква Репликация по типу катящегося колеса 𝜃, откуда и название. позволяет быстро сделать очень много копий, чем, например, пользуются бактериофаги. Для её запуска нужен спецальный фермент, который разрывает одну из цепей двунитевой кольцевой молекулы в ориджине и связывается с 5’-концом, а 3’-конец служит праймером для ДНК-полимеразы. В результате мы получим одноцепочечную копию, замещающую оторванную вторую нить. Из неё дальше нужно сделать двуцепочечную ДНК, для чего делается другой разрыв, начинающий синтез другой цепи, а оторванная кольцева плазмида доделывается полимеразой и сшивается лигазой. 8 (a) Тета тип. 4. (b) Тип катящегося колеса. Транскрипция. РНК-полимеразы, информационная РНК и генетический код, транспортные РНК, рибосомальные РНК Промоторы и терминаторы транскрипции прокариот, RBS сайт. Транскрипция эукариот (процессинг мРНК, сплайсинг, Cap сайт, polyA), промоторы эукариот, энхансеры, сайленсеры. Транскрипция - это процесс синтеза молекулы РНК на матрице молекулы ДНК. Он осуществляется ДНК-зависимой РНК-полимеразой с матричной цепи ДНК по направлению от 5’- к 3’-концу синтезируемой РНК. Противоположная матричной цепь ДНК носит название РНК-полимераза кодирующей. – фермент, осуществляющий синтез молекул РНК. В узком смысле, РНК-полимеразой обычно называют ДНК-зависимые РНК-полимеразы, осуществляющие синтез молекул РНК на матрице ДНК, то есть осуществляющие транскрипцию. Ферменты класса РНК-полимераз очень важны для функционирования клетки, поэтому они имеются во всех организмах и во многих вирусах. Химически РНКполимеразы являются нуклеотидил-трансферазами, полимеризующими рибонуклеотиды на 3’-конце цепи РНК. У эукариот в отличие от бактерий существует три комплекса РНК-полимераз, каждая из которых отвечает за синтез специфических продуктов: I - синтез большинства рРНК; II- синтез мРНК; III - синтез тРНК и других малых РНК. РНК-полимераза бактерий представляет собой сложный мультибелковый комплекс. 𝜎 -субъединица в составе комплекса отвечает за инициацию транскрипции, связываясь с промотором. Элонгация цепи продолжается со скоростью приблизительно 50 нуклеотидов в секунду для бактериальных РНК-полимераз до тех пор, пока фермент не сталкивается со вторым сигналом на ДНК, стоп-сигналом, который называют терминатором. Для большинства генов бактерий стоп-сигнал состоит из строки пар нуклеотидов A–T c предшествующей ей последовательностью ДНК, обладающей двойной симметрией, которая, будучи транскрибирована в РНК, сворачивается в структуру «шпильки». Когда полимераза транскрибирует терминатор, то образование шпильки может способствовать вытягиванию РНК-транскрипта из активного участка. Этот механизм также известен как Rho-независимая терминация. Rho-зависимая терминация происходит при помощи специального Rho-белка, который узнаёт терминаторную последовательность и садится на неё, а когда РНК-полимераза доходит до неё, приводит к терминации. РНК, кодирующая первичную аминокислотную последовательность называется ричной РНК. информационной или мат- Нуклеотидная последовательность гена с помощью этой мРНК транслируется в аминокис- лотную последовательность белка при помощи правил, которые в своей совокупности известны как 9 генети- ческий код. С помощью транспортной РНК доставляются аминокислоты к рибосоме, где она садится в А-сайт для трансляции. Основу самой рибосомы составляет рибосомальная РНК, она считывает информа- цию с мРНК и производит катализ образования пептидных связей между аминокислотами, которые принесли тРНК. Для посадки рибосомы перед старт-кодоном, в основном у прокариот, есть последовательность нуклеотидов, называемая ribosome-binding site (RBS). Заметим, что в случае эукариот мРНК сразу после транскрипции и мРНК, которая используется в трансляции, – это не одно и то же. Она должна пройти процесс, называемый цией или процессингом. посттранскрипционной модифика- Процессинг включает в себя несколько этапов: кэпирование, полиаденилирование и сплайсинг. Первые два достаточно просты: при кэпировании на 5’-конец присоединяется 7-метилгуанозин, через необычный 5’,5’- трифосфатный мостик, что не даёт рибонуклеазам разрезать его, ведь они привыкли к 5’-3’ фосфодиэфирным связям. Полиаденилирование заключается в присоединении к 3’-концу от 100 до 200 остатков аденилина, делает это поли(А)-полимераза. Это нужно, так как с 3’-конца РНК разрушаются ферментами, и без полиАнавески она не переживёт путешествие из ядра в цитоплазму. Наконец, сплайсинг – это процесс, при котором из пре-мРНК вырезаются интроны. Делается это специальным комплексом, сплайсосомой, которая узнаёт GU- и AG-граничные последовательности экзонов и интронов, а также А в центре интронта и катализирует две нуклеофильные атаки, в результате которых интрон вырезается. Про промоторы, энхансеры и сайленсеры написано подробно в девятом билете. Механизм сплайсинга. 10 5. Трансляция. Структура рибосомы. Рибосомная РНК и белки. Функциональные активности и функциональные участки рибосомы. Информационные и транспортные РНК. Аминоацил-тРНК-синтетазы. Энергетика биосинтеза белка, использование АТФ и ГТФ. Инициация трансляции у прокариот, последовательность Шайна – Далгарно. Инициация трансляции у эукариот, кэп-сайт. Терминация трансляции. Трансляция это процесс синтеза белка по матрице мРНК, который осуществяет рибосома. Рибосома состоит из малой и большой субъединиц, малая считывает информацию с мРНК, а большая присоединяет соответствующую аминокислоту к синзтезируемой цепочке. По состову рибосома состоит из рибосомальной РНК и рибосомных белков, 50:50 у высших животных и 60:40 у бактерий. Для того, чтобы трансляция могла происходить, нужны тРНК с аминокислотами. тРНК имеют антикодон, коплиментарный учатку мРНК, а также участок для приединения аминокислоты. Присоединение производится ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами (АТРС), процесс энергозатратен и производится в два шага: аминокислота активируется с затратой АТФ и присоединяется к тРНК. Схематично: 1 2 Aminoacid + ATP + tRNA − → Aminoacid−AMP + PP𝑖 + tRNA − → PP𝑖 + tRNA−Aminoacid + AMP. АТРС есть двадцать штук, по числу аминокислот, и распознавать она их должна безошибочно. На деле ошибки есть, так как часть аминокислот сильно похожи друг на друга, но происходят максимум с частотой 10−5 . Для корректировки ошибок существует процесс редактирования, который выходит за рамки билета, но лучше о нём знать – мы не просто игнорируем неправильные последовательности в полипептидах. Итак, тРНК готовы, теперь сам процесс трансляции. Он, как и любой матричный процесс, делится на этапы инициации, элонгации и терминации. Инициация. Для инициации в целом нужено две вещи: RBS (ribosome-binding site) и старт-кодон, почти всегда AUG. Нельзя обойтись просто старт-кодоном, потому что тогда инициация будет очень неспецифична. В случае прокариот RBS это последовательность Шайна – Дальгарно – последовательность длиной 5-8 нулеотидов, обогащённая пуриновыми основаниями, которая связывается с малой субъединицей, которая обогащены пиримидинами. В инициации участвуют три фактора, креативно названные IF-1, IF-2 и IF-3 (от initiation factor), первые два влияют на конформацию