Министерство науки и высшего образования Российской Федерации федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Н. П. ОГАРЁВА» (ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва») Факультет биотехнологии и биологии Кафедра биотехнологии и биохимии КУРСОВАЯ РАБОТА по теме: РАНЕВЫЕ ПОКРЫТИЯ С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ Автор курсовой работы ________________ Г. Х. Шарифкулова подпись, дата Обозначение курсовой работы: КР–02069964–19.03.01–33–21 Направление подготовки 19.03.01 Биотехнология Руководитель работы д-р. биол. наук, профессор ___________________ подпись, дата Оценка ______________ Саранск 2021 Д. А. Кадималиев Министерство науки и высшего образования Российской Федерации федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Н. П. ОГАРЁВА» (ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва») Факультет биотехнологии и биологии Кафедра биотехнологии и биохимии ЗАДАНИЕ НА КУРСОВУЮ РАБОТУ Студент Шарифкулова Гамиля Хаджи-Муратовна 503 группа 1 Тема Раневые покрытия с протеолитическими ферментами 2 Срок предоставления работы к защите ____________________ 3 Исходные данные для научного исследования: научные работы отечественных и зарубежных учёных по теме исследования 4 Содержание курсовой работы (проекта) 4.1 Введение 4.2 Аналитический обзор 4.2.1 Этиология и причины сочащихся ран 4.2.2 Способы лечения сочащихся ран 4.2.3 Протеолитические ферменты 4.2.4 Участие протеолитических ферментов в лечении сочащихся ран 4.3 Материалы и методы исследования 4.3.1 Методы определения протеолитической активности 4.3.2 Методы контроля эффективности ранозаживляющих препаратов с ферментами 4.3 Заключение 4.4 Список использованных источников Руководитель работы __________________ подпись, дата Задание к исполнению принял __________________ подпись, дата 2 Д. А. Кадималиев РЕФЕРАТ Курсовая работа 50 с., 4 рис., 45 источников. РАНЫ, ЗАЖИВЛЕНИЕ, РАНЕВЫЕ ПОКРЫТИЯ, ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, МЕДИЦИНА. Целью работы является изучение особенностей протеолитических ферментов и их применения в медицине в качестве средства для лечения ран. В процессе работы был проведен анализ литературных данных, касающихся области изучения процессов заживления ран, раневых покрытий с протеолитическими ферментами. Степень внедрения – частичная. Область применения – научно-исследовательская работа кафедры биотехнологии и биохимии. Эффективность – расширение знаний в области изучения раневых покрытий с ферментами. 3 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 5 1 Аналитический обзор 7 1.1 Этиология и причины сочащихся ран 7 1.2 Способы лечения сочащихся ран 19 1.3 Протеолитические ферменты 30 1.4 Участие протеолитических ферментов в лечении сочащихся ран 36 2 Материалы и методы 40 2.1 Методы определения протеолитической активности 2.1.1 Метод определения подлинности 40 фермента по створаживающему действию на растворы молока 2.1.2 Методика определения протеолитической активности в ГЛФ 40 40 2.2 Методы контроля эффективности ранозаживляющих препаратов с ферментами 43 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 45 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 46 4 ВВЕДЕНИЕ Широкое распространение раневой патологии и связанные с ней осложнения, трудность своевременной диагностики, лечение и наносимый экономический ущерб перерастают в серьезную социальную проблему. Длительное лечение ран в стационаре приводит к значительным материальным затратам, обусловливая тем самым значимость проблемы [4]. Для улучшения результатов лечения гнойных и сочащихся ран дополнительно к хирургической обработке применяют местные ранозаживляющие средства, которые представлены мазями на гидрофобной и гидрофильной основе, пленочными повязками, пенными материалами, гелями, а также традиционными перевязочными средствами на основе хлопковой целлюлозы. В последние десятилетия в арсенале основных лечебных средств для купирования гнойнонекротических процессов стала применяться местная ферментотерапия. Трипсин при попадании на гнойно-некротическую рану расщепляет нежизнеспособные ткани, которые обычно удаляются при хирургической обработке [4]. Применяемые методы лечения гнойных и сочащихся ран, не удовлетворяют современную практическую медицину [4], поэтому проблема лечения таких ран является весьма актуальной. Согласно вышеизложенному основной целью данной курсовой работы являлось изучение особенностей заживления ран и оценить возможность протеолитических ферментов в медицине. В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования: – рассмотреть этиологию и причины сочащихся ран; – изучить способы лечения сочащихся ран; – ознакомиться с понятием протеолитические ферменты; 5 – проанализировать участие протеолитических ферментов в лечении сочащихся ран. 6 1 Аналитический обзор 1.1 Этиология и причины сочащихся ран Кожа – самый большой орган в организме, выполняющий множество различных функций [29]. В дополнение к ее способности регулировать температуру тела, получать внешние раздражители и помогать в синтезе витамина D, одна из самых ценных ролей кожи заключается в ее способности защищать организм от травм, микробной инвазии и высыхания [28]. Она состоит из преимущественно клеточного эпидермиса и подлежащей дермы, которая состоит из волокон соединительной ткани, относительно мало населенных клетками (рисунок 1). И эпидермис, и дерма играют важную роль в функционировании кожи и ее реакции на травмы [29]. Рисунок 1 – Анатомия кожи человека, иллюстрирующая структуры, необходимые для заживления ран [29] Эпидермис, благодаря своей быстрой митотической активности и толстому слою кератина на своей поверхности обеспечивает быстрое 7 заживление ран и обеспечивает очень стойкий барьер от инородного вторжения и высыхания. Тогда как, дерма обеспечивает основу для эффективного роста волос, выработки пота и жира, и играет важную роль в терморегуляциии. Также очень важную роль играет подкожный слой (подкожная клетчатка), который отделяет кожу от фасции и обеспечивает поддерживающий каркас, чтобы кожа могла выполнять свои функции [28]. Рана – это нарушение целостности кожи или слизистых, как правило, сопровождающееся повреждением глубжележащих тканей или органов, вызванное механическим воздействием. Традиционное медицинское определение ран основано, в первую очередь, на этиологии, где причиной раны (сейчас она называется острой) было приложение внешней силы (нож, пуля и т.д.), а патологический процесс на коже, вызванный «внутренней патологией» (венозный застой с гипертензией и др.) называли язвой (сейчас она называется хронической раной). На текущий момент большую часть повреждений кожи называют раной и делят их на острые и хронические в зависимости от срока давности и их тенденции к заживлению (или отсутствию заживления). Соответственно, этиологический фактор в данном случае не является определяющим. Хронической раной принято называть рану, существующую более 3-х недель или рану не способную пройти через последовательный процесс восстановления анатомической целостности и поддержания функционального результата. Тем не менее, сохраняется ряд причин, которые не позволяют учитывавших анатомическое отказаться этиологию от существовавших процесса, расположение, а характер также ранее классификаций, повреждающего требуемые агента, медицинские вмешательства, результаты лечения. По характеру ранящего оружия различают раны: резаные, колотые, рубленые, ушибленные, размноженные, рваные, скальпированные, укушенные, отравленные, огнестрельные (пулевые, осколочные) и другие. 8 По форме: линейные, дырчатые, звездчатые, лоскутные По обстоятельствам нанесения намеренные (операционные), случайные и боевые. По степени бактериального загрязнения: Асептические (чистые), т. е. нанесенные в стерильных условиях (при соблюдении правил асептики); согласно современным представлениям, операционные раны называют «условно стерильными» и требуют назначения в послеоперационном периоде антибиотикопрофилактики. Контаминированные (микробно загрязненные) – все случайные раны, а также случаи, когда в результате условно чистых операций в рану попадают патогенные микроорганизмы из патологического очага (острый аппендицит, перитонит и т. д.); определяющим фактором перехода контаминированной раны в инфицированную является недостаточная антибактериальной терапии. Инфицированные характеризующиеся (в развитием том числе активного и гнойные) воспаления с – раны, иммунным компонентом в ответ на контаминацию патогенными микроорганизмами при отсутствии адекватной антибактериальной терапии [8]. Чтобы полностью понять, как заживают раны, сначала необходимо оценить существующие биологические механизмы, лежащие в основе этого процесса [28]. Комплекс местных и общих реакций организма, развивающихся с момента получения раны до её заживления называют раневым процессом [8]. Заживление ран – это многоступенчатый и сложный процесс, состоящий из 1) воспаления, 2) пролиферации 3) фазы созревания [28, 34]. Вторая и третья фазы заживления в целом постоянны вне зависимости от типа заживления раны и наступают только после эпителизации раны. 9 Течение всех фаз раневого процесса занимает в среднем от 9 до 12 месяцев. Формирование хронической раны характеризуется нарушением или блокировкой одной из фаз раневого процесса. Понимание течения раневого процесса важно для учета состояний и заболеваний пациента, которые могут влиять на процесс заживления [8]. На первой стадии воспаления происходит гемостаз и образование тромбов, во время которых иммунные клетки рекрутируются и способствуют воспалению путем высвобождения различных цитокинов