Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com Визуализация Учебное пособие Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com Учебное пособие по BioTek Imaging www.biotek.com 1321031 Ред. I Июль 2020 г. Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com СОДЕРЖАНИЕ 1 4 5 Учебное руководство BioTek Imaging Введение 1 - Перед тем, как начать 1.1 - Диспетчер задач Gen5 1.2 - Ручной режим против экспериментального режима 1.3 - Сохранение файлов Gen5 и определение библиотеки изображений 1.4 - Типы пластин 1.5 - Мощные цели 6 8 9 11 16 20 2 - Краткое руководство по визуализации 2.3 - Обработка и анализ изображений 22 27 29 2.4 - Переход в экспериментальный режим 31 год 2.5 - Дополнительные возможности получения 35 год 2.6 - Лучшие практики 38 2.1 - Получение изображения 2.2 - Просмотр и редактирование изображений 42 3 - Расширенное руководство по приобретению 3.1 - Оптимизация настроек экспозиции 43 год 3.3 - Монтаж изображения 46 48 3.4 - Z-укладка 57 год 3.2 - Высококонтрастное светлое поле (HCBF) 62 73 76 3.5 - Захват кинетических изображений 3.6 - Цели большой мощности и масла 3.7 - Описание планшета и лабораторная посуда 84 4 - Экспериментальный режим визуализации 4.1 - Создание эксперимента по визуализации 4.2 - Разница между экспериментом и протоколом 4.3 - Области интереса и маяки 4.3.1 - Эксперимент по идентификации рентабельности инвестиций 4.3.2 - Добавление маяков для отметки областей интереса 4.3.3 - Менеджер ROI для пакетной обработки 85 89 90 91 97 99 102 5 - Что такое автофокус 103 110 5.1 - Методы автофокуса 5.2 - Лазерный автофокус 114 6 - Обработка изображений 117 118 119 122 6.1 - Инструменты аннотации 6.2 - Предварительная обработка изображения 6.3 - Цифровой фазовый контраст 6.4 - Деконволюция 124 7 - Базовый анализ изображения 128 130 133 134 7.1 - Основная маска и подсчет 7.2 - Расчетные показатели 7.3 - Анализ субпопуляции 7.4 - Детали клеточного анализа 2 141 7.5 - Определение плагина изображения 8 - Расширенный анализ 8.1 - Анализ высокого содержания с Image Prime 8.2 - Вторичная маска 8.3 - Создание точечной диаграммы или гистограммы 8.4 - Точечный подсчет 8.5 - Создание метрики настраиваемого объекта 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение 9.1 - Расположение пластин 9.2 - Отчетность и экспорт 9.3 - Сохранение изображений 142 145 147 152 156 161 168 169 171 175 180 10 - Настройка и оборудование 181 186 194 196 200 10.1 - Инструменты и аксессуары 10.2 - Кубики светодиодных фильтров и объективы 10.3 - Лабораторное оборудование Контактная информация 3 Вступление Ваш новый BioTek® Система визуализации инструментов Добро пожаловать в BioTek Imaging and Microscopy! Это руководство поможет вам понять, как использовать прибор (имидж-сканер) и программное обеспечение в соответствии с вашими потребностями и методами анализа. Пожалуйста, просмотритеПрежде чем вы начнете раздел и Краткое руководство пользователя перед использованием прибора. Мы с нетерпением ждем возможности помочь вам добиться больших успехов с помощью наших тепловизоров и программного обеспечения Gen5 и надеемся, что это руководство станет постоянным ресурсом для нынешних и будущих участников лаборатории. В этом руководстве представлены краткие справочные разделы (в начале руководства), а также подробные описания и иллюстрации прибора и программного обеспечения для тех, кто хочет понимать основные моменты процесса. 4 1 - Перед тем, как начать Пять важных шагов для новых пользователей В этом разделе описаны шаги быстрой настройки и представлена навигация Gen5 для начинающих пользователей. Вы должны выполнить эти шаги, чтобы иметь возможность делать четкие, качественные изображения и знать, где они были сохранены.. Эти шаги являются строительными блоками для использования вашего тепловизора и Gen5. Вы можете найти подробную пошаговую поддержку позже в руководстве. Примечание: Для использования всех функций, описанных в этом документе, требуется Gen5 версии 3.10 или выше. Перед первым использованием тепловизора вам следует: 1. Общие сведения о диспетчере задач Gen5 2. Знайте разницу между ручным режимом и экспериментальным режимом. 3. Определите, где и как сохранять файлы и изображения. 4. Узнайте, как создавать и редактировать определение пластины (актуально для ВСЕХ судов). 5. Если возможно, сделайте настройки для получения оптимального изображения с большим увеличением (20X и выше). Предпосылки: л Тепловизор должен быть установлен, подключен к контроллеру (главному компьютеру), настроен и включенный. л Образцы должны быть правильно подготовлены для визуализации. Выполнение этих первых быстрых шагов имеет решающее значение как для немедленного, так и для долгосрочного успеха. с тепловизором! 1.1 - Диспетчер задач Gen5 1.2 - Ручной режим против экспериментального режима 1.3 - Сохранение файлов Gen5 и определение библиотеки изображений 1.4 - Типы пластин 1.5 - Мощные цели 5 6 8 9 11 16 1 - Перед тем, как начать 1.1 - Диспетчер задач Gen5 Запустите Gen5. После того, как заставка исчезнет, Параметры запуска представлены. Выбирать Стандарт и установите флажок, чтобы пропустить это диалоговое окно в будущем. Отобразится диспетчер задач. При выборе пункта меню диспетчера задач отображаются соответствующие элементы управления для этой задачи. Прочитай сейчас: Немедленно запустите эксперимент Ручной режим тепловизора: Используйте тепловизор как ручной микроскоп, делая по одному снимку за раз Эксперименты: Для автоматического сбора и анализа: запустите существующий эксперимент или создайте новый Протоколы: Экспериментальный план без данных Инструментальный контроль: Для независимого управления имидж-сканером, включая инкубацию, открытие / закрытие держателя, заливку и дозирование, заправку газа и т. Д. Настраивать: Настроить прибор; определение предпочтений, безопасности, контроля качества прибора (Gen5 QC) и системного меню Помощь: Доступ к разделам справки Gen5, часто задаваемым вопросам, образцам файлов и контактной информации нашего центра технической поддержки (TAC) 6 1 - Перед тем, как начать 7 1 - Перед тем, как начать 1.2 - Ручной режим против экспериментального режима Все инструменты визуализации BioTek можно использовать двумя способами: автоматическим и ручным. В первую очередь они предназначены для использования в качестве автоматических микроскопов (экспериментальный режим), но вы также можете использовать их как настольный микроскоп, делая отдельные изображения по одному (ручной режим). Вы также можете оптимизировать настройки анализа в ручном режиме, а затем преобразовать эти настройки в эксперимент для автоматизации анализов. Вот основные различия и сходства обоих: Ручной режим Изображение Захватывать Анализ Комментарии Экспериментальный режим Комментарии Одно изображение Низкая громкость Многолуночный захват нескольких Скрининг, высокий захватывать; Захватывать образцы; Некоторые изображений; Полная автоматизация плиты плотности, срез ткани и камера получения изображений; Поиск и высокий визуализация ОИ, включая пропускная способность хорошо работают слайды; сканирование слайдов с помощью изображение Z-стек, кинетический Нефтяные цели BioStack получение Подсчет клеток и Нет соотношений, Подсчет клеток и другие показатели Соотношения, индивидуальные другие сотовые настраиваемые формулы клеточного анализа; Субпопуляции формулы и метрики анализа; Субпопуляции или из каждого изображения / лунки / трансформация трансформация полного планшета / полного сосуда шаги применены с каждого изображения шаги несколько изображений один за раз, включая монтаж, в полной мере тарелка / сосуд Поместите ярлык ручного режима тепловизора на рабочий стол Чтобы сразу перейти в режим настольного микроскопа: В сеансе ручного режима разверните Контроль панель и щелкните Создать ярлык на рабочем столе. Вы можете использовать этот ярлык для мгновенного запуска сеанса в ручном режиме. 8 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 1 - Перед тем, как начать 1.3 - Сохранение файлов Gen5 и определение библиотеки изображений Примечание: Размер каждого файла изображения составляет не менее 2 МБ (и 7,57 МБ при использовании камеры с широким полем обзора (WFOV)). Монтаж 4x4 на лунку 96-луночного планшета потребует3327 МБ дискового пространства. Настоятельно рекомендуется использовать внешний жесткий диск или другое дополнительное хранилище для изображений. Во время установки тепловизора и программного обеспечения Gen5 вполне вероятно, что настройки по умолчанию были сохранены. Чтобы проверить или изменить эти параметры, закройте диспетчер задач и выберитеСистема> Настройки из меню Gen5. Изменения глобальные и изменит место хранения будущих экспериментов, протоколов и файлов изображений. Выбирать: Система> Настройки 9 1 - Перед тем, как начать Параметры сохранения изображения Файлы изображений Raw имеют большие размеры по сравнению с другими файлами данных Gen5, поэтому они обрабатываются по-другому. Изображения хранятся в файловой системе Windows в указанном пользователем месте. НажмитеПросматривать для перенаправления файлов изображений. См. Также 9.3 - Сохранение изображений на стр. 175.. 10 1 - Перед тем, как начать 1.4 - Типы пластин Определение планшета - это больше, чем просто карта ваших лунок. Это обеспечиваеткритическая информация чтобы тепловизор мог найти фокус и защитить ваши объекты и образцы. Чтобы получить доступ к библиотеке типов планшетов, закройте диспетчер задач и: л В Gen5 выберите Система> Типы пластин а также Копировать тип тарелки, который больше всего похож на ваш судно. л Тебе нужно: Пластина / сосуд с правильно подготовленными образцами. Важный: Как минимум, вы должны установить высоту дна и толщину дна для достижения наилучших результатов! л В ручном режиме тепловизора вы можете обновить запись типа планшета. Нижняя отметка: развернуть Фокус панель для кнопки. Но имейте в виду, что это глобальное изменение текущего выбранного типа пластины, и ваши изменения повлияют на всех других пользователей, которые используют этот тип пластины. Более безопасный способ создать свою собственную «копию» типа пластины и внести изменения в эту запись типа пластины. 11 1 - Перед тем, как начать Высота дна: Чтобы определить отметку дна: 1. Поместите планшет для образцов на держатель. 2. Щелкните 3. Сосредоточьтесь на образце; проверьте центр и углы пластины. Когда изображение в порядке, нажмите Примечание: Не используйте Область поиска вертикального тепловизора для определения высоты дна. 12 1 - Перед тем, как начать Нижний Толщина: Это значение приходит с тарелки производитель а также можно найти в листе технических характеристик или позвонив производителю. См. Также 10.3 Лабораторное оборудование на стр. 194. 13 1 - Перед тем, как начать Используйте AutoMapping для точного определения положения скважины Функция Auto Map Gen5 позволяет легко точно определить положение скважин в ваш тип пластины. Это важный первый шаг к выполнению анализов ELISPOT и других анализов на всю лунку. Запустите Auto Map, чтобы точно указать Gen5, как центрировать лунки на изображениях. Примечание: Эта функция не поддерживает держатели предметных стекол, колбы или подобное лабораторное оборудование. Он разработан для стандартных микропланшетов. Вертикальный тепловизор: Передано источник света - хороший выбор для Auto Map с пустой тарелкой. 14 1 - Перед тем, как начать Используя пустую тарелку, нажмите Запустить и следуйте подсказкам. Когда кажется, что обе лунки расположены правильно, щелкните Ok для сохранения смещений. Gen5 обновит запись типа пластины. 15 1 - Перед тем, как начать 1.5 - Мощные цели При работе с целями 20Х и выше необходимы два дополнительных шага. В этом разделе рассматриваются только воздушные цели - информацию о нефтяных целях (доступно ТОЛЬКО для Lionheart) см.3.6 - Цели большой мощности и масла на стр.. A. Определите параметры изображения для мощных объективов Особенно при использовании объективов высокой мощности определение «доступной нижней области фокусировки» важно для защиты ваших объективов и образцов. 1. Установите флажок «Определить доступную нижнюю область фокуса». 2. Нажмите кнопку «Сгенерировать значения по умолчанию из существующих определений скважин». 3. Введите Толщина дна - просмотрите спецификации от производителя сосудов или начните с приблизительной оценки, например, 500 мкм для стандартного микропланшета, 200 мкм для держателя предметных стекол. «Максимальное расстояние под держателем» обычно равно 0. Этот параметр поддерживает висячие пластины и специальные сосуды, такие как колбы T25 в адаптере. 4. Сохраните настройки. 16 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 1 - Перед тем, как начать B. Отрегулируйте корректирующую манжету. Корректирующие манжеты позволяют точно регулировать объектив, чтобы компенсировать изменения в сосуде, чтобы по-прежнему добиться четкой фокусировки. Вы должны отрегулировать корректирующую манжету на мощных объективах с 20-кратным, 40-кратным и 60-кратным воздушным увеличением, чтобысоответствовать толщине дна сосуда для образца. Если ошейник отрегулирован неправильно, изображения будут размытыми, и автофокусировка может быть затруднена. При необходимости повторите этот шаг для новых или других судов. Используйте ручной режим для доступа к цели: Когда вы нажимаете Цель доступа, турель опустится и повернется, чтобы расположить цель, которую вы в данный момент используете для удаления. Откройте дверцу доступа и снимите ее. 17 1 - Перед тем, как начать После снятия объектива найдите корректирующую втулку, шкалу и метку совмещения. Поворачивайте воротник до тех пор, пока отметка совмещения не укажет толщину дна вашего сосуда в миллиметрах.Это должно быть то же значение, которое вы вводите для Нижняя толщина определения вашей пластины, с поправкой на мм. Например, при толщине дна 500 мкм корректирующая манжета будет установлена на 0,5. Верните цель в турель и нажмите Ok. Инструмент вернется к тем же осям x, y и z. координаты как до коррекции. Вам нужно будет перефокусировать поле. Тип плиты Микропланшет со стеклянным дном Типичная толщина дна 0,17 мм Это типичные Нижний толщины. Проверять твоя тарелка Покровное стекло 0,17 мм Пластиковый микропланшет (например, 96-, 384-луночный) 0,5 мм Микропланшет низкой плотности (например, 6-, 12-луночный) до 2,0 мм производитель спецификации для фактическое дно толщина. Примечание: Доступ к целям также можно получить из меню Gen5: Система> Конфигурация прибора> Просмотр / изменение> Настройка. НажмитеДоступ рядом с интересующей целью. Узнайте больше об объективах и кубиках светодиодных фильтров: См. 10.1 - Инструменты и аксессуары на стр. 181.. 18 2 - Краткое руководство по визуализации Сбор данных в ручном режиме и преобразование в эксперимент Ручной режим позволяет использовать тепловизор, как если бы это был ручной микроскоп без окуляров. Сеансы в ручном режиме сохраняются с расширением имени файла..имм и может быть снова открыт позже из Диспетчер задач: Выбрать Ручной режим тепловизора. Ручной режим позволяет получить одно поле за раз до 4 цветов. Если вы сохраняете ту же позицию в фокусе, то есть не меняете координаты x, y, когда вы начинаете захват изображений, Gen5 накладывает до четырех каналов на одно изображение. Цель этого раздела - помочь вам получить одно многоцветное изображение. 2.3 - Обработка и анализ изображений 22 27 29 2.4 - Переход в экспериментальный режим 31 год 2.5 - Дополнительные возможности получения 35 год 2.1 - Получение изображения 2.2 - Просмотр и редактирование изображений 38 2.6 - Лучшие практики Инструкции по быстрому запуску Щелкните значок Ручной режим кнопка на панели инструментов главного меню или открыть Диспетчер задач (если необходимо) 20 2 - Краткое руководство по визуализации 1. Выберите Ручной режим тепловизора. 2. Выберите Захватить сейчас. Откроется диалоговое окно «Загрузить пластину». 3. Поместите тарелку на носитель / платформу и выберите ее Тип плиты (создан в Прежде чем вы начнете: 1.4 - Типы пластин, как показано на странице 11). Откроется окно ручного режима с изображением вашей первой скважины в реальном времени. Вы можете услышать поворот башни цели и движение сцены - это нормально. 21 год 2 - Краткое руководство по визуализации 2.1 - Получение изображения Ручной режим состоит из 4 основных разделов: л Навигация л Экспозиция л Фокус л Получение См. Также 3 - Расширенное руководство по захвату на стр. 42.. 22 2 - Краткое руководство по визуализации 1. Навигация Навигация по планшетам и лункам находится в верхней части экрана ручного режима и включает инструменты выбора цели и цвета. ВНайти изображение кнопка выполняет автоматическую экспозицию и автофокус итеративно, чтобы найти свой изображение. Инвертированный тепловизор: Выберите Задача а также Канал от объективов и установленных флуоресцентных кубов или светлого поля, цветного светлого поля, фазового контраста, в зависимости от ситуации. Нажмите Найти изображение. Найти изображение указывает Gen5 обнажить скважину и затем сфокусироваться на ней, что может занять несколько секунд, но может быть хорошей отправной точкой. Затем, при необходимости, вы можете использовать элементы управления «Экспозиция» и «Фокус», описанные ниже, для точной настройки изображения. Вы можете перемещаться по колодцу, используя: л джойстик, если есть, л клавиши со стрелками, л мышью, чтобы щелкнуть прямо в области карты скважины (поля обзора) 23 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 2 - Краткое руководство по визуализации 2. Контроль воздействия Лучшая практика: Съемка изображений с минимально возможными настройками экспозиции для получения наилучших результатов анализа. В то время как человеческий глаз предпочитает изображения с более высокой экспозицией, программное обеспечение предпочитает изображения с меньшей экспозицией. После приобретения используйтеЯркость и контраст элемент управления для улучшения просмотра изображения. 3. Органы управления фокусом Органы управления фокусировкой помогают позиционировать объектив для получения наилучшего изображения. л Если изображения не в нужном фокусе, попробуйте увеличить Экспозиция настройки и разверните Фокус панель для запуска FM сканирование. Когда вы найдете хороший пик, нажмитеУстановите высоту фокуса на максимальное соотношение FM кнопка. л При необходимости используйте Автоэкспозиция а также Автофокус элементы управления, чтобы слегка отрегулировать настройки до тех пор, пока вы не будете удовлетворены качеством изображения, переключаясь между экспозицией и фокусировкой. 24 2 - Краткое руководство по визуализации 4. Контроль за приобретением В камера кнопка делает снимок с текущими настройками. 25 2 - Краткое руководство по визуализации Нажмите Обработка / анализ после захвата изображений. Gen5 сохранит коллекцию миниатюр и представит их для обработки и анализа по мере продвижения. Основные шаги сбора данных в ручном режиме 1. Выберите Увеличение (цель) и первый Канал (или источник света для вертикального тепловизора) и перейдите к области пластины, которую нужно захватить. 2. Щелкните Найти изображение. Gen5 автоматически открывает, а затем фокусируется на колодце. Это может занять несколько секунд. 3. При необходимости используйте Автоэкспозиция а также Автофокус элементы управления, чтобы слегка отрегулировать настройки до тех пор, пока вы не будете удовлетворены качеством изображения, переключаясь между экспозицией и фокусировкой. 4. Щелкните камеру, чтобы сделать снимок. Затем вы можете изменить цвет / канал и повторить шаги захвата. 5. Когда вы сделали снимки, которые хотите сохранить или проанализировать, нажмите Обработка / анализ. 26 год 2 - Краткое руководство по визуализации 2.2 - Просмотр и редактирование изображений Перед обработкой и анализом вы можете просмотреть изображения, отрегулировать яркость и контраст, чтобы улучшить их внешний вид, аннотировать изображение и сохранить его для презентации. Эскизы на нижней панели представляют полученные изображения: щелкните, чтобы выбрать их для просмотра. 27 2 - Краткое руководство по визуализации Контраст яркости (B&C): Gen5 автоматически регулирует яркость и контраст изображения для оптимального просмотра. Щелкните значокКонтраст яркости кнопку, чтобы открыть элемент управления. Щелкните значокКанал стрелка в элементе управления, чтобы закрыть его. Выбирать Нейтральный на элементе управления B&C, чтобы восстановить исходное состояние изображения. (ВыбиратьАвто чтобы позволить Gen5 вносить корректировки.) Настройка B&C не влияет на анализ изображения; он просто улучшает отображение на мониторе компьютера. Свойства канала: Чтобы применить прозрачность и / или настроить цветовые градиенты для улучшения изображения, щелкните Свойства канала в элементе управления B&C. Панель инструментов аннотаций 1. Показать изображение в полноэкранном режиме 2. Измените масштаб, чтобы увидеть все изображение. 3. Увеличение до 1 пикселя экрана на 1 пиксель изображения. 4. Инструмент «Масштаб»: нарисуйте рамку на изображении для увеличения; щелкните правой кнопкой мыши, чтобы уменьшить масштаб 5. Инструмент ручной прокрутки: нажмите и перетащите, чтобы переместить изображение. 6. Инструмент профиля линии, чтобы провести линию через изображение, чтобы увидеть относительную интенсивность. 7. Общие инструменты аннотации для рисования полилиний, прямоугольников и окружностей, наложения текста и выделения областей интереса. 8. Инструмент измерения для определения размера интересующих объектов. 9. Инструмент «Сетка» для включения и выключения пользовательской сетки. 10. Сдвиг каналов для преодоления смещения и улучшения наложения. 11. Экспорт изображения или метаданных в Excel. Подробнее: 6.1 Инструменты аннотации, как показано на странице 117. 28 год 2 - Краткое руководство по визуализации 2.3 - Обработка и анализ изображений Обработку и анализ изображений в ручном режиме можно выполнить после получения изображения: Выбрать Обработка / анализ. См. Раздел 7 - Базовый анализ изображения на странице 124. Узнать больше. Обработка изображений Gen5 предоставляет параметры обработки с учетом контекста. Как правило, они работают лучше всего, когда применяются в указанной последовательности. 1. Щелкните параметр в Добавить этап обработки коробка. 2. Изначально оставьте настройки по умолчанию: нажмите Ok; при необходимости вы можете изменить настройки позже. 3. Используйте обработанное изображение в Анализ изображений (на следующем шаге). Gen5 создает новый набор данных для обработанного изображения. Вы можете сравнить их, выбрав их в История изображений коробка. Дважды щелкните обработанные данные, чтобы изменить их параметры. Анализ изображений 1. Щелкните Анализировать перейти к этапу анализа. 2. Щелкните Клеточный анализ. 29 2 - Краткое руководство по визуализации 3. Выберите свой канал обнаружения и нажмите Начинать. 4. Используйте инструмент «Профиль линии» и нарисуйте линию, чтобы получить параметры порога и размера объекта. 5. Щелкните Параметры (под кнопкой Пуск), введите свои настройки и нажмите Подать заявление (а также Ok чтобы закрыть диалог). 6. Gen5 возвращается в предыдущее окно и обновляет результаты, отображаемые в Результаты изображения а также Детали объекта таблицы справа. 7. Внизу экрана щелкните Добавить шаг сохранить анализ (или Применить изменения если шаг был ранее сохранен). 30 2 - Краткое руководство по визуализации 2.4 - Переход в экспериментальный режим После того, как вы получили изображение с оптимальными настройками и применили необходимые шаги обработки и анализа, вы можете легко преобразовать настройки этого изображения в экспериментальный режим, который автоматизирует сбор нескольких образцов, например, предметное стекло камеры или многолуночный планшет. 1. Выберите интересующее изображение. 2. Щелкните Создать эксперимент из набора изображений кнопка. Вы можете просто щелкнуть Читать новое кнопку, чтобы начать сбор данных. Чтобы отредактировать протокол, см. Ниже. Чтобы отредактировать эксперимент Вы можете внести изменения в свой эксперимент после преобразования. Наиболее частыми изменениями будут: A. Выбор интересующих скважин Б. Изменение метода автофокусировки 31 год 2 - Краткое руководство по визуализации A. Выбор интересующих скважин После преобразования сеанса ручного режима в эксперимент откройте этап чтения, чтобы внести изменения: Кроме того, если это улучшит ваш анализ, вы можете добавить действия (шаги) к своей процедуре, щелкнув их. Например, добавьте «Установить температуру», чтобы включить инкубацию. Перетащите шаги в списке, чтобы изменить их порядок. 