малой субъединицы, помогая связываться с первой тРНК, несущей метионин (который кодируется AUG’ом), а последний связывает малую субъединицу до конца инициации, не давая сесть большой субъединице раньше времени, и вместе с IF-1 отходит при присоединении тРНК Met . IF-2 остаётся. У эукариот всё одновременно проще и сложнее. Проще, потому что им не нужна RBS как таковая, ведь есть cap-сайт, к которому присоединяется рибосома, а дальше скользит по мРНК до первого старт-кодона (это происходит с помощью слишком большого числа факторов, чтобы их перечислять). Сложнее, потому что это эукариоты и нужно всегда усложнять, поэтому существует и второй механизм, не зависящий от cap-сайта, который похож на то, что происходит у прокариот: рибосома садится на специальный участок, называемый IRES (internal ribosomal entry site, участок внутренней посадки рибосомы), который направляет её в сторону старт-кодона. Элонгация. Так или иначе посадив малую субъединицу и приартачив к ней большую, можно синтезиро- вать белок. Здесь будут участвовать два фактора элонгации, опять имеющие креативные названия EF-1а и функциональных участка, назыА-сайт, B-сайт и С-сайт Р-сайт и Е-сайт. В А-сайт (от aminoacyl) приходят новые тРНК, которые EF-2 у эукариот, а у прокариот – EF-Tu и EF-G. У рибосомы есть три ваемые предварительно поверяются первым фактором на предмет того, что тРНК несёт соответствующую себе аминикислоту и что это та аминокислота, которая нужна сейчас (проверяется конформационно, образующиеся комплексы первого фактора и тРНК имеют конкрентные конформации), в это время в P-сайте (от peptide) большая субъединица рибосомы катализирует реакцию присоединения к уже имеющемуся пептиду, тРНК без аминокислоты перемещается в Е-сайт (от exit), это делает второй фактор, откуда диссоциирует, а в Р-сайт транслоцируется новая аминоацилированная тРНК. Терминация. В какой-то момент рибосома доходит до стоп-кодона. Ему не соответствуют тРНК, поэтому трансляция дальше не идёт. Всё заканчивается с помощью белков RF-1, RF-2 и RF-3 (от release factor, фактор освобождения). Первые два отделят полипептидную цепь, а третий отделяет мРНК. Также, как мы узнаем в девятом билете, возможна и знакомая нам терминация шпилькой. 11 Отметим, что белки рибосомы обладают ГТФ-активностью, поэтому для полипептидной реакции используется не АТФ, а ГТФ. Более подробно, за весь процесс присоединения одной аминокислоты два ГТФ гидролизируются до ГДФ – один используется первым фактором элонгации для образования тройного комплеса с тРНК при проверке соответствия, а второй используется вторым фактором элонгации при перемещении рибосомы на триплет ниже по мРНК. 12 6. Репликоны. Инициация раунда репликации ДНК Escherichia coli. Белки участвующие в регуляции инициации репликации (DnaABC, ssb, SeqA, dam). Топологические проблемы репликации. Сегрегация репликонов по бактериальным клеткам. Репликация плазмид, мобильных элементов, фагов и вирусов. Особенности репликации в эукариотах. Теломеры и центромеры. Сегрегация хромосом. Репликон – участок ДНК или РНК, реплицирующийся из одной точки начала репликации (ориджина репликации). Большая часть бактериальных хромосом и плазмид является кольцевыми молекулами с единственной точкой начала репликации. В каждой эукариотической хромосоме имеется множество репликонов. Средний размер такого репликона невелик по сравнению с прокариотическим: около 40 000 пар оснований у дрожжей и около 100 000 пар оснований у животных. У репликации есть три этапа: инициация, элонгация и терминация. Здесь мы разберём, что происходит в E. coli. DnaA – белок, который активирует инициацию репликации ДНК в бактериях. Это фактор инициации репликации, который способствует разматыванию ДНК в ориджине репликации. Начало фазы инициации репликации определяется концентрацией DnaA, который накапливается во время роста. Репликация начинается с активного связывания DnaA с участками матричной ДНК недалеко от ориджина репликации. Связывание DnaA приводит к конформационным изменениям и разделению нитей, за счёт чего присоединяется ещё больше DnaA. Первоначально, DnaA связан с DnaC, белком-репрессором, который держит репликаDnaB, образование этого ционную вилку до объединения с геликазой комплекса требует АТФ. После посадки DnaB, DnaC отходит и начинать разватывать двойную цепь. Затем небольшие белки SSB (single- strand DNA-binding protein) связываются с одноцепочечными участками ДНК и стабилизируют их. Dam-метилаза (сайт-специфическая ДНК-метилтрансфераза) – фермент, который метилирует аденин последовательности 5’-GATC-3’ в недавно синтезированной ДНК. Метилирование защищает ДНК от разрезание собственными эндонуклеазами рестрикции. SeqA – белок, который предотвращает вторичную инициацию репликации. Он связывает в ориджине репликации с двуцепочечной ДНК, у которой одна цепь метилирована, а другая нет (т.е. пока Dam-метилаза не успела сработать) и защищает ориджин от соединения с DnaA. Топологические проблемы репликации: На каждые 10 пар оснований, образующихся в репликационной вилке, родительская двойная спираль должна совершить один полный оборот вокруг своей оси. Следовательно, для того чтобы репликационная вилка могла продвигаться вперед, вся хромосома впереди нее должна вращаться, что для длинных хромосом потребовало бы большой затраты энергии. При репликации ДНК эта проблема решается иначе: путем образования в спирали своего рода «шарнира», особого класса белков, называемых ДНК-топоизомеразами. ДНК-топоизомераза представляет собой нечто вроде «обратимой нуклеазы». Сначала она разрывает цепь ДНК, а затем ковалентно присоединяется к разорванному концу. Существуют 2 типа ДНК-топоизомераз: 1. Топоизомераза типа I разрывает только одну из двух цепей двойной спирали ДНК, что дает возможность двум участкам ДНК по обе стороны от разрыва свободно вращаться относительно друг друга вокруг фосфодиэфирной связи, находящейся напротив разрыва, которая в этом случае выполняет роль упомянутого выше «шарнира». Всякое напряжение в спирали ДНК заставляет ее вращаться в таком направлении, чтобы ослабить это напряжение. Поэтому вращение во время репликации ДНК происходит лишь на коротком отрезке спирали – в той части, которая находится непосредственно перед репликационной вилкой. Аналогичная проблема, возникшая в процессе транскрипции ДНК, решается таким же путем. 