и факторов роста [34]. Воспалительная стадия начинается с агрегации тромбоцитов и образования фибринового сгустка, который восстанавливает гемостаз и обеспечивает внеклеточный матрикс для миграции клеток. После коагуляции активируются многочисленные цитокины (например, трансформирующий фактор роста-β, тромбоцитарный фактор роста, фактор роста фибробластов, интерлейкин-1), которые вызывают в организме выход и активацию иммунных клеток. Нейтрофилы и макрофаги работают вместе, чтобы очистить рану, удаляя бактерии и нежизнеспособные клетки хозяина. Тучные клетки выделяют гранулы, содержащие гистамин и другие ферменты, которые вызывают характерные признаки воспаления – покраснение, жар, отек и боль [28]. Рана освобождается от девитализированных тканей и инородных тел. В момент повреждения в рану поступает кровь, привнося в нее не только клеточные элементы, но и различные белки, среди которых наибольшее значение имеет фибриноген. Первичная сосудистая реакция на травму начинается с интенсивной вазоконстрикции, она развивается в течение 5-10 мин. В результате адгезии и агрегации тромбоцитов происходит тромбирование сосудов. Затем наступает процесс активной вазодилатации. Он обычно проявляется примерно через 20 мин после возникновения травмы и сопровождается возрастанием капиллярной проницаемости. Ключевым химическим медиатором ответственным за вазодилатацию и сосудистую 10 проницаемость является гистамин, увеличивающий сосудистую проницаемость в течение примерно 72 ч. В это время могут наблюдаться первые клинические признаки воспалительной реакции – эритема и повышение местной температуры вследствие вазодилатации, отек вследствие повышения сосудистой проницаемости и боль в результате повышения внутритканевого давления, как результат отека. Исходом вазодилатации является истечение тканевой жидкости из стенки раны («первичный защитно-биологический эффект»), что обеспечивает минимизацию контакта подлежащих тканей с микробами и их токсинами в течение 6-8 часов. Увеличение степени сосудистой проницаемости в зоне травмы лежит в основе притока к ней различных клеточных популяций, в том числе полиморфонуклеарных лейкоцитов (PMN) и мононуклеарных лейкоцитов. Последние по мере созревания превращаются вначале в раневые макрофаги, а позже – в лимфоциты. В течение 4-6 часов после ранения лейкоциты мигрируют посредством диапедеза (просеивания) через стенку сосудов в зону повреждения. При отсутствии инфекции и инородных тел количество лейкоцитов в ране уменьшается. Если же бактерии или инородные тела не элиминируются, воспалительный процесс продолжается. Лейкоциты выбрасывают гидролитические энзимы для разрушения бактерий и очищения раны. Большинство лейкоцитов двигается по направлению к поверхности раны, где и погибают. Миграция лейкоцитов обеспечивает образование лейкоцитарной пробки. Когда фаза воспаления поддерживается возрастающим количество патогенных бактерий и девитализированными тканями, физиологический ответ может превосходить воздействие первичной травмы. Мононуклеарные фагоцитирующие клетки и трансформированные макрофаги появляются в ране через 1-2 сут. Они высвобождают факторы гемостаза и факторы роста, которые активируют и стимулируют деление фибробластов и рост кровеносных сосудов. В течение 3-4 суток после ранения макрофаги становятся доминирующим типом клеток в ране. В отличие от нейтрофилов, 11 они имеют долгую жизнь и находятся в ране даже в поздние сроки процесса заживления. Макрофаги выполняют важную функцию очищения раны посредством фагоцитоза от некротических тканей, инородных тел и погибших клеток. В течение первых 3-5 суток после травмы остатки органических веществ утилизируются и в рану мигрируют фибробласты и эндотелиальные клетки. Длительность и интенсивность воспалительной реакции определяет количество и плотность формирующейся рубцовой ткани [8]. Далее, пролиферативная стадия начинается с реэпителизации раны. На стадии пролиферации, цитокины и факторы роста опосредуют реэпителизацию, формирование внеклеточного матрикса и ангиогенез [34]. Продолжается от 5 суток до 3 недель после травмы. В течение этого периода происходит пролиферация соединительной ткани. Фибробласты синтезируют не только коллаген, но и протеогликаны, эластин, содержат энзимы, необходимые для синтеза холестерола, завершения цикла Кребса и гликолиза [28]. Клетки эпидермиса мигрируют в боковом направлении по свободному краю раны и начинают рассекать внеклеточный матрикс за счет секреции коллагеназы и плазмина. По мере прогрессирования заживления раны повышается потребность в кислороде и питательных веществах в месте раны. В результате секретируются цитокины, которые стимулируют регенерацию нового кровоснабжения области, процесс, называемый неоваскуляризацией [28]. Для нормального функционирования фибробластам требуются витамины группы В и С, кислород, аминокислоты и микроэлементы. Фибробласты начинают появляться в ране в конце воспалительной фазы и уже в течение первых 2-3 суток после возникновения раны, они начинают доминировать среди клеточных популяций в течение первой недели. Раневые фибробласты продуцируют разнообразные субстанции, необходимые для раневого заживления, включая гликозаминогликаны (GAG) и коллаген. 12 Возрастание содержания коллагена в ране взаимосвязано с увеличением прочности раны. Источником биохимического стимула ангиогенеза являются макрофаги и тромбоциты. На первой неделе после ранения активность синтеза коллагена достигает максимума, и незрелые коллагеновые фибриллы становятся гистологически видимыми. Образуется грануляционная ткань, видимая невооруженным глазом в ране, служащая барьером для получения микробами питательных веществ. Грануляционная ткань бесцветна, однако за счет ангиогенеза принимает розовый или красный оттенок [8]. Наличие этих новых кровеносных сосудов в сочетании с факторами роста, продуцируемыми макрофагами, позволяет фибробластам в ране начать выработку нового внеклеточного матрикса, который восстановит структуру и функции поврежденной ткани. Эта богатая фибробластами грануляционная ткань состоит в основном из коллагена I типа и других вспомогательных структурных белков. Примерно на второй неделе заживления раны начинается ремоделирование, поскольку миофибробласт становится преобладающим в грануляционной ткани, обеспечивая уплотнение и сжатие раны с помощью перекрестных связей с коллагеном [28]. Коллаген является важным строительным материалом соединительной ткани. Содержание коллагена в ране регулируется балансом между продукцией и деградацией коллагена посредством коллагеназы. Искусственное регулирование этого баланса дает расширенные возможности для вмешательства в процесс раневого заживления и формирование рубца [8]. Наконец, сокращение и ремоделирование раны происходят на стадии созревания [34]. Рана закрывается, прочность рубцовой ткани возрастает. Коллагеновые фибриллы, которые в процессе фиброплазии располагались беспорядочно, превращаются в более организованные структуры, изменяя расположение в зависимости от направления сил механического воздействия. В процессе 13 ремоделирования многие из «старых» фибрилл лизируются коллагеназами, тогда как параллельно идет процесс образования новых фибрилл. Направление сил, действующих на рану, является важным фактором, в результате которого происходит разрушение фибрилл. Гистологически, зрелая рубцовая ткань представлена параллельными, плотными пучками коллагена, содержащими небольшое количество кровеносных сосудов и клеток в сравнении с неповрежденными тканями. В течение 3 месяцев рубец становится плоским, мягким и светлым. Начинается образование ответвлений капилляров от соседних сосудов, проникающих в рану и растущих петлями. Так как с момента снижения синтеза коллагена необходимость в высоком напряжении кислорода пропадает, многие из этих кровеносных сосудов не сохраняются. Так, рана трансформируется из богатой капиллярами и клетками ткани в относительно бедный клеточными элементами рубец, состоящий из прочных коллагеновых тканей. Исходом физиологичного процесса раневого заживления является образование нежного рубца с небольшим фиброзом, минимальным при наличии раневой контракции и возвращение практически к нормальной структуре ткани и функции органа [8]. Эти фазы происходят частично, но упорядоченно [34]. Течение раневого процесса сопровождается разнообразными клиническими проявлениями, среди которых выделяются трех главных симптома: Зияние кожных краев и стенок раны Кровотечение из поврежденных сосудов Боль и пальпаторная болезненность в области раны [8]. В медицине под экссудацией (от лат. [ex] sudare – выделение) понимают обусловленное воспалительным процессом выделение компонентов крови из капилляров в окружающие ткани или на внутреннюю, или внешнюю поверхность. Экссудация начинается от момента травмы, 14 поэтому первую фазу заживления раны также называют воспалительной, или экссудативной, фазой [2]. В зависимости от особенностей клеточного и биохимического состава различают следующие виды экссудата: 1. Серозный экссудат, почти прозрачный, характеризуется умеренным содержанием белка (3-5%, в основном альбумины), невысоким удельным весом (1015-1020), рН в пределах 6-7. В осадке содержатся единичные сегментоядерные гранулоциты и слущенные клетки серозных оболочек. Серозный экссудат образуется при воспалении серозных оболочек (серозный плеврит, перикардит, перитонит и др.), а также при ожоговом, вирусном или аллергическом воспалении. Серозный экссудат легко рассасывается и не оставляет никаких следов или образует незначительное утолщение серозных оболочек. 