32 2 - Краткое руководство по визуализации После открытия этапа чтения нажмите Полный Пластина в правом верхнем углу. Откроется карта вашей тарелки. Щелкните лунки, чтобы выбрать или отменить их выбор. Будут отображены скважины, выделенные синим цветом. Б. Изменение метода автофокусировки Предложения Gen5 5 методы автофокусировки на основе изображений и 6th метод лазерной автофокусировки, который требует покупки дополнительного аксессуара. л Методы автофокусировки на основе изображений позволяют получить серию изображений в различных плоскостях z в поисках нужного изображения. максимальная контрастность. л Лазерная автофокусировка направляет инфракрасный лазер на дно лунки для определения границы раздела сосуджидкость. По умолчанию Gen5 будет использовать «Автофокус с дополнительным сканированием» для флуоресцентных каналов и «Автофокусировка по яркому полю (двойной пик)» для яркого поля и фазового контраста. См. 5 - Что такое автофокусировка на странице 102. для подробного обсуждения методов автофокуса. Чтобы изменить метод автофокусировки: Если вы выберете Обученный пользователем автофокус или Лазерный автофокус, вам будет предложено сделать эталонное сканирование. 33 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 2 - Краткое руководство по визуализации а. При появлении запроса щелкнитеOk , чтобы открыть окно ручного режима. б. Перейдите к интересующему вас колодцу и найдите наилучший фокус с помощью джойстика или ручного управления, как описано в Разделе 2.1. c. НажмитеСохранить настройки. По умолчанию Gen5 использует фокальную плоскость канала 1 для каналов 2–4. Поэтому мы рекомендуем использовать самый сильный сигнал в качестве канала 1. Если вы ожидаете, что ваши каналы НЕ будут иметь одинаковую фокальную плоскость, щелкнитеВарианты фокусировки по вашим последующим каналам. Вы также можете: л Создайте определенное смещение от канала 1, введя число в поле Смещение (мкм) поле л Автофокусировка отдельно на других ваших каналах 34 2 - Краткое руководство по визуализации 2.5 - Дополнительные возможности получения В Режим изображения панель в ручном режиме позволяет вам определить дополнительные возможности для получения изображений, в том числе: л Кинетическая визуализация: снимать вживую биологии в реальном времени или настроить покадровую визуализацию. л Распределение: если необязательный Реагент Инжектор настроен, этапы дозирования могут быть встроены в ваш анализ. л Продвинутая визуализация: приобрести одиночные и множественные изображения в плоскости x / y (Montage) или z (Z-Stack). л Обрезать изображение до нужного размера: Устранение краевых эффектов в лунках микропланшета и включить функцию. Набор одного изображения - Одно поле, состоящее из одной координаты x, y и z. Может быть захвачено до 4 цветов, включая фазу или яркое поле. Монтаж изображения - Поле, состоящее из нескольких изображений (2–2000 изображений), которые могут быть скомпилированы (сшиты) для обеспечения большего поля обзора (в пределах одной z-плоскости). Плитки можно сшивать в Обработке. 35 год 2 - Краткое руководство по визуализации Z-стек изображений - Поле, состоящее из одиночных x- / y-координат, захваченных в нескольких z-плоскостях (до 200 срезов), толщиной до 0,1 мкм за шаг. Одно изображение, называемое Z-проекцией, может быть создано из этих изображений во время обработки изображения. См. 3 - Расширенное руководство по захвату на стр. для подробного обсуждения. Параметры ручного режима Movie Maker Разверните Контроль панель для изменения настроек видеосъемки по умолчанию. Цитирование «W» моделей: Доступно на Контроль панель: снимите этот флажок, чтобы снимать изображения в поле обзора стандартного размера. Биннинг Разверните Фокус панель, чтобы применить биннинг к вашим изображениям. См. Раздел Параметры размещения на стр. 70.. 36 2 - Краткое руководство по визуализации «Расширенная микроскопия» Gen5 дает вам мгновенную обратную связь, чтобы помочь вам быстро оценить качество вашего образца. Вы можете использовать то же сглаживание фона, сглаживание изображения и пороговую фильтрацию, предлагаемые в Cellular Analysis, чтобы применить ядерную маску для подсчета ячеек и / или измерения слияния в режиме реального времени. Когда у вас есть сфокусированное и правильно экспонированное изображение образца, увеличьте Счет и слияние панель для выполнения подсчета клеток на лету или измерения конфлюэнтности. Разверните Сценическое движение панель, чтобы изменить эти настройки по умолчанию: л Отрегулируйте размер шага X / Y слайдер на сцене Панель «Движение» для настройки степени движения при использовании карты скважины. л Перемещение носителя по щелчку мыши: позволяет выбрать область фокусировки щелчком мыши на карте скважины или отображаемом изображении. Включение джойстика отключает эту опцию. л Держите пластину в приборе на выходе: отменяет обычное поведение Gen5 по извлечению держателя планшета после каждого считывания. 37 2 - Краткое руководство по визуализации 2.6 - Лучшие практики Найдите заметки о приложении и другие ресурсы по адресу: www.biotek.com \ ресурсы Рекомендуемые микропланшеты: л Greiner® Обработанный µClear TC 655090 96-луночный и 781091 384-луночный черный полистирол л Greiner µClear клеточно-репеллент 655976 96-луночный и 781976 384-луночный черный л Greiner 655892 96-луночное и 781892 384-луночное стеклянное дно л Corning® 4850 96-луночная половина площади и 4851 384-луночное стеклянное дно Получите наилучшее качество изображения при использовании мощных объективов со стеклянным дном. Для масляных объективов и объективов с низким WD требуются стеклянные сосуды. Важный: Убедитесь, что в настройках экрана Windows установлено 100% для наилучшего просмотра. Чтобы предотвратить расплескивание или рассыпание среды, особенно для клеток в суспензии в планшетах с низкой плотностью, вы можете замедлить носитель тарелки чтобы не повредить содержимое сосуда. Для инструментов, которые его поддерживают: л л л В ручном режиме визуализации установите опцию на экране «загрузочная пластина». В экспериментальном режиме включите более низкую скорость в Процедура> Параметры диалог. Включите или отключите настройку с помощью Инструментальный контроль панель (или через системное меню). Установка экспозиции для образцов с низким уровнем сигнала: Лучшая практика для анализа - снимать изображения с минимально возможными настройками экспозиции. В то время как человеческий глаз предпочитает изображения с более высокой экспозицией, программное обеспечение предпочитает изображения с меньшей экспозицией. В средах с низким уровнем сигнала легко переэкспонировать изображение, особенно при использовании камер WFOV, где коррекция освещенности может уменьшить доступный диапазон интенсивности сигнала при более высоких экспозициях. При использовании тепловизора «W-модель» отмените выбор Использовать широкий угол обзора установка настроек экспозиции (а затем включение опции Использовать WFOV перед захватом) - хороший способ выбрать оптимальные значения экспозиции. После приобретения используйте Яркость и контраст контроль для улучшения внешнего вида изображения. В ручном режиме разверните Контроль панель для доступа к Use Wide FOV. 38 2 - Краткое руководство по визуализации Устранение проблем с фокусировкой Возможные способы лечения проблем с фокусировкой включают: л л Определите «высоту дна» вашего судна как описано в 1.4 - Типы пластин, как показано на стр.11: Gen5 использует «отметку дна» в качестве отправной точки для автофокусировки. Важно правильно определить высоту дна сосуда и образцов, которые вы снимаете. Отрегулируйте корректирующий воротник как описано в 1.5 - Цели большой мощности, как показано на странице 16: при использовании объективов с большим увеличением, 40x и 60x (воздух), убедитесь, что «корректирующая манжета» объектива правильно настроена для используемого типа пластины. Точно так же убедитесь, что другие настройки «типа пластины», такие как «доступная нижняя область фокусировки», соответствуют используемым сосудам. Попробуйте другой метод автофокусировки Просмотрите параметры автофокусировки, чтобы определить, подходит ли альтернативный метод для вашего приложения. См. Раздел 5.1 - Способы автофокусировки на стр.. Отрегулируйте параметры автоэкспозиции Снимите флажок «Ставить скорость важнее качества изображения». Время интеграции будет увеличено, что обычно приводит к лучшему изображению. Ручной режим: откройте панель Imaging Mode, выберите Расширенные настройки. Режим эксперимента: щелкните Параметры фокуса. Все еще размыто? Изменить Целевое воздействие% л Если сигнал относительно однороден по изображению: уменьшите до 25-50%. л Если яркость изображения сильно варьируется: увеличьте до 80–100%. Это заставит алгоритм фокусировки нацеливать более тусклые объекты и игнорировать яркие объекты, которые могут мешать фокусировке. Используйте динамическую гистограмму для установки экспозиции Используйте динамическую гистограмму Gen5 во время получения изображения, чтобы определить наилучшие настройки экспозиции. Гистограмма обновляется по мере того, как вы выбираете различные настройки экспозиции, что дает вам мгновенную обратную связь о влиянии вашего выбора. См. Гистограммы на странице 44.. После съемки используйте элементы управления яркостью и контрастностью (B&C), чтобы улучшить просмотр в Интернете. 39 2 - Краткое руководство по визуализации Посев, инкубация и обращение с планшетами для клеток Убедитесь, что ваши клетки правильно посажены (т.е. 40-70% конфлюэнтности). К вашему сведению: BioTek предоставляет Находите рекомендации заметки приложения в и другие примечании к приложению под названием:Автоматизированная культура тканей полезная информация в BioTek's Фиксация клеток и окрашивание в микропланшетах. Найдите эту заметку и другие полезные информация на сайте BioTek. Центр поддержки клиентов: https://customer.biotek.com Многие факторы влияют на качество данных флуоресцентной визуализации и анализа изображений, в том числе один из наиболее важных факторов: хорошая подготовка образцов. Флуоресцентное изображение - это необработанные данные для эксперимента, поэтому пристальное внимание к деталям при подготовке образца значительно улучшает результаты анализа. п Покрытие клеток После посева клеток дайте им посидеть на лабораторном столе за 15–20 минут до инкубации, чтобы дать клеткам л время для более равномерного оседания, уменьшая неравномерное распределение в лунках и сводя к минимуму краевые эффекты. п Рост клеток л Не штабелируйте чашки в инкубаторе, чтобы избежать неравномерного распределения тепла и влажности. увеличивает вариацию от пластины к пластине. Держите чашки подальше от дверцы инкубатора, которая часто нагревается, создавая дополнительные л краевые эффекты в лунках. п Сложное добавление ДМСО: клетки обычно могут выдерживать конечную концентрацию от 0,25 до 1% ДМСО (клеточного типа л зависимый). Разбавьте растворитель и тщательно перемешайте, чтобы избежать вариаций, вызванных неправильным перемешиванием. Основным источником ложных срабатываний на многих экранах являются автофлуоресцентные соединения. л Рекомендуется визуально подтверждать изображения в лунках для проверки, чтобы убедиться, что попадания не вызваны автофлуоресцентными соединениями. п Пример п Добавление л п Конденсация красных автофлуоресцентных соединений: доксорубицин и эпирубицин. реагента Теплые фиксаторы и реагенты перед добавками для уменьшения стресса клеток. на крышке / уплотнении пластины л Применяйте температурный градиент при определении инкубации настройки для предотвращения образования конденсата. п Микропланшеты л для визуализации Перед визуализацией очистите дно микропланшета или поверхность предметного стекла. Удалите любые конденсат со дна пластины безворсовой тканью. л При визуализации ранее окрашенного планшета, который хранится при 4ºC, дайте ему нагреться до комнатная температура; в противном случае на дне пластины скапливается конденсат, что приводит к нечеткому изображению. л Выберите правильный микропланшет Gen5; выбор неправильного сосуда приводит к сбоям автофокусировки из-за неправильных размеров пластины. См. Также Ускорение процесса фокусировки на странице 108.. 40 2 - Краткое руководство по визуализации 41 год 3 - Расширенное руководство по приобретению Инструменты для оптимизации анализа После того, как вы освоитесь с базовым сбором данных в ручном и экспериментальном режимах, Gen5 предоставит множество способов улучшить ваши настройки, чтобы оптимизировать анализ и получить больше сложные изображения. В этом разделе вы найдете: 3.1 - Оптимизация настроек экспозиции 43 год 3.2 - Высококонтрастное светлое поле (HCBF) 3.3 - Монтаж изображения 3.4 - Z-укладка 46 48 57 год 62 73 76 3.5 - Захват кинетических изображений 3.6 - Цели большой мощности и масла 3.7 - Описание планшета и лабораторная посуда 42 3 - Расширенное руководство по приобретению 3.1 - Оптимизация настроек экспозиции Воздействие зависит от 3 переменные: интенсивность светодиода (яркость), время интегрирования (длительность экспозиции) и усиление камеры (цифровое усиление сигнала). У каждого из них есть свои преимущества и недостатки. ниже: Параметр экспозиции Преимущество высокой настройки Недостаток высоких настроек 1. Яркость светодиода Чувствительность Фото-отбеливание 2. Время интеграции Более высокое качество изображения Значительно более низкая скорость визуализации 3. Усиление камеры Более высокая скорость чтения Низкое качество изображения В дополнение к кнопке Auto Expose в ручном режиме, ползунки для всех трех переменных позволяют пользователю получить хорошо экспонированное изображение с учетом конкретных требований анализа, например, компенсируя светочувствительный реагент за счет уменьшения интенсивности светодиода и интеграции время, но нарастающий выигрыш. Эти ползунки присутствуют во всех режимах изображения, кроме цветного яркого поля. 43 год Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 3 - Расширенное руководство по приобретению Использование светлого поля и фазового контраста проходящий свет для изображений образцов, а не кубиков светодиодных фильтров, используемых при флуоресцентной визуализации. Таким образом, свет освещает образец сверху, делая эти режимы совместим только с прозрачными крышками. Гистограммы В дополнение к визуальным подсказкам в прямом изображении гистограмма изображения может предоставить дополнительную информацию для точной настройки параметров экспозиции и максимального использования динамического диапазона камеры. Гистограммы отображают относительное количество пикселей заданного уровня интенсивности (от черного до белого) всех пикселей для текущего изображения. Ось X показывает значения интенсивности пикселей, а ось Y показывает количество пикселей на каждом уровне интенсивности. Чем больше пикселей в изображении при заданном уровне интенсивности, тем выше его пик на гистограмме. Gen5 отображает гистограмму изображения в двух шкалах по оси Y, линейной и логарифмической. Черный (или темный) график использует линейную шкалу, а серый (или более светлый) график использует логарифмическую шкалу. При захвате изображения гистограмма изображения может подтвердить, что динамический диапазон камеры используется эффективно. Передержанные изображения имеют пик в крайнем правом углу, иллюстрирующий скопление пикселей, которые насыщают динамический диапазон камеры. Недоэкспонированные изображения показывают большинство пикселей, накопленных слева на гистограмме. 44 год 3 - Расширенное руководство по приобретению Недоэкспонировано изображение и гистограмма DAPI окрашенный ядра клеток. В гистограмма не использовать полный динамический диапазон и есть соответственно плохой контраст в изображение. Передержанный изображение и гистограмма DAPI окрашенный ядра клеток. Примечание Потери из детализация текстуры в насыщенный ядра. Должным образом экспонированное изображение и гистограмма ядер клеток, окрашенных DAPI. Обратите внимание на сохранение деталей текстуры в ядрах изображения и использование полного динамического диапазона в гистограмме без чрезмерной или недостаточной экспозиции интенсивности пикселей. 45 3 - Расширенное руководство по приобретению 3.2 - Высококонтрастное светлое поле (HCBF) Требования: Lionheart FX, Cytation 1, Cytation 5 (только модели с фазовым контрастом: CYT5MPV или CYT5PV), Cytation 7 (модели «W») и программное обеспечение Gen5 Image Prime или Image +. Не поддерживается в Cytation 3. Для инструментов Lionheart FX и Cytation 5 требуется покупка и установка дополнительных принадлежностей, предоставляемых BioTek. Значительные улучшения в подсчете клеток были замечены при использовании настраиваемой диафрагмы при визуализации в ярком поле для определенных моделей инструментов. Эта простая модификация дает высококонтрастные изображения прикрепленных клеток, которые можно легко подсчитать Gen5. Перед захватом изображения необходимо установить апертуру HCBF и импортировать файл .xml для 4-кратного объектива (следуйте инструкциям по установке, прилагаемым к комплекту). Специальная диафрагма не нужна для Цитирование 1 а также Цитирование 7 формирователи изображения, так как эти инструменты оборудованы для высококонтрастного светлого поля (HCBF). Цитирование 7 у тепловизоров есть ручной переключатель для включения HCBF: поднимите верхнюю дверцу и переместите переключатель в положение Высокий контраст. Захват изображения Изображения могут быть получены как в ручном, так и в экспериментальном режиме. Расфокусировка для лучшего контраста Для улучшения подсчета клеток рекомендуется слегка расфокусировать изображение в ярком поле. Обычно это итеративный процесс проб и ошибок, чтобы определить, как достичь максимальной контрастности при сохранении приемлемого фокуса. 1. Сначала найдите оптимальные настройки фокуса. 2. Затем расфокусируйте изображение, уменьшив «Текущее положение» на начальную точку -250 мкм (в ручном режиме). 3. Использовать Инструмент линии после расфокусировки, чтобы оценить влияние настройки на разделение сигналов фона и переднего плана. Ваша цель - найти четко определенные пики интенсивности для расфокусированных ячеек. изображение до расфокусировки изображение после расфокусировки 46 3 - Расширенное руководство по приобретению Ручной режим Экспериментальный режим Найдя наилучшее положение фокусировки, нажмите Выполните два считывания в режиме яркого поля: одно «в кнопку положения и вычтите 250 мкм, чтобы фокусе» для лучших изображений и одно «расфокусированное» «расфокусировать» изображение (например: 3263–250 = для лучшего подсчета ячеек. Для второго канала выберите 3013). Оцените результаты этой расфокусировки и при Варианты фокусировки. ВыбиратьФокусная высота от первого необходимости отрегулируйте настройку. канала (+ смещение), и введите расфокусировку Компенсировать. Лучшие результаты наблюдались при высококонтрастном подсчете клеток в лунках с тяжелыми менисками при отключении функции «коррекции освещенности» Gen5. Если возникает этот тип эффекта мениска, отмените выбор Выполните коррекцию освещенности. 47 3 - Расширенное руководство по приобретению 3.3 - Монтаж изображения Монтаж позволяет захватывать большее поле зрения, сохраняя при этом разрешение желаемой цели. Монтаж - хороший выбор, когда: л л Для анализа требуется много ячеек Большие объекты содержат информацию за пределами единственного поля зрения Gen5 поддерживает получение до 2000 изображений (плиток) в одном поле, которые можно обрабатывать, сшивать и анализировать индивидуально или как одно окончательное изображение. Для сшивания изображений, Gen5 Image + или Image Prime требуется программное обеспечение. Монтаж в ручном режиме Разверните Режим изображения панель. Перемещайтесь по полю обзора с помощью программных элементов управления или джойстика и нажмите соответствующую кнопку границы: «Установить сверху», «Установить снизу», «Установить влево» и «Установить вправо». Зона покрытия будет обозначена красным квадратом на карте колодца. Gen5 определит, сколько изображений необходимо для покрытия области, используя настройки наложения по умолчанию. После определения области, которую вы хотите захватить, нажмите кнопку камеры. Поскольку "Авто для вышивания" является настройкой по умолчанию, плитки будут иметь перекрытие 10%. Рекомендация: установите границы как можно ближе к краям интересующего объекта. 48 3 - Расширенное руководство по приобретению После определения области захвата для монтажа в ручном режиме вы можете редактировать некоторые параметры, в том числе Перекрытие плитки для сшивания. Монтаж в экспериментальном режиме в Процедура, создать изображение прочитайте шаг и Выбрать Монтаж. Нажмите Монтаж целиком. Затем отрегулируйте количество рядов и столбцы как необходимо определить зона захвата, которые будут показано на карте колодца. Вы также можете определить смещения для монтаж центрировать или использовать маяки (крытые в 4.3 - Маяки, области интереса и смещения ). 49 3 - Расширенное руководство по приобретению Gen5 предлагает 3 методы для плитки перекрывать. К по умолчанию, Gen5 применяет «Авто для сшивание », который определяет перекрытие на основе объективный размер. Это создает оптимальное количество общий Информация между изображениями (указано пунктирные линии) на создать бесшовные окончательно сшитый изображение. Альтернатива варианты включают: Нет перекрытия: Обычай: Вы можете вводить значения для разделения столбцов и строк. Положительные значения Изображения трогают, но увеличивают перекрытие; отрицательные значения распространяют изображения, как показано здесь. не иметь общего области. 50 3 - Расширенное руководство по приобретению Другой дефолт параметр определяется объективный размер будет ли Gen5 «Только автофокус в центр монтаж" (подана заявка на низкий питание цели) или «Автофокус все изображения »или плитки (подал заявку на высокий питание цели). Щелкнув Передовой параметры под Монтаж настройки, дает вы контролируете варианты, так что ты можешь измениться настройки как необходимо. Объекты в вышитом изображении на основе фотомонтажа без перекрытия могут выглядеть неровными и искаженными, а один объект может даже появиться как несколько объектов. Например, на изображении справа Gen5 будет насчитать 8 объектов: Gen5 будет насчитывать 8 ячеек в этом Монтаж без перекрытия. 51 3 - Расширенное руководство по приобретению Применение нахлеста рекомендуется для более высоких качественно сшитые изображения. Gen5 использует метод кросс-корреляции для смешивания отдельных плиток в одно плавное изображение. В этом случае окончательно сшитое изображение будет выглядеть как это изображение, и только 4 объекта будут подсчитано: Gen5 будет насчитывать 4 ячейки в этом прошитый монтаж. Просмотр монтажа и сшитого изображения Просмотр отдельных плиток После захвата изображения монтажа Gen5 представляет специальный Контроль поле, позволяющее просматривать необработанное изображение целиком (без сшивки) или отдельную плитку: л Все позиции: нажмите эту кнопку, чтобы отобразить весь монтаж. л Щелкните плитку в элементе управления, чтобы отобразить этот сегмент монтажа. Каждая плитка представляет собой плитку в монтаже. Примечание. Управление монтажом отображается только тогда, когда открыт необработанный монтаж. Он закрывается, когда просматривается сшитое изображение. 52 3 - Расширенное руководство по приобретению Навигация Инструменты: в зависимости от количества плиток средство просмотра в ручном режиме, а также при обработке или анализе изображений будет варьироваться от кнопок до счетчиков для выбора плиток. 