13 2. Топоизомераза типа II (или ДНК-гираза) ковалентно связывается с обеими цепями двойной спирали ДНК и вносит в нее на время двухцепочечный разрыв. Ферменты этого типа активируются под действием тех участков на хромосомах, где перекрестились спирали. Присоединившись к такому перекресту, топоизомераза обратимо разрывает одну из двух двойных спиралей, создавая тем самым для другой своего рода «ворота» и вынуждает вторую двойную спираль пройти через этот разрыв и затем сшивает обе разорванные цепи, а затем отделяется от ДНК. Действуя подобным образом, топоизомеразы типа II очень быстро разделяют две сцепленные кольцевые молекулы ДНК. Сегрегация репликонов. Сегрегация репликонов по бактериальным клеткам. Для эффективного распределения генетического материала в бактериальных клетках разработан специальный механизм. Незадолго до начала репликации материнская ДНК закрепляется специальном сайтом на мембране клетки. По мере роста мембраны и разделения нитей материнской ДНК, точки связывания разных нитей ДНК с мембраной начинают расходиться в разные части клетки. Таким образом, происходит разделение генетического материала по дочерним клеткам. Мобильные генетические элементы – последовательности ДНК, которые могут перемещаться внутри генома. Примеры: плазмиды, бактериофаги, транспозоны (некодирующая часть генома). Про репликацию плазмид мы уже знаем из третьего билета, где расписаны тета тип и тип катящегося колеса. Транспозоны – участки ДНК организмов, способные к передвижению (транспозиции) и размножению в пределах генома. ДНК-транспозоны передвигаются по геному способом «вырезать и вставить» благодаря комплексу ферментов под названием транспозаза. Транспозаза закодирована в последовательности транспозона. На концах участков ДНК-транспозона расположены инвертированные повторы, которые являются особыми участками узнавания транспозазы, таким образом отличая эту часть генома от остальных. Транспозаза способна делать двухцепочные разрезы ДНК, вырезать и вставлять в ДНКмишень транспозон. Ретротранспозоны – это мобильные генетические эле- менты, которые применяют метод «копировать и вставить» для распространения в геноме животных. Процесс передвижения включает промежуточную стадию молекулы РНК, которая считывается с участка ретротранспозо- 14 на и которая затем, в свою очередь, используется как матрица для обратной транскрипции в последовательность ДНК. Новосинтезированный ретротранспозон встраивается в другой участок генома. Репликация вирусов на примере бактериофага лямбда. Бактериофаг лямбда внедряется в клетку и выпрыскивает в нее линейную молекулу ДНК с липкими концами, которая сворачивается в плазмиду. Затем возможно 2 варианта: 1. Литический цикл – фаг воспроизводит себя и далее убивает клетку-хозяина. Геномная ДНК фага проникает в клетку-хозяина, где происходит транскрипция вирусных генов, репликация его генетического материала и синтез вирусных белков. В конце концов наступает лизис клетки, откуда выходят новообразованные вирусные частицы; 2. Лизогенный цикл – фаг встраивает свой геном в геном бактерии и удваивается при каждом делении клетки (такая стадия жизненного цикла вируса называется профагом), то есть не убивает клеткухозяина сразу, в отличие от литического цикла. Особенности репликации в эукариотах: Как уже упоминалось, эукариоты имеют много репликонов в отличии от прокариот и скорость их репликации в несколько раз ниже. Кроме того, не стоит забывать, что в эукариотах репликация происходит в ядре. Важной особенностью хромосом являются теломеры – концевые участки хромосом, которые состоят из ко- ротких тандемных повторов. В каждом цикле деления теломеры клетки укорачиваются из-за неспособности ДНК-полимеразы синтезировать копию ДНК с самого конца. Для решения этой проблемы существуют специальные ферменты – теломеразы, которые умеют достраивать теломеры. Про центромеры и сегрегацию хромосом в ходе репликации было подробно рассказано во втором билете. 15 7. Мутагенез. Спонтанный мутагенез. Скорость мутагенеза. Индуцированный мутагенез. Репарация димеров тимина с помощью фотолиазы и эксцизионной репарации. Понятие сайт-специфического мутагенеза.2 Мутация – стойкое (то есть такое, которое может быть унаследовано потомками данной клетки или ор- ганизма) изменение генотипа. Процесс возникновения мутаций называется мутагенез. Мутации делятся на спонтанные и индуцированные. Спонтанные мутации среды с частотой около возникают самопроизвольно в нормальных для организма условиях окружающей 10−9 на нуклеотид за один цикл репликации. При этом ДНК-полимераза ошибается гораздо чаще (если система репарации все починила, это не считается за мутацию!), а фиксируются в популяции мутация гораздо реже (потому что работает естественный отбор). Причина возникновения спонтанных мутаций – ошибки в работе ДНК-полимеразы. Частоту возникновения спонтанных мутаций можно оценить, определив степень сходства нуклеотидных последовательностей ДНК в гомологичных некодирующих участках генома у разных видов организмов, зная примерное время жизни их ближайшего общего предка. Другой способ: напрямую подсчитать количество генетических изменений, спонтанно возникающих в большой популяции клеток за относительно короткий промежуток времени. Индуцированные мутации возникают в результате мутагенных воздействий в искусственных условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды (ультрафиолетовое излучение, радиация, химические мутагены, высокая температура). Образование и починка тиминового димера. Пример индуцированной мутации – возникновение тиминовых димеров. Под действием ультрафиолетого света (120-340 нм) происходит ковалентное сшивание рядом стоящих пиримидинов. При сшивании тиминов образуется циклобутановое производное, блокирующее репликацию. Образование димеров является главной причиной возникновения меланомы у человека. Существуют 2 пути репарации: ∙ Тиминовые димеры "расшиваются"путем прямой репарации при участии фотолиаз, осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение. ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны 300 - 600 нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр. ∙ Эксцизионная репарация включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы. У E.coli эксцизионная репарация осуществляется мультиферментным комплексом, включающим белки uvrA, uvrB, uvrC (ultraviolet repair), которые узнают поврежденный участок и вносят 5’- и 3’-разрывы с разных сторон от него, uvrD – геликазу, которая отсоединяет вырезанный олигомер – 12 нуклеотидов, используя энергию АТФ. Таким же способом лечится, например, апуринизация. 2 Для пущего понимания билета, его автор рекомендовала к просмотру вот это видео. 16 Точечные и хромосомные мутации. Другие примеры индуцированных мутаций: разрыв сахарофосфатных связей под действием рентгеновского излучения (1-120 нм) и двуцепочечное разрывы под действием ионизирующей радиации (10-3-1 нм). Из-за меньшего размера генома бактерии более устойчивы к радиации. По уровню возникновения мутации делятся на Точечная мутация точечные, хромосомные и геномные. – тип мутации в ДНК или РНК, для которой характерна замена одного азотистого основания другим. Термин также применяется в отношении парных замен нуклеотидов, инсерции (вставки) и делеции одного или нескольких нуклеотидов. Частые причины возникновения точечных мутаций – дезаминирование, апуринизация (см. рис.) и таутомерные переходы, которые приводят к ошибкам в работе ДНК-полимеразы. Хромосомные мутации – перестройки хромосом, изменение их строения. К хромосомным мутациям относятся делеция, дупликация, инверсия, транслокация. Геномные мутации – изменение количества хромосом. Сайт-специфический мутагенез – это метод молекулярной биологии, который используется, чтобы со- здать конкретные изменения в последовательности ДНК, гена и продуктов генов. Основная идея: амплифицировать исходную плазмиду, используя не совсем подходящие праймеры, чтобы получить ее немного измененный аналог. Имея в праймерах другой нуклеотид, дополнительные последовательности или сажая их в правильном месте, можно добавлять, убирать или изменять нуклеотиды в целевой плазмиде. 