2. Фибринозный экссудат характеризуется высоким содержанием фибриногена, который при соприкосновении с поврежденными тканями переходит в фибрин, вследствие чего экссудат уплотняется. На поверхность серозных оболочек фибрин выпадает в виде ворсинчатых масс, а на поверхность слизистых оболочек – в виде пленок. В связи с этими особенностями фибринозное воспаление подразделяется на дифтериитическое (плотно сидящие пленки) и крупозное (рыхло сидящие пленки). Крупозное воспаление развивается в желудке, кишечнике, бронхах, трахее. На серозных оболочках массы фибрина частично подвергаются аутолизу, а большая часть организуется, то есть прорастает соединительной тканью, в связи с чем могут образовываться спайки и рубцы, нарушающие функцию органа. На слизистых оболочках фибринозные пленки подвергаются аутолизу и отторгаются, оставляя дефект слизистой оболочки, – язву, глубина которой определяется глубиной выпадения фибрина. 15 Заживление язв может происходить быстро, но в некоторых случаях затягивается на длительные сроки. 3. Гнойный экссудат – это мутная воспалительная жидкость зеленоватого оттенка, вязкая, содержащая альбумины, глобулины, нити фибрина, ферменты, продукты протеолиза тканей и большое количество полиморфноядерных лейкоцитов, преимущественно разрушенных (гнойные тельца). Гнойное воспаление может возникать в любой ткани, органе, серозных полостях, коже и протекать в виде абсцесса или флегмоны. Скопление гнойного экссудата в полостях организма носит название эмпиемы. Этиологические факторы гнойного воспаления разнообразны, оно может быть вызвано стафилококками, стрептококками, менингококками, гонококками, микобактериями, патогенными грибками и др. 5. Гнилостный экссудат (ихорозный) развивается при участии в воспалительном процессе патогенных анаэробов. Воспаленные ткани подвергаются гнилостному разложению с образованием дурно пахнущих газов и грязно-зеленого экссудата. 6. Геморрагический экссудат характеризуется содержанием различного количества эритроцитов, вследствие чего он приобретает розоватую или красную окраску. 7. Смешанные формы экссудата – серозно-фибринозный, серозногнойный, серозно-геморрагический, гнойно-фибринозный и другие – возникают при присоединении вторичной инфекции, при снижении защитных сил организма или прогрессировании злокачественной опухоли [22]. Экссудаты из ран образуются на ранних стадиях заживления ран, когда медиаторы воспаления, такие как гистамин и брадикинин, увеличивают проницаемость капилляров [31]. Воспаление в пораженной области приводит к увеличению выделения плазмы крови в интерстиций (пространство между тканями или клетками), 16 что способствует внедрению иммунокомпетентных воспалительных клеток (лейкоцитов, макрофагов) в область раны. Их задачей является борьба с инфекциями и удаление остатков клеток, бактерий и инородных тел путем фагоцитоза (фаза очищения). Одновременно экссудат увлажняет раневую среду и распределяет биохимически активные медиаторы, имеющие значение для формирования клеток, сосудов и тканей в последующей фазе грануляции. Таким образом, экссудат является важным фактором раневой репарации. Если рана заживает без осложнений, его количество уменьшается в соответствии с фазами течения раневого процесса. Оно максимально в фазе очищения и уменьшается по мере наступления эпителизации. Возможный дефицит влаги или избыток экссудата, как правило, можно без проблем скорректировать с помощью соответствующих активно увлажняющих раневых покрытий [2]. Однако избыток экссудата может привести к чрезмерному увлажнению раны, подавлению пролиферации фибробластов и продлению фазы воспаления, тем самым препятствуя процессу заживления, что может привести к опасным для жизни осложнениям и увеличению заболеваемости пациентов. Кроме того, плохое управление экссудатом неизбежно увеличивает затраты на лечение [31]. В основном речь идет о длительно незаживающих, или так называемых хронических, ранах, в которых экссудат становится проблемным фактором. При этом помехи и затруднения не всегда обусловлены избытком экссудата. Встречаются хронические раны, высохшие настолько, что они уже не способны образовывать экссудат, необходимый для нормального заживления [2]. Тем не менее на практике хронические раны с обильной экссудацией встречаются гораздо чаще. Избыточная экссудация таких стагнирующих ран может быть обусловлена рядом причин. Вследствие постоянного притока воспалительных клеток, вызванного продолжающимся поражением тканей, хроническая рана длительно задерживается в фазе воспаления и поэтому 17 постоянно продуцирует экссудат. Однако воспалительные процессы, способствующие интенсивным раневым выделениям, в свою очередь, обусловлены раневой инфекцией и наличием некроза, особенно если речь идет об экссудирующих опухолевых ранах. Зачастую присутствие отека увеличивает количество экссудата. Принадлежность к фазе воспаления, а также инфекционное происхождение отражаются на составе, консистенции и цвете экссудата. Физиологический, «нормальный» раневой экссудат чист и прозрачен, имеет медовый или янтарно-желтый цвет и водянистую консистенцию. Вязкий, окрашенный в зеленый или красный цвет и имеющий неприятный запах экссудат указывает на критический рост возбудителя или инфицирование. В этих случаях необходим подбор антибактериальной терапии, при необходимости дополнительное системное лечение антибиотиками. Экссудат хронических ран, как это и ожидалось в связи с их продолжительным характером, содержит значительно большее количество провоспалительных цитокинов и протеаз, в частности матриксных металлопротеаз. Проблема обильно мокнущих ран может быть решена посредством удаления некроза, контроля раневой инфекции и лечения основных заболеваний. Также являются полезными приподнятое положение ног, компрессионная терапия для устранения отеков или меры по стимуляции лимфооттока [2]. Гнойное заболевание мягких тканей – это результат внедрения и размножения в мягких тканях патогенных гноеродных микробов с последующим формированием гнойного очага, для чего необходимо, с одной стороны, преодоление защитных сил макроорганизма, с другой – наличие определенной чувствительности организма к патогенному агенту. Гнойные поражения мягких тканей возникают в результате осложненного течения травматических повреждений мягких тканей (механические – укусы, травмы; термические; химические), хирургического лечения острых и хронических гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей (фурункул, карбункул, 18 флегмона, абсцесс и др.), при различных инфекционных послеоперационных и постинъекционных осложнениях. У ряда пациентов наличие гнойного очага связано с осложненным течением сосудистых заболеваний с трофическими нарушениями: трофические язвы на фоне венозной, артериальной недостаточности, на фоне синдрома диабетической стопы [10, 49]. За последние годы под влиянием различных факторов, в первую очередь мощного селективного действия антибиотиков, произошли значительные изменения этиологии раневых инфекций. В настоящее время ведущими возбудителями являются: стафилококки (S. aureus, S. epidermidis); стрептококки; I-, B-, Y-гемолитические и негемолитические представители семейства Enterobacteriaceae (E. coli, Citrobacters spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp.); неферментирующие грамотрицательные бактерии (Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Moraxella spp., Flavobacterium, Achromobacter); облигатные неспорообразующие анаэробные микроорганизмы (Bacteroides, Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, F. nucleatum, P. melaninogenicus). Следует отметить, что отчетливо прослеживается зависимость видового состава ран от их происхождения [23]. Следовательно, разработка повязок для ран с умным потенциалом управления экссудатом, которые могут обеспечить соответствующую влажность для заживления ран без чрезмерного увлажнения раневого ложа, является весьма актуальной [31]. Посредством соответствующих мер такие раны необходимо возвращать в фазу экссудации, например, путем хирургического или физического удаления омертвевших тканей с помощью повязки, позволяющей также стимулировать аутолитическое очищение [2]. 1.2 Способы лечения сочащихся ран Несмотря на разнообразие методик и препаратов, применяемых в современной медицине для стимуляции репарации тканей, интерес к данной 19 проблеме не угасает. Существует ряд проблем, обусловленных малой эффективностью существующих средств, что порой требует нежелательного одновременного применения сразу нескольких препаратов, действующих на разные звенья патогенеза регенеративного процесса. В связи с этим, следует сказать, что наибольшее внимание заслуживает комплексный подход, заключающийся в адекватном местном лечении ран, а также общеукрепляющей терапии, направленной на повышение защитных и регенераторных возможностей организма [15] Оценка дерматологических бактериальных инфекций включает в себя ряд этапов. Во-первых, наличие инфекции и возбудителя определяются клиническими и, при необходимости, лабораторными средствами. Во-вторых, определяется, является ли инфекция первичной или вторичной. Наконец, лечение направлено против возбудителя. Препаратом является антибиотик, обладающий антимикробной активностью в отношении вероятных патогенов, подбирается способ введения и график дозирования, которые повышают вероятность устранения инфекции, а также наименьшую вероятность аллергических реакций или побочных эффектов. Важнейшим дополнением к применению антибиотиков является тщательное очищение ран и перевязка [24]. Основным методом лечения, позволяющим быстро очистить рану от некротизированных тканей, полноценно дренировать и создать условия для заживления, является хирургическая обработка раны, промывание ее растворами антисептиков, дренирование раны и раннее ее закрытие оперативным путем. На практике принципы хирургического лечения гнойной раны выполняются далеко не всегда [12]. Так, М.