53 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 3 - Расширенное руководство по приобретению Сшивание изображений Важный: Предварительно уменьшенный Сшивание изображений или создание одного изображения из сшитый монтаж должен быть меньше 4096 МБ. монтажных плиток можно найти в разделе Обработка изображений Сшитые изображения (после уменьшения) как в ручном, так и в экспериментальном режиме. См. Раздел2.3 - должны быть меньше 1 ГБ (1024 МБ). Обработка и анализ изображений, как показано на странице 29 для инструкций по ручному режиму или раздела 6 - Обработка изображения, как показано на странице 114 для инструкций по Экспериментальному режиму. л Канал регистрации - это канал, который будет использоваться для определения выравнивания плитки. Выберите канал с наибольшим сигналом и охватом, часто это ваше ядерное пятно. л Способы слияния - это алгоритмы сшивания изображений из монтажа в одно изображение. Каждая опция относится к методу разрешения перекрывающихся пикселей. л Обрезать сшитое изображение, чтобы удалить черные прямоугольники по краям. обрезает окончательный монтаж, чтобы выровнять его с областью наибольшего покрытия. Поскольку плитки выровнены в монтаж, некоторые требуют большего смещения для создания бесшовного наложения с соседними элементами. Если этот параметр не отмечен, оставшаяся область будет заполнена черным ящиком. л Заполните промежутки между плитками локальным цветом фона проверяет 4 ближайших пикселя, которые имеют допустимую интенсивность, и усредняет эти значения для оценки локальной интенсивности; и использует эту интенсивность, чтобы заполнить пробелы. л Уменьшить размер сшитого изображения уменьшает окончательный размер изображения. Изображение с полным разрешением будет (2,2 МБ [минимальный размер каждой плитки] X плиток в монтаже). Уменьшение размера улучшает производительность компьютера и объем памяти, но также снижает разрешение получаемого монтажа. Линейное смешение обычно является наиболее эффективным методом слияния и выбором по умолчанию. Вы можете поэкспериментировать с другими методами, чтобы выбрать лучший вариант для ваших нужд. Чтобы протестировать различные методы слияния: щелкните Изменить настройки в ручном режиме или отредактируйте шаг чтения в экспериментальном режиме. 54 3 - Расширенное руководство по приобретению Исключить ненужные плитки «Маскируйте» плитки, чтобы исключить нежелательные участки из вышитых результатов монтажа и анализа. 1. Выберите несшитый монтаж в окне «История изображений» в ручном режиме или необработанное изображение, установленное в эксперименте. 2. Выберите плитку, которую вы хотите замаскировать, щелкнув изображение или используя инструменты навигации. 3. Щелкните Маска. Gen5 отмечает плитку красным крестиком. Gen5 запрашивает комментарий журнала аудита при применении маски. «Надлежащая лабораторная практика» (GLP) ведет записи о причинах появления маски. Устранение проблем с монтажом / сшиванием Плохая взаимная корреляция Чтобы исправить "плохую взаимную корреляцию" в сшитом изображении, определите Обычай перекрытие плитки на этапе чтения. Выбирать: л Изменить шаг изображения в ручном режиме, л Читать шаг в экспериментальном режиме. Авто для сшивания: по умолчанию Gen5 определяет перекрытие 10% или 75 мкм, в зависимости от того, что больше. Обычай: позволяет указать перекрытие плитки. Увеличьте перекрытие до 20-30%, чтобы избежать плохой взаимной корреляции. Примечание: Gen5 может отображать сообщение «плохая взаимная корреляция» даже при идеальном сшивании. Когда Gen5 обнаруживает две или более пустых плиток, между которыми ничего не пересекается, он сообщает о плохой взаимной корреляции. Образец сшитого изображения с плохой кросскорреляцией 55 3 - Расширенное руководство по приобретению На вышеприведенном сшитом изображении с плохими результатами кросс-корреляции монтажные изображения (плитки) были сняты с 10% перекрытием. Когда изображения были сняты с Обычай 20% перекрытие (показано слева), Gen5 генерировало такое же сшитое изображение со сглаженными переходы между плитками. Монтаж занимает слишком много времени? Нажмите Расширенные настройки внизу шага чтения (в экспериментальном режиме) или шага редактирования изображения (в ручном режиме): 1. Уменьшите Задержка после движения плиты параметр. 2. Включите Только автофокус по центру монтажа. Обычно эти изменения позволяют сэкономить 30-40 минут при считывании изображений за 3 часа. 56 3 - Расширенное руководство по приобретению 3.4 - Z-укладка Z-stacking захватывает несколько изображений в нескольких плоскостях оси z (или фокальных). Используйте Z-стекинг при анализе: л толстые образцы, такие как сфероиды и опухолевидные колонии, л анализы висячей капли, л целые организмы, такие как рыбки данио и C.Elegans, л анализы проводят в матригеле, такие как ангиогенез и образование трубок. С этими типами образцов необходимо получить несколько изображений (до 200 срезов) путем перемещения объектива по оси z с шагом 0,1 мкм или больше. После получения Gen5 позволяет просматривать, анализировать и сохранять отдельные фрагменты (изображения). Gen5 также может комбинировать срезы (или подмножество срезов) в «Z-проекцию». Z-проекции можно обрабатывать и анализировать как одно изображение. Рекомендация: Сначала используйте ручной режим, чтобы определить оптимальные параметры для получения zstack вашего образца. Затем примените эти параметры в эксперименте (режим эксперимента). Захват Z-стека Полезно знать перед тем, как начать: л Как в ручном режиме, так и в режиме эксперимента отправной точкой Gen5 для получения z-стека является Нижняя отметка выбранного типа пластины. Убедитесь, что высота дна вашего судна определена правильно:См. Высота дна: на странице 12.. л Gen5 определяет высоту захвата z-стека как «толщину образца». 57 год 3 - Расширенное руководство по приобретению Ручной режим Z-Stack Органы управления фокусом 1. После выбора увеличения и цветовых каналов или света источник; при желании применить бининг на панели «Фокус»; и установите экспозицию Когда вы определяете захват высоту для z-стека, Gen5 определяет Образец толщина. или автоматическую экспозицию. 2. Используйте Автофокус кнопки управления (показанные выше) или джойстиком (не показан), чтобы найти верхнее или нижнее положение оси z, которое наилучшим образом определяет начало области образца, которую вы хотите захватить. 3. Разверните режим визуализации панель и включить Z-стек. л Gen5 всегда показывает текущая позиция Z когда вы двигаетесь по оси z. Размер шага задается целью. 4. Щелкните значок Установленный для каждого положения, когда вы нашли самое низкое и самое высокое в фокусе изображения образца. Отредактируйте шаг визуализации, чтобы просмотреть / изменить количество 5. ломтики. Нажмите кнопку камеры, чтобы сделать снимок Z-стека. В зависимости от высоты захвата и объективной глубины резкости (или размера шага) Gen5 определяет толщину образца и устанавливает количество срезов, необходимых для захвата всего образца. Вы можете использовать ручной режим, чтобы определить лучшие параметры, а затем сохранить их в эксперименте, нажмите Создайте эксперимент из набора изображений. 58 3 - Расширенное руководство по приобретению Экспериментальный режим Z-Stack Чтобы определить Z-стек непосредственно в эксперименте режим, установите: л Размер шага: по умолчанию глубина резкости Цель; при необходимости его можно изменить; л Количество ломтиков: определяет Образец толщина. л Точка фокусировки: по умолчанию Нижний позиция это точка фокусировки. Вы можете использовать ползунок Гибкие инструменты для определения высоты захвата для Z-стека или количествоИзображения под точкой фокусировки определить альтернативу диапазон захвата. Просмотр Z-стека После захвата Gen5 представляет Z-Stack Control. Вы можете использовать: л ползунок или кнопки прокрутки высоты для отображения одного фрагмента в время по порядку, л л Слайд-шоу Z-Stack: для просмотра фрагментов в виде слайд-шоу: Z-Stack Фильм: нажмите кнопку записи, чтобы снять фильм. хорошо зум или ручной режим В режиме эксперимента установите матрицу планшета. Данные в "Рисунок" без ZProj ярлык, чтобы открыть Z-Stack Control и просмотреть отдельные срезы. 59 3 - Расширенное руководство по приобретению Создание Z-проекции Требуется программное обеспечение Gen5 Image + или Image Prime После получения z-стека Gen5 может объединить срезы (изображения) в 2Dрендеринг или Z-проекция. Все или выбранное подмножество срезов в zstack могут быть включены в проекция. Чтобы создать Z-проекцию: л В ручном режиме нажмите Добавить шаг в области обработки изображений (показано справа). л Ручной режим В экспериментальном режиме определите Сжатие данных шаг. До или после определения Z-проекции Gen5 позволяет вам попытаться улучшить качество изображения с помощью предварительной обработки и / или Создайте несколько Z-проекций, деконволюции. После создания проекции вы можете проанализировать изображение. каждая из которых использует свой метод, чтобы быстро оценить результаты каждого метода и выбрать лучший для ваших образцов. В сочетании с монтажом сшивание изображений должно выполняться до создания Z-проекции. Укажите метод и срезы для Zпроекции 1. В окне Z Projection выберите цвет. Канал. Для многоканального zстека щелкните значок + вкладка для каждого дополнительного цвета. Gen5 предоставит все последующие каналы. По умолчанию для них установлено значение «Использовать настройки канала. 1 », но вы можете изменить настройки для каждого канала отдельно. 2. Выберите Метод. Для большинства анализовСовмещение фокуса метод самый лучший. Он включает только сфокусированные изображения в проекция. 3. Используйте верхний а также Нижний кнопки прокрутки фрагментов или перетащите ползунок, чтобы ограничить проекцию подмножеством фрагментов. 60 3 - Расширенное руководство по приобретению Gen5 может выполнять анализ изображения на Z-проекции как в ручном, так и в экспериментальном режимах. Z-проекция рассматривается как любое другое отдельное изображение. Исправление проблем: л Наложение фокуса Z-проекции: При использовании метода совмещения фокуса для создания z-проекции, вы можете настроить «Размер макс. фильтр », чтобы улучшить результат. Размер фильтра зависит от выборки: как правило, чем меньше интересующие объекты, тем меньше должен быть размер фильтра, и, наоборот, чем больше объекты, тем больше размер фильтра. л Получение Z-стека: (для инвертированных формирователей изображений) Убедитесь, что все ваши объективы, светодиоды и кубики фильтров откалиброваны, если у вас возникли проблемы с получением изображений z-стека. Выбирать Система> Конфигурация прибора. Дважды щелкните элемент тепловизора и щелкнитеНастраивать. Щелкните значок Конфигурация изображения вкладка и перезапустить Автоматическая калибровка. Это может занять несколько минут. 61 3 - Расширенное руководство по приобретению 3.5 - Захват кинетических изображений Цейтраферная съемка изображений доступна как в ручном, так и в экспериментальном режимах. На продолжительность интервала влияет несколько факторов, в том числе: л Количество каналов обнаружения л Время интеграции л Метод автофокуса л Биннинг (См. Раздел Параметры размещения на стр. 70.) л Расширенные режимы визуализации: Montage и / или Z- Куча Кинетика, требующая высокой частоты кадров, такая как анализ ионных каналов, может выполняться, когда интересующий сигнал имеет соответственно быстрое время интегрирования. Время интеграции для достижения 10 кадров в секунду (fps) должно быть установлено на 50 миллисекунд (мс) или меньше; время интеграции для достижения 20 кадров в секунду должно быть 20 мс или меньше (при включенном бининге). Быстрая кинетика должна выполняться в режиме Well Mode. Кинетическое приобретение 1. Разверните Режим изображения панель (Z-Stack и Montage Ручной режим могут выполняться в кинетическом цикле) и проверьте Кинетическая визуализация а также Распределить, если это применимо. 2. Щелкните Изменить шаг изображения. 3. В цикле Well Mode дважды щелкните Dispense и Начать кинетику шаги для определения дозировки, интервала (время между шагами визуализации) и общего времени выполнения. 4. Щелкните Выбирать Кинетическая визуализация и / или Распределить чтобы позволить Изменить шаг изображения кнопка: 62 выполнить пробег. 3 - Расширенное руководство по приобретению Важный: Кинетический интервал должен быть достаточно длинным для получения изображений. Пиковая скорость: 10 кадров в секунду (кадров в секунду) при полном разрешении, 20 кадров в секунду при биннинге 2x2. Сохраните настройки ручного режима, чтобы создать эксперимент. В противном случае определите шаг кинетического чтения, как обычно, в диалоговом окне процедуры Gen5. Прерывистая кинетика Наиболее гибкая кинетическая опция Gen5 «прерывистая кинетика» освобождает инструмент, чтобы его можно было использовать в других экспериментах, во время инкубации или периодов отдыха. Прерывистая кинетика также дает вам возможность добавлять реагенты или иным образом манипулировать планшетом / сосудом между считываниями (получение изображения). Gen5 объединяет измерения / изображения, полученные в нескольких сеансах, объединяя их в один набор результатов. Это дает пользователям полный контроль над получением изображений, вместо того, чтобы полагаться на автоматические или запрограммированные интервалы стандартного кинетического захвата изображения. Прерывистая кинетика предоставляет все возможности кинетического анализа стандартной кинетики, например кинетические кривые, Max V. Примечание: Для протоколов BioSpa OnDemand требуется прерывистая кинетика. 63 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 3 - Расширенное руководство по приобретению Настройте прерывистый кинетический эксперимент: 1. В диспетчере задач выберите Протоколы> Создайте новый (или создайте новый эксперимент). 2. При определении процедура, выберите Параметры, и выберите Прерывистая кинетическая Процедура. 3. Введите "расчетные" моменты времени в Дни: Часы: Минуты: Расчетное общее время и Расчетный интервал. Это всего лишь приблизительная оценка, которая не повлияет на реальную экспериментальную деятельность. Gen5 использует ваши предполагаемые временные рамки для настройки представлений данных и формул с заполнителями до тех пор, пока фактические данные фиксируются. Если вы сомневаетесь в необходимом временном периоде и интервалах, лучше их переоценить. 4. Определите этапы чтения как обычно и сохраните протокол. 5. Создайте эксперимент на основе протокола и читайте табличку. 6. Сохраните эксперимент (и при желании закройте файл). 7. Удалите планшет и обрабатывайте (например, добавляйте реагент, инкубируйте и т. Д.), Пока не наступит время для следующего чтения. 8. Откройте эксперимент, поставьте пластину на носитель, щелкнуть Читать новоеи выберите «Продолжить чтение». Gen5 компилирует все считанные данные в набор кинетических данных и выполняет сокращение данных, как определено в протоколе. 64 3 - Расширенное руководство по приобретению Параметры регистрации кинетических изображений Примечание: Для быстрых кинетических анализов Кинетическое выравнивание кадра, как показано на лицевой странице - лучший вариант для улучшения получения изображений. Кинетическая регистрация изображений замедляет процесс, захватывая до 5 дополнительных изображений, которые могут добавить до 20 секунд на кадр. Gen5 предоставляет эту функцию для коррекции некоторых эффектов инкубации на пластиковых планшетах и улучшения отслеживания клеточной активности во время покадровых анализов. Регистрация изображения выполняет корректировку несущей X / Y между съемками кинетических изображений. Регистрация сравнивает изображения до и после, чтобы определить дрейф по оси x или y. Затем корректирует любой дрейф, обнаруженный до захвата изображения, путем изменения положения держателя. Выберите эталонное изображение: либо первое изображение, снятое за кинетический промежуток времени, либо предыдущее захваченное изображение. л Зарегистрируйтесь на первое изображение: Если вы ожидаете небольших изменений в биологии образца в течение эксперимент. л Зарегистрируйтесь на предыдущее изображение: если биология быстро меняется, например, рост клеток или фенотип. изменения. л Порог успешной регистрации: Введите значение от 0 до 1 (по умолчанию 0,25). Это значение представляет порог, которому должна соответствовать регистрация изображения, чтобы считаться успешной, где 1 - идеальное совпадение, а 0 - несоответствие. 65 3 - Расширенное руководство по приобретению Если нормализованный коэффициент взаимной корреляции между тестовым и эталонным изображением ниже порога успешной регистрации, перемещение по регистрации не выполняется. В случаях, когда регистрация изображения приводит к неправильной настройке положения образца, это может помочь поднять порог. л Максимальный ход на кинетическую петлю: При желании вы можете указать максимальное расстояние, на которое выравнивание может перемещаться во время каждого кинетического считывания. Кинетическое выравнивание кадра После выполнения кинетического чтения Gen5 предлагает этап обработки изображений для улучшения качества фильма, созданного из изображений. Кинетическое выравнивание кадров устраняет возникающее перемещение XY между кадрами. естественно во время захвата изображения. Ручной режим На панели обработки: Экспериментальный режим Добавьте шаг сокращения данных: или в увеличении лунки (из матрицы планшета) щелкните Процесс: 66 3 - Расширенное руководство по приобретению Перед созданием фильма выполните этот этап выравнивания кадров, выбирая параметры, которые дают наилучший эффект для вашего анализа. Некоторые могут потребоваться эксперименты. Затем выберите "Выровнен (канал обнаружения) "набор данных в качестве источника фильма: См. Раздел «Запись и сохранение видеороликов с интервальной съемкой» ниже.. Запись и сохранение видео в режиме замедленной съемки Gen5 3.00 (и выше) предлагает средства управления создателем фильмов как в ручном, так и в экспериментальном режиме. Как правило, кинетическая или покадровая съемка дает наилучшие результаты, но Z-стек и ручное управление процессом визуализации также могут быть зафиксированы в фильме. 67 3 - Расширенное руководство по приобретению Ручной режим Экспериментальный режим После определения и выполнения шага кинетического считывания в Щелкните запись во время сеанса. Gen5 просверлите масштабирование скважины: Нажмите кнопку «Стоп», чтобы завершить запись. Выбирать Параметры фильма от Контроль панель для настройки параметров: К вашему сведению: л Нажмите кнопку записи, чтобы открыть элементы управления: Использовать Качественный ползунок, чтобы сделать изображения более резкими или наоборот, чтобы сэкономить место на диске, уменьшив размер файла. л л Аннотации к изображениям будут записаны и сохранены в фильме. Кинетическая съемка поддерживается в ручном режиме. л Замаскированные кадры можно исключить из фильма. л Кинетическое выравнивание кадра: можно применить специальный этап обработки изображения для улучшения качества фильмов, созданных на основе кинетического считывания. 68 3 - Расширенное руководство по приобретению Сохранение файлов фильмов Gen5 предлагает два формата файлов и несколько других вариантов сохранения файлов фильмов: л .wmv - это формат видеофайлов Windows по умолчанию л .mp4 - это стандартный отраслевой формат видеофайлов. Примечание: Сшитые монтажные фильмы: MP4 ограничен разрешением 9,4 мегапикселей. WMV ограничен до 12,3 мегапикселей изображений. Если вы попытаетесь записать видео с большим разрешением изображения, например сшитый монтаж, вы можете получить сообщение об ошибке или видео может быть недоступно для просмотра. 69 3 - Расширенное руководство по приобретению Параметры биннинга Объединение изображений может улучшить фокусировку и скорость получения. Биннинг - это метод, который объединяет интенсивности из сетки 2x2 пикселей в один пиксель. Это уменьшает размер изображения и хранилище до 25% от исходного размера. Это также может сократить время интегрирования, необходимое для экспонирования, до раза, поскольку интенсивности каждого пикселя в сетке 2x2 суммируются в конечном пикселе. Объединение влияет на настройки экспозиции: объединенные изображения ярче, чем изображения без объединения с теми же настройками экспозиции, потому что интенсивности пикселей удваиваются. Ручной режим Экспериментальный режим Определите на этапе чтения процедуры Gen5 предлагает два варианта объединения изображений: автофокус и захват, но объединение должно быть включено, чтобы автофокусировка применила его к захвату. Вы можете протестировать эффекты объединения в ручном режиме, включив и отключив параметр и просмотрев разницу. Преимущества биннинга Недостатки биннинга меньший размер файла изображения пониженное пространственное разрешение потенциально улучшенное отношение сигнал / шум уменьшенный размер изображения (меньшее разрешение) более высокая производительность - меньшая интеграция более высокая чувствительность, особенно для красных красителей л Автофокус: Биннинг влияет на настройку экспозиции во время автофокусировки. Gen5 регулирует экспозицию автоматически, чтобы получить максимально возможную интенсивность. л Захватывать: Gen5 хранит информацию об изменении размера (количество пикселей по высоте и ширине) вместе с изображением. Обычно изображения будут иметь размер 1/4 по сравнению с захватом без биннинга. Рекомендуемая практика при использовании биннинга: проверьте и установите настройки экспозиции в каждом канале с включенным биннингом перед захватом. 70 3 - Расширенное руководство по приобретению Кинетический монтаж Z-Stack В Gen5 3.04 или выше вы можете комбинировать расширенные методы сбора данных. Комбинирование покадровой визуализации с zстеком и захватом монтажа может быть полезно для многоклеточных анализов, например, для визуализации сфероидов или рыб данио. Такая сложная компиляция изображений приведет к созданию файлов данных значительно большего размера в зависимости от количества цветовых каналов, срезов z-стека, плиток монтажа и кинетических интервалов. Подумайте о своих потребностях в управлении файлами перед тем, как приступить к этому типу приобретения, например, можете ли вы сохранить файлы на внешний жесткий диск? Gen5 поддерживает до 2000 изображений / канал / лунку или до 8000 изображений / лунку. Помните об этом ограничении при определении количества фрагментов в z-стеке и количества фрагментов в монтаже. Важный: Предварительно уменьшенный сшитый монтаж должен быть меньше 4096 МБ. Сшитые изображения (после уменьшение) должно быть меньше 1 ГБ (1024 МБ). Ручной режим Экспериментальный режим Скопируйте и вставьте, чтобы добавить канал В ручном режиме Gen5 копирует настройки живого сеанса для цветового канала и позволяет вставлять их в шаг чтения. Чтобы добавить еще один канал в кинетику, z-стек и / или монтаж, прочтите: 1. Щелкните Изменить шаг изображения. ОткрытьЧитать шаг (внутри кинетической петли, если применимо). 2. Добавьте канал в диалоговом окне шага визуализации и нажмите OK, чтобы закрыть окно. 3. Вернувшись в Захватывать выберите дополнительный канал и определите его настройки фокуса и экспозиции. Примечание. Gen5 запоминает последние параметры, использованные для канала. 4. 5. Когда настройки определены, нажмите кнопку Копировать кнопку, а затем выберите Изменить шаг изображения. Щелкните значок Буфер обмена кнопку для канала, чтобы вставить настройки. Когда все каналы 71 3 - Расширенное руководство по приобретению определены, щелкните OK, чтобы закрыть шаг чтения. Нажмите ОК, чтобы закрыть окно процедуры. 6. Щелкните, чтобы начать процедуру. 72 3 - Расширенное руководство по приобретению 3.6 - Цели большой мощности и масла Рекомендации по достижению высоких целей л л Джойстик: если возможно, используйте джойстик для наиболее точного управления навигацией и фокусировкой. Средства контроля воздействия: См. 3.1 - Оптимизация настроек экспозиции на стр. Больше подробностей. Кроме для настройки яркости светодиода, чтобы получить более точный контроль над настройками экспозиции, щелкните ползунок, а затем используйте клавиши со стрелками на клавиатуре или колесо мыши, чтобы более плавно увеличивать или уменьшать настройки. л Сократите время интеграции и увеличить Усиление камеры, по крайней мере, изначально, при попытке найти интересующий объект. Затем выберитеАвтоэкспозиция. Важный: См. 1.5 - Цели большой мощности на стр. для важных рекомендаций по установке для мощных объективов. Цели 40X, 60X и 100X: ограничение Карты 96- и 24-луночных планшетов при использовании объектива высокой мощности В зависимости от судна, мощные объективы могут быть не в состоянии сделать снимки всех скважин или участков судна. Помните об этом при нанесении покрытия на образцы. Это ограничение видно при выборе лунок для считывания на этапе считывания (щелкните значокПолная тарелка кнопка). Напротив, ограничение неочевидно при определении макета пластины. Gen5 определяет это ограничение на карте номеров: л л X, чтобы показать, когда невозможно получить изображение какой-либо части скважины; O, чтобы показать, когда можно получить изображение только части скважины. Чтобы просмотреть карту номера в ручном режиме, нажмите Хорошо: 73 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 3 - Расширенное руководство по приобретению Чтобы просмотреть карту планшета в экспериментальном режиме: 1. Создайте Процедура и выберите Тип плиты. 