17 Сайт-специфический мутагенез в разных случаях. 8. Гомологичная рекомбинация. Модель Холлидея. Гены рекомбинации (recA, ssb, ruvABC). RecA и SOS-ответ. Сайт-специфическая рекомбинация. Рекомбинация в эукариотах. Кроссинговер. Для длительного существования вида необходима генетическая изменчивость, которая позволяла бы при- спосабливаться к изменяющейся среде. Следовательно, важным свойством ДНК следует считать ее способность к перестройкам, которые могут изменять и комбинацию генов в данном геноме, и их экспрессию. Перестройки в ДНК представляют собой результат генетической рекомбинации. События, из которых складывается генетическая рекомбинация, могут быть подразделены на два больших класса: гомологичная рекомбинация и сайт-специфическая рекомбинация. В процессе гомологичной рекомбинации генетический обмен происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями ДНК, по большей части между двумя копиями одной и той же хромосомы. Одним из самых известных примеров такого рода служит обмен участками гомологичных хромосом в процессе мейоза – кроссинговер. Этот обмен создает возможность для опробования разных вариантов (аллелей) одного и того же гена в новых комбинациях с другими генами и тем самым повышает шансы на выживание в изменяющейся среде. Мейоз свойствен только эукариотам, но бактерии и вирусы тоже используют гомологичную рекомбинацию в процессе горизонтального переноса генов. Еще одна очень важная функция гомологичной рекомбинации устранения двух- или однонитевых повреждений ДНК. Как происходит гомологичная рекомбинация у прокариот? (на примере E. coli ) RecBCD – это комплекс из трех белков, который играет здесь ключевую роль: RecD – хеликаза и нуклеаза, RecB – хеликаза, RecC – распознает Chi-сайт. RecBCD использует энергию АТФ и работает в условиях избытка ионов Mg2+ . Белок RecA связывается с одноцепочечной ДНК, в комплексе с ней сканирует местную хромосому с целью выявления гомологичных областей и доводит к ним оцДНК, где и происходит гомологичная рекомбинация. RuvAB участвуют в миграции структуры Холлидея. Вместе с RuvC они образуют комплекс RuvABC, ко- торый приводит к разрешению структуры – крест Холлидея режется и получается конечный продукт. RuvC — это эндонуклеаза, которая вырезает вырожденную последовательность нуклеотидов 5’-(A/Т)ТТ(G/C)-3’, которая встречается в ДНК примерно раз в 64 нуклеотида. Итак, сам процесс: ∙ RecBCD связывается с концом двуцепочечной ДНК. ∙ RecBCD «расстёгивает» ДНК. RecD — быстрая хеликаза, сидящая на 5’-цепи, а хеликаза RecB медленнее и сидит на 3’-цепи. Образуется два одноцепочечных хвоста и одна оноцепочечная петля, которые увеличиваются по мере продвижения RecBCD по ДНК. ∙ Два одноцепочечных «хвоста», которые комплементарно соединяются друг с другом, образуя вторую одноцепочечную петлю. Обе одноцепочечные петли движутся и увеличиваются. 18 Гомологичная рекомбинация у прокариот. ∙ По достижении Chi-сайта (его последовательность нуклеотидов – 5’-GCTGGTGG-3’) RecBCD делает надрез на 3’-конце. Дальнейшее раскручивание спирали ДНК создает длинный хвост, вблизи 3’-конца которого находится Chi-сайт. ∙ RecBCD загружает белки RecA на Chi-хвост. В какой-то момент субъединицы комплекса RecBCD распадаются. ∙ Комплекс RecA-оцДНК внедряется в интактную хромосому и создает D-петлю, которая может разрешиться с образованием интактной рекомбинантной ДНК двумя способами. ∙ D-петля разрезается и соединяется с поврежденной ДНК, формируя таким образом структуру Холлидея, которая мигрирует под действием RuvAB комплекса. Разрешение структуры (с помощью белков RuvABC и RecG) приводит к формированию двух продуктов рекомбинации реципрокного типа. ∙ 3’-конец Chi-хвоста служит затравкой для синтеза ДНК, с которого начинается образование репликационной вилки. При разрешении репликационной вилки образуются одна рекомбинантная нереципрокная ДНК, одна ДНК родительского типа и один фрагмент ДНК. Как происходит гомологичная рекомбинация у эукариот? Им это нужно, опять же, для устранения двухцепочечных разрывов и для обеспечения генетического разнообразия во время кроссинговера мейоза. Известно два основных механизма гомологичной рекомбинации: путь репарации двуцепочечных разрывов (DSBR-путь), также известный как модель двойной структуры Холлидея, и путь синтезозависимого отжига цепи (SDSA-путь). Оба начинаются одинаково, однако потом механизм разделяется. DSBR чаще всего заканчивается кроссинговером, в отличие от SDSA, где хромосомы участками не меняются. Опишем процесс подробно: 19 Гомологичная рекомбинация у эукариот. ∙ Когда двуцепочечный разрыв в цепи обнаружен, белковый комплекс MRX (у человека MRN) встает по обе стороны от разрыва, после чего следует отрезание 5’-концов. ∙ Репликативный белок А (RPA), имеющий высокое сродство к одноцепочечной ДНК, связывает выступающие 3’-концы и с помощью ряда других белков формирует комплекс с одноцепочечной ДНК, покрывая её. ∙ Затем нуклеопротеидная нить ищет похожую или идентичную цепь ДНК и внедряется в неё, когда находит. В клетках, делящихся путем митоза, «жертвой» внедрения обычно является сестринская хроматида, идентичная поврежденной ДНК, которая чаще всего используется в качестве матрицы для репарации. В мейозе реципиентным ДНК-дуплексом служит гомологичная хромосома, которая очень похожа на повреждённую хромосому, но не обязательно идентична ей. ∙ В ходе вторжения цепи между торчащим 3’-концом внедряющейся цепи и гомологичной хромосомой образуется D-петля. После этого ДНК-полимераза продлевает 3’-концы. Получившаяся перекрёстная структура называется структурой Холлидея. Вслед за этим на внедрённой цепи происходит синтез ДНК, восстанавливая её комплементарно гомологичной хромосоме в том месте, откуда была вытеснена D-петля. Далее пути расходятся: ∙ DSBR-путь уникален тем, что на втором выступающем 3’-конце (который не участвовал во внедрении) также образуется структура Холлидея с цепью гомологичной хромосомы. Далее двойная структура Холлидея становится продуктом рекомбинации под действием никирующих эндонуклеаз — рестриктаз, вносящих разрыв только в одну цепь ДНК. DSBR, как правило, влечёт за собой кроссинговер, хотя иногда конечный продукт может быть другим. Приведёт DSBR к кроссинговеру или нет определяется тем, как будет разрезана, или «разрешена», структура Холлидея. Кроссинговер может произойти, если одна структура Холлидея будет разрезана по пересекающимся нитям, а другая нет. Продукт, не подвергшийся кроссинговеру, получится лишь в том случае, если обе структуры разрешены по пересекающимся нитям. ∙ Гомологичная рекомбинация путем SDSA приводит к образованию хромосом, не прошедших процесс кроссинговера. Сначала SDSA следует классическому сценарию: одна из цепей поврежденной ДНК внедряется в молекулу-матрицу, вытесняя из последней другую цепь, в результате чего образуется Dпетля и структура Холлидея. Далее же ДНК-полимераза продлевает внедрённую цепь комплементарно молекуле-матрицы, и одновременно с этим комплементарно вытесненной цепи синтезируется остальная