И. Кузин и соавторы [11] считают, что полная хирургическая обработка раны возможна у 70-80% больных и лишь в 35% наблюдений после нее можно наложить первичные швы. Невозможность и нецелесообразность оперативного закрытия раны 20 определяют необходимость проведения ее местного лечения. Подчеркнем, что хирургическое лечение, местная и медикаментозная терапия гнойной раны являются конкурирующими или взаимозаменяющими методами. Их можно рассматривать только в качестве дополняющих друг друга компонентов комплексного лечения гнойной раны [12]. Биологические методы стимуляции заживления ран представляют собой биологически активные вещества растительного или животного происхождения, которые проявляют антиоксидантные, антимикробные или противовоспалительные свойства. Знания о роли коллагена в формировании соединительной ткани легли в основу создания препаратов на его основе. Широкое распространение получили такие материалы как комбутек, метуракол, коллахит, альгикол, колоцил и другие. Эффективность применения данного фибриллярного белка обусловлена его способностью формировать в области раневого дефекта своеобразный каркас или матрицу, которая стимулирует местный иммунитет, пролиферацию и миграцию гранулоцитов, макрофагов, фибробластов, улучшает перенос факторов роста, а также инициирует ангиогенез. В процессе заживления биоматериал постепенно направленно замещается соединительной тканью организма и таким образом исключается беспорядочный рост грануляционной ткани, что в свою очередь способствует более быстрому заживлению раны и восстановлению нормальной структуры ткани. Имеются данные о роли коллагена в активизации процесса регенерации хронических ран [41]. Так же одним из ключевых участников регенерационного процесса тканей является естественный компонент межклеточного вещества тканей человека гиалуроновая кислота (ГК), которая обладает противовоспалительными и иммунодепрессивными свойствами. Материалы на основе ГК способствуют пролиферации, дифференцировке клеток и разрастанию сосудистой сети [32]. 21 Разработаны препараты местного действия, содержащие факторы роста, которые принимают участие во всех трех фазах раневого процесса и играют ключевую роль в координации функций клеток и регенерации тканей. Так, инфильтрация тканей в области дефекта препаратами эпидермального фактора роста активизирует пролиферацию и дифференцировку фибробластов, кератиноцитов и эндотелиальных клеток. Однако, несмотря на то что факторы роста имели клинический успех, их потенциал в качестве терапевтических агентов, как правило, ограничивается особенностями нативной структуры. В частности, это связано с не стабильной структурой белка, коротким временим полужизни в кровотоке и локализованной тканевой активностью. Эти ограничения создают значительную потребность в новых инструментах и технологиях, которые сделают факторы роста более пригодными для терапевтического использования [15]. Химические методы. Отдельной группой средств для стимуляции регенерации являются препараты пиримидинового ряда, которые являются составной частью нуклеиновых кислот и оказывают на организм многообразное действие, а в частности, в зоне раны пиримидиновые основания ускоряют созревания грануляционной ткани и процесс эпителизации. Известны препараты пентоксил, метилурацил, оротат калия, оксиметацил, ксимедон, которые выступают в качестве эффективных неспецифических стимуляторов и оказывают влияние на различные системы, участвующие в регенерации тканей. Препараты данного ряда также обладают мембраностабилизирующим, антитоксическими и антиоксидантными свойствами и активно используются для борьбы с послеоперационными осложнениями воспалительного характера [15]. Определенное место среди стимуляторов регенерации занимают антиоксиданты, что связано со значительной роль свободнорадикальных реакций (СРР) перекисного окисления липидов (ПОЛ) в течении раневого процесса [12]. Гидроксильные радикалы ОН-, в условиях снижения активности системы антиоксидантной защиты, запускают вторичные СРР не 22 только в зоне раневого дефекта, но и в клетках перифокальной зоны. В результате наблюдается задержка развития последующих за воспалением фаз раневого процесса. Природным антиоксидантом является препарат дигидрокверцетин, который оказывает антиоксидантное, ангиопротекторное, дезинтоксикационное, противоотечное антитоксическое, действие, а также радиопротекторное способствует и процессам фибриллообразования и стабилизации фибрилл коллагена [17]. Также известно, что ключевой детерминантой на протяжении процесса заживления является значение pH. В частности, было установлено, что рН влияет на активность ряда тканевых ферментов, фибробластов, пролиферацию кератиноцитов и иммунологические реакции в ране. Кроме того, изменение рН в ране влияет на эффективность противомикробных препаратов [42]. Физические методы. Развитие медицинской физики позволило внедрить в хирургическую практику ряд методов стимуляции регенерационного процесса, основанных на некоторых физических явлениях, таких как электромагнитное поле, ультразвук, ультрафиолетовое и лазерное излучения, электрический ток и другие [15]. Так, ультрафиолетовое облучение в субэритемных дозах оказывает антибактериальный эффект, стимулирует формирование грануляционной ткани, избирательно воздействует на иммунитет кожи и оказывает иммунорегуляторное действие, нормализуя баланс про- и противовоспалительных цитокинов в ране, что способствует более быстрому закрытию раневого дефекта [15]. Так же на течении раневого процесса благоприятно сказывается применение ультразвука в режиме умеренной мощности. Под действие звуковых волн в области раны происходит улучшение микроциркуляции крови и лимфы и повышение восстановительных процессов. 23 интенсивности окислительно- Данный физический фактор также оказывает повреждающее действие на бактериальную мембрану, тем самым увеличивая чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам и антисептикам, что способствует снижению риска инфекционных осложнений в области послеоперационных ран [15]. Низкоинтенсивное лазерное облучение красного и инфракрасного диапазонов также способно оказывать положительное влияние на заживление дефектов кожи путем стимуляции местного иммунитета, улучшения микроциркуляции и уменьшения отек тканей. Предполагается, что поглощение световой энергии вызывает изменение клеточного окислительно-восстановительного состояния, которое индуцирует активацию многочисленных внутриклеточных сигнальных путей и изменяет сродство транскрипционных факторов, связанных с пролиферацией и регенерацией тканей. Эффективна для стимуляции регенерации кожных дефектов и энергия магнитных полей. Установлено, что магнитное поле улучшает микроциркуляцию, оказывает противовоспалительный, противоотечный, обезболивающий эффекты, может способствовать пролиферации эндотелиальных клеток сосудов и образованию коллагена кожи, увеличивая таким образом прочность послеоперационных рубцов и скорость заживления ран в целом [15]. Так же не следует забывать, что кроме стимулирования регенерационных процессов, требуется создать оптимальные условия для заживления раны. С этой целью возможно применения раневых покрытий – особых изделий, главной задачей которых является создание благоприятных условий для заживления раны на всех этапах [15]. Xue с соавторами разработали композитный материал для удаления экссудатов путем абсорбции и испарения с использованием облучения в ближней инфракрасной области (БИК) на основе фототермического эффекта [43]. Эта конструкция предлагает явные преимущества для непрерывного 24 дренажа избыточного экссудата из влажных ран, поскольку она включает испарение абсорбированного экссудата за счет фототермического эффекта, индуцированного БИК. В отличие от принципа абсорбции, регулирующего обычные повязки, эта стратегия основана на осмосе для транспортировки жидкости при удалении экссудата. Испарение экссудатов с перевязочного материала, вызванное ближним инфракрасным излучением, помогает поддерживать материал в ненасыщенном состоянии и способно непрерывно отводить экссудаты из влажной раны. Однако под воздействием БИК-излучения перевязочный материал подвергается воздействию относительно высоких температур (> 54 ° C), что может вызвать ожог окружающих тканей и увеличить риск апоптоза [43]. Хотя более низкие температуры могут быть более безопасными, эффективность дренажа не может быть гарантирована. Кроме того, поскольку эти материалы являются синтетическими, их производство может включать сложную стратегию изготовления, а их использование может быть связано с проблемами, связанными с загрязнением, что значительно ограничивает крупномасштабное производство с использованием восходящего пути синтеза [31]. Учитывая эти недостатки, существует острая необходимость в разработке альтернативных повязок для ран с эффективными и устойчивыми подходами к синтезу и безопасным потенциалом использования для управления экссудатом и заживления ран. В исследовании китайских ученых, вдохновленном естественной иерархической структурой сахарного тростника, в которой сосудистые пучки отвечают за транспортировку воды, а клетки паренхимы отвечают за хранение сахарозы, изготовили непрерывно дренирующуюся повязку на основе стеблей сахарного тростника для удаления экссудатов из гипергидратированных ран. Целлюлозные каркасы из сахарного тростника, полученные с