2. Щелкните Читать, и установите Изображение как метод обнаружения. 3. Установите Задача до 40x, 60x, 100x (фаза, стандарт или масло) и щелкните Полная тарелка. Нефтяные цели Только Львиное Сердце Lionheart поддерживает использование масляных иммерсионных объективов, а Gen5 помогает пользователям наносить и удалять масло. Масляные иммерсионные объективы оптимизированы для просмотра через покровное стекло толщиной 0,17 мм и не имеют корректирующей манжеты для отмены этого предпочтения. Масляные иммерсионные объективы Olympus доступны с увеличением 60X или 100X. Прозрачное иммерсионное масло Olympus® типа F, поставляемое с вашим объективом, имеет высокую вязкость, которая создает непрерывный столб жидкости между двумя поверхностями. Не рекомендуется использовать другие масла. Кроме того, масло оптически похоже на стекло с показателем преломления 1,515. Требования Использовать стеклянные сосуды: л л покровные стекла л слайды л микропланшеты со стеклянным дном и чашки Петри Только ручной режим: масляные цели могут использоваться только в режиме реального времени или в ручном режиме, но не л эксперименты. По одному хорошо за раз: лучший способ избежать растекания масла на сосуде, изобразить одну скважину или слайд л вовремя. Одна капля масла: используйте как можно меньше масла, обычно достаточно одной капли. Вы можете л повторно нанесите масло по мере необходимости. Очищайте масло после каждого применения.: очищайте объектив бумагой для линз после каждого захвата л изображения. Это предотвращает просачивание масла и повреждение компонентов подэтапа. Также очистите дно емкости. л Примечание. Автофокус не поддерживается, и Gen5 не калибрует масляные объективы. Точно так же не поддерживается формирование изображений «Цветное яркое поле». Процедура: использование масляных иммерсионных объективов с Lionheart Инструкции по установке масляных иммерсионных объективов можно найти в руководстве оператора. Примечание: масляные иммерсионные объективы не калибруются во время настройки. Процедуры заливки и очистки масла пошаговые. Вы можете выполнить их с помощью панели управления прибором Gen5 или ответить на запросы при выборе цели по маслу в ручном режиме. Лучшая практика заключается в том, чтобы следовать предложенной последовательности для загрузки масла, а затем очистить объектив, прежде чем снова переключиться на цель, не связанную с маслом. 74 3 - Расширенное руководство по приобретению Контроль панель: если установлен масляный иммерсионный объектив, вы можете открыть Чистая цель мастер через панель управления прибором. 1. Выберите масляный объектив. 2. Щелкните масленку, чтобы открыть мастер. 3. Следуйте инструкциям, нажимая кнопки, чтобы сообщить Gen5, на каком этапе вы находитесь. Выбирать Пропускать когда применимо для перехода к следующему шагу. Для Например, если при запуске на носителе нет таблички, нажмите первую кнопку «Пропустить». 4. Обязательно очищайте объектив после использования. 75 3 - Расширенное руководство по приобретению 3.7 - Описание планшета и лабораторная посуда Выбор сосуда для культивирования клеток значительно влияет на качество изображения и успешность анализа, особенно при использовании объективов с более высоким увеличением. Если возможно, выберите самый тонкий и плоский носитель. Получите наилучшее качество изображения при использовании мощных объективов со стеклянным дном. Для масляных объективов и объективов с низким WD требуются стеклянные сосуды. Лучший выбор: стеклянные пластины или пластины с оптическим дном, например: Рекомендуемые микропланшеты: л Greiner® Обработанный µClear TC 655090 96-луночный и 781091 384-луночный черный полистирол л Greiner µClear клеточно-репеллент 655976 96-луночный и 781976 384-луночный черный л Greiner 655892 96-луночное и 781892 384-луночное стеклянное дно л Corning® 4850 96-луночная половина площади и 4851 384-луночное стеклянное дно Правильное определение пластины для вашего судна также имеет решающее значение для достижения наилучших результатов. В наиболее сложных случаях вы можете создавать собственные схемы размещения, включая лунки внутри лунок (см. Пользовательское лабораторное оборудование в этом разделе); однако даже самое простое определение пластины требует правильного определенияНижняя отметка а также Нижняя толщина. Определение Нижняя отметка это критический параметр в автоматизации визуализации. Убедитесь, что ваши микропланшеты, предметные стекла и другие сосуды для образцов точно описаны в Gen5. Высота дна является отправной точкой для автофокусировки и помогает предотвратить столкновение объектива с судном. Точная высота дна также сокращает время автофокусировки для каждого изображения. 76 3 - Расширенное руководство по приобретению Что такое отметка дна Поверхность носителя и калибровочная апертура находятся в положении фокуса «0»: высота дна измеряется от 0 до поверхности образца. Важный: Для правильного определения высоты дна требуется хорошее четкое изображение ваших образцов. Примечание: Не используйте Область поиска вертикального тепловизора для определения высоты дна. л В ручном режиме тепловизора вы можете обновить запись типа планшета. Нижняя отметка: развернуть Фокус панель для кнопки. Но имейте в виду, что это глобальное изменение текущего выбранного типа пластины, и ваши изменения повлияют на всех других пользователей, которые используют этот тип пластины. Более безопасный способ создать свою собственную «копию» типа пластины и внести изменения в эту запись типа пластины. 77 3 - Расширенное руководство по приобретению 1. Выберите Система> Типы пластин. 2. Найдите используемый тип плашки и щелкните Просмотр / изменение. «Типы пластин по умолчанию» изменить нельзя: необходимоКопировать их и создайте новое определение пластины с уникальным именем. 3. Нажмите Параметры изображения. 4. В окне «Описание плашки - Параметры изображения»: убедитесь, что Определить нижнюю область фокуса проверяется для установления запретных зон и предотвращения объективных столкновений с перевозчиком, и щелкнуть . 5. При появлении запроса поместите сосуд на держатель или предметный столик тепловизора и нажмите OK. 6. Выберите объектив и куб светодиодного фильтра. Используйте самую сильную длину волны для ваших образцов (например, GFP или DAPI). 7. Подтвердите выбранную по умолчанию лунку, A1, или выберите другую лунку для проведения измерений в различных частях планшета (как описано ниже). 78 3 - Расширенное руководство по приобретению 8. Беги Автоэкспозиция а потом FM сканирование. Когда вы получите определенный пик: нажмитеУстановите высоту фокуса на максимальное соотношение FM. 9. Щелкните Сохранить настройки. Gen5 обновитНижняя отметка ценить. Поправка на изменчивость по пластине Пластик имеет тенденцию к деформации, особенно при помещении в инкубатор; это может вызвать большую вариабельность микропланшета. Например, возможна разница в 200-1000 мкм между A1 и D6 в 96-луночном планшете. Сосуды с более низкой плотностью (например, 6-луночные планшеты) также имеют большую вариабельность по дну планшета. Если вы видите проблему с фокусировкой изображения на пластине, сделайте еще 2–4 измерения в углах и в центре. (На шаге 7 выше выберите каждый из четырех углов: например, A1, A10, D6, H1, H12.) ЗапуститеFM сканирование для каждой лунки (шаг 8 выше) и запишите высоту дна для каждой лунки. Усредните значения, чтобы получить Рекомендуемая высота дна для пластины. Введите среднее значение в полеНижняя отметка поле. Примечание: При использовании куба с лазерной автофокусировкой (LAF) этот процесс не требуется. FM-сканирование Хороший Плохой Хорошие результаты: четко выраженный пик. Сохраните эти настройки для своего Плохие результаты: недостаточный диапазон; пик не обнаружен. Для типа пластины. получения лучших результатов развернитеРасстояние сканирования под Расширенные настройки и повторно запустите сканирование FM. 79 3 - Расширенное руководство по приобретению Определение нестандартного лабораторного оборудования Gen5 предлагает инструменты для создания собственного «пластинчатого типа» или «лабораторного оборудования». Если ваши анализы изображений выполняются на предметных стеклах камеры или других нестандартных микропланшетах, вы можете определить индивидуальное лабораторное оборудование. Для достижения наилучших результатов используйте штангенциркуль для измерения размеров сосуда и / или получите спецификации от производителя. Лучшая практика: начните с существующего типа пластины. При создании новых типов планшетов и лабораторного оборудования легче начать с размеров заранее заданного сосуда, аналогичного новому. Применяются некоторые правила: л Сосуды должны быть одного размера. л Колодцы должны быть одинакового размера л В каждом сосуде должно быть одинаковое количество лунок. Чтобы ускорить процесс, сделайте снимок судна, чтобы использовать его в качестве шаблона: Следуйте инструкциям при загрузке фотографии лабораторного оборудования: Создайте запись о лабораторном оборудовании: 1. Выберите Система> Тип пластины. . 2. Щелкните 3. По возможности выберите существующий тип пластины в качестве ориентира. 4. Если возможно, загрузите фотографию судна для использования в качестве ориентира. При появлении запроса щелкните каждый край лабораторной посуды. 5. Следуйте инструкциям на экране: 80 3 - Расширенное руководство по приобретению Используйте комбинацию "щелчка и перетаскивания" инструмента рисования и заполнения полей размеров приблизительными значениями, чтобы определить новое лабораторное оборудование. Примечание: импортированное изображение используется только для справки и не сохраняется. 81 год 3 - Расширенное руководство по приобретению Поэкспериментируйте с элементами управления, чтобы определить, какие из них подходят вам лучше всего. Часто скрытие изображения упрощает точную настройку размера колодца. Gen5 автоматически помечает вашу готовую запись лабораторного оборудования как «Избранное», что упрощает выбор при определении сеанса. 82 3 - Расширенное руководство по приобретению 83 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 4 - Экспериментальный режим визуализации Автоматизация анализа Лучший выбор: ручной режим или экспериментальный режим? Выберите режим визуализации, который лучше всего соответствует вашим потребностям: Ручной режим, (2.1 - Получение изображения, как показано на странице 22), является хорошей отправной точкой для л точно настроить фокусировку и определить лучшие параметры для применения в эксперименте. Ручного режима достаточно для захвата небольшого количества изображений с низкой пропускной способностью или для анализа с помощью Gen5 или внешней программы. Выберите ручной режим, чтобы снимать фильмы или делать снимки для презентаций. Тип файла Gen5: .IMM л л Объективы с масляной иммерсией и высокой числовой апертурой поддерживаются только в ручном режиме. л Видоискатель вертикального тепловизора доступен только в ручном режиме. Экспериментальный режим - лучший выбор для захвата нескольких изображений и их анализа с помощью Gen5, а также для высокопроизводительной обработки и анализа нескольких планшетов. Поиск и визуализация ОИ возможны только в экспериментальном режиме. Тип файла Gen5: .XPT л Некоторые функции доступны только в экспериментальном режиме: лазерный автофокус, области интереса, маяки и т. Д. Захват изображения в ручном режиме Экспериментальный режим 4.1 - Создание эксперимента по визуализации 4.2 - Разница между экспериментом и протоколом 4.3 - Области интереса и маяки 4.3.1 - Эксперимент по идентификации рентабельности инвестиций 4.3.2 - Добавление маяков для отметки областей интереса 4.3.3 - Менеджер ROI для пакетной обработки 84 85 89 90 91 97 99 4 - Экспериментальный режим визуализации 4.1 - Создание эксперимента по визуализации Три способа создать эксперимент с изображениями: 1. Из сеанса ручного режима (.IMM) (См. Раздел 2.4 - Переход в экспериментальный режим на стр. 31.). 2. Создайте новый эксперимент с нуля из Диспетчер задач: Выбрать Эксперименты> Создать и выберите Стандарт протокол. 3. Создайте новый эксперимент на основе протокола из диспетчера задач. (Узнайте о различиях между протоколами и экспериментами Gen5стр.89.) л Щелкните значок Gen5 на панели инструментов, чтобы открыть диспетчер задач: 85 4 - Экспериментальный режим визуализации Изменение эксперимента После открытия файла эксперимента выполните следующие действия, чтобы улучшить его: 1. Щелкните Процедура. 2. Тип плиты: Выберите готовое определение пластины из раскрывающегося списка «Тип пластины». Отметьте «Использовать крышку», если применимо. (Убедитесь, что определение вашего планшета оптимизировано для ваших образцов(как описано на странице 76).) 86 4 - Экспериментальный режим визуализации 3. Чтобы добавить шаг, щелкните Изображение. 4. Сообщите Gen5, хотите ли вы найти рентабельность инвестиций и, если применимо, как. Примечание: Вы можете поиск ROI а затем изображение они используют любые тепловизор и любой увеличение. 5. Выберите Увеличение (Цель) использовать и определять карту номеров или сохранять Полная тарелка, если это применимо. 6. В зависимости от тепловизора выберите источник света, например, Цвет Светодиодный куб и фильтрующий куб до 4 каналов. 7. Экспозиция: Использовать Автоэкспозицияустановите флажок "Авто" и нажмите кнопку Уэллс кнопка. 8. Выберите как положительные, так и отрицательные лунки (самая высокая и самая низкая интенсивность) для наилучшей автоматической экспозиции. полученные результаты. л Ярлык на карте пластины: вместо выбирая по одной лунке, щелкните заголовок столбца или строки, чтобы выбрать весь блок. л Либо снимите флажок Авто и нажмите для запуска ручного режима и выбора оптимальных настроек экспозиции для каждого канала. 87 4 - Экспериментальный режим визуализации 9. Теперь вы можете обработать все сосуды / планшеты для образцов, используя оптимальные настройки. Щелкните OK, чтобы закрыть шаг чтения. 10. Щелкните значок Читать кнопка. Примечание: Если ваши образцы не в фокусе, вам может потребоваться проверить параметры фокусировки и оптимизировать их (См. 5 - Что такое автофокусировка на странице 102.). Вертикальный тепловизор эксперименты: Фиксированная фокусная высота обычно является хорошим выбором при использовании 2-кратного увеличения. Результаты захвата изображения эквивалентны автофокусу, а фиксированная фокусировка выполняется значительно быстрее. Нажмите Параметры фокусировки чтобы включить эту функцию. 88 4 - Экспериментальный режим визуализации 4.2 - Разница между экспериментом и протоколом Gen5 использует два общих термина для определения отдельных элементов своего инструментария. Различие тонкое и будет иметь большее или меньшее значение в зависимости от того, как вы используете Gen5. В любом случае вы будете работать наиболее эффективно, если поймете каждую роль и заставите ее работать на вас. Протокол (* .prt) Эксперимент (* .xpt) Протокол - это набор инструкций, предназначенных для сбора, У эксперимента есть копия протокола и как минимум один преобразования, составления отчетов и / или экспорта данных. планшет. Он выполняет инструкции, предоставленные протоколом, для получения результатов. Протоколы создаются и сохраняются как отдельные Хотя эксперимент создается с использованием файлы. Они действуют как шаблон; на одном протоколе существующего протокола, этот протокол можно можно проводить неограниченное количество изменить в рамках эксперимента. экспериментов. Протокол состоит из требований к считыванию, таких как метод Проведение эксперимента - единственный способ обнаружения и длина волны, и действия, связанные со обработать протокол. считыванием, такие как встряхивание и инкубация (процедура), В Прочитай сейчас кнопка доступна после того, как в расположение планшета, сокращение данных, а также просмотр данных, отчетность и экспорт. протоколе был определен шаг чтения; С его помощью параметры. создается эксперимент, основанный на протоколе. Протокол можно многократно использовать (как есть или В эксперименте можно обрабатывать несколько планшетов, каждый модифицировать) в рамках экспериментов. Сам по себе из которых считается уникальным анализом с независимо протокол не дает результатов. Протоколы не имеют сообщаемыми или экспортированными результатами. связанных с ними табличек. . prt - это расширение имени файла протокола. . xpt - это расширение имени файла эксперимента. Изменения, внесенные в автономный протокол, не В рамках эксперимента вы можете выбрать Сохранить отражаются ни в каких ранее созданных экспериментах, протокол как для захвата текущих сведений о основанных на этом протоколе. Чтобы применить измененный протоколе и сохранения их либо как нового протокола, протокол, необходимо создать новый эксперимент. либо как перезаписи исходного протокола. Дополнительные сведения см. В справочной системе Gen5. 89 4 - Экспериментальный режим визуализации 4.3 - Области интереса и маяки Доступны два различных метода для определения и визуализации областей интереса (ROI) в эксперименте: 1. Эксперименты по идентификации рентабельности инвестиций: Обнаружение областей интереса с малым увеличением и изображений с большим увеличением. (Требуется Gen5 v.3.09 или выше.)См. 4.3.1 - Эксперимент по определению рентабельности инвестиций на следующей странице.. 2. Добавьте маяки, чтобы пометить РИ: Поместите маяк на каждую РИ в каждой лунке отдельно при создании эксперимента Gen5. (Требуется Gen5 v.3.08 или выше.)См. 4.3.2 - Добавление маяков для отметки областей интереса на стр. 97. 3. Пакетная обработка ROI: Использование укладчика планшетов BioStack для обработки нескольких слайдов или микропланшетов, содержащих области интереса. (Требуется Gen5 v.3.10 или выше.)См. 4.3.3 - Менеджер ROI для пакетной обработки на стр.99. Преимущества каждого варианта визуализации ROI Маяки Рентабельность инвестиций Шаг интерактивного обнаружения для поиска рентабельности инвестиций дает Простое одноэтапное определение рентабельности инвестиций (после перехода к пользователям полный контроль каждой лунке) Представление всего планшета упрощает идентификацию лунок с ROI Все РИ одинакового размера и формы Нестандартные размеры и формы Отображаются обе скважины с рентабельностью инвестиций и без нее. См. 4.3.2 - Добавление маяков для отметки областей интереса на стр. 97 См. 4.3.1 - Эксперимент по определению рентабельности инвестиций на следующей странице. 90 4 - Экспериментальный режим визуализации 4.3.1 - Эксперимент по идентификации рентабельности инвестиций Требуется Gen5 версии 3.09 или выше. Функция «Области интереса» (ROI) Gen5 представляет собой трехэтапный процесс: 1. Шаг открытия: сканирование образца с малым увеличением, чтобы вы могли видеть всю область образца. 2. Определение рентабельности инвестиций: пользователь рисует прямоугольник или полилинию, чтобы определить области интереса в каждой лунке. 3. Рентабельность инвестиций захвачена: Gen5 отображает определенные области интереса с большим увеличением (обычно). Отображаются только скважины с определенной рентабельностью инвестиций; пустые лунки пропускаются. Пошаговое обнаружение рентабельности инвестиций и визуализация 1. Создайте новый эксперимент с этапом визуализации и скажите Gen5 найти рентабельность инвестиций. 2. Выберите имидж-сканеры для выполнения шагов по обнаружению и визуализации. 3. Определите параметры изображения: объектив и цветовой канал. 4. Во-первых, на этапе обнаружения определите все потенциальное поле для ROI. Использовать Монтаж полностью ярлык, чтобы закрыть весь колодец, если это необходимо. Нажмите Полная тарелка для ограничения снимаемых скважин, если применимо. Этот параметр будет исправлен для визуализации ROI, за исключением того, что отображаются только лунки с одной или несколькими определенными ROI. 91 4 - Экспериментальный режим визуализации 5. Сохраните настройки по умолчанию в диалоговом окне «Настройка области интереса», по крайней мере, на начальном этапе. Вы можете настроить Маржа ROI после получения некоторого опыта в процессе. 6. Задайте этап получения изображения с желаемым увеличением и цветовыми каналами. НажмитеПодтвердить чтобы убедиться, что процедура может быть выполнена в соответствии с определением. 7. Прочтите табличку. 92 4 - Экспериментальный режим визуализации Шаг открытия ROI 1. На Матрица идентификации ROI, щелкните лунку, чтобы определить ее ROI. 93 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 4 - Экспериментальный режим визуализации 2. Сохранить изменения для каждой индивидуальной скважины. 3. Когда все области интереса определены, нажмите РИ изображений. 94 4 - Экспериментальный режим визуализации ROI - Часто задаваемые вопросы Хорошо знать: л Gen5 отображает только лунки / сосуды с определенной рентабельностью инвестиций; скважины, не имеющие рентабельности инвестиций, пропущено. л Первоначальный шаг изображения в процессе, изображение ROI Discovery (обычно снимаемое с низким увеличение для наибольшего поля зрения) сохраняется вместе с экспериментом. Его можно просматривать, составлять отчеты и экспортировать. л Gen5 применяет свое стандартное соглашение об именах к ROI: Well Name-ROI: ROI-index л Статистика изображений может быть представлена для отдельной области интереса и / или суммы / среднего значения Все РИ в хорошо. Однако метрики объектного уровня не поддерживаются. Когда это возможно, использование опции «Каждая рентабельность инвестиций» позволяет сэкономить время при составлении отчетов обо всех рентабельности инвестиций по отдельности. л Метки времени: как и для монтажа и захвата z-стека, Gen5 сохранит одну метку времени для всех изображения / ROI в скважине. Это время будет использовано для проведения кинетического анализа. Точно так же с точками данных температуры Gen5 будет хранить по одной на лунку. л Автофокусировка может выполняться один раз на лунку в самой центральной области интереса или для каждого захваченного изображения, области интереса или плитки монтажа в лунке. 95 4 - Экспериментальный режим визуализации л Кинетическая покадровая визуализация: кинетическая петля может быть добавлена к процедуре ROI после определения шага визуализации. л Статистика изображений при увеличении изображения: выделенные точки данных сообщаются из метаданных изображения, а не из измерения текущей области интереса. Высота и ширина зависят от самого .tiff, а не от размеров области интереса. См. Также Просмотр ОИ на стр. 100. 96 4 - Экспериментальный режим визуализации 4.3.2 - Добавление маяков для отметки областей интереса Требуется Gen5 версии 3.08 или выше. По умолчанию Gen5 делает снимки в центре колодца. Два способа изменить положение X / Y области захвата в эксперименте: л Маяки: для определения областей интереса, когда рентабельность инвестиций варьируется от скважины к скважине. Маяки могут быть полезен в кинетических анализах, например, когда клетки отошли от центра. л Горизонтальные и вертикальные смещения: когда интересующая область не находится в центре скважины, а находится в одной и той же области (координаты X / Y) каждой лунки. Маяки или смещения можно использовать в анализах царапины, когда царапина смещена от центра. Определение маяков - ROI Вместо того, чтобы фиксировать центр колодца, вы можете захватить одну или несколько областей интереса на судне, пометив их маяком. Маяк указывает горизонтальный и вертикальный (x / y) смещения в скважине. Примечание: Чтобы определить такое же смещение для все колодцы, используйте Горизонтальное смещение от центра колодца а также Вертикальное смещение от центра колодца параметры. 1. В диалоговом окне «Шаг считывания изображения» установите Задача а также Цвет и выберите Определить маяки, затем щелкните к определить маяки. Gen5 запускает специальный сеанс ручного режима, чтобы вы могли определять маяки. При необходимости используйте инструменты фокусировки и экспозиции. 