часть поврежденной ДНК. При этом возможен процесс миграции точки ветвления, когда точка пересечения цепей, принадлежащих рекомбинирующим ДНК, начинает перемещаться между ними. Иногда в 20 процессе слияния новосинтезированных цепей с молекулой ДНК могут возникать участки, выбивающиеся из дуплекса, а также иные возможные пробелы и бреши. Все они успешно вырезаются и устраняются в процессе лигирования, после чего рекомбинацию можно считать завершённой. Во время митоза именно SDSA-путь является основным путём гомологической рекомбинации для репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Тем не менее, при мейозе тоже часто происходит гомологичная рекомбинация без кроссинговера, которая, вероятно, является примером репарации разного рода повреждений. Сайт-специфическая рекомбинация отличается от гомологичной рекомбинации тем, что для ее осуществления не требуется гомологии ДНК. В обмен вступают короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, участвующих в этом процессе, распознаваемые особым сайт-специфическим рекомбинационным ферментом. Таким образом, сайт-специфическая рекомбинация изменяет распределение нуклеотидных последовательностей в геноме. Иногда эти изменения приурочены к каким-то этапам и определенным образом организованы, как, например, при исключении интегрированного бактериофага из бактериальной хромосомы. Однако, они могут носить и совершенно случайный характер, например при включении в геном подвижных (мобильных) элементов. Характерным примером такой рекомбинации служит встраивание кольцевой ДНК фага 𝜆 в хромосому Е. coli и ее обратное выщепление. Рекомбинация происходит в пределах специфической нуклеотидной последовательности ДНК фага 𝜆 (attP-сайт) и уникальной последовательности ДНК Е. coli (аttВ-сайт). Нуклеотидные последовательности attP- и attВ-сайтов совершенно различны, хотя имеют общее ядро (О) протяженностью в 15 нуклеотидных пар. attP (POP’) простирается на 150 нуклеотидов влево (Р) и на 75 нуклеотидов вправо (Р’) от общего ядра, a attB (BOB’) – это сегмент длиной всего около 25 нуклеотидов, включая и ядро. Поскольку нуклеотидные последовательности, фланкирующие attP- и attВ-сайты слева (attL) и справа (attR), для этих сайтов различаются, механизм рекомбинационного выщепления ДНК фага 𝜆 из ДНК Е. coli должен отличаться от механизма их рекомбинационной интеграции. И действительно, для рекомбинации между attL и attR при исключении фаговой ДНК помимо белка Int необходимы фаговый белок xis и клеточный белок HF. Процесс рекомбинационного выщепления, по-видимому, имеет некоторое сходство с процессом интеграции, но роль указанных трех белков, особенно белка xis, все еще изучается. SOS-система – это защитная система бактерий. Она активируется в ответ на повреждения ДНК, вызван- ные УФ-излучением или действием химических агентов, а также при подавлении репликации и под действием некоторых лекарств. В самом начале SOS-ответа в ответ на неблагоприятное воздействие активируется белок RecA, для этого необходимы одноцепочечная ДНК и АТФ. Под действием RecA происходит расщепление белка LexA — стабильного репрессора многих оперонов. Многие гены, которые в нормальных условиях репрессированы LexA, кодируют белки, участвующие в репарации. Некоторые белки экспрессируются на низком уровне и в нормальных условиях, но при разрушении LexA их экспрессия резко усиливается. Например, ген urvB, продукт которого участвует в эксцизионной репарации, имеет два промотора, один из которых независим от LexA, а другой контролируется LexA. В нормальных условиях работает только один промотор, но при расщеплении LexA функционируют оба, что повышает уровень белкового продукта. LexA связывает в своих мишенях так называемый SOS-бокс — участок длиной 20 пар оснований, содержащий консенсус из восьми абсолютно консервативных позиций. Как правило, SOS-бокс входит в состав промотора. LexA репрессирует также ген recA и собственный ген, поэтому в условиях SOS-ответа идёт активный синтез обоих белков. Уровень RecA может повыситься в 50 раз, и в таких концентрациях RecA начинает сам участвовать в эксцизионной репарации. При этом RecA продолжает индуцировать саморасщепление LexA, что не даёт ему функционировать в роли репрессора во время SOS-ответа. Если же неблагоприятное воздействие уходит, то клетка быстро возвращается к нормальному состоянию. В отсутствие травмирующего фактора белок RecA больше не может дестабилизировать LexA, и LexA начинает 21 подавлять экспрессию своих генов-мишеней. RecA запускает расщепление не только LexA, но также белка UmuD, который благодаря этому активируется, и вместе с ним активируется система репарации, склонной к ошибкам. Комплекс UmuD2UmuC связывается с RecA вблизи места повреждения. Далее RecA разрезает UmuD с образованием UmuD’, что активирует комплекс, и после этого комплекс UmuD’2UmuC, известный как ДНК-полимераза V, синтезирует фрагмент ДНК поверх повреждённого участка, допуская при этом существенно больше ошибок, чем обычные ДНКполимеразы. Показано, что SOS-система может играть основную роль в появлении мутаций, вызывающих устойчивость к некоторым антибиотикам. Увеличение частоты мутаций в ходе SOS-ответа вызывается тем, что при нём повреждённые участки восстанавливаются ДНК-полимеразами, склонными к ошибкам. Последний вопрос: при чем тут ssb? Белки, связывающие одноцепочечную ДНК (Single-strand binding protein, SSB) – это общее название для белков, которые связывают одноцепочечные фрагменты ДНК и предотвращают комплементарное спаривание. Одноцепочечные участки ДНК имеют термодинамически более выгодную форму — дуплекс. Белки SSB предотвращают образование дуплекса и позволяют компонентам репликационной вилки осуществлять репликацию ДНК. 3 Из всех белков, упомянутых ранее, к ним относятся RecA у прокариот и RPA у эукариот. 3 «Фух», заключил на этом моменте автор билета. 22 9. Промоторы прокариот и регуляторные элементы. Лактозный оперон. Аттенюация на примере триптофанового оперона. Quorum sensing регуляция luxR/luxI типа. Промоторы эукариот. Энхансеры и сайленсеры. Альтернативный сплайсинг.4 Промотор – это последовательность нуклеотидов, узнаваемая РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции. Мы знаем, что полимеразы бывают разные, они отличаются 𝜎 -факторами. Полимераза может инициировать транс- ляцию в любом месте генома, но в клетке инициация происходит только на промоторах. Основным фактором у как вам известно, является 𝜎70 , E. coli, промоторами которой явля- ются две последовательности из шести нуклеотидов, расположенные выше сайта начала транскрипции на 10 и 35 нуклеотидов. Поэтому их называют -10 и -35 элементы. Они не идентичны везде, но для них можно получить так называемые консенсус-последовательности, то есть то, что там будет в среднем. Промотор-последовательность эукариотов мы все прекрасно помним, это ТАТА(АТ). Регуляторные элементы – неко- дирующие участки ДНК, которые регулируют транскрипцию соседствующих генов, обычно за счёт присоединения факторов транскрипции (белки такие). Например, регуляторным элементом является операторный участок лактозного оперона. Обсудим его подробнее. Как можно понять по названию, лактозный оперон