помощью щелочной обработки и обеззараживания натуральных субстратов сахарного тростника, были покрыты золотыми наностержнями для облегчения фототермической чувствительности при 25 облучении в ближней инфракрасной области. Путем имитации транспирации растений и включения функции реагирования на раздражители естественные волокна тростника были преобразованы в перевязочные материалы для управления экссудатом для ускоренного заживления ран. Поскольку полученные каркасы из сахарного тростника содержали сосудистые пучки и проявляли непрерывно фототермическую самостоятельно эффективностью антибактериальные испарения свойства чувствительность, дренировать (95%). были они были экссудаты Чтобы включены способны с высокой придать повязке наночастицы Ag (рисунок 2) [31]. Процесс заживления в модели раны был более быстрым при использовании этого композита с БИК-облучением, чем при использовании имеющихся в продаже повязок. Более того, поскольку клетки паренхимы в композите образовывали закрытые камеры после удаления сахара, материал способствовал эффективной теплоизоляции для защиты нижележащего слоя раны даже при высокой температуре верхней поверхности (53 ° C) [31]. Обычные гидрофильные повязки на раны, такие как хлопковые марли или синтетические повязки, широко используются на начальных этапах заживления ран для удаления избыточного экссудата. Однако наиболее заметной проблемой, связанной с этими повязками, является их быстрое насыщение из-за ограниченной способности абсорбировать жидкость, что неизбежно приводит к чрезмерному увлажнению раны [31]. 26 Рисунок 2 – Антибактериальная характеристика материала и контроль экссудата. (A) Репрезентативное изображение, изображающее активность композита против S. aureus и E. coli. (B) СЭМ-изображения S. aureus и E. coli до и после антибактериальной обработки. (C) Область ингибирования для S. aureus и E. coli. (D) Сравнение эффектов коммерческой повязки и композита на стимулированный экссудат (суспензия S. aureus, меченная красной флуоресценцией). Изображения были получены в УФ-излучении [31]. Для раневых покрытий выделяют целый ряд условий: во-первых, они должны обеспечивать благоприятное окружение для раны и хорошо выполнять дренажную функцию. Во-вторых, должны препятствовать инфицированию раны или сдерживать размножение уже проникших микроорганизмов [15]. В-третьих, сами покрытия не должны травмировать рану, оказывать раздражающее действие или аллергический эффект. Наиболее распространены и весьма часто применяются пленочные, гидроколлоидные, альгинатные, коллагеновые, 27 гидроцеллюлярные и гидрогелевые раневые покрытия, а также гидрофибры и другие сорбирующие покрытия [1]. Учитывая вышеупомянутые недостатки, были использованы коммерчески доступные технологии для эффективного дренажа избыточного раневого экссудата, и в этой области были проведены новаторские исследования. Например, гидрофобные повязки из пенополиуретана использовались для лечения ран с выделением экссудата от умеренного до сильного. Однако абсорбирующие перевязочные материалы для ран имеют недостатки, которые вызывают накопление экссудата вокруг раны, что приводит к повторному увлажнению и чрезмерной гидратации раневого ложа, тем самым увеличивая риск инфицирования [31]. Чтобы решить эту проблему, Shi с соавторами разработали самодренирующуюся повязку, содержащую слой гидрофобного массива нановолокон и обычный гидрофильный слой медицинской марли. Хотя эта повязка отводила избыточный экссудат из раневого ложа в одном направлении, абсорбционная способность не сохранялась после того, как перевязочный материал был насыщен экссудатом. Следовательно, удаление избыточного экссудата на основе абсорбции сильно ограничено недостаточной абсорбционной способностью перевязочного материала. Более того, поскольку перевязочные материалы должны быть небольшими и тонкими для удобства использования, их объем неизбежно уменьшается, что ограничивает их абсорбционную способность. Для полного удаления раневого экссудата повязки необходимо заменять, когда они почти пропитались [31]. Основные функции перевязочных средств для ран включают 1) усиленную миграцию эпидермиса 2) стимулирование синтеза коллагена и ангиогенеза, 3) защиту от загрязнения. В случае сильно экссудирующих больших ран или невропатических язв особенно ценятся перевязочные материалы для ран, которые могли бы эффективно высушить экссудаты. В частности, для этих ран идеальная 28 повязка может включать следующие свойства: 1) тонкая, но обладающая достаточной механической прочностью для поддержания структуры, 2) высокая способность поглощать большие объемы экссудата и 3) простота удаления после поглощения экссудатов [34]. А.В. Штейнле экссудирующих ран с соавторами проводили абсорбирующей лечение повязкой на обильно основе наноструктурированного графита. Исследователи доказали, что раневая повязка на основе наноструктурированного графита по сравнению с другими перевязочными средствами, обладает максимальной поглотительной и сорбционной способностями, но при этом – минимальными адгезивными свойствами. Большой интерес вызывают работы по лечению ран с обильным отделяемым. Исследователи использовали раневую повязку, выполненную из трех слоев. Слой, контактирующий с раневой поверхностью, состоящий из проницаемого материала, прилегающего к нему сорбционного слоя, а также одного и более внешних защитных слоев. Сорбционный слой организован из фторированных графитовых частиц. Авторы доказали, что раневая повязка обладает высокими адсорбционными свойствами, создает благоприятные условия течения раневого процесса, атравматична, является воздухо- и паропроницаемой [16]. Поскольку частая замена использованных повязок может вызвать значительный дискомфорт у пациента и увеличить потребление медицинских ресурсов, была предложена новая стратегия, позволяющая избежать замены повязок [43]. Ферментативное очищение ран – это высокоселективный метод, при котором используются природные протеолитические энзимы, производимые фармацевтической индустрией специально для лечения ран. Вносимые протеазы действуют в ране совместно с эндогенными ферментами организма. В основном ферментные препараты производятся на основе бактериальной коллагеназы, папаина/мочевины, трипсина, 29 фибринолизина/ ДНКазы, комбинации стрептокиназы – стрептодорназы и субтилизина. Только первые три продукта широко представлены на рынке. В разных странах традиционно применяется один или два из указанных препаратов, в зависимости от доступности сырья. Ферментные препараты применяются в сочетании с другими биологически активными препаратами [5]. Для ускорения регенерации послеоперационных ран могут быть использованы весьма популярные в нашей стране в 70-80 годы прошлого века, выкристаллизованные трипсин и химотрипсин, которые выступают в качестве некролитического, противовоспалительного, фибринолитического, антиоксидантного и противоинфекционного агента, а также способствуют снижению антибиотикорезистентности и вирулентности микроорганизмов, стимулируют синтез коллагена и обладают обезболивающим действием [38]. Однако данная группа препаратов, как средств ускоряющие процесс заживления, не имеет широкого клинического применения, так как протеолитические ферменты активны лишь во влажной среде при фиксированном значении pH – 6 и расщепляют компоненты раневого экссудата, повреждают регенерирующий соединительнотканный матрикс [21]. 1.3 Протеолитические ферменты Ферменты – это биологические катализаторы, которые ускоряют биохимические реакции в живых организмах. Впервые слово «фермент» было использовано немецким физиологом Вильгельмом Кюне в 1878 году, когда он описывал способность дрожжей производить алкоголь из сахаров, и произошло от греческих слов en (что означает «внутри») и zume (что означает «дрожжи») [37]. По структуре ферменты представляют собой белки с первичной структурой ковалентно связанных аминокислот [27]. Это глобулярные белки, размер которых варьируется от 100 до 2000 аминокислотных остатков. 30 Аминокислоты при этом могут быть расположены в виде одной или нескольких полипептидных цепей, которые складываются и изгибаются, образуя определенную трехмерную структуру, включающую небольшую область, известную как активный центр (рисунок 3), где происходит фактическое связывание субстрата. Активный сайт может включать только небольшое количество (менее 10) составляющих аминокислот [37]. Рисунок 3 – Представление связывания субстрата с активным центром молекулы фермента [37] Термин «протеазы» относится к комплексу протеолитических ферментов, который может включать протеиназы и пептидазы. Этот класс ферментов способен гидролизовать пептидные связи [33]. «Пептидазная единица» характеризует домен, несущий каталитический аппарат. Он часто состоит из двух субдоменов с остатками активного сайта и бороздки для связывания субстрата между субдоменами. Помимо каталитических остатков, специфичность пептидазы определяется остатками, выстилающими эту бороздку [36]. Ферменты, используемые в протеолитических процессах, традиционно имеют растительное или животное происхождение, но существует древняя традиция использования микробных протеаз для приготовления различных пищевых веществ. В результате ферментационная 31 промышленность разработала недорогие технологии производства протеолитических ферментов высокой чистоты из микробных источников. Микробные протеазы до некоторой степени вытеснили традиционные протеазы животного и растительного происхождения и, кроме того, нашли новые применения благодаря своим особым свойствам. Известно, что грибы продуцируют три различных типа протеиназ: кислотные, нейтральные и