97 4 - Экспериментальный режим визуализации Вы можете изменить увеличение (меньшее или большее) и / или цвет при распознавании маяков, если это необходимо. 2. Щелкните значок Хорошо кнопку, чтобы выбрать колодец, в котором вы хотите определить маяки. 3. Перейдите к области интереса с помощью инструментов навигации. Например, используя карту скважины, щелкните внутри схемы скважины, чтобы перейти к соответствующему месту в скважине, затем,щелкните само изображение, чтобы разместить маяк. + Красный крест на самом изображении и красный крест на карте колодца обозначают место расположения маяка. Несколько способов назначать маяки и управлять ими: л Щелкните внутри самого изображения, чтобы определить ROI / маяк. л Щелкните карту колодца, чтобы перейти к этой области. колодца. Gen5 обновляет координаты, чтобы определить ваше местоположение. л Используйте кнопки со стрелками вокруг карты колодца, чтобы двигаться в этом направлении. 4. Gen5 активирует элементы управления несколькими маяками после определения маяков. Используйте верхний элемент управления для оценки и изменения выбора маяка. 5. Чтобы определить маяки в другом колодце, повторите шаги 2–4. 6. Когда вы закончите определять маяки на этой пластине, щелкните Сохранить настройки. 98 4 - Экспериментальный режим визуализации На этапе чтения нажмите кнопку планшета, чтобы посмотреть, где определены маяки. Наведите указатель мыши на колодец, чтобы увидеть его смещения. Хорошо знать: л Статистика изображений может быть представлена для отдельной области интереса и / или суммы / среднего значения Все РИ в хорошо. Однако метрики уровня объекта не поддерживаются для нескольких маяков / областей интереса. Когда он доступен, опция «Каждая рентабельность инвестиций» позволяет сэкономить время при составлении отчетов по каждой рентабельности инвестиций по отдельности. л Gen5 применяет свое стандартное соглашение об именах к ROI: Well Name-ROI: ROI-index л Максимальное количество маяков - 255. л Когда маяки не назначены для скважины, Gen5 захватывает изображение для этого колодца, как обычно, в центр колодца. л Регистрация кинетического изображения: при этом будет использоваться ближайший к центру колодца маяк. опция включена. л Метки времени: как и для монтажа и захвата z-стека, Gen5 сохранит одну метку времени для всех изображения / ROI в скважине. Это время будет использовано для проведения кинетического анализа. Точно так же с точками данных температуры Gen5 будет хранить по одной на лунку. л Автофокусировка может выполняться один раз на лунку на самом центре маяка или для каждого захваченного изображения в лунке. 4.3.3 - Менеджер ROI для пакетной обработки Требуется Gen5 версии 3.10 или выше. Менеджер ROI, особенно полезный для сканирования слайдов и аналогичных анализов с использованием укладчика планшетов BioStack, сохраняет исходные изображения обнаружения и захваченные ROI вместе с экспериментом. При использовании BioStack все планшеты в исходной партии визуализируются один раз на этапе обнаружения. Затем менеджер ROI представляет каждую пластину для идентификации ROI. Когда все области интереса идентифицированы, области интереса захватываются на этапе изображения, одна пластина за другой. 99 4 - Экспериментальный режим визуализации Хорошо знать л Вы можете добавлять новые планшеты в партию: при обработке дополнительных планшетов в эксперименте Gen5 добавляет их в текущую партию, перезапуская процесс только для этих добавленных пластин. л л Во время пробежки нажмите Подробности в окне состояния, чтобы отслеживать прогресс. Слайды / лунки и планшеты без определенных областей интереса не отображаются. Gen5 пропускает планшеты в партии, у которых нет рентабельности инвестиций идентифицированы после шага обнаружения. В конце запуска отображается сообщение, подтверждающее это действие. Просмотр РИ Области интереса обрабатываются / обрабатываются так же, как и другие захваты нескольких изображений, например, монтаж, кинетика. Gen5 открывает окно управления ROI после захвата и обработки, чтобы вы могли просмотреть каждую отдельную ROI. Как и другие многоиндексные наборы данных, отдельные изображения можно просматривать и анализировать, но некоторые функции могут выполняться только для «всех» областей интереса. Gen5 ожидает, что ROI, захваченная с большим увеличением, будет монтажом, и поэтому всегда предоставляет возможность обработки сшивания изображений. Монтаж должен быть сшит до того, как Gen5 сможет их проанализировать. 100 4 - Экспериментальный режим визуализации 101 5 - Что такое автофокус Как выбрать правильный метод для анализа Gen5 предлагает два разных типа автофокусировки: автофокусировку на основе изображения (программную) и автофокусировку на основе лазера. Выбор правильной настройки зависит от конфигурации вашей системы и биологии ваших колодцев. Для простоты использования можно без изменений использовать настройки по умолчанию на основе изображений. Выбор метода автофокусировки оказывает значительное влияние на ваш анализ как на надежность получения сфокусированного изображения, так и на общее время анализа. Параметры автофокусировки на основе изображений и обученные пользователем входят в стандартную комплектацию всех инструментов. Лазерный автофокус требует дополнительного аппаратный аксессуар. 103 110 5.1 - Методы автофокуса 5.2 - Лазерный автофокус 102 5 - Что такое автофокус 5.1 - Методы автофокуса Gen5 предлагает 5 различных алгоритмов автофокусировки на основе изображений, описанных ниже. Для большинства методов визуализации хорошо работают настройки по умолчанию, за исключением тех случаев, когда определенные обстоятельства требуют дополнительной оптимизации. Gen5 применяет настройки по умолчанию для шага считывания изображений в зависимости от увеличения объектива. Ручной режим Экспериментальный режим В ручном режиме разверните а также Выбрать Расширенные настройки при захвате одномерного изображения: для мульти- или щелкните размерные изображения, например, кинетические. Параметры автофокуса Примечание: Использовать метод фокусировки по умолчанию а также Использовать настройки метода фокусировки по умолчанию: Настройки по умолчанию основаны на выбранной цели. Если вы измените цель, не забудьте сбросить эти флажки, чтобы повторно применить настройки по умолчанию для текущей цели. По умолчанию Gen5 использует канал 1 на этапе чтения в качестве канала фокуса и применяет эту фокальную плоскость ко всем остальным каналам; поэтому важно выбрать наиболее устойчивый сигнал для канала 1. По возможности лучше всего подходит ядерное контрастное окрашивание (DAPI, Hoechst, Draq5) или, в качестве альтернативы, канал с наиболее сильным сигналом и наименьшей изменчивостью от скважины к скважине. 103 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 5 - Что такое автофокус Только экспериментальный режим Когда ваш анализ включает в себя сигналы в каждом канале, которые не имеют той же фокальной плоскости, что и канал 1, вы можете либо применить заранее определенное смещение к каждой лунке, либо выполнить отдельный этап автофокусировки для каждого канала. Настройте это, нажав Параметры под каждым каналом и с помощью элементов управления в верхней части диалогового окна. Методы автофокусировки на основе изображений Метод автофокуса 1 2 Краткое описание Автофокус с Метод Gen5 по умолчанию для флуоресценции: Поиск небольшой области с расширением до дополнительное сканирование более крупного сканирования, если оптимальное соотношение FM не достигнуто. Сканирование, затем AF Сканирует большую область, затем выполняет автофокусировку в области пика. Это требует больше всего времени, но может быть наиболее точным для сложных или необычных систем. 3 Автофокус без сканирования Самый быстрый способ, когда уже доказано, что настройки фокусировки позволяют получать хорошие изображения. Это хороший вариант, когда колодцы малонаселены. 4 Яркий автофокус Метод Gen5 по умолчанию для светлого поля: Работает как «Автофокус с дополнительным сканированием», но оптимизирован для двойного пика, обнаруживаемого в светлых полях и изображениях с фазовым контрастом. 5 Обученный пользователем AF Основываясь на эталонном изображении, Gen5 «обучен» распознавать предпочтительную фокальную плоскость относительно пика сканирования. Этот метод занимает больше всего времени. (Узнайте об автофокусировке, обученной пользователем, в справке Gen5.) 104 5 - Что такое автофокус Временная шкала автофокуса См. Также 5.2 - Лазерный автофокус на стр. 110.. 105 5 - Что такое автофокус Объяснение автофокусировки на основе изображений Методы автофокусировки на основе изображений работают путем получения серии изображений через ряд Z-плоскостей для определения положения с наивысшей «метрикой фокусировки» или «FM». Метрика фокуса - это число, используемое для оценки того, насколько хорошо оптическая система была сфокусирована при съемке изображения (или насколько резкими являются отдельные элементы изображения). Во время автофокусировки на основе изображений Gen5 перемещает объектив по оси z, начиная с нижней отметки пластины, и делает три изображения. Коэффициент FM рассчитывается для каждого изображения. Основываясь на этой информации, Gen5 определяет, где метрика фокуса достигает максимума (наилучшее изображение), перемещает объектив в это положение и делает следующее изображение. Процесс повторяется до тех пор, пока не удастся добиться значительного улучшения FM. В этой позиции делается окончательное изображение. Это называется «поиском» или просто «автофокусом». Иногда первоначальная оценка начальной точки автофокусировки может быть неправильной, и «Поиск» не выполняется. В этом случае можно выполнить сканирование метрики с широким фокусом, чтобы найти местоположение по оси Z, в котором метрика фокусировки достигает своего максимума. Этот процесс называется «сканированием». В вашем методе автофокусировки также можно настроить дополнительные параметры, включая расстояние сканирования и шаг сканирования, параметры автоэкспозиции и минимальный коэффициент FM. Эти параметры можно отрегулировать для оптимизации скорости или адаптации к сложной биологии. Чтобы оптимизировать скорость и попрактиковаться в настройке этих параметров, попробуйте выполнить упражнение, указанное ниже, в сравнении с настройками по умолчанию. Объективы перемещаются по оси Z в сторону оптимальной фокусировки. 106 5 - Что такое автофокус 107 5 - Что такое автофокус Ускорение процесса фокусировки При использовании малого увеличения как с вертикальным, так и с перевернутым формирователем изображения, например, 1,25X или 2,5X, с большой глубиной резкости, установка «Фиксированной фокусной высоты» (вверху экрана) - лучший способ ускорить автофокусировку. Экономьте время, ускоряя процесс фокусировки в своих экспериментах. Сначала откройте этап «Читать» в своем эксперименте и нажмитеВарианты фокусировки для первого канала (DAPI на изображении выше): 1. Отмените выбор обоих Использовать метод фокусировки по умолчанию а также настройки. 2. Изменить Метод фокусировки на «Автофокус без дополнительного сканирования». 3. Измените % экспозиции захвата для фокуса до 50. 108 5 - Что такое автофокус 4. Под Параметры автоэкспозиции, Уменьшить Целевое воздействие% между 35-45. Это немного недоэкспонирует изображения, но сохранит достаточный динамический диапазон. 5. Снимите флажок Использовать порог интеграции по умолчанию, и установите Порог интеграции (мсек) до 50. Это экономит время сбора данных, сначала увеличивая усиление камеры и яркость светодиода. 6. Примените эти настройки к другим каналам, установив для них: Фокусная высота от первого канала (+ смещение) вверху экрана. 109 5 - Что такое автофокус 5.2 - Лазерный автофокус BioTek предлагает дополнительный аксессуар для лазерной автофокусировки - широко используемую альтернативу автофокусировке на основе изображений. Лазерный автофокус, особенно в режиме яркого поля, обычно более надежен, с лучшей воспроизводимостью, что делает его рекомендуемым вариантом при создании фильмов или слайд-шоу. В отличие от методов автофокусировки на основе изображений, которые требуют получения и сравнения нескольких изображений, лазерная автофокусировка обычно использует только одно изображение на лунку для определения оптимальной фокусировки. Преимущества по сравнению с методами автофокусировки на основе изображений: л Скорость л Более низкая фототоксичность л Поддержка кинетического анализа с лучшей воспроизводимостью л Повторяемость Также важно знать: л Лазерный автофокус доступен только в режим эксперимента. л Лазерный автофокус поддерживается с фазовыми и стандартными объективами 4X-60X. Короткое рабочее расстояние объективы не поддерживаются (например, масляная иммерсия, некоторые APO и т. д.) л Не рекомендуется для движущихся биологических объектов: если клетки движутся в направлении Z, этот метод может не попасть в желаемую фокальную плоскость. л л Днища тарелок должны быть идеально чистыми. Не используйте пластиковые микропланшеты с 10-кратным увеличением. Различия в толщине пластины приводят к достаточным отклонениям отраженного света, чтобы прервать процесс автофокусировки. Для получения наилучших результатов используйте стеклянные пластины, особенно при использовании объектива 10X. Предпосылка: Установите кубик лазерной автофокусировки, как показано на странице 193. Как это работает - лазерный автофокус 1 Ссылка на захват Пользователь находит желаемый фокус для своего образца. Gen5 активирует Сканировать лазерный куб для сканирования окружающей высоты Z и отмечает положение желаемого фокуса. 2 Gen5 сравнивает и Во время считывания пластины лазер маркирует пятно и делает снимок. Gen5 сравнивает Выравнивает изображение с эталонным сканированием и перемещает объектив вверх или вниз (ось z) по мере необходимости, чтобы точно соответствовать фокусу эталонного сканирования. 3 Повторить Процесс фокусировки повторяется в каждой лунке планшета. 110 5 - Что такое автофокус Как использовать лазерный автофокус 1. Создайте новый эксперимент с этапом считывания изображений. 2. Выберите объектив и цветовой канал. 3. 4. Рекомендуется: вручную определить оптимальное Экспозиция настройки (как обычно). 5. Щелкните Варианты фокусировки. 5. В окне «Автофокус» снимите флажок Использовать метод фокусировки по умолчанию. 6. Установите Метод фокусировки на «Лазерный автофокус». 7. Следуйте подсказке Gen5, чтобы сделать снимок эталонного сканирования сейчас (или нажмите кнопку, чтобы выполнить этот шаг позже). Перед сканированием кнопка обрамлена красной рамкой. Чтобы повторить сканирование, нажмите кнопку еще раз. 8. Выберите Хорошо с лучшим сигналом, и сосредоточьтесь на образце, как вы бы как обычно. 9. Когда качество изображения вас удовлетворит, нажмите Сохранить настройки на «Захват эталонного сканирования». Это определяет оптимальное положение фокуса объектива для считывания пластинки. Для достижения наилучших результатов всегда делайте или повторно снимайте эталонное сканирование для каждого эксперимента, чтобы обеспечить точное позиционирование, особенно с мощными объективами. От партии к партии микропланшеты могут иметь разные допуски по толщине дна. Выполните обычный эксперимент с Gen5, например, прочитайте планшет. Gen5 определит и применит смещение объектива к образцу для каждой лунки в планшете. 111 5 - Что такое автофокус Устранение неполадок лазерной автофокусировки Важный:Не используйте пластические микропланшеты10Xpower цель. Используйте стеклянные пластины для достижения наилучших результатов. Gen5 обеспечивает варианты для тонкая настройка лазер автофокус когда дефолт настройки делать не производить удовлетворительно изображений. Прочтите параметры пошаговой автофокусировки Первый, просмотреть ссылку отсканируйте (пример ниже), чтобы определить проблему. В зависимости от увеличения объектива вы должны увидеть один или два четко определенных пика в середине диапазона сканирования датчика (ось x); один пик с высокой интенсивностью пикселей и второй пик с более низкой интенсивностью. л Если интенсивность пикселей любого пика превышает 50 000, образец может быть переэкспонирован. Захватить заново сканировать и, при необходимости, Отменить настройки лазерной экспозиции чтобы настроить их вручную. л Отсутствие пиков может указывать на недостаточную экспозицию, что в любом случае требует перефокусировки: повторно сделайте снимок эталонного сканирования. Если проблема не исчезнет, увеличьте настройки экспозиции. 112 5 - Что такое автофокус л Некоторые микропланшеты не отражают лазерный свет и не могут использоваться в этом приложении. Плохие или непоследовательные результаты захвата изображения: "Отключить использование фокальной плоскости из предыдущей лунки "предназначен для предотвращения искажения значений фокусировки плохой лункой для всех последующих лунок. Лазерная автофокусировка обычно ссылается на предыдущую лунку в качестве начальной точки фокуса. Если, например, загрязнение на дне планшета сбивает лазер с толку, эта опция ограничивает проблему до Он говорит Gen5 полагаться на отметку дна в качестве начальной точки. Расфокусированные изображения Для всех методов автофокусировки, когда все попытки захватить изображения, соответствующие текущим настройкам, терпят неудачу, Gen5 берет наилучшее или максимально близкое изображение. Таким образом, методы автофокусировки Gen5 могут получать изображения не в фокусе или изображения, не соответствующие критериям. Когда это происходит, Gen5 отмечает лунку красной рамкой в матрице вида планшета. 113 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 6 - Обработка изображений Оптимизация вашего изображения Обработка изображений относится к математической модификации изображений для улучшения их качества. BioTek дает вам полный контроль над вашими изображениями и данными, таким образом,изображения, представленные сразу после получения, действительно необработанные. Вы можете применить любой из нескольких методов обработки для улучшения изображения с точки зрения эстетики и / или анализа. В зависимости от типа получения изображения эти методы включают: л Предварительная обработка изображения (выравнивание и сглаживание фона) л Деконволюция л Цифровой фазовый контраст л Сшивание изображений (покрыто 3.3 - Монтаж изображения, как показано на странице 48) л Z-проекция (покрыта 3.4 - Z-укладка, как показано на странице 57) л Кинетическое выравнивание кадра (описано в 3.5 - Захват кинетического изображения, как показано на странице 62) После сбора данных в ручном или экспериментальном режиме сразу становится доступным окно управления яркостью и контрастностью (B&C). Модификации B&C никоим образом не изменяют ваши исходные данные. Чтобы добавить другие этапы обработки, выберитеПроцесс (как показано ниже). Варианты обработки, относящиеся к приобретенному вами представлены изображения. 117 118 119 122 6.1 - Инструменты аннотации 6.2 - Предварительная обработка изображения 6.3 - Цифровой фазовый контраст 6.4 - Деконволюция 114 6 - Обработка изображений Ручной режим 115 6 - Обработка изображений Экспериментальный режим Или: Добавить Сжатие данных шаг к эксперименту (или протоколу): 116 6 - Обработка изображений 6.1 - Инструменты аннотации Стандартные программные инструменты для добавления примечаний к изображениям предлагаются после того, как вы сделали снимок. Их также можно использовать для аннотирования графиков и других элементов набора данных Gen5. Панель инструментов аннотаций Когда присутствует панель инструментов, вы можете добавлять заметки, чтобы привлечь внимание к интересующим областям изображения или диаграммы. Примените сетку, чтобы лучше идентифицировать объекты. Показывайте размер объектов с помощью инструмента «Измерение» и т. Д. Эти инструменты могут улучшить ваши отчеты и анализ результатов. Чтобы использовать инструменты аннотации: 1. Щелкните и перетащите по изображению. 2. Захватите узлы элемента, чтобы изменить их размер. 3. Наведите курсор на инструмент позиционирования, чтобы переместить его. 4. Дважды щелкните элемент, чтобы изменить его "Характеристики. " 5. Щелкните правой кнопкой мыши контекстно-зависимый меню. Выбирать Характеристики к изменить цвет и другие элементы предмета. Из контекста Меню аннотаций, вы можете " Группа"несколько аннотаций, чтобы переместить или скопировать их. После использования инструмента для добавления элемента к изображению (например, эллипса, показанного выше) щелкните элемент правой кнопкой мыши и выберите Характеристики изменить его внешний вид. Аннотации сохраняются вместе с изображениями, которые сохраняются для презентации; в фильмах, снятых на основе кинетических чтений; а также в отчетах и экспорте. 117 6 - Обработка изображений 6.2 - Предварительная обработка изображения Этап предварительной обработки изображения Gen5 сглаживает фон и края объектов, чтобы создать более чистое и резкое изображение. Вычитание фона использует алгоритм катящегося шарика, в котором область определенного размера («катящийся шарик») перемещается по изображению. Внутри области все интенсивности пикселей усредняются, и это среднее значение вычитается из каждого пикселя. В отличие от изменений яркости и контрастности, предварительная обработка изображенияизменяет ваши данные. Используйте инструмент «Профиль линии», чтобы оценить размер и показать сравнительную яркость пикселей. Это полезно для определения оптимального диаметра катящегося шарика. Фон: При предварительной обработке изображений слабый сигнал, например фон, удаляется, создавая темный фон. Однако при неудачно выбранном размере катящегося шарика допустимый сигнал также может быть удален. Настройки по умолчанию: примерно в 3 раза больше обычных предметов. Отредактируйте шаг предварительной обработки изображения и снимите флажок «Авто”, Чтобы настроить размер катящегося шарика. Сглаживание: на этом шаге также можно добавить метод удаления шума по периметру объекта. При сглаживании каждый пиксель заменяется в среднем 9 пикселями (шаблон 3x3), процесс, который можно повторять до тех пор, пока линии периметра не будут более равномерно повторять истинную форму объекта. 118 6 - Обработка изображений 6.3 - Цифровой фазовый контраст Требуется программное обеспечение Gen5 Image + или Image Prime Изображения светлого поля можно улучшить с помощью Цифровой фазовый контраст обработки, особенно при использовании 96- или 384луночных планшетов. Цифровой фазовый контраст устраняет «эффект мениска», который возникает при визуализации в проходящем свете (например, фазовый контраст и яркое поле) на пластинах с высокой плотностью. Цифровой фазовый контраст корректирует неравномерное освещение и эффект ореола, который наблюдается в противном случае. Gen5 выполняет три шага для применения цифрового фазового контраста к полученным изображениям: 1. Инвертирует изображение светлого поля (делая его похожим на фазово-контрастное изображение). 2. Фильтрует изображение, используя «Размер элемента структурирования». 3. Регулирует контраст изображения. При использовании 96- или 384-луночных планшетов вы можете получить лучшие результаты, получая изображения в ярком поле и обрабатывая их с помощью цифрового фазового контраста, чем получение изображений в стандартном режиме фазового контраста. Как применить цифровой фазовый контраст: После получения изображений с ярким полем Gen5 предоставляет возможность обрабатывать их с помощью Цифровой фазовый контраст. Применять Цифровой фазовый контраст: л В ручном режиме нажмите Добавить шаг в Область обработки изображения (показана ниже). л В экспериментальном режиме определите Сжатие данных шаг (показан справа). Экспериментальный режим Ручной режим После добавления шага обработки повторно выберите изображение в История изображений и выберите Изменить шаг чтобы изменить размер элемента. 