замешан в метаболизме лактозы. Его задача – чтобы белки, нужные для метаболизма лактозы, синтезировались, когда есть лактоза и мало глюкозы. Как это делается? В отсутствие лактозы белок LacI (кодируется репрессором lacI, видно выше) обратимо цепляется за операторную часть lac-оперона и всё, если лактозы нет, то никто синтезироваться не будет. Когда лактоза есть, две молекулы связываются с LacI, что изменяет его конформацию и отрывает от оператора. Получается всё, транскрипция будет? Параша будет, потому что нет -35 элемента, поэтому РНК-полимераза это дело не узнаёт. Тут вступает в роль вторая часть механизма регуляции: есть такой белок, называющийся белок, активирующий катаболизм (catabolism activating protein, CAP), который с цАМФ образуем комплекс, садится на участок выше оперона и помогает РНК-полимеразе сесть. Превращение АМФ в цАДФ регулируется ферментом, который ингибируется глюкозой, а ещё глюкоза активирует фермент, который превращается цАМФ в АМФ, поэтому когда есть глюкоза, вся вот эта шарабара с посадкой CAP не получится. Теперь обсудим, что такое аттенюация. Вообще это умное слово, которое значит «ослабление». И вот ослабE. coli потому E. coli описана лять можно по-разному, мы рассмотрим на примере триптофанового оперона, причём именно в что это единственный организм который мы знаем в других местах она несильно отличает, а в понятнее всего. Сразу отметим, что спонсором этого механизма является отсутствие ядра у бактерий, из-за чего на ещё не до конца оттранскрибированную мРНК может уже забраться рибосома и начать транслировать белок. Опять методом несложной мыслительной работы можно понять, что триптофановый оперон связан с синтезом 2-амино-3-(1H-индол-3-ил)пропионовой кислоты, также известной как триптофан. У trp-оперона сразу после оператора идёт последовательность, кодирующая первый пептид, называющийся что синтезируется первым), внутри этой последовательности и есть интересующая нас 4 Для пущего понимания билета, его автор рекомендовал к просмотру вот это видео. 23 лидерный (потому аттенюаторная по- Механизм аттенюации в триптофановом опероне. следовательность или просто аттенюатор. У E. сoli в ней четыре инвертированные последовательности, креативно названные 1, 2, 3 и 4, идут друг за другом. Инвертированные последовательности, как мы знаем, могут образовывать шпильки, тут возможно образование трёх разных: 1-2 (на которую в целом можно забить), 2-3 и 3-4. Если образуется 2-3, то 3-4 не образуется. Только 3-4 является терминаторной. Так вот, тот самый лидерный пептид содержит два триптофана друг за другом. Триптофан это достаточно редкая аминокислота, поэтому если её нет, то рибосома конкретно встрянет в этом месте. Но мы помним, что сидит она на мРНК, которую в это время во всю транскрибируют. Происходит гонка между рибосомой и образованием шпилек. Если триптофан есть, то рибосома быстро доходит до участка 2, закрывает его и образуется 3-4 шпильки, которая терминаторная, то есть после синтеза лидерного пептида рибосома слетает и ничего больше не синтезируется, а ничего больше = белки для синтеза триптофана, то есть когда триптофана много, больше не синтезируется. Если триптофана нет, то рибосома не закрывает участок 2, образуется шпилька 2-3, которую, когда триптофан появится, рибосома благополучно пройдёт, ибо она не терминаторная, и оттранслирует все белки дальше по мРНК. В итоге, когда триптофана мало, он будет синтезироваться. Тут надо ещё раз отметить, что для всего вот этого важна синхронность трансляции и траснкрипции, для чего в лидерной последовательность есть специальный “сайт паузы”, на котором РНК-полимераза останавливается и рассуждает о жизни, пока не придёт рибосома и не начнёт трансляцию. Как он работает нам знать не надо (надеюсь). Теперь поговорим про quorum sensing (чувство кворума) – умное выражение, по факту обозначающее процессы, в ходе которых бактерии говорят друг другу «я здесь» и координируют свои действия. Мы рассмотрим, как это работает, на примере A. fischeri и их luxR/luxI системы. Немного о мотивации: у бактерии есть lux-система, которая отвечает в том числе за синтез люцеферазы – белка, который производит биолюминесценцию (светятся короче). Смысла светиться, когда бактерий мало, нет, поэтому надо каким-то образом действовать сообща. Это происходит с помощью авто-индукторов – молекул, которые бактерия выделяет в 24 Механизм кворум сенсинга. среду вокруг себя и которые могут проникать в другие бактерии через мембрану (обычно они очень быстро выходит из бактерии, что их произвела, не взаимодействую с её системами). Эти автоиндукторы производятся белком LuxI и образуют с другим белком, LuxR, комплекс, который садится на оператор lux-оперона, усиливая экспрессию. Тогда образуется больше LuxI, то есть больше авто-индуктура, что ещё больше услиливает экспрессию – положительная обратная связь. У эукариот смысл промоторов тот же, сами промоторы другие. База это сайт начала транскрипции, сайт посадки РНК-полимеразы и общий фактор транскрипции [например, BRE-элемент, который узнаётся TFIIB (транскрипционный фактор IIВ) РНК-полимеразы, или ТАТА-бокс, который связывается ТАТАсвязывающим белком, который расплетает ДНК, а потом TFIID РНК-полимеразы]. Энхансеры и сайленсеры это участки ДНК, которые имеют один и тот же смысл: к ним прилипает какой-то белок. В случае энхансеров он способствует присоединению РНК-полимеразы, тем самым улучшая экспрессию, а в случае сайленсеров – наоборот, присоединяется белок-репрессор, который понижает либо совсем подавляет синтез РНК. Ещё важно понимать, что энхансеры и сайленсеры могут быть вообще где угодно: на несколько килобаз выше или ниже усиляемого/ослабляемого участка, внутри интронов или на второй нити хромосомы. Наконец, обсудим альтернативный сплайсинг. Это когда один ген можно использовать для кодирования Альтернативный сплайсинг. нескольких белков. Обычно это делается пропуском экзона на этапе сплайсинга. Это на порядок увеличивает 25 биоразнообразие, у человеков 95% мультиэкзонных генов сплайсятся альтернативно. Возникает вопрос: какого лешего это вообще часть этого билета? А всё очень просто. Как мы все знаем, что время сплайсинга спайсосома режет интроны и экзоны по сайтам сплайсинга, поэтому можно воспрользоваться механизмами репрессоров и энхансеров по аналогии с транскрипцией. Действительно, можно посадить на сайт сплайсига какой-нибудь белок, который не даст сплайсосоме сесть и разрезать, либо наоборот посадить белок, привлекающий сплайсосому, тем самым устроив сплайсинг там, где его могло и не быть – так можно вырезать экзоны. 