щелочные. Микробные протеазы нашли широкое применение в пивоваренной, молочной, текстильной и кожевенной промышленности. В частности, протеазы грибов нашли применение в пищевой промышленности; это особенно верно для кислотных протеаз, которые, среди прочего, могут замещать активности, связанные с папаином, ренином и пепсином. Среди грибов виды Aspergillus и Mucor являются важным источником протеаз в промышленности. Виды A. flavus, A. oryzae, A. niger, M pusillus, M miehei (теперь переименованные в Rhizomucor pusillus и Rhizomucor michei) и Rhizopus используются в приготовлении восточных продуктов, таких как темпе и кодзи, а также в сыроварении в качестве заменителя для натурального сычужного фермента [39]. Протеолитические ферменты относятся к классу ферментов гидролаз (EC 3) и сгруппированы в подкласс пептидных гидролаз или пептидаз (EC 3.4). В зависимости от участка действия фермента протеазы также можно подразделить на экзопептидазы или эндопептидазы. Экзопептидазы катализируют гидролиз пептидных связей около N- или C-концевых концов субстрата. Аминопептидазы (рисунок 4) могут высвобождать отдельные аминокислоты (EC 3.4.11), дипептиды (дипептидилпептидазы, EC 3.4.14) или трипептиды (трипептидилпептидазы EC 3.4.14) с N-концевого конца своих субстратов. Отдельные аминокислоты могут высвобождаться из дипептидных субстратов дипептидазами (EC 3.4.13) или из полипептидов карбоксипептидазами дипептидазы (EC (EC 3.4.15) 3.4.16-3.4.18), в высвобождают 32 то время дипептиды как пептидил из С-конец полипептидной цепи. Эндопептидазы расщепляют пептидные связи внутри и на расстоянии от концов полипептидной цепи [33]. Рисунок 4 – Действие аминопептидаз и карбоксипептидаз на удаление концевых аминокислотных остатков, а также эндопептидаз на полипептидный субстрат (имеющий n остатков) [33] Основываясь на каталитическом механизме и наличии аминокислотных остатков в активном центре, протеазы можно сгруппировать как аспарагиновые протеазы, цистеиновые протеазы, глутаминовые протеазы, металлопротеазы, аспарагиновые протеазы, сериновые протеазы, треониновые протеазы и протеазы со смешанным или неизвестным каталитическим механизмом [30]. Действие протеолитических ферментов играет важную роль в нескольких физиологических процессах, например, в переваривании пищевых белков, делении клеток, каскаде свертывания крови, передаче сигнала, переработке полипептидных гормонов, апоптозе и жизненном цикле нескольких болезнетворных микроорганизмов. Благодаря своей ключевой 33 роли в жизненном цикле многих хозяев и патогенов они имеют большое медицинское, фармацевтическое и академическое значение [30,25]. Ранее было подсчитано, что около 2 % генов человека кодируют протеолитические ферменты [25] и из-за их необходимости во многих биологических процессах протеазы стали важными терапевтическими мишенями. Протеазы – это широко применяемые ферменты в нескольких секторах промышленности и биотехнологии, кроме того, их использование требует многочисленных исследовательских приложений, включая получение фрагментов Кленова, синтез пептидов, расщепление нежелательных белков во время очистки нуклеиновых кислот, использование протеаз в экспериментах с культурами клеток [26]. Протеолитические ферменты играют значительную роль в различных физиологических процессах. Ключевая роль протеиназ проявляется не только в процессах деградации запасных белков, удалении «неправильных» белков, образующихся в результате мутаций и ошибок биосинтеза, но и участии в посттрансляционном процессинге белков, активации неактивных предшественников физиологически активных белков и пептидов, что свидетельствует о том, что протеиназы во многих случаях являются «пусковыми механизмами» ряда каскадных процессов и выполняют различные регуляторные функции. В настоящее время установлено, что протеолитические ферменты участвуют в процессах секреции, транспорта белковых веществ через биологические мембраны, адаптации клеточного метаболизма к изменениям внешней среды, в осуществлении защитных функций. Наряду с причинами физиологического характера интерес к протеолитическим ферментам обусловлен еще и тем, что они являются удобным объектом для изучения структуры белков, активных центров ферментов, механизмов регуляции ферментативной активности, других важных вопросов энзимологии и белковой химии. С практической точки 34 зрения интерес к протеолитическим ферментам связан с их непосредственным участием в процессах, протекающих при хранении и переработки растительного сырья, а также применением препаратов протеаз в различных отраслях: сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине [6]. Во многих процессах, проходящих в организме, протеолитические ферменты играют свертывании важную крови, роль, биосинтезе например, белка, при оплодотворении, фибринолизе, гормональной регуляции, иммунном ответе (активации системы комплимента). В этих случаях фермент расщепляет в субстрате одну или несколько связей (ограниченный протеолиз). Действием природных ингибиторов ферментов и путем активации неактивных предшественников на посттрансляционной регулируется активность протеолитических ферментов. Многие тяжелые заболевания (мышечная дистрофия, аутоиммунные заболевания, эмфизема легких) возникают в результате нарушения регуляции активности протеолитических ферментов. Фермент гиалуронидазу, катализирующий расщепление гиалуроновой кислоты, используют для рассасывания рубцов после ожогов и операций. Аспарагиназа нашла применение для лечения лейкозов. Ферменты на твердом носителе применяют в анализе – ферментные электроды, тест-полоски и т.д. При нарушении пищеварения применяются ферментные препараты [19]. Применение ферментов в медицине разнообразно. Протеолитические ферменты (трипсин, фибринолизин) применяют для обработки гнойных ран с целью расщепления погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалениях дыхательных путей, при тромбозах [14]. Особенно перспективно их использование для лечения ран. 35 1.4 Участие протеолитических ферментов в лечении сочащихся ран Основной задачей лечения больных после вскрытия гнойников является быстрейшее очищение раны от некротизированных тканей и гнойно-фибринозного экссудата, что способствует раннему появлению грануляций. С этой целью относительно широко применяются протеолитические ферменты [9]. Протеолитические ферменты использовались для облегчения восстановления тканей с древних времен. Трипсин:химотрипсин – это пероральный протеолитический ферментный препарат, который используется в клинической практике с 1960-х годов. Он обеспечивает лучшее разрешение воспалительных симптомов и способствует более быстрому восстановлению острой травмы тканей, чем некоторые другие существующие ферментные препараты [38]. Наибольшее распространение получили ферменты пищеварительного тракта животных (трипсин, химотрипсин, химопсин); ферменты, деполяризующие ДНК и РНК (дезоксирибонуклеаза и рибонуклеаза), а также бактериальные ферменты с аналогичным действием (стрептокиназа, террилитин). Ферменты («биологический скальпель») способны быстро и безболезненно удалять из раны некротические массы. Их чаще применяют в виде порошка, наносимого на поверхность раны по 10–20 мг или в виде 2 % раствора, который заливают в рану или смачивают тампоны [9]. Известно о существовании гелевой повязки «Debrase», содержащей смесь протеолитических ферментов, извлеченных из ананаса. Этот продукт получил статус охранного препарата в Европе. Вибрилаза (рекомбинантный вибриолизин), протеолитический фермент морского микроорганизма Vibrio 36 proteolyticus, продемонстрировал эффективность против денатурированных белков, таких как те, которые обнаруживаются в обгоревшей коже [40]. Папаин – протеолитический фермент. Протеолитические и противовоспалительные свойства папаина позволили применять его в хирургии для санации различных свищей, очищения от некротических тканей ран и подготовки поверхностей трофических язв к кожной пластике у больных [18]. Трипсин – эндогенный протеолитический фермент класса гидролаз, синтезируемый экзокринными клетками поджелудочной железы млекопитающих в виде неактивного предшественника — профермента трипсиногена, который в двенадцатиперстной кишке под действием энтеропептидазы, самого трипсина и ионов кровяное русло Са2+ превращается в трипсин [20]. При попадании в и при недостаточности соответствующих ингибиторов трипсин может активизировать фактор свертывания крови XII (фактор Хагемана), плазминоген, прекалликреин и «запускать» таким образом каскад реакций свертывающей, фибринолитической и калликреин-кининовой систем. В настоящее время выпускаются коммерческие препараты трипсина, предназначенные для медицинского и ветеринарного применения, а также для использования в качестве реагента при производстве вакцин, лекарственных средств передовой терапии и генно-инженерных препаратов. В медицинской практике применяют трипсин кристаллический (для местного и парентерального применения) и трипсин аморфный (только для местного применения), который, выступая в роли биоантисептика, оказывает выраженное противовоспалительное, противоотечное (при внутривенном и внутримышечном введении), регенерирующее и избирательное некротическое действие при воспалительных заболеваниях дыхательных путей, при пародонтоза, тромбофлебите, при лечении воспалительнодистрофических ожогов. 