119 6 - Обработка изображений Установите размер элемента структурирования Установить Размер элемента структурирования чтобы соответствовать размеру интересующих объектов на изображении. л Слишком большой = геометрические артефакты исказят изображение. л Слишком маленький = истинный сигнал в сэмпле будет потерян. Примечание: чем больше размер элемента, тем больше времени занимает обработка. Цифровой фазовый контраст и размер элемента структурирования показаны Ниже приведено иллюстрированное объяснение того, как процесс «Структурирование элемента» улучшает изображения с цифровым фазовым контрастом. В то время как мы показываем концепцию с использованием 2D-изображений, в реальном приложении Gen5 использует 3Dповерхности, где интенсивность изображения находится на оси Z. Gen5 масштабирует изображение, чтобы покрыть полный динамический диапазон. 1. Исходное изображение: темные предметы на светлом фоне. 2. Перевернутое изображение: светлые объекты на темном фоне 3. Структурирующий элемент (SE) скользит под профилем изображения, чтобы установить фон (горизонтальные линии на этом 2D-изображении). 120 6 - Обработка изображений 4. Фон, найденный на предыдущем шаге. (Объекты меньше SE были удалены.) 5. После вычитания фона интересующие объекты светятся на темном фоне. На последнем этапе Gen5 масштабирует изображение, чтобы покрыть полный диапазон яркости от нуля (полная темнота) до максимальной интенсивности. 121 6 - Обработка изображений 6.4 - Деконволюция Деконволюция (Ричардсон-Люси) устраняет ошибку «размытия», вызванную оптической системой и определяемую функцией рассеяния точки (PSF). Gen5 выполняет деконволюцию на одном изображении (2-D) с использованием конкретных значений. (XML-файл каждой цели хранит свое значение сигмы для стандартного отклонения ядра Гаусса.) Ядро увеличивает общий шаг резкости области, а Stdev определяет, насколько резкость в этой области. Перед деконволюцией После деконволюции Для большинства пользователей Gen5 вариант «Авто» - лучший выбор. Визуализаторы BioTek стабильны во времени, поэтому поправочный коэффициент, установленный на заводе-изготовителе для каждой цели, является безопасным выбором. Кроме того, вы можете поэкспериментировать со значениями коррекции, примененными к изображению, чтобы попытаться улучшить его. 122 6 - Обработка изображений 123 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 7 - Базовый анализ изображения Получение количественных данных из ваших изображений Gen5 Image + и Image Prime поддерживают эти функции Базовый анализ изображений помогает идентифицировать интересующие объекты, сообщать о желаемых показателях и группировать их. на значимые субпопуляции. 128 130 133 134 141 7.1 - Основная маска и подсчет 7.2 - Расчетные показатели 7.3 - Анализ субпопуляции 7.4 - Детали клеточного анализа 7.5 - Определение плагина изображения Для начала щелкните Анализировать в Ручной режим: 124 7 - Базовый анализ изображения Увеличить изображение Экспериментальный режим: 125 7 - Базовый анализ изображения Инструмент анализа 126 7 - Базовый анализ изображения Если параметры по умолчанию не идентифицируют объекты в достаточной степени, или вы хотите добавить метрики или создать более подробный анализ, нажмите Параметры (под кнопкой Пуск). Кроме того, если вы хотите сравнить результаты анализа по нескольким лункам, вы можете «Добавить набор изображений» в нижней части окна, чтобы выбрать дополнительные лунки (например, положительный и отрицательный контроли). «Параметры» открывает инструменты сотового анализа: 1. Первичная маска и счет предоставляет инструменты для установки самого широкого определения вашего объекта, например ядер в клетках млекопитающих. Начните с измененияПорог и размер объекта, если настройки по умолчанию неправильно идентифицируют ваши объекты. 2. Вторичная маска доступно только в том случае, если вы приобрели Gen5 Image Prime и позволяет проводить более подробный анализ изображений с высоким содержанием. 3. Расчетные показатели позволяет вам выбрать показания, которые будут генерировать значимые данные для вашего анализа. 4. Анализ субпопуляции позволяет вам определять подгруппы ваших объектов с помощью операторов И / ИЛИ и выбирать данные, которые вы хотите сгенерировать для этих групп. 127 7 - Базовый анализ изображения 7.1 - Основная маска и подсчет В Cellular Analysis изображения можно анализировать на предмет детализации на уровне ячеек, таких как размер объекта, интенсивность и округлость. Gen5 сообщает общее количество всех идентифицированных объектов на изображении, определяя их с помощью первичной маски. Самый важный параметр для идентификации всех ваших объектов - это порог. Порог устанавливает минимальное значение интенсивности пикселей для интересующего сигнала.. Порог определяет, какие пиксели включить в маску объекта. Когда применяется порог 10 000, например, только объекты с интенсивностью пикселей от 10 000 до макс. 65 520 идентифицируются и обводятся маской. Если порог был увеличен до 20000, размер маски объекта уменьшится или исчезнет, поскольку только пиксели от 20000 до 65 520 включены. На изображениях ниже показано поведение маскировки при двух порогах: Вы можете ясно видеть, что при увеличении порога в подсчет включается меньше объектов. Любое изображение с флуоресцентной меткой может быть каналом обнаружения и использоваться для установки порога маски обнаружения для целей измерения. Маска, установленная в одном канале обнаружения, клонируется на все нисходящие каналы, чтобы можно было проводить измерения интенсивности. Как правило, ядерный ДНК-связывающий краситель, такой как Hoechst или DAPI, является основным каналом обнаружения для ядерной маски (как указано выше Примеры). Однако в некоторых случаях требуется маска на основе окраски цитоплазмы или целых клеток. Чтобы определить порог: Используйте инструмент профиля линии проследить несколько репрезентативных областей изображения для определения начального пороговое значение. Инструмент «Профиль линии» предлагает «25% = значение» в качестве начального порогового значения. Когда анализируются несколько изображений или наборов изображений (как в ручном, так и в экспериментальном режиме), ко всем анализируемым изображениям применяется одно и то же пороговое значение, чтобы можно было сравнивать данные между изображениями. Используйте инструмент «Линия» для нескольких изображений, которые представляют динамический диапазон образцов или анализа, например для положительных и отрицательных контролей. Поскольку ко всем изображениям будет применяться один и тот же порог, оптимизация порога на основе максимальной интенсивности изображений обычно дает лучшие аналитические результаты. 128 7 - Базовый анализ изображения Советы по передовой практике: л В Разделить соприкасающиеся объекты Функция рекомендуется в приложениях, где важен номер объекта, например при исследованиях пролиферации, цитотоксичности или миграции для разделения двух или более объектов, маски которых соприкасаются. Функция «Разделять соприкасающиеся объекты» может быть бесполезной или рекомендованной в приложениях, где маска задается цитоплазматическими красителями или многоклеточными структурами. л С использованием Включить краевые объекты в клеточном анализе зависит от приложения. Для приложений, включающих подсчет объектов, пользователь должен решить, следует ли включать или исключать граничные объекты; Gen5 применяет правило ко всем наборам изображений. Когда важны измерения площади, рекомендуется исключить краевые объекты, так как ячейки на краю изображения являются неполными и могут исказить аналитические результаты. 129 7 - Базовый анализ изображения 7.2 - Расчетные показатели Gen5 может генерировать широкий спектр количественных данных из ваших изображений. ВыберитеРасчетные показатели Вкладка, чтобы выбрать релевантные для вас показатели. Нажмите «Выберите или создайте интересующие метрики на уровне объекта »Для дополнительных вариантов, особенно если вы Gen5 Image Prime Пользователь. 130 7 - Базовый анализ изображения Новым пользователям часто бывает сложно применить доступные измерения в Cellular Analysis к фактическим Приложения. Вот пример приложения, чтобы проиллюстрироватькак измерения ядерной морфологии могут быть использованы для определения стадии клетки в клеточном цикле с использованием маски, определяемой ДНКсвязывающим красителем такие как Hoechst или DAPI. Для клетки в G0/1 фазе ядерный краситель отражает содержание ДНК 2N и будет иметь нормальной интенсивности и нормального размера и формы. Как только клетка достигает G2, она реплицирует свою ДНК; при содержании ДНК 4N будет измеримое удвоение интенсивности ядерной флуоресценции. Это можно увидеть на клеточном уровне, используя среднюю, пиковую и интегральную ядерную интенсивность. Когда клетка достигает фазы M, она, вероятно, будет иметь ту же интенсивность, что и клетка в фазе G2, поскольку дополнительной репликации ДНК не произошло; однако он будет иметь искаженные пропорции из-за образования веретена перед митозом клетки. Если бы на каждую клетку было проведено только одно измерение, было бы невозможно определить стадию клеточного цикла, но в сочетании эти измерения позволяют проводить расширенное морфологическое определение стадий клеточного цикла. Статистика изображений На панели анализа выберите Статистика изображений и нажмите Начинать для генерации следующих данных: Статистика изображений Среднее (на цветовой канал) Средняя интенсивность пикселей в объекте. 131 7 - Базовый анализ изображения Статистика изображений Мин. Минимальное значение яркости пикселей в объекте. Максимум Максимальное значение яркости пикселей в объекте. STD DEV Вычисляется с использованием стандартного отклонения (n-1) интенсивности всех пикселей, расположенных внутри или по периметру объекта. резюме Вычисляет стандартное отклонение / среднее значение. Насыщенные пиксели% Вычисляется путем подсчета числа пикселей, значение которых больше или равно пределу насыщенности, заданному для камеры инструмента, разделенному на количество пикселей в изображении. См. Технические характеристики прибора для получения информации об уровне насыщенности и разрешении изображения. Фокусная высота Положение объектива по оси Z (в микронах). Коэффициент FM Коэффициент FM - это коэффициент, сообщаемый алгоритмом автофокусировки. Общая интенсивность Сумма интенсивностей пикселей выше или ниже порога. Общая площадь Сумма площади пикселей выше или ниже порога (в микронах). Слияние Количество пикселей выше или ниже порогового значения, деленное на общее количество пикселей в изображении * 100. Ширина Ширина изображения извлекается из метаданных изображения; размеры в мкм. Рост Высота изображения извлекается из метаданных изображения; размеры в мкм. 132 7 - Базовый анализ изображения 7.3 - Анализ субпопуляции Добавление субпопуляций позволяет идентифицировать подгруппы в основной популяции. Чтобы продолжить наш пример клеточного цикла, три полезных субпопуляции могут быть клетками в G0 / G1, S и G2 / M. Gen5 позволяет использовать как можно больше выбранных вами показателей, чтобы сделать определение как можно более конкретным. Вы можете дополнительно разграничить их, выбрав «Все условия» или «По крайней мере одно условие», которые должны быть выполнены для того, чтобы объект был засчитан. Наконец, вы можете выбрать желаемые показатели для каждой субпопуляции и сложить их, чтобы создать индивидуальную субпопуляцию.См. Также Определение субпопуляции с помощью графика на странице 155.. 133 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 7 - Базовый анализ изображения 7.4 - Детали клеточного анализа Создание масок объектов для клеточного анализа Процесс идентификации ячеек или «Первичная маска и подсчет». 1 Gen5 отображает полученное изображение как 2D изображение. Каждый пиксель на экране соответствует пикселю, захваченному камерой. В интенсивность каждого пикселя пропорционально уровню сигнала, принимаемого камерой. Интенсивность пикселя указывается как число, пропорциональное уровню света, падающего на пиксель: от 0 для полной темноты до 65 520 для максимальной интенсивности. 2 Цель процесса идентификации клеток (создание маски) - определить, какие объекты на изображении, которые следует рассматривать как допустимые ячейки или интересующие объекты, и какую форму назначить каждому объекту. (Процесс выполняется математически, но эти иллюстрации позволяют визуализировать этапы процесса.) Двухмерное изображение преобразуется в трехмерное пространство с плоскостью XY, представляющей местоположение пикселя, а осью Z, представляющей интенсивность пикселя. В этом трехмерном пространстве высота объекта пропорциональна интенсивности его пикселей на изображении. Яркие объекты - высокие, а тусклые - короткие. 134 7 - Базовый анализ изображения 3 Gen5 предоставляет инструмент линии для измерения профиля интенсивности изображения. Пользователь рисует линию на 2Dизображении, а Gen5 создает вертикальную плоскость этой линии. Изображение этой вертикальной плоскости и то, как она разрезает 3D-объекты, отображается рядом с 2Dизображением. Пользователь может решить, какие объекты слишком малы по 25%: При использовании линейного инструмента Gen5 отображает пороговое значение 25%, которое часто является оптимальной настройкой. высоте (интенсивности), чтобы их можно было считать ячеек и с какого уровня интенсивности начинать считать объекты действительными. Этот уровень интенсивности называетсяПорог для идентификации клеток. 4 В трехмерном пространстве горизонтальная плоскость математически генерируется на уровень интенсивности равен Порогу. Эта плоскость порога будет рассекать трехмерные объекты, интенсивность которых превышает порог. Тусклые объекты низкой интенсивности останутся ниже этой плоскости. 5 Если мы теперь посмотрим на плоскость порога в 2D, он будет содержать контуры, где плоскость разрезает трехмерные объекты, интенсивность которых превышает пороговое значение. Эти объекты соответствовали критериям интенсивности для допустимой ячейки. 135 7 - Базовый анализ изображения 6 Затем размер XY каждого объекта может быть по сравнению с минимумом и максимальный размер объекта, указанный пользователем. Объекты, не соответствующие критериям MIN, MAX, игнорируются. Объекты, попадающие на края изображения (не полностью содержащиеся в области XY изображения), могут быть включены или исключены из анализа. 7 Gen5 применяет маски вокруг действительных объекты, которые соответствуют набору пользователя критерии. Только действительные объекты считаются представляющей интерес "совокупностью". Каждая маска очерчивает область изображения для формирования отдельных объектов на изображении (ячеек). Для этих объектов выполняется анализ ячеек (например, подсчет их, оценка площади, измерение периметра и т. Д.). Примечание: На интенсивность каждого объекта (ячейки) процесс идентификации ячейки не влияет. Анализ субпопуляции Gen5 предоставляет дополнительные возможности клеточного анализа путем определения и оценки субпопуляций. Анализ субпопуляции отвечает на вопрос: какие объекты из общей популяции соответствуют определенным критериям. Общая популяция клеток была установлена, как описано выше, с использованием фильтров порогового значения и размера. Этот процесс был выполнен с использованием цветового канала 1 (в нашем примере - DAPI). «Население», то есть общее количество объектов, равно 3, обозначенным желтыми масками. 136 7 - Базовый анализ изображения Для анализа также можно использовать измерения интенсивности в цветовых каналах 2–4. Gen5 сообщает об интенсивности в этих каналах только для объектов, определенных масками, созданными в канале 1. Мы можем назвать их измерения «Красный на синем» (красный для интенсивности красного канала и синий для основного канала, используемого для идентификации масок населения или объектов). В этом примере, если мы определяем субпопуляцию как объекты с определенным значением интенсивности красного, общее количество объектов будет равно 2. (Третья ячейка тусклее, чем указано). Анализ субпопуляции: варианты результатов Требуется программное обеспечение Gen5 Image + или Image Prime Детали объекта: В инструменте анализа после применения первичной маски определите полезные условия для анализа с помощью панели сведений об объекте. Это работает в обоих направлениях: вы можете выделить ячейку на изображении или строку в таблице, чтобы точно определить результаты. 137 7 - Базовый анализ изображения л щелкните ячейку на изображении или, л щелкните строку в таблице. л щелкните заголовок столбца в таблице, чтобы изменить порядок сортировки на это значение. л выберите несколько строк в таблице, чтобы выделить эти ячейки на изображении (нажмите Ctrl, чтобы выбрать несмежные строки). В режиме сотового анализа нажмите Параметры (под кнопкой Пуск) и выберите Анализ субпопуляции таб. Выберите ранее определенную популяцию для редактирования или нажмите «Добавить», чтобы создать новую. 138 7 - Базовый анализ изображения 1. В Метрики объекта поле, выделите элемент для оценки и щелкните Добавить условие. 2. В Изменить условие в раскрывающемся списке выберите функцию и введите значение или предел; вводите только целые числа без запятых. Щелкните ОК. 3. В режиме сотового анализа щелкните значок Начинать кнопку, чтобы повторно запустить анализ и сообщить о результатах состояния. Важный: Имейте в виду разницу между использованием Параметры применять ядерную маску к изображению (например, порог) и анализировать субпопуляции на основе определенных условий, найденных в результатах анализа. Например, вы можете использовать инструмент «Профиль линии» или диаграмму рассеяния для определения оптимального порога интенсивности (чтобы игнорировать объекты, которые не представляют интереса). 139 7 - Базовый анализ изображения Сложенные критерии субпопуляции: Когда для получения полезных результатов можно использовать несколько условий, например, интересующие объекты должны быть определенного размера. и / или внутри определенной формы вы можете добавить условия для каждого критерия. Все или Одно: тогда вы можете потребовать, чтобы объекты удовлетворяли всем или только одному условию. См. Также Определение субпопуляции с помощью графика на странице 155.. 140 7 - Базовый анализ изображения 7.5 - Определение плагина изображения Для некоторых анализов ограничение области анализа на изображении улучшает результаты статистического и клеточного анализа. Применение заглушки позволяет исключить неважную информацию. Чтобы применить заглушку: Снимите флажок, чтобы включить кнопку: Используйте инструменты для определения заглушки: 1. Сначала выберите Форма штекера. 2. Затем нарисуйте область заглушки на изображении. 3. Щелкните и перетащите заглушку, чтобы изменить ее размер или переместить, или используйте числовые значения X и Y, чтобы расположить и изменить размер. 4. Если возможно, вы можете Инвертировать маска. 5. Или, особенно при определении эксперимента, Загрузить тестовое изображение. Примечание: л одна и та же пробка применяется ко всем лункам в эксперименте; л вилку можно включать и выключать в ручном режиме; л использование заглушки может заменить необходимость определения сложных фильтров субпопуляции. 141 8 - Расширенный анализ Анализ высокого содержания с Image Prime BioTek's Gen5 Image Prime содержит специально лицензированные возможности анализа высокого содержания, как показано в таблице ниже. Этот раздел актуален только для клиентов, которые приобрели Image Prime. Gen5 Image Prime выводит анализ изображений на продвинутый уровень, включая мощные инструменты анализа, такие как расширение и уменьшение ядерной маски; вторичная маска для идентификации цитоплазмы или целых клеток; пользовательские измерения на уровне объекта для анализа перемещения и субпопуляции. Кроме того, модуль точечного подсчета доступен для покупки, т. Е. Для модуля точечного подсчета требуется уникальный пользовательская лицензия. 8.1 - Анализ высокого содержания с Image Prime 8.2 - Вторичная маска 8.3 - Создание точечной диаграммы или гистограммы 8.4 - Точечный подсчет 8.5 - Создание метрики настраиваемого объекта 142 145 147 152 156 161 8 - Расширенный анализ Gen5 3.0 Editions Сравнение функций Функции визуализации / анализ Gen5 Gen5 Безопасность / IVD Gen5 Gen5 Image + ImagePrime Поддержка от 1,25X до 60X1 Икс Икс Икс Икс Фазовый контраст2 (от 4X до 40X) Икс Икс Икс Икс Монтаж Икс Икс Икс Икс Z-укладка Икс Икс Икс Икс Z-проекция Икс Икс Цифровой фазовый контраст Икс Икс Сшивание изображений Икс Икс Икс Икс Анализ субпопуляции Икс Икс ROI Discovery эксперименты Икс Икс Подбор попаданий Икс Икс Визуализация и другие шаги, определенные для Икс Икс Подсчет ячеек (через первичную маску) Икс Икс разных участков пластины за одну процедуру Икс Икс Икс Икс Икс Икс Икс Икс Икс Икс Икс Икс Сотовый анализ и статистика в пользовательском плагине Икс Икс Аннотации поддерживаются в изображениях, графиках, фильмах Икс Икс Объединение изображений для улучшения фокусировки и скорости захвата Поддержка нестандартного лабораторного оборудования Movie Maker: запись в живом режиме; кинетическая съемка с выравниванием кадров Скорость сбора данных: до 10 кадров в секунду при полном разрешении, 20 кадров в секунду с биннингом Возможности расширенного анализа: Вторичная маска для измерения цитоплазмы / целой клетки Икс Пользовательские метрики на уровне объекта Икс Графики показателей уровня объекта: диаграммы разброса и Икс гистограммы 1Lionheart FX также поддерживает нефтяные цели 60X и 100X. 2кроме Cytation 1, Cytation 3, Cytation 7 143 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 8 - Расширенный анализ Функции визуализации / анализ Gen5 Gen5 Безопасность / IVD Gen5 Gen5 Image + ImagePrime Динамическое определение порога для сотовых масок Икс Анализ субпопуляции с использованием custommetrics Икс Дополнительный модуль точечного подсчета Икс # Установок на серийный номер 5 144 25 2 2 8 - Расширенный анализ 8.1 - Анализ высокого содержания с Image Prime Инструменты клеточного анализа 1. В Инструмент анализа, Выбрать Клеточный анализ и выберите Канал обнаружения, если необходимо. См. Предложения по изменению настроек анализа для повышения производительности в разделе «Исправить». 2. Затем щелкните Параметры для настройки параметров, чтобы наилучшим образом идентифицировать или сегментировать интересующие объекты в вашей выборке. 3. Порог: Как правило, значение по умолчанию «Авто» или динамическое определение пороговых значений наиболее Сосредоточение внимания на проблемах эффективно для различения интересующих элементов на основе их интенсивности пикселей. Но фиксированный стр. 39 порог работает лучше, когда интенсивность сильно варьируется в зависимости от изображения или токсичность клеток является обычным явлением на изображениях. 4. Сегментируйте интересующие объекты по их размеру, задав минимальный и максимальный размер объекта, который наилучшим образом соответствует вашим целям анализа. 5. Щелкните Начинать для получения результатов. 145 8 - Расширенный анализ Инструмент анализа После просмотра результатов и использования элементов управления анализом, таких как Профиль линии чтобы определить оптимальные значения порога и размера объекта, вы можете изменить параметры и повторно запустить анализ: нажмите Начинать снова, чтобы применить ядерную маску к изображению. л Использовать Расширенные возможности обнаружения для дальнейшей идентификации интересующих объектов изображение на основе размера объекта. л Вы можете использовать кнопки быстрого экспорта, чтобы сохранить изображение и / или результаты его анализа в Excel. См. Раздел 7.5 - Определение подключаемого модуля изображения на стр. 141.. Экспериментальный режим: Определите шаги сокращения данных для выполнения этого анализа в эксперименте. Gen5 сообщит об анализе для всех лунок в вашем сосуде для образцов. 146 8 - Расширенный анализ 8.2 - Вторичная маска Требуется Gen5 Image Prime Gen5 Image Prime, основанный на первичной маске, которая обычно используется для идентификации ядра клетки, позволяет определить вторичную маску для измерения цитоплазмы или всей клетки. Вот некоторые примеры использования вторичной маски: л Анализы транслокации: измерение изменения сигнала между ядром и цитоплазмой л Морфология клеток: измерение изменения формы цитоплазмы или целой клетки л Фенотипические анализы: стратегия скрининга для открытия лекарств Вторичная маска генерирует отдельные наборы данных, которые можно использовать вместе с теми, которые генерируются первичной маской: удваивая набор инструментов для комплексного анализа с помощью фильтров подгруппы и пользовательских метрик объектов. Создать вторичную маску После определения основной маски Gen5 предлагает несколько вариантов определения области второй маски. маска: л Сначала выберите включать или исключить первичная маска измерения в ваш набор данных, т.