26 10. Репарация ДНК. Эксцизионная репарация NER и BER. Белки эксцизионной репарации (гликозилазы, АП-нуклеазы, UvrABCD, ДНК-полимераза II). SOS-ответ бактерий. Роль генов: recA, lexA, umuCD, uvrABCD. Как мы поняли в билете номер семь, с ДНК могут случаться разнообразные точечные мутации нуклеотидов, которые нужно исправлять. Процесс исправления называется репарацией. Существует два основных способа репарации: Истинная репарация. В этом случае есть специальный фермент, который способен быстро и точно узнать определённую мутацию и починить её. Так, например, работает метилтрансфераза, забирающая метил с азотистого основания на свой собственный цистеин. Она одоноразовая, потому что с цистеина метил уже не снять, но работает. Такой подход прост, но плох тем, что чаще всего достаточной точности в обнаружении мутаций достичь не получается. Эксцизионная репарация заключается в удалении повреждёния и заменой на правильное азотистое осноNER) и эксцизионную репарацию оснований (BER). Начнём с последней. Она начинается с того, что ферменты ДНК-гликозилазы распознают повреждёнвание. Она, в свою очередь, подразделяется на эксцизионную репарацию нуклеотидов ( ные основания, неспаренные основания или урацил (которого в ДНК быть не должно), в основном за счёт того, что повреждённые основания нарушают структуру спирали и «торчат» из неё, попадая в активный центр гликозилазы. Узнавая, она разрезает связь азотистого основания с дезоксирибозой, образует АП-сайт (апуриновый и апиримидиновый). Дальше есть два варианта, слабо отличающихся друг от друга, которые возникают из-за того, что гликозилаза может быть лиазей, то есть может разорвать цепь с 3’-конца повреждённого нуклеотида. Если так происходит, то дальше другой фермент, АП-эндонуклеаза, вносит разрыв с 5’-конца, тем самым полностью вырезая нуклеотид, а бреш застраивается и зашивается ДНК-полимеразой и лигазой. Если гликозилаза не имеет лиазной активности, то АП-эндонуклеаза связывает с АП-сайтом и вместе с ним вырезает всю его семью ещё с десяток соседей, а дальше всё опять застраивается и зашивается. Но BER применим не всегда, потому что проблема может быть больше, чем в одном нуклеотиде, например, для пиримидиновых димеров. Тогда на помощь приходит NER, который, судя по ферментам из названия билета, мы будем рассматривать в прокариотах. NER прокариотов осуществяется системой белков UvrABCD. Первые три объединяются в Вольтрона комплекс UvrABC, который является эндонуклеазой: сначала UvrA находит пиримидиновый димер или другую «крупную лажу» в ДНК и связывается с UvrB. Далее UvrA диссоциирует с затратой АТФ, а к UvrB присоединяется UvrC, который вносит надрезы по обе стороны от повреждения с отступом в несколько нуклеотидов влево и вправо, что тоже требует АТФ. После этого хеликаза UvrD расплетает ДНК между разрезами, высвобождая цепь, которая достаивается полимеразой и зашивается лигазой. Чаще всего отрезаются коротки куски в 12 bp, но иногда UvrABC пьянет и режет полторы килобазы или даже девять килобаз, почему так происходит никто не знает. Наконец, отметим, что UvrABC может не только сам узнавать повреждения, но и привлекаться другими белками. Про SOS-ответ и замешанные в нём ферменты было подробно написано в седьмом билете. 27 11. Классификация белков по фунции. Ферменты, классификация ферментов (примеры для основных групп по EC). Хроматографические методы разделения белков: гель-фильтрация, ионообменная хр-я, обращённая фаза, аффинная хр-я. По функциям белки обычно делят на следующие категории: ∙ Структурные – принимают участие в формировании клеточных мембран, в частности, могут образовывать в них каналы. (коллаген, кератин). ∙ Питательные и запасные – обеспечивают питание организма аминокислотами, кальцием и фосфором, атакже их запас в белках того же класса. (казеин, овальбумин) ∙ Сократительные – обеспечивают работу мышц, движение жгутиков и ресничек у простейших, изменение формы клеток, перемещение органелл внутри клетки. (актин, миозин) ∙ Транспортные – беспечивающие транспорт липидов, гормонов и иных веществ; в мембране переносят глюкозу, аминокислоты, ионы и др. (гемоглобин, ионные каналы) ∙ Ферменты – почти все химические реакции в организме протекают при участии ферментов: катализаторов, ингибиторов и др. ∙ Защитные – защищают организм от вторжения других организмов или предохраняющие его от повреждений. (иммуноглобулин, интерферон, фибрин) ∙ Рецепторные – позволяют клеткам и органеллам получать сигналы извне. (холинорецептор, инсулинрецептор, родопсин) ∙ Регуляторные – участвуют в управлении биологическим и процессами, например, обмену веществ. (гистоны, инсулин, глюкагон) В соответствии с классификацией Комиссии по ферментам (Enzyme committee, EC), ферменты делятся на 7 основных классов, которые далее подвергаются дополнительной классификации. К классу привязан специальный номер, используемый для его обозначения в классификации, эти номера соответственно: 1. Оксидоредуктазы – окислительно-восстановительные реакции, перенос атомов H и O или электронов от одного субстрата на другой. (дегидрогеназа, оксидаза) 2. Трансферазы – перенос функциональной группы от одного субстрата на другой. (киназы) 3. Гидролазы – образование двух продуктов из одного субстрата в результате гидролиза. (липазы, фосфатазы) 4. Синтазы – негидролитическое добавление или удаление группы к или от субстрата. Образование C−N, C−O или C−S C−C, связи. (карбоксилазы) 5. Изомеразы – внутримолекулярная перестановка, то есть изомеризация молекулы субстрата. (гексазы) 6. Лигазы – соединение двух молекул в результате синтеза новой C−C, C−N, C−O или C−S связи, сопря- жённое с одновременным гидролизом АТФ. (синтетазы) 7. Транслоказы – перенос ионов или молекул через мембраны или их разделение в мембранах. (мембранные транспортные белки) Дальнейшая классификация ферментов подразумевает разделение на подклассы и под-подклассы. В итоге каждый фермент получает личный кодом вида «КФ X.Y.Z.W», где X – класс фермента (один из семи описанных выше), Y – подкласс, Z – под-подкласс, W – порядковый номер фермента в его под-подклассе. Пример использования классификации: рассомотрим наш любимый фермент, благодаря которому можно бухать: алкогольдегидрогеназу, имеющую КФ 1.1.1.1: КФ 1 — Оксидоредуктазы, КФ 1.1 — Оксидоредуктазы, окисляющие группу CH−OH, КФ 1.1.1 — Алкогольоксидоредуктазы, восстанавливающие то есть алкогольоксидоредуктазы, NAD+ . Перейдём ко второй части билета. Одним из самых используемых методов для разделения белков в белковом растворе является хроматография. Рассмотрим её различные виды: 28 ∙ Гель-фильтрация (разделение по молекулярной массе). Метод основан на использовании гелевых гранул, имеющих поры определенной характерной величины. Частицы, имеющие размер сильно больший, чем характерный размер пор, будут проходить хроматографическую колонку, не задерживаясь, в то время как мелкие частицы будут забиваться в порах и проходить медленно. Так как молекулярная масса кореллирует с размером молекулы, такой метод храматографии позволит разделить тяжеле белки от легких микромолекул или белки с сильно отличающейся массой и т.д. ∙ Ионнообменная хроматография (разделение по типу заряда молекулы). Этот метод основан на различии констант ионнообменного взаимодействия у компонентов смеси. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми молекулами-ионами противоположного заряда. Данный метод классифицируется на два типа — катионную и анионную хроматографию: катионная ионообменная хроматография задерживает положительно заряженные катионы, так как неподвижная фаза имеет отрицательно заряженные функциональные группы (например, PO3− 4 ), анионная задерживает отрицательно заряженные анионы, так как неподвижная фаза имеет по- ложительно заряженные группы (например, ∙ Нормально-фазовая хроматография NH+ 4 ). (разделение по типу растворимости). Данный вариант хро- матографии осуществляется при твердой полярной неподвижной фазе и гидрофобной подвижной. Это позволяет первыми вывести с колонки наиболее неполярные соединения, так как более полярные хуже связываются с подвижной фазой и адсорбируются на колонке. Тот же тип разделения используется при обратно-фазовой хроматографии: в ней неподвижная фаза гидрофобна, подвижная – гидрофильна. Аналогично, при использовании этого варианта хроматографии первыми будут покидать колонку более полярные молекулы. Однако стоит отметить, что для белков более подходящей является нормальнофазовая хроматография, так как они могут денатурировать в большинстве подвижных фаз, используемых для обратно-фазовой. ∙ Афинная хроматография (основана на специфическом связывании с мишенью). В ее основе лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с носителем. В случае аффинной хроматографии в роли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты), вступающие с лигандом (тоже, как правило, органическим) в специфическое биохимическое взаимодействие. Например: антитело-антиген, гормон-рецептор и т.д. Именно высокая специфичность подобного взаимодействия обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии и её широкое (по сравнению с другими видами лигандной хроматографии) распространение. 29 12. Реакции гликолиза. Основные реакции цикла Кребса, глиоксилатный шунт. Цикл Кальвина. RuBisCo и пируваткарбоксилаза для фиксации CO2. Различия С3 и С4 фотосинтеза.5 Гликолиз это процесс окисления глюкозы, при котором из одной молекулы глюкозы образуются две молекулы пировиноградной кислоты (ПВК или пирувата). Гликолиз состоит из цепи последовательных ферментативных реакций и сопровождается запасанием энергии в форме АТФ и НАДH. Для прохождения гликолиза не требуется кислорода, поэтому он проходит в цитозоле клеток. Однако для + него необходимы 2 АТФ и НАД . Общая формула гликолиза выглядит так: Glucose + 2NAD+ + 2ATP + 4ADP + 4P𝑖 → → 2Piruvate + 2NADH + 2H+ + 4ATP + 2ADP + 2P𝑖 + 2H2 O. Условно процесс делится на три части: 1. Фосфорилирование глюкозы; 2. Разделение на две 3-С молекулы глицеральдегид-3-фосфата; 3. Окисление гилцеральдегид-3-фосфата до пирувата с образованием АТФ. Пируват, полученный в ходе гликолиза, может после быть использован в цикле Кребса (ЦТК, или цикл трикарбоновых кислот, или цикл лимонной кислоты). 5 Для пущего понимания билета, его автор рекомендовал к просмотру вот это видео. 30 Цикл Кребса – основной путь аэробного дыхания для большинства клеток. У эукариотов он проходит в митохондриях, где позже поставляет продукты своих реакций в электронно-транспортную цепь (ЭТК). В ней благодаря реакциям окислительного фосфорилирования происходит выработка АТФ. В прокариотических клетках цикл Кребса проходит прямо в цитозоли. Цикл Кребса условно делится на три части по количеству атомов углерода в молекуле: 1. Шесть: цитрат 2. Пять: → цис-аконитат → изоцитрат; 𝛼-Кетоглутарат; 3. Четыре: сукцинил-КоА → сукцинат В ходе одного цикла выделяются 2 Глиоксилатный шунт. CO2 , → фумарат → малат → оксалоацетат. 3 НАДН, 1 ФАДH2 и 1 ГТФ. В цикле Кребса есть «короткий путь»: среди всех превращений можно «перепрыгнуть» с изоцитрата на малат, совершив промежуточное превращение в глиоксиловую кислоту (глиоксилат) с использованием еще одного ацетил-КоА. При этом остаток изоцитрата превращается в сукцинат, который далее используется для синтеза углеводов. Таким образом, глиоксилатный шунт представляет собой видоизмененный ЦТК, при котором (с использованием двух ацетил-КоА за цикл!) выделяется какая-то часть энергии цикла Кребса и при этом выделяется сукцинат, служащий источником углерода для образования углеводов. Данный цикл используют для этих целей растения, бактерии, грибы и протисты. Животные, в том числе человек, не имеют данного цикла. Цикл Кальвина – основной метаболический путь темновой фазы фотосинтеза, присутствующий у всех растений. Фаза называется «темновой», потому что реакции, происходящие в ней, не зависят от освещенности. Глобальная задача этого цикла – выводить из организма растения CO2 – продукт световой фазы фотосинтеза. Он это делает с образованием углевода – молекулы глюкозы. Важнейшая реакция цикла – фиксация CO2 , то есть присо- единение молекулы С из него к существующей углеродной цепочке. В цикле Кальвина это делает фермент рибулозабисфосфаткарбоксилаза (RuBisCo), присоединяющий CO2 , к рибулозе, после чего та распадается на молекулы 3-фосфоглицерата, с которыми происходят дальнейшие реакции, в том числе образование глюкозы. Данный механизм носит название С3-фиксации из-за того, что фиксация CO2 приводит к образованию трехуглеродных молекул. Суммарная формула реакций в цикле исключая рибулозы: 6CO2 + 10NADH + 10H+ + 16ATP → Glucose + 6H2 O + 10NAD+ + 16ADP + 16P𝑖 . В цикле Кальвина условно можно выделить три стадии: 1. Фиксация CO2 ; 2. Восстановление 3-фосфоглицерата; 3. Восстановление рибулозы. С4-фиксация и С4-фотосинтез. 31 Фермент RuBisCo, осуществляющий С3-фиксацию, является неспецифичным: он может связываться как с CO2 , так и с O2 . При этом он все равно затрачивает АТФ, но работает вхолостую, так как в таком случае не образуется глюкоза. Из-за этого при наличии кислорода в растениях цикл Кальвина перестает работать эффективно, из-за чего растение страдает. Поэтому для успешного фотосинтеза необходимо создавать области с повышенной концентрацией CO2 , в которых нет O2 . Для этого существует механизм С4-фиксации углекислого газа, который позволяет как раз создавать такие области. Этот механизм представляет собой маленький цикл, который использует промежуточный продукт гликолиза, фосфоенолпируват (ФЕП), для фиксации CO2 на нем. В отличие от RuBisCo, фермент, производящий эту фиксацию, пируваткарбоксилаза, селективен к CO2 . В результате этого образуется CO2 . Пируват при помощи При этом выделившийся CO2 отправ- кислороду и фиксирует только четырехуглеродная молекула малата, которая способна разбиваться на пируват и фосфорилирования превращается в ФЕП, возвращая цикл к началу. ляется в специальную область, где он и будет содержаться для успешного выполнения цикла Кальвина. Растения, живущие в жарких регионах, используют этот механизм, чтобы успешно фотосинтезировать. Так как из-за более теплого климата поры растений должны быть закрыты, чтобы предотвратить испарение воды, в них проникает меньше углекислого газа. Поэтому для эффективной работы цикла Кальвина им нужно изолировать CO2 от O2 . Для этого использу- ется С4-фиксация, которая из области смеси тивно фиксирует CO2 CO2 и O2 селек- и высвобождает его из малата в клетки обкладки проводящего пучка, где и создается область, свободная от кислорода, содержащая только CO2 , где и происходит цикл Кальвина. С4 фотосинтез отличается от С3 фотосинтеза тем, что в последнем весь цикл реакций происходит в клетках мезофилах, в то время как при С4-фотосинтезе сначала происходит «очистка» от кислорода при помощи С4-фиксации в мезофиллах, а сам цикл Кальвина происходит в клетках обкладки проводящего пучка, используя только чистый 32 CO2 .