37 Трипсин обладает формах свойствами расщепления фибринозных образований, омертвевших участков тканей, вязких экссудатов и секретов. Для лечения гнойных ран может быть использован трипсин кристаллический, иммобилизованный на диальдегидцеллюлозе или на активированном трикотажном полиамидном полотне [20]. Трипсин:химотрипсин – это широко используемая комбинация пероральных протеолитических ферментов для ускорения восстановления травматических, хирургических и ортопедических травм. Он обладает высокой биодоступностью, не теряя своей биологической активности в качестве противовоспалительного, противоотечного, фибринолитического, антиоксидантного и противоинфекционного помогают устранить признаки средства. Эти свойства и симптомы воспаления, вызванного повреждением тканей, и облегчают процесс восстановления. Они также оказывают обезболивающие эффекты и уменьшает боль, связанную с заживлением [38]. На отечественном рынке представлена целая линейка продукции, в которую входят раневые покрытия с трипсином и лизоцимом (ПАМ-ТЛ), только с трипсином (ПАМ-Т) и (Протеокс-Т), с трипсином и мексидолом (Протеокс-ТМ), с лизоамидазой (Лизоамид) и протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба (Мультиферм) [3]. Практическая ценность указанных медицинских изделий выражается в высоком клиническом эффекте; пролонгированном действии (до 72 часов); уменьшении числа перевязок, что исключает травмирование грануляционной ткани, отсутствии побочных действий; избирательном действии только на патологический очаг; атравматичности, благодаря низкой адгезии; существенном уменьшении количества наносимых действующих веществ [3]. Большой интерес представляет применение протеолитического комплекса из hepatopancreas краба и его иммобилизация на нерастворимый носитель с целью получения медицинского изделия пролонгированного действия [4]. 38 Коллективом ученых под руководством проф. В.Н Филатова, разработано новое лечебное покрытие «Мультиферм» для лечения ран различной этиологии, трофических язв и пролежней. «Мультиферм» представляет собой многослойное раневое покрытие, состоящее из лечебного и впитывающего слоев. Лечебный слой – это модифицированная целлюлоза, обработанная хитозаном, протеолитический к комплекс которой из ковалентно гепатопанкреаса присоединен краба [13]. Многокомпонентный ферментный комплекс обеспечивает широкий спектр терапевтического действия. Хитозан (Хт) в комбинации с ферментами обладает выраженным ранозаживляющим действием. Протеолитическая активность комплекса способствует очищению раневой поверхности от некротизированных действие, тканей, оптимизирует эластолитическое процессы и регенерации коллагенолитическое и препятствует формированию рубца. Впитывающий слой сорбирует раневое отделяемое и таким образом способствует понижению уровня микробной обсемененности в зоне раны [4]. 39 2. Материалы и методы исследования 2.1 Методы определения протеолитической активности 2.1.1 Методика определения подлинности фермента по створаживающему действию на растворы молока Метод основан на способности фермента створаживать молоко. Определение створаживающей активности проводили в водяном термостате с прозрачными стенками из стекла или плексигласа. Основное оборудование: Термостат с прозрачными стенками ТПС. Створаживающая активность выражается временем, прошедшим с момента добавления испытуемого раствора до появления первых признаков створаживания молока. Требуемое значение показателя качества: Время створаживания протеолитического фермента для ГЛФ должно быть не более 50 сек [4]. 2.1.2 Методика определения протеолитической активности в ГЛФ Метод основан на определении количества тирозина, освобождаемого ферментом из казеина. За единицу протеолитической активности (ПЕ) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при температуре 37 ºС катализирует переход в неосаждаемое 10% трихлоруксусной кислотой состояние такое количество казеина, которое соответствует 1 мкМоль тирозина [4]. Активность грибных и бактериальных протеиназ определяют при значениях рН в следующих диапазонах: 2,5±0,2 и 5,5±0,2 – кислые протеиназы; 7,2±0,2 – нейтральные протеиназы; 9,5±0,2 – щелочные протеиназы [7]. 40 0,100-1,000 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности), тщательно растирают в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством буферного раствора с соответствующим рН реакционной смеси. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см , доводят этим же буферным раствором объем жидкости до метки и перемешивают. Из этого раствора готовят не менее двух разведений в зависимости от предполагаемой активности, используя этот же буферный раствор. Приготовление раствора с массовой долей казеината натрия 2% (субстрат) 2,000 г воздушно-сухого казеината натрия растворяют в 90 см буферного раствора, затем раствор доводят до нужного рН добавлением раствора соляной кислоты концентрации 1 моль/дм3 или добавлением нескольких капель раствора гидроокиси натрия концентрации 1 моль/дм3. Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем до метки буферным раствором. При подкислении раствора казеината натрия соляной кислотой первоначально (при значении рН в диапазоне 5,1-3,0) наблюдается образование мелких хлопьев, которые исчезают при дальнейшем добавлении соляной кислоты до рН 2,5 [7]. Берут три пробирки (одна контрольная, две опытные). В опытные пробирки наливают по 2 мл субстрата и помещают их в ультратермостат при температуре 30 °С. Примерно через 10 мин в каждую пробирку приливают по 2 мл раствора фермента (предварительно термостатированного при 30 °С 3-4 мин), пробирки встряхивают и оставляют на гидролиз ровно на 10 мин при температуре 30 °С. Через 10 мин добавляют в обе пробирки по 4 мл раствора ТХУ, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Быстро перемешивают смесь и 41 для обеспечения полного осаждения выдерживают пробирки со смесью при температуре 30 °С еще в течение 20 мин. Затем смесь фильтруют в сухие пробирки. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. Отбирают в пробирки с предварительно налитыми туда 5 мл раствора углекислого натрия концентрации 0,5 моль/дм3 по 1 мл фильтрата, перемешивают и быстро приливают по 1 мл рабочего раствора реактива Фолина. Дают реакционной смеси постоять 20 мин. После реакции растворы приобретают голубую окраску, интенсивность которой определяют фотоэлектрическим колориметром против контроля. Контрольный опыт готовят, прибавляя реактивы в обратной последовательности: для этого в контрольную пробирку наливают 2 мл ферментного раствора того же разведения, как и в опыте, добавляют 4 мл ТХУ, выдерживают в ультратермостате при температуре 30 °С в течение 10 мин, а затем вносят 2 мл субстрата. Через 20 мин нахождения в термостате раствор фильтруют, отбирают в сухую пробирку с предварительно налитыми туда 5 мл раствора углекислого натрия концентрации 0,5 моль/дм3, 1 мл фильтрата, перемешивают, добавляют 1 мл рабочего раствора реактива Фолина. Колориметрирование проводят фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Значения оптической плотности должны лежать в диапазоне 0,07-0,45 для кислых протеиназ и 0,2-0,6 для нейтральных и щелочных протеиназ. При отклонении оптической плотности от указанной необходимо подобрать такое разведение препарата, чтобы оптическая плотность укладывалась в данные пределы. Для вычисления протеолитической активности строят градуировочную характеристику по тирозину и по ней вычисляют тирозиновый эквивалент, то есть ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 мл 42 стандартного раствора. Этот эквивалент необходимо установить для каждой новой партии реактива Фолина и каждого фотоэлектрического колориметра. Для построения градуировочной тирозина концентрации 10 характеристики готовят раствор моль/дм3. Для этого 181,2 мг чистого тирозина растворяют в растворе соляной кислоты концентрации 0,2 моль/дм3 в мерной колбе вместимостью 1 дм3. Из этого исходного раствора тирозина готовят дальнейшие разведения [7]. Протеолитическую активность Х вычисляют по формуле (1): где А1- оптическая плотность испытуемого раствора при 280 нм; А2 – оптическая плотность контрольного раствора при 280 нм; V1 – объем испытуемого раствора, мл; V – объем реакционной смеси в пробирке, мл; V0 – объем аналитической пробы испытуемого раствора, мл; a – навеска геля, в мг; Кт – тирозиновый коэффициент – 1,20; t – время реакции, мин; Требуемое значение показателя качества. Протеолитическая активность в ГЛФ должна быть не меньше (2,0±0,5) ПЕ/г геля [4]. 2.2 Методы контроля эффективности ранозаживляющих препаратов с ферментами Методика исследования ранозаживляющей активности проводится на крысах. Гистологическое изучение образцов кожи осуществлялось непосредственно после эвтаназии животного, вырезался лоскут кожи 1 см на 43 2 см (с захватом пораженного и здорового участка), который помещался в фиксирующую жидкость (10% нейтральный забуференный формалин) на 72 часа. После промывки под проточной водой в течение 24 часов, проводится обезвоживание образца в изопропиловом спирте с последующим пропитыванием обезвоженного образца парафином с последующей заливкой в парафин с 6% воском. С парафиновых блоков делались срезы толщиной 610 мкм, окрашивались гематоксилином и эозином для выявления типовых гистологических характеристик патологических изменений структур кожи с помощью световой микроскопии [10]. 44 различных ЗАКЛЮЧЕНИЕ Одно из направлений современной фармации – концепция «многофункциональных лекарств». Лекарственным средствам, действующим на одну, строго определённую мишень, противопоставлена широта фармакологического действия и способность нескольких действующих веществ взаимодействовать одновременно с разными мишенями. Для монопрепаратов для лечения ран характерно однонаправленное действие (например, только антимикробное или противовоспалительное, или дегидратирующее и т.