е. отменить выбор флажок для исключить первичная маска из анализа. 147 8 - Расширенный анализ л Если включено, вы можете Расширять или Уменьшать размер маски, если это необходимо. Примеры: л Отмените выбор параметра «Первичная маска», чтобы исключить сигнал DAPI и измерить GFP только в измерениях всей соты. При измерении изменений размера ячеек применяйте пороговое значение маски распространения. л Рассмотреть возможность Расширятьмаску для покрытия перинуклеарной области, если там наблюдается сигнал. л И наоборот, для анализов транслокации вы можете захотеть Уменьшать первичная маска для предотвращения двойного счета интенсивности сигнала в переходной зоне вокруг ядра. Для целых клеток измерения, выбрать Расширять или Уменьшать размер первичной маски по указанным микронам. Используйте инструмент линии, чтобы определить оптимальный размер. Для цитоплазмы измерения, укажите размер вторичной маски на основе: л Расстояние от Главная маска л Ширина кольца Области измерения определяется путем установки оптимального расстояния от ядро или первичная маска и размер кольца вокруг ядра. Анализ может быть ограничено определенными кольцо или включать целую ячейку, с сигналом в первичной маске или без него. 148 8 - Расширенный анализ Пороговые методы вторичной маски Когда требуется измерение интенсивности цитоплазмы, например, в анализе транслокации, применение порогового значения улучшает результаты. Доступны два метода порога: Распространение маски и Порог в маске. Оба метода используют первичную маску в качестве отправной точки для вторичной маски, но увеличивают иначе. Порог в методе маски Метод распространения маски Когда сигнал высокий вокруг первичной маски. Применяет порогкак он растет. Когда объекты хорошо разделены или глобально Для измерения вариации формы. Для измерения вариации интенсивности. круговые. Применяет порогпосле того, как он вырастет. Просмотр масок на экране После определения вторичной маски выберите «Канал» и заполните Маска флажки для их просмотра (в правом нижнем углу окна). Имена наборов данных Gen5 Именование результирующих наборов данных: Измерения в каналах 2–4 для первичной маски показывают измерение и канал. Пример: л л л Среднее значение объекта (GFP) л Среднее значение (Техасский красный) Измерения в каналах 2–4 для вторичной маски показывают измерение_2 и канал. Примеры: 149 8 - Расширенный анализ л Объект Среднее_2 (GFP) л Объект Mean_2 (Техасский красный) Примечание: Наборы данных, созданные с помощью предварительной обработки изображений, например плоский фон, имеют Цф префикс (сокращение от преобразования). Параметры вторичной маски Как применять вторичную маску, зависит от целей измерения; Вот некоторые примеры: Маска всей ячейки с порогом Применение: сигнализация всей клетки; площадь измерительной ячейки; слияние; цитоскелетные изменения. Цитоплазма и ядерные маски с порогом Применение: изменения формы клеток, такие как гипертрофия, изменения цитоскелета. 150 8 - Расширенный анализ Исключение перинуклеарной области, измерение цитоплазмы и ядра (без порога) Применение: транслокация. Порог не применяется, потому что, когда сигнал перемещается (перемещается), маска исчезает. Без перинуклеарной области, измерение цитоплазмы и ядра (с порогом) Применение: HCS Поэкспериментируйте с различными настройками и значениями, оценивая различия, просматривая эффекты, чтобы определить оптимальные параметры для вашего анализа. 151 8 - Расширенный анализ 8.3 - Создание точечной диаграммы или гистограммы Требуется Gen5 Image Prime Диаграмма рассеяния или гистограмма могут быстро проинформировать вас о тенденциях в ваших анализах. Эти графики могут быть очень полезны для: л оценка качества анализа (например, слишком много выбросов?) и способы его оптимизации; л определение пороговых значений для фильтрации подгрупп населения; л определение максимальных и минимальных значений и т. д. 152 8 - Расширенный анализ Несколько способов создать диаграмму рассеяния или гистограмму: Ручной режим После первого раунда Клеточный анализ, на панели «Сведения об объекте» щелкните См. Также «Анализ сотовой связи: управление метриками уровня объекта» на странице 166.. Экспериментальный режим Два метода: 1. Просверлите лунку в матрице планшета (увеличение лунки), щелкните На этапе анализа на панели «Сведения об объекте» щелкните 2. , создать или отредактировать изображение (аналогично ручному режиму). В Клеточный анализ Шаг сокращения данных, выберите Расчетные показатели: 153 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 8 - Расширенный анализ Экспериментальный режим 1. Выберите Гистограмма или Точечная диаграмма. Откроется диалоговое окно, в котором вы можете определить различные настройки графика. 2. Задайте настройки оси x: а. Выберите данные для отображения из списка. Доступна любая метрика уровня объекта, отображаемая на панели сведений об объекте. б. Определите степень детализации гистограммы, задав диапазон. Диапазон должен быть больше нуля. 3. Для гистограмм по оси ординат отображается процент количества ячеек для выбранной метрики; вы можете выбрать наборы данных для диаграммы рассеяния. а. Использование автоматического диапазона означает, что Gen5 устанавливает значения по оси Y от 0 до 100% генеральной совокупности. Если ваше распределение велико, вы можете уменьшить диапазон, чтобы максимальное значение было ближе к максимальному пределу диапазона. При просмотре ранее определенного графика рассеяния или гистограммы щелкните Изменить график изменить его внешность. 154 8 - Расширенный анализ Определите субпопуляцию с помощью графика Точечные диаграммы и гистограммы позволяют визуально определить субпопуляцию. 1. В ручном режиме и после получения и обработки изображения перейдите к Инструмент анализа и выберите Клеточный анализ, затем щелкните Начинать. 2. При необходимости щелкните Параметры для точной настройки параметров добавьте вторичную маску и т. д. 3. Щелкните «Создать график» и выберите «Гистограмма» или «График разброса по осям X, Y». 4. Определите Данные для построения графика по осям X и Y и нажмите ОК. 5. На гистограмме или диаграмме рассеяния щелкните и перетащите, чтобы создать рамку вокруг точек или полос, которые будут определять вашу подгруппу. 6. Выберите Новое население в открывшемся контекстном меню. 7. Назначьте уникальный Имя для нового населения. 8. При необходимости выберите критерии «Все / или условия». Выделите условие и нажмите «Изменить», чтобы изменить его значение. 9. Щелкните Ok создать субпопуляцию. 155 8 - Расширенный анализ 8.4 - Точечный подсчет Требуется дополнительный модуль Gen5 Image Prime «Точечный подсчет» Для анализов, требующих измерения мелких внутриклеточных объектов («пятен»), таких как стеатоз, аутофагосомы, липосомы, микроядра, вирусные инфекции и т. Д. Просмотрите список доступных измерений: Расчеты точечного подсчета на стр. 160. Лучшая практика: После применения основной или дополнительной маски просмотрите иллюстративную лунку и используйте Инструмент «Линия» для определения вероятного размера пятна. 1. Заполните Подсчет пятен флажок. 2. Установите минимальные и максимальные значения размера, чтобы игнорировать пятна за пределами ожидаемого диапазона. 3. Щелкните Расширенные настройки для уточнения изображения для точечного подсчета: 156 8 - Расширенный анализ Оптимальные настройки размера катящегося шарика и порогового значения зависят от исследуемой выборки, но вы можете экспериментировать с различными значениями, оценивать эффект и настраивать их, пока не будут достигнуты наилучшие результаты. Примечание: Точечный подсчет доступен только в том случае, если вы определили первичную или вторичную маску. Советы по подсчету пятен Предварительное условие: Модуль точечного подсчета должен быть приобретен, а его специальная лицензия зарегистрирована в BioTek. Включите точечный подсчет и определите его параметры на Вторичная маска вкладка Cellular Analysis, как описано ранее. Следующие предложения могут улучшить ваши результаты. Хотя ваш образец может диктовать различные настройки, часто хорошей отправной точкой для точечного подсчета является агрессивная предварительная обработка чтобы удалить как можно больше фона и упростить обнаружение пятен. (Вы можете редактироватьПредварительная обработка изображений шаг, который уже был определен.) 157 8 - Расширенный анализ 1. Открыть Предварительная обработка изображений. 2. Выберите вкладку вторичного канала (в данном примере GFP) и снимите флажок «использовать те же параметры, что и канал. 1. ” 3. Отмените выбор Авто и установите Диаметр катящегося шара к 1 мкм. 4. Изменить Приоритет к Прекрасные результаты. Основной канал: Оставьте значение по умолчанию или примените настройки предварительной обработки для основного канала, как вы обычно делаете для идентификации ядер, подсчета клеток и т. Д. Агрессивное выравнивание фона необходимо выполнять только на канале точечного подсчета. 158 8 - Расширенный анализ Gen5 предлагает множество способов определения интересующей области для точечного подсчета. Вот общий подход: 1. Применить Основная маска для идентификации ядер; канал с самым сильным сигналом. 2. Применить Вторичная маска со вторым каналом, фон которого выровнен, как описано выше) на расширение первичной маски поэкспериментируйте с масками разного размера, чтобы оптимизировать точечный подсчет. 3. Заполните Подсчет пятен Установите флажок, чтобы включить элементы управления и отрегулировать диапазон размера пятна по мере необходимости для ваших образцов. 4. Выберите Расширенные настройки ссылку для подсчета пятен и дальнейшую настройку Размер катящегося шарика а также Порог чтобы лучше всего визуализировать и считать пятна. л После выполнения расчетов оцените их в Результаты по объекту стол. Измените настройки анализа, экспериментируя с разными значениями, чтобы определить, какие из них дают наилучшие результаты. л Для просмотра пятен используйте элементы управления в Выделить объекты панель (под Результаты по объекту стол). Просматривайте по одному каналу за раз, чтобы активировать все элементы управления. 159 8 - Расширенный анализ Расчеты точечного подсчета Gen5 поддерживает следующие показатели объектного уровня. Выделенные элементы выбираются и рассчитываются по умолчанию. На вкладке «Расчетные показатели» вы можете выбрать дополнительные показатели для расчета и создания отчетов: Измерения размеров: л Размер л Площадь л Периметр л Округлость Gen5 вычисляет эти показатели по тем же формулам, что и Анализ изображений - определения сокращения данных. Измерения интенсивности вторичной маски: Измерения интенсивности первичной маски: л Область [<канал>] л Area_2 [<Channel>] л Среднее [<канал>] л Среднее_2 [<канал>] л StdDev [<канал>] л StdDev_2 [<канал>] л Пик [канал] л Peak_2 [канал] л Интегральный [канал] л Integral_2 [канал] л Количество пятен [канал] л Spots Count_2 [канал] л Размер пятна [канал] л Размер пятна_2 [канал] л Область пятен [канал] л Пятна Area_2 [канал] л Площадь суммы точек [Канал] л Область суммы пятен_2 [канал] л Среднее значение точек [Канал] л Пятна Mean_2 [канал] л Spots StdDev [канал] л Spots StdDev_2 [канал] л Spots Int [канал] л Spots Int_2 [канал] л Spots Sum Int [канал] л Сумма пятен Int_2 [канал] 160 8 - Расширенный анализ 8.5 - Создание метрики настраиваемого объекта Требуется Gen5 Image Prime Gen5 позволяет вам создать свою собственную «метрику настраиваемого объекта» для измерения клеточной активности, которая в настоящее время не рассчитывается в результатах по умолчанию. Как и в случае с другими операциями по сокращению данных Gen5, вы выбираете наборы данных и применяете формулу для вычисления желаемых результатов. Открыть Клеточный анализ варианты в ручном или экспериментальном режиме: Ручной режим Режим эксперимента 1. После получения изображения добавьте Обработка данных> Анализ сотовой связи Клеточный анализ шаг. 2. Щелкните Параметры. 161 8 - Расширенный анализ Ручной режим Режим эксперимента 1. Выберите Расчетные показатели таб. 2. Щелкните значок «Выберите или создайте интересующие метрики на уровне объекта" ссылка 3. Щелкните . 4. Выберите до пяти переменных для использования в пользовательских измерениях: 5. Напишите формулу, используя токены, например M1, которые представляют каждую переменную, и выберите Оператор скважины. 6. Дайте новой метрике настраиваемого объекта уникальное имя. Вы можете включить настраиваемую метрику в отчеты и использовать ее для определения подгрупп и других этапов сокращения данных. См. Раздел «Метрика настраиваемого объекта: пример приложения» на следующей странице.. 162 8 - Расширенный анализ Метрика настраиваемого объекта: пример приложения Требуется Gen5 Image Prime Измерение ядерной транслокации обычно используется для определения клеточного ответа на интересующее соединение. В этом примере мы создадим метрику настраиваемого объекта и применим ее в Анализе субпопуляции. Наша метрика настраиваемого объекта будет мерой соотношения между цитоплазмой и ядерным сигналом. Одно значение показывает, как сигнал движется в обоих отсеках. Средний коэффициент транслокации Соотношение ядро / цитоплазма: НИЗКОЕ Соотношение ядро / цитоплазма: ~ 1 Соотношение ядро / цитоплазма: ВЫСОКОЕ Сотовый ответ Состояние покоя Нет транслокации Перемещение Состояние покоя: перед транслокацией цитоплазма Полная транслокация Транслокация: после транслокации цитоплазма переместилась в ядро ясно виден После этапа «Предварительная обработка изображения» (называемого в этом примере «Преобразованный GFP #») для уменьшения фона и улучшения изображений для анализа мы будем использовать инструменты клеточного анализа для создания настраиваемой метрики: среднего коэффициента транслокации. 163 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 8 - Расширенный анализ 1 Применить Основная маска для измерения ядра. 2 Применить Вторичный Маска измерять цитоплазма. 3 Следуйте пошаговым инструкциям, чтобы открыть элементы управления Gen5: См. Раздел 8.5 - Создание метрики настраиваемого объекта на стр. 161.. Выберите первичный и вторичный наборы данных: л Среднее [преобразованное [GFP #]] л Среднее_2 [преобразованное [GFP #]] для показателя "Средний коэффициент транслокации" 164 8 - Расширенный анализ 4 См. Раздел Анализ субпопуляции: варианты результатов на странице 137.. Создайте определение субпопуляции: средние клетки транслокации Определите критерии, соответствующие вашему анализу. 5 Просмотр результатов в матрице планшетов: 6 Создайте дополнительные шаги сокращения данных: Наконец, чтобы создавать полезные отчеты, диаграммы и расчетах, «метрики настраиваемых объектов» можно использовать на дополнительных этапах обработки данных. В этом примере мы создали преобразование для использования в ZPrime и создании кривой. 165 8 - Расширенный анализ Сотовый анализ: управление метриками на уровне объектов В окне «Сокращение данных» создайте шаг «Анализ сотовой связи»> выберите вкладку «Расчетные показатели»> щелкните ссылку внизу окна. В диалоговом окне «Управление метриками уровня объекта» вы можете добавлять или удалять метрики из своего представления, чтобы уточнить результаты, которые вы хотите видеть, и, что наиболее важно, сохранить данные с экспериментом. Любая метрика уровня объекта может использоваться для создания метрики уровня скважины. Создание / редактирование точечной диаграммы или гистограммы Нажмите Управляйте графиками для добавления диаграммы разброса или гистограммы к данным эксперимента. В Gen5 Image Prime метрики на панели «Интересующие метрики объекта» также доступны в эксперименте, созданном из ручного режима захвата, и могут использоваться для построения диаграммы или создания таблицы в интерактивном представлении или в файле отчета / экспорта. См. Также 8.5 - Создание метрики настраиваемого объекта на стр. 161.. 166 8 - Расширенный анализ 167 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение Настройте свой результат 169 171 175 9.1 - Расположение пластин 9.2 - Отчетность и экспорт 9.3 - Сохранение изображений Макеты Gen5, построители отчетов / экспорта В эксперименте Gen5 позволяет создавать индивидуальный макет планшета, определяя идентификаторы образцов, разведения, концентрации, стандарты, контроли, реплики и их размещение / положение на планшете. Наряду с данными, полученными в ходе эксперимента, эту информацию можно экспортировать в Excel или другие форматы и вывести в формате отчета Gen5 по умолчанию. Параметры сохранения Gen5 Gen5 предлагает несколько способов сохранения изображений и файлов других типов. Файлы могут храниться локально или на сервере / в сети. Функция архивирования компилирует все содержимое файла эксперимента или сеанса ручного режима, включая любые изображения, фильмы, данные и анализ, в один файл. Zip-файлы особенно полезны для обмена и перемещения экспериментальных файлов и данных. 168 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение 9.1 - Расположение пластин Компоновку планшета легко определить с помощью инструментов Gen5 для идентификации образцов, стандартов, контролей и проб. Следуй этим шагам: 1. Выбирать Протокол> Схема планшета или выберите его в дереве файлов. 2. В Мастер компоновки пластин В открывшемся окне выберите типы лунок, используемые в вашем анализе (установите соответствующие флажки). 3. Следуйте указаниям мастера, чтобы определить Концентрации или Разведения, если применимо, ввод значений для каждого типа. При необходимости используйте кнопки «Далее» и «Назад», чтобы добавить полезную информацию для каждого типа. По завершении Gen5 открывает сетку или карту пластин, которая представляет ваш тип пластины. 4. Назначьте идентификаторы лунок их соответствующим местоположениям на карте планшета, щелкнув лунки в сетке. 169 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение л Когда вы выбираете соответствующее начальное количество реплик в поле Serial Assignment, идентификаторы меняются. соответственно. л Хранить Следующее разбавление Установите флажок и щелкните, чтобы назначить реплики в ориентации строки или столбца. л Вы также можете назначить идентификаторы образцов, используя значок «Плашка» в дереве файлов. Установите ориентацию строки или столбца. 170 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение 9.2 - Отчетность и экспорт Gen5 Быстрый экспорт Быстрый экспорт в Excel предлагается в нескольких представлениях. Просто нажмите кнопку быстрого экспорта изображения или данных, чтобы мгновенно экспортировать в Excel. Будет экспортирован только текущий отображаемый вид. Генераторы отчетов и экспорта Gen5 В режиме эксперимента вы можете настроить отчеты так, чтобы они включали только самую полезную информацию. Изучите доступные параметры для включения или исключения данных и форматирования внешнего вида отчета. Чтобы настроить экспорт / отчет: 1. Щелкните (или выберите Builder из Файлового дерева). 2. Ответьте на запросы Gen5. В окне конструктора на Характеристики страницы, оставьте значение по умолчанию «Автоматически» в разделе «Содержимое» или выберите Обычай. 3. Затем выберите Содержание на левой панели, чтобы указать данные для включения в отчет и настроить макет. 171 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение 4. После определения или настройки отчета / экспорта щелкните: л л экспортировать в Excel. для предварительного просмотра или печати отчета. Увеличение миниатюрных изображений при экспорте мощности Для экспериментов с изображениями Gen5 дает вам возможность увеличивать размер миниатюрных изображений в матрице, статистике или таблице результатов анализа. Наилучшие результаты начинаются с подготовки листа Excel для размещения увеличенного размера изображений. После определения протокола, компоновки планшета и этапов сокращения данных, определите Power Export: Настроить Энергетический экспорт шаблон (изменить Характеристики к Обычай как описано ранее). Затем выберите Редактировать шаблон запустить Excel для увеличения высоты и ширины ячеек. 172 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение Как обычно, используйте Надстройки панель инструментов для настройки отчета: 173 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение Для правильного размера изображений может потребоваться метод проб и ошибок. Примечание: это изменение не распространяется на распечатанные отчеты, QuickExport или CopyToClipboard. 174 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение 9.3 - Сохранение изображений При сохранении сеанса Gen5 все полученные изображения автоматически сохраняются в библиотеке изображений Gen5. Необработанные изображения автоматически сохраняются как 16-битные файлы TIFF в исходной шкале серого. TIFF обычно считается лучшим типом файла для сохранения изображения высочайшего качества для использования в программном обеспечении для анализа изображений и для повторного анализа с помощью Gen5. Чтобы сохранить цветные наложения с масштабной линейкой или повторно сохранить необработанные данные в альтернативном формате, вы можете щелкнуть, как указано ниже, или просто щелкнуть изображение правой кнопкой мыши. Кроме того, полученные изображения можно сохранить в файлах различных форматов, вызвав вручную Сохранить функция. В режиме анализа нижний левый угол: л Сохранить необработанные данные изображения сохраняет изображение в 16-битный TIF формат. Многоканальные изображения могут быть сохранены в виде отдельных файлов для каждого изображения или в виде стопки изображений в одном файле TIF. л Сохранить изображение для презентации сохраняет изображение или текущий дисплей в цвете, а не в оттенках серого. Масштабная линейка и положение увеличения изображения могут быть включены. Доступны несколько вариантов файлов изображений, в том числе: TIF, JPEG, PNG, GIF, BMP и EMF. Рекомендации по сохранению изображений Визуализация генерирует файлы данных гораздо большего размера, чем считывает флуоресценция (RFU) и оптическая плотность (OD). Размер каждого отдельного файла изображения составляет примерно 2,1 МБ со стандартными приборами FOV; вдвое больше этого размера при использовании моделей Cytation «W» с камерами с широким полем зрения. Трехцветный монтаж одной лунки 4x4 создает файл 175 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение размер около 100 МБ. Это быстро увеличивается при сканировании 96-луночного планшета, потенциально генерируя файлы размером около 9,6 ГБ. Поэтому важно разработать план хранения файлов, чтобы предотвратить потерю данных. Важный: Проконсультируйтесь со своим ИТ-отделом, чтобы разработать и внедрить стратегию хранения файлов. Вопросы, которые следует учитывать, включают в себя место хранения, соглашения об именах файлов, частоту резервного копирования и доступ пользователей. Рекомендации BioTek: л Хранить все файлы локально: Если это совместимо с вашим рабочим процессом и рабочими правилами, сохраните все ваши эксперименты и файлы изображений локально на жестком диске вашего компьютера, используя файловую систему Windows или базу данных Gen5. Убедитесь, что на жестком диске достаточно места для хранения всех образов, включая резерв виртуальной памяти 20 ГБ. Рассмотрите возможность подключения к компьютеру дополнительного запоминающего устройства, чтобы увеличить его емкость. Вместе со своим ИТ-отделом разработайте план резервного копирования (или архивирования) и / или совместного использования файлов путем их переноса на сетевой или внешний диск (см. Рекомендации ниже). л На защищенном сетевом диске: Если у вас есть надежная системная сеть и нескольким пользователям требуется доступ к файлам и изображениям экспериментов Gen5, поместите их на общий диск. Использовать базу данных Gen5 (SharedDB), который требуется для соблюдения требований FDA 21 CFR Part 11 для хранения файлов экспериментов и протоколов. И создатьБиблиотека изображений Gen5 на том же сетевом диске, что и общая база данных. (ВыбиратьСистема> Настройки> Хранилище файлов чтобы указать способ хранения.) Важный: Если ваша сеть не является безотказной, т.