д.). Преимуществом комбинированных препаратов является возможность одновременного воздействия на разные звенья раневого процесса. Поскольку в настоящее время показано, что процесс репарации раны является ферментативным с необходимым присутствием влажной среды, актуальна разработка неадгезивных полимерных гелевых покрытий с иммобилизованными протеолитическими ферментами. Последние способны размягчать и антимикробной лизировать некротические активностью и образования, охлаждающим действием, обладают хорошо моделируются и не травмируют рану, позволяют визуально контролировать ее состояние. Представляет интерес использование протеолитических ферментов химотрипсина и трипсина, которые повышают эффективность терапии за счет усиления лечебного действия благодаря более быстрому и полному гидролизу пептидных связей [42]. 45 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 Андреев Д. Ю. Современные раневые покрытия / Д. Ю. Андреев, Б. А. Парамонов, А. М. Мухтарова // Вестник хирургии им. И. И. Грекова. – 2009. – № 3. – С. 98-102. 2 Антюшко Т. Д. Лечение ран. Паллиативный уход за ранами / Т. Д. Антюшко // Медицинские технологии «ПАУЛЬ ХАРТМАНН». – 2021. – №1, Т. 31. – С. 1-36. 3 Белов А.А. Новые текстильные перевязочные материалы на основе биодеградируемых полимеров, содержащих протеиназы, для лечения ран и ожогов / А.А. Белов, А.А. Ванюшенкова, Э.Э. Досадина, А.А. Ханафина // Раны и раневые инфекции. Журнал им. проф. Б. М. Костючёнка. – 2018. – T.5, №1. – C.16–26. 4 Бркич Л. Л. Разработка состава и технологии получения комбинированного лекарственного препарата на основе хитозансодержащих фармацевтических субстанций 14.04.01 – Технология получения лекарств : диссератация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук / Л. Л. Бркич ; Москва, 2019. – 190 с. 5 Будневский С.В. Новые раневые покрытия, содержащие серотонин и трипсин, в лечении экспериментальных гнойных ран: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. / С.В. Будневский; Москва, 2004. 6 Витол И. С. Протеолитические ферменты и их белковые ингибиторы из зерна тритикале / И. С. Витол, Е. П. Мелешкина // ХИПС. – 2018. – № 3. – С. 36-45. – Текст : непосредственный. 7 ГОСТ 20264.2-88 ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ. Методы определения протеолитической активности. Дата введения 1989-01-01. – 15 c. 8 Завражнов А. А. Раны и раневой процесс : Учебно-методическое пособие для интернов, ординаторов и практических врачей / А. А. Завражнов, М. Ю. Гвоздев, В. А. Крутова, А. А. Ордокова. – Краснодар : Изд-во 46 Кубанского государственного медицинского университета, 2016. – 29 с. – Текст : непосредственный. 9 Казарян Н. С. Роль и способ применения протеолитических ферментов в процессе лечения гнойных ран / Н. С. Казарян, К. К. Козлов, А. Ю. Быков // Омский научный вестник. – 2013. – № 2. – С. 20-21. – Текст : непосредственный. 10 Компанцев Д. В. Ранозаживляющее средство на основе мальтодекстрина / Д. В. Компанцев, Г.В. Саградян, М.В. Ароян, Т.М. Никулина // Научные ведомости. – 2017. – №5. – С.113–122. 11 Кузин М.И. Местное медикаментозное лечение гнойных ран. Методические рекомендации / М.И. Кузин, Б.М. Костюченок, Б.М. Доценко [и др.]. Москва, 1985. – 6 с. – Текст : непосредственный. 12 Луцевич О.Э. Современный взгляд на патофизиологию и лечение гнойных ран / О.Э. Луцевич, П.И. Толстых, О.Б. Тамразова, [и др.] // Хирургия. – 2011. – № 5. – С. 72-77. – Текст : непосредственный. 13 Медушева Е.О. Производные диальдегидцеллюлозы, модифицированные биологически активными веществами / Е.О. Медушева, В.Н. Филатов, В.В. Рыльцев [и др.] // Фармация. – 2016. – №1. – С.52–56. 14 Минаев С. В. Роль протеолитических энзимов в разрешении раневого процесса и профилактике послеоперационных осложнений / С. В. Минаев, Ю. И. Стернин // Медицинский совет. – 2013. – № 5. – С. 66-68. – Текст : непосредственный. 15 Морозов А. М. Современные методы стимуляции процесса регенерации послеоперационных ран / А. М. Морозов, А. Н. Сергеев, Н. А. Сергеев, [и др.] // Современные методы стимуляции процесса регенерации послеоперационных ран. – 2020. – № 3. – С. 54-60. – Текст : непосредственный. 16 Парамонова О. А. Эффективность применения современных раневых покрытий в комплексном лечении больных флегмонами лица и шеи: специальность 14.01.17 – хирургия : диссератация на соискание ученой 47 степени кандидата медицинских наук / Олеся Андреевна Парамонова ; Краснодар, 2020. – 141 с. Патент РФ на изобретение №2522214/ 10.07.2014. Олифирова 17 О.С., Целуйко С.С., Брегадзе А.А., [и др.]. Способ стимуляции заживления ран различного генеза природным антиоксидантом дигидрокверцетином. Пенджиев А. М. Применение протеолитических энзимов дынного 18 дерева в медицинской практике / А. М. Пенджиев // Химико- фармацевтический журнал. – 2002. – № 6. – С. 32-34. – Текст : непосредственный. 19 Столярова Е. А. Использование ферментных препаратов в медицине / Е. А. Столярова, Д. Р. Байгузина // Бюллетень медицинских конференций. – 2017. – № 6. – С. 1273. – Текст : непосредственный. 20 Суханова С. М. Трипсин. Свойства и применение в производстве биологических лекарственных препаратов / С. М. Суханов, Е. М. Петручук, А. А. Генералов // Биопрепараты. – 2018. – № 2. – С. 106-113. – Текст : непосредственный. 21 Третьяков А.А. Комплексное лечение трофических язв нижних конечностей и длительно незаживающих ран / А.А. Третьяков, А.Н. Неверов, С.В. Петров, И.З. Гатиатуллин // Оренбургский медицинский вестник. – 2016. – № 4. – С. 62-68. – Текст : непосредственный. 22 Чеснокова Н. П. Инфекционный процесс: монография / Н. П. Чеснокова, А. В. Михайлов, Е. В. Понукалина [и др]. – М.: Издательство Академия Естествознания, 2006. – 434 с. – Текст : непосредственный. 23 Шабловская Т. А. Низкочастотная ультразвуковая кавитация в комплексном лечении гнойно-некротических заболеваний мягких тканей в амбулаторной практике: специальность 14.01.17 – хирургия : диссератация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Олеся Андреевна Парамонова ; Краснодар, 2015. – 180 с. 48 24 Bikowski J. Secondarily infected wounds and dermatoses: a diagnosis and treatment guide / J. Bikowski // The Journal of Emergency Medicine. – 1999. – Vol. 17, I.1. – P. 197-206. 25 Craik C. S. Proteases as therapeutics / C. S. Craik, M. J. Page, E. L. Madison // Biochem. J. – 2011. – Vol. 435. – P. 1-16. 26 da Silva R. R. Bacterial and Fungal Proteolytic Enzymes: Production, Catalysis and Potential Applications / R. R. da Silva // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2017. – Vol. 183. – P. 1-19. 27 Eslahi H. General biography, structure and classification of enzymes / H. Eslahi, M. Ghaffari-Moghaddam, M. Khajeh [et al.] // Research and Reviews in Materials Science and Chemistry. – 2014. – Vol. 3. – I. 1. – P. 1-83. 28 Hussey M. Principles of Wound Closure / M. Hussey, M. Bagg // Operative Techniques in Sports Medicine. – 2011. – Vol. 19, I.4. – P. 206-211. 29 Kirwan H. The Skin and Wound Healing / H. Kirwan, R. Pignataro // Pathology and Intervention in Musculoskeletal Rehabilitation. – 2016. – Vol. 6. – P. 25-62. 30 Li Q. Commercial proteases: Present and future / Q. Li, L. Yi, P. Marek [et al.] // FEBS Lett. – 2013. – Vol. 587. – P. 1155-1163. 31 Li Y. Regulating wound moisture for accelerated healing: A strategy for the continuous drainage of wound exudates by mimicking plant transpiration / Y. Li, Zhang Y., Wang Y., [et al.] // Chemical Engineering Journal. – 2021. – Vol. 429. – P. 1-13. 32 Litwiniuk M. Hyaluronic acid in infl ammation and tissue regeneration / M. Litwiniuk, A. Krejner, M. S. Speyrer, [et al.] // Wounds. – 2016. – Vol. 28, I. 3. – P. 78-88. 33 Mótyán J. Research Applications of Proteolytic Enzymes in Molecular Biology / J. Mótyán, F. Tóth, J. Tőzsér // Biomolecules. – 2013. – Vol. 3. – P. 923-942. 34 Park T. H. Development and characterization of a superabsorbing hydrogel film containing Ulmus davidiana var. Japonica root bark and pullulan for 49 skin wound healing / T. H. Park, S. Lee, R. Amatya, [et al.] // Saudi Pharmaceutical Journal. – 2020. – Vol. 28, I. 7. – P. 791-802. 35 Rawlings N. D. The database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors / N. D. Rawlings, A. J. Barrett, A. Bateman // Nucleic Acids Res. – 2012. – Vol. 40. – P. 343-350. 36 Rawlings N. D. Twenty-five years of nomenclature and classification of proteolytic enzymes / N. D. Rawlings // Biochimica et Biophysica Acta. – 2019. – Vol. 151. – P. 1-34. 37 Robinson P. K. Enzymes: principles and biotechnological applications / P. K. Robinson // Essays In Biochemistry. – 2015. – Vol. 59. – P. 1-41. 38 Shah D. The Role of Trypsin:Chymotrypsin in Tissue Repair / D. Shah, K. Mital // Advances in Therapy. – 2018. – Vol. 35. – P. 31-42. 39 Souza P. M. A biotechnology perspective of fungal proteases / P. M. Souza, M. L. Bittencourt, C. C. Caprara [et al.] // Brazilian Journal of Microbiology. – 2015. – Vol. 46. – P. 337-346. 40 Vellard M. The enzyme as drug: application of enzymes as pharmaceuticals / M. Vellard // Current Opinion in Biotechnology. – 2003. – Vol. 14. – P. 444-450. 41 Vyas K.S. Wound healing: biologics, skin substitutes, biomembranes and scaffolds / K.S. Vyas, H.C. Vasconez // Healthcare (Basel). – 2014. – Vol. 2, I.3. – P. 356-400. 42 Wang Y. Advances in the Research of Influence of pH Value on Healing of Chronic Wounds / Y. Wang, X. Li, W. Zhao, [et al.] // Chinese Journal of Burns. – 2019. – Vol. 35, I. 6. – P. 474-476. 43 Xue J. Bioinspired multifunctional biomaterials with hierarchical microstructure for wound dressing / J. Xue, X. Wang, E. Wang, [et al.] // Acta. Biomater. – 2019. – Vol. 100. – P. 270-279. 50