е. сбои в сети или ошибки возникают с некоторой регулярностью, тогда «Сохраняйте все файлы локально» на надежном ПК. Это лучший способ избежать потери данных. л Отключите некоторые автоматические функции: В обоих случаях, сетевом или локальном, отключите процедуры автоматического обновления компьютера, сканирование на вирусы или другие параметры питания, которые могут прервать эксперимент Gen5. Это особенно важно при проведении кинетических или временных анализов. л Следуйте инструкциям, прилагаемым к тепловизору re: Gen5's Computer Requirements to "Расширьте виртуальную память"для оптимизации размера подкачки памяти. Настройка библиотеки изображений Gen5 Gen5 предоставляет два способа определения имен файлов и расположения сгенерированных файлов: л Глобальная настройка: чтобы по умолчанию применить соглашение об именах и места хранения файлов ко всем файлам изображений, выберите Система> Настройки> Параметры сохранения изображения (в разделе Исходные настройки протокола). л Настройка для каждого протокола (Протокол> Параметры протокола> Параметры сохранения изображения): для отмены глобальной настройки, применения отдельных параметров сохранения к файлам изображений или для повторного подключения эксперимента с изображениями. Дополнительная информация: выполните поиск по запросу «Параметры сохранения изображения» в справке Gen5 для получения дополнительной информации. Файловое хранилище Примечание: Размер каждого файла изображения составляет не менее 2 МБ (и 7,57 МБ при использовании камеры с широким полем обзора (WFOV)). Монтаж 4x4 на лунку 96-луночного планшета потребует3327 МБ дискового пространства. Настоятельно рекомендуется использовать внешний жесткий диск или другое дополнительное хранилище для изображений. Рекомендуется использовать дополнительную флешку для большого количества файлов изображений. 176 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение Система управления файлами: Gen5 хранит файлы изображений в отдельной папке от файлов «Эксперимент», «Протокол» и «Ручной режим тепловизора» (IMM). Расположение файла изображения (библиотека изображений Gen5) определяется пользователем. Этот параметр является глобальным, и для всех новых экспериментов или захватов в ручном режиме по умолчанию используется это системное предпочтение. Примените глобальное именование файлов и места хранения для всех захваченных изображений. Определите, где будут храниться файлы Gen5: на локальном компьютере или в защищенной сети? л По возможности храните файлы локально л За исключением Gen5 Secure для соответствия требованиям FDA 21CFR Part 11: используйте сеть Поскольку файлы изображений очень большие по сравнению с другими файлами данных Gen5, Gen5 обрабатывает их по-другому. За исключением файлов изображений, файлы экспериментов Gen5 могут храниться в База данных Gen5 или в Файловая система Windows. Файлы изображений слишком велики для хранения в базе данных Gen5. Файлы изображений хранятся вБиблиотека изображений Gen5 в указанном пользователем месте в Файловая система Windows. 177 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение Во время установки имидж-сканера и программного обеспечения Gen5 было определено место для сохранения файлов изображений, поскольку оно требуется для запуска имидж-сканера. Чтобы изменить местоположение или определить, где хранятся файлы изображений, щелкнитеСистема> Настройки> Параметры сохранения изображения. Это глобальная настройка для всех файлов изображений, захваченных в файлах экспериментального и ручного режима изображений (IMM). Параметры хранения изображений и форматов файлов л . IMM для создания образов файлов сеансов в ручном режиме л . XPT для файлов экспериментов Gen5 Необработанные л данные изображений (файл TIF) для анализа Сохранение л изображений для презентации л Форматы файлов TIF, JPEG, PNG, GIF, BMP и EMF л Movie Maker (mp4, wmv) л Ознакомьтесь с автоматизированной проверкой "Соглашения об именах файлов л изображений" Параметры сохранения: "Соглашение об именах файлов" Функция Zip-файла Gen5: экспорт файлов изображений Выберите «Создать Zip-файл» в меню «Файл», чтобы аккуратно упаковать сеанс ручной визуализации или эксперимент. Это заархивирует ваши изображения, протокол и ваш анализ в один легко переносимый файл. Примечание: Вы должны находиться в ручном режиме тепловизора или иметь открытый файл эксперимента, чтобы использовать функцию Zip. Примечание: Файлы экспериментов и файлы изображений можно переместить в другие места. Но никогда не переименовывайте папку с файлами изображений: при переименовании папки с изображениями ссылка на эксперимент разрывается, и Gen5 не сможет установить на нее ссылку. Папки с файлами изображений при перемещении должны быть подпапками в папке экспериментов, чтобы папки экспериментов и изображений могли автоматически повторно связываться. 178 9 - Макеты планшетов, отчеты / экспорт и сохранение При обновлении версии Gen5 При установке более поздней версии Gen5 (например, когда пробная версия программного обеспечения была установлена во время демо): л SharedDB: Перед установкой более новой версии Gen5 запишите имя общей базы данных, которая установлена в настоящее время. Чтобы определить текущее имя базы данных: 1. Запустите текущую версию Gen5 и выберите Система> Конфигурация базы данных> SharedDB. 2. Запишите имя и расположение используемой в настоящее время SharedDB, чтобы определить правильный файл для обновления Gen5. Когда вы устанавливаете обновленную версию Gen5, в конце процесса установки Gen5 предложит вам запустить Утилиту обновления базы данных. (При желании этот шаг можно выполнить позже.) 3. Выберите Общая база данных определенную на шаге 2, и локальную базу данных из списка выбора и выполните обновление. 179 10 - Настройка и оборудование Инженерия, лежащая в основе вашего тепловизора В этом разделе представлены подробные объяснения аппаратного обеспечения каждого из наших приборов для визуализации. Здесь вы найдете информацию об установке и калибровке куба с лазерной автофокусировкой и куба светодиода / фильтра, а также внутренние схемы формирователей изображений. Вы также найдете адаптеры для лабораторной посуды для разных сосудов. и их номера деталей. 10.1 - Инструменты и аксессуары 10.2 - Кубики светодиодных фильтров и объективы 10.3 - Лабораторное оборудование 180 181 186 194 10 - Настройка и оборудование 10.1 - Инструменты и аксессуары Компоненты инструмента Показано в разрезе Cytation: Компоненты многорежимной системы обнаружения, вверху 1. Счетверенный монохроматор 2. Фильтр оптических и альфа-лазерных компонентов. Не показано, но доступно в Cytation 5: Phase Contrast (который заменит оптический фильтр и компоненты альфа-лазера). 3. Объектив тубуса и камера. 4. Кубы светодиодов и фильтров. 5. Объективная турель Полностью укомплектованный Cytation 5 с оптикой на основе фильтров На этой иллюстрации Cytation 7 в разрезе показаны некоторые из тех же компонентов, что и выше, с добавлением вертикального тепловизора вверху: 1. Счетверенный монохроматор 2. Вертикальный тепловизор Все модели имеют вертикальный тепловизор с 4 фиксированными линзами и 2 источниками света светлого поля. W-модели также имеют перевернутый тепловизор: 3. Объектив тубуса и камера. 4. Кубы светодиодов и фильтров. 5. Объективная турель Полностью оборудованная Cytation 7 с вертикальным и перевернутым сканерами 181 10 - Настройка и оборудование Показано в разрезе Lionheart: Компоненты системы визуализации: 1. Кольца фазового контраста, 1 светодиод яркого поля 2. Обогреватели в крышке и основании 3. Объектив тубуса и камера. 4. Кубы светодиодов и фильтров. 5. Объективная турель Lionheart FX 1 - Недоступно для Lionheart LX 182 10 - Настройка и оборудование Сравнение функций тепловизоров BioTek Функции Львиное Сердце Львиное Сердце FX LX Цитация 5 Цитирование 1 Цитирование 7 ИКС* Альфа-обнаружение Икс Переменная Икс пропускная способность монохроматоры (Флорида) Фазовый контраст Икс ИКС* Икс Икс (4x-40x цели) Инкубация до Икс Икс 65 ° С1 Цвет Яркое поле Икс Икс Икс Икс ИКС* ИКС* ИКС* ИКС* Икс Икс Икс ИКС* Икс Икс (Пятно H&E) Джойстик позиционное управление Большая вместимость (6 цель) турель Погружение в масло цели Икс Расширенный Икс динамический диапазон в FP, TRF, FI * По желанию 1 Температурный контроль варьируется: до 40 ° C с Lionheart FX, 45 ° C с Cytation 1, Cytation 3, Cytation 7 и 65 ° C с Cytation 5. 183 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 10 - Настройка и оборудование Двойные инжекторы реагентов Когда приложения требуют быстрого ввода и считывания, или когда просто удобнее распределить один или два реагента в сосуд внутри прибора, доступен дополнительный модуль двойного инжектора реагентов с приводом от шприца. Установка выполняется быстро и без инструментов. Программное обеспечение Gen5 позволяет интуитивно управлять дозированием. Видеть 19 - Двойной инжектор реагентов Недоступно для Lionheart LX Контроллер газа CO2 / O2 Анализы живых клеток требуют контролируемого окружающей среды, включая регулирование CO2 и O2 уровни. Дополнительный газовый контроллер обеспечивает точный мониторинг и контроль CO2 (от 0 до 20%) и O2 (от 1 до 19%) уровней внутри прибора. Lionheart FX предлагает дополнительную вставку предметного столика «Камера окружающей среды», которая поддерживает функцию перезарядки газа для быстрого восстановления уровня газа после открытия крышки. Узнайте больше в руководстве оператора. Видеть 20 - Контроль газа Недоступно для Lionheart LX 184 10 - Настройка и оборудование Джойстик Некоторые пользователи могут найти дополнительный джойстик, который упрощает поиск образцов и фокусировку на них, особенно при использовании объективов большой мощности. Джойстик предлагает более точную и разнообразную навигацию, чем стандартные компьютерные пошаговые элементы управления. Например, джойстик позволяет перемещаться одновременно по осям X и Y. Как и пошаговое управление Gen5, он предлагает точное управление фокусировкой. (PN 1320003) После подключения джойстика перезапустите инструмент, чтобы установить с ним связь. Примечание: Недоступно с Cytation 1 или 3. 185 10 - Настройка и оборудование 10.2 - Кубики светодиодных фильтров и объективы Сборки светодиодного куба и фильтрующего куба Для флуоресцентной визуализации имидж-сканер может содержать до четырех светодиодных кубов и сборок фильтрующих кубов, по одному на каждый канал цвета получения изображения. Кубики установлены на механических салазках, легко снимаются и заменяются. Доступны различные длины волн для поддержки большинства известных приложений флуоресцентной микроскопии. Кубики соединены для совместной работы: л нижний куб содержит мощный светодиод и фокусирующую линзу, л верхний куб содержит фильтр возбуждения, дихроичный фильтр и излучение Легкий доступ к ползунку для светодиода и сборки фильтрующего куба фильтр. Длина волны светодиода соответствует требованиям к цвету фильтров в верхнем кубе. (Цитирование показано выше) Светодиодный куб (внизу) и фильтрующий куб (вверху) Типичные светодиодные спектры 186 10 - Настройка и оборудование Посетите библиотеку документов Gen5 для получения исчерпывающих списков светодиодных индикаторов, кубов фильтров и объективов. образец данных В Gen5 выберите Система> Библиотека документов для Объективы формирования изображения, светодиоды и кубики фильтров или получите самую свежую информацию на сайте BioTek: www.biotek.com. 187 10 - Настройка и оборудование Установка и калибровка объективов и светодиодных фильтров Светодиодные кубы и фильтрующие кубы л Gen5 помогает обеспечить правильное соответствие светодиодного куба фильтрующему кубу, ограничивая параметры конфигурации соответствующими компонентами. л Светодиоды откалиброваны по интенсивности света каждый раз прибор включен. Калибровка светодиода обеспечивает стабильный сигнал на протяжении всего эксперимента. л Разные светодиоды имеют разный максимально допустимый ток. Таким образом, важно правильно определить длину волны и положение светодиодного куба в Gen5. Конфигурация прибора перед включением прибора. 188 10 - Настройка и оборудование Выбирать Система> Конфигурация прибора. Дважды щелкните элемент тепловизора и щелкнитеНастраивать. Важная информация о целях Объективы необходимо откалибровать после установки и перед первым использованием (за исключением масляных объективов, которые не калиброваны). Калибровка выполняется с помощью вкладки Gen5 Imaging Configuration, показанной выше. Целью калибровки является: Расположите центр оптической оси объектива относительно держателя пластины в плоскости XY л (горизонтальной), л Найдите фокусную точку каждого объектива относительно поверхности держателя пластины по оси Z (по вертикали). Уменьшите л сдвиг пикселей для каждого из установленных кубиков фильтра. л Важный: Модели Cytation «W» и модели «V» с объективами большой мощности (воздушные объективы 40X - 60X) требуют наличия «пластины для установки объектива» во время автокалибровки. В моделях «W» должен использоваться номер PN 1852501 (который поддерживает коррекцию освещенности FL); другие модели и тепловизоры Lionheart могут использовать любую пластину для установки объектива, включая PN 1222531, для калибровки своих мощных объективов. 189 10 - Настройка и оборудование л Корректирующая манжета: воздушные объективы 20X, 40X и 60X имеют корректирующую манжету. Начните с позиции .17 на манжете для покровных стекол и планшетов со стеклянным дном или с позиции .5 для стандартных пластиковых микропланшетов. При необходимости отрегулируйте хомут для поддержки другой пластины. типы, (как описано на странице 17). Объективы фазового контраста: На заводе BioTek устанавливает и калибрует необходимые компоненты фазового контраста, фазоконтрастный объектив и соответствующую диафрагму. Если необходимы корректировки, найдите Инструкции по калибровке фазового контраста в руководстве оператора. Убедитесь, что «Конфигурация прибора» Gen5 точно соответствует фактическому содержанию светодиодных индикаторов, кубиков фильтров и объективов. Выбирать Система> Библиотека оптики> Светодиоды и кубики фильтров. Если какие-либо компоненты отсутствуют в списке, импортируйте их с веб-сайта BioTek: www.biotek.com. 190 10 - Настройка и оборудование Изменение и калибровка объективов и светодиода - кубики фильтров При необходимости поменяйте местами объективы и / или кубики светодиодов и кубы фильтров изображения. Чтобы предотвратить перегрузку светодиодных кубов, вы должны сначала сообщить тепловизору, какие конфигурации светодиодных кубов будут установлены. Важный: При замене компонентов надевайте перчатки, чтобы избежать их загрязнения. Шаг 1. Обновите настройки Gen5 Первый, используйте Gen5 для обновления встроенных настроек тепловизора: 1. В Gen5 выберите Система> Конфигурация прибора. Дважды щелкните элемент тепловизора и щелкните Настраивать. Щелкните значокКонфигурация изображения таб. 2. Задайте конфигурации объектива, светодиодного куба и куба фильтра для ваших компонентов. Рекомендация: Как правило, лучше всего устанавливать цель с наименьшей мощностью, начиная с 4X, в позиции №1, а цели с более высокой мощностью в последующих позициях. Однако лучше всего на последних позициях устанавливать объективы мощностью ниже 4Х. Последовательность примеров: 4X, 20X, 60X, 2,5X, 1,25X. 3. В Объективная конфигурация области щелкните Доступ кнопку, чтобы переместить турель в это положение. 4. После определения щелкните Отправить значения. (Не закрывайте это окно Gen5 до завершения остальной части процедуры.) Примечание: Если вы меняете только объективы, а не кубы изображения, нет необходимости выключать тепловизор. Шаг 2. Установите компоненты физически 1. Выключите прибор, чтобы установить объективы, светодиодные кубы и кубы фильтров в заранее заданные места. 2. Откройте дверцу доступа. 191 10 - Настройка и оборудование Светодиодные фильтры: Инструменты: Шестигранник 3/32 / шестигранный ключ 1. Потяните за ползун фильтра и вытяните его. 2. Поместите новый светодиодный куб в определенное положение (положение 1, 2, 3 или 4). 3. Используйте шестигранный ключ, чтобы вкрутить светодиодный куб в салазки фильтра. 4. Вставьте разъем провода светодиода в гнездо на печатной плате. 5. Поместите куб фильтра формирования изображения на верхнюю часть светодиодного куба и прикрутите его к светодиодному кубу. Цели: л Установите каждую цель в определенное положение. л НЕ затягивайте слишком сильно! л Надежно привинтите: особенно с мощными объективами, убедитесь, что адаптер объектива правильно ввинчивается на свое место в револьверной головке. Будьте внимательны при их установке. Если вы чувствуете остановку или смещение, удалите объектив и попробуйте снова. Проверьте правильность установки, убедившись, что между адаптером и револьверной головкой нет зазора. Важный: Убедитесь, что соответствует вашему сосуду для пробы. Шаг 3. Запустите автокалибровку. 1. Включите тепловизор. Через пару минут вы можете услышать чирикающий звук, указывающий на то, что калибровка не завершена. Нажмите кнопку извлечения держателя планшета, чтобы отключить сигнал тревоги. 2. На Gen5 Конфигурация изображения вкладку, щелкните Автоматическая калибровка . Это займет несколько минут. Автокалибровка без паузы позволяет отойти от тепловизора во время калибровки, (т. е. взаимодействие с пользователем не требуется для завершения процесса). Если не все компоненты были заменены, Быстрая калибровка экономит время за счет калибровки только новых компонентов. 192 10 - Настройка и оборудование Установите кубик лазерной автофокусировки Лазерный автофокус - дополнительный аксессуар Установите кубик лазерной автофокусировки (номер по каталогу 1225010) в положение 1 на слайде (следуйте процедуре установки светодиода формирования изображения и кубиков фильтра). Используйте шестигранный ключ 3/32, чтобы затянуть невыпадающие винты куба. Вставьте зажим куба в гнездо. . Детали калибровки светодиода Свет, излучаемый светодиодом, пропорционален току, подаваемому на светодиод. Для каждого светодиода можно установить 10 различных уровней тока (от 1 до 10 = от минимального до максимального). При включении Gen5 измеряет уровень света, излучаемого каждым светодиодом на каждом из 10 уровней тока. Затем светодиод поддерживает тот же уровень яркости, что и первоначально записанное значение, до тех пор, пока устройство не будет выключено. 193 Перевод: английский - русский - www.onlinedoctranslator.com 10 - Настройка и оборудование 10.3 - Лабораторное оборудование Микропланшеты и другие сосуды для образцов Визуализацию можно выполнять в различных форматах сосудов для образцов, включая микропланшеты на 6–384 лунок, предметные стекла для микроскопов, чашки Петри разного размера и Corning® 25 см.2 прямоугольные колбы для культивирования клеток со скошенным горлышком. А кастомные сосуды, которые соответствуют базовой геометрии микропланшета, могут быть определены в Gen5 для использования в изображения. Держатель чашки Петри 100 мм PN 1222242 Держатель слайда Держатель чашки Петри PN 1220548 PN 1222240 38,7 мм PN 1222246 35,5 мм Колба Корнинга T25 PN 1222210 (Цитирование) Камера для подсчета клеток Адаптер для нескольких сосудов PN 1322131 и 1320016 PN 1450541 PN 1452275 (Львиное Сердце) 194 Держатель чашки Петри 60 мм PN 1222241 Nunc 4-луночный адаптер 10 - Настройка и оборудование Сценические вставки Lionheart Дополнительные вставки предметного столика могут удовлетворить ваши требования к анализу: Экологическая камера для тарелок с крышкой1 Фляга квадратная Т-75 Колба П-образная Т-75 При смене этапов перейдите к Система> Конфигурация прибора> Настройка и измените настройку сцены, чтобы сообщить Lionheart, какая сцена установлена. Только Lionheart FX: при использовании ступеней колбы Т-75 установите «Советы по дозированию" к <нет>, если они были настроены ранее. 1Только Lionheart FX. 195 Показатель Калибровка . Объективы, светодиоды и кубики фильтров 178 69 175 69 178 178 . IMM . mp4 . TIF . WMV . XPT . застегивать панель инструментов 28 год 117 191 Инструменты Автоматическая калибровка Автоэкспозиция 43 год 102 39 106 108 110 103 33 14 86 156 Автофокус Как улучшить Автофокус Как улучшить Лазерный автофокус Методы Выбор методов AutoMap Автоматизированный захват изображения Аутофагосомы Пакетная обработка Маяки и ROI Лучшая практика Сотовый анализ Производительность компьютера Покрытие ячеек и обращение с ними 129 176 40 36, 70 12, 76 Биннинг Нижняя отметка Нижняя толщина Яркое Поле 13 Покрытие клеток 131, 134, 145 Клеточный анализ 130 161 128 37 17 37 156 Основная маска Мера слияния Корректирующий воротник Счет и слияние Подсчет пятен Обрезать изображение для 35 год 55 161 хорошей взаимной корреляции Метрика настраиваемого объекта Настроить маску 35 год 181 Цитирование 7 D DAPI 45, 128, 131 122 Деконволюция 119–120 Цифровой фазовый контраст 63 184 40 Прерывистая кинетика Двойные инжекторы реагентов 14 86 ELISPOT анализы Экспериментальный режим преобразовать из ручного режима в ручной режим Экспорт результатов Экспозиция для образцов с низким уровнем сигнала 31 год 8 171 38 F Файловое хранилище 130 184 E Сравнение характеристик C 128, 131 ДНК-связывающий краситель 46 Высокий контраст Расчетные показатели Морфология клетки ДМСО 45 118 99 90 Сглаживание фона 37 147 40 Распылитель B Фон 22, 26 Ручной режим Количество ячеек специальный показатель 145 Аннотации 43 год Захватывать Расчетные метрики А Настройки анализа Усиление камеры 188 191 Файловое хранилище 183 9, 175, 177 176 грамм Область поиска Флуоресцентная микроскопия Элементы управления фокусом Проблемы с фокусировкой Как ускорить автофокус Выравнивание рамы 84 186 24 39 108 66 129, 134 Включить краевые объекты 6 Инструментальный контроль Время интеграции 43 год 181 62 инвертированный имидж-сканер Анализ ионных каналов J грамм Газовый контроллер Gen5 Библиотека документов Сравнение характеристик 184 175 187 143 175, 177 Файловое хранилище 176 Библиотека изображений Конфигурация прибора Общая база данных Обновление версии База данных типов планшетов Gen5 Показатели графического объекта 188, 190 179 179 11 152, 166 175 Оттенки серого Мощные цели Анализ высокого содержания Гистограмма высококонтрастного 46 16 142 46 152 метрики объекта Hoechst Анализ изображений Гистограмма изображения 44 год Библиотека изображений Предварительная обработка изображений Обработка изображений Цифровой фазовый контраст Сшивание изображений Z-проекция Качество изображения и скорость Параметры сохранения изображения Сглаживание изображения Статистика изображений Определения Хранение изображений Z-укладка изображений 66 65 62 71 Регистрация изображения Кинетический захват изображений Кинетический монтаж Z-Stack L 11, 194 Лабораторное оборудование 110 186 Светодиод лазерной О 188 Яркость светодиода 43 год 28, 118, 128, 135 Инструмент профиля линии Львиное Сердце Lionheart FX и липосомы для сравнения цитат 182 183 156 M Создание фильмов 22 29 Получение изображения 35 год Выравнивание рамы 128, 131 я Регистрация изображения Кинетический Светодиодный куб 44–45 светлого поля K автофокусировки (LAF) ЧАС HCBF 185 Джойстик 9, 176 118 29, 114, 118 119 52 60 39 65 10 118 131 131 175, 178 57 год 197 Ручной режим преобразовать в эксперимент Маска 128–129, 131, 134, 147 монтажная плитка ядерный Метод маски Распространять Порог 67 8 20 55 145 149 149 Матрица увеличить размер миниатюр микропланшетов определение рекомендуемые Монтаж Сшивание Файлы фильмов Movie Maker 172 11, 194 76 76 35, 48, 56 52, 55 69 36 Инструменты навигации N Точечный подсчет 23 134 Инструменты навигации Ядерная маска О Цели 40X и 60X Ограничения коррекции воротника регулировки высокой мощности 90 Миниатюры изображений фототоксичность Пластина Определение Тип плиты Затыкать Основная маска Основная маска Краткое пособие Отчетность и отчеты построителей экспорта RGB 128, 186 99 90 ROI менеджер Рентабельность инвестиций S Сосуды для проб Сохранить Сохранение файлов изображений Диаграмма разброса Вторичная маска Настраивать Общая база данных Разделить соприкасающиеся объекты 145 динамичный 172 62 увеличить размер 147, 149 39 150 Исправление проблем Цф U 45 181 14 108 Недоэкспонировано Вертикальный тепловизор Автоматическая карта 84, 88 23 ручной режим V 128 Просмотр профиля линии 6 184 171 171 Дозатор реагентов 128, 134 режим эксперимента р Прочитай сейчас 6 Порог Автофокус 192 171 20 Быстрый экспорт 140 Анализ транслокации Q Быстрая калибровка 131, 133, 136-137 Интервальные анализы 147 110 76 11 141 145 128 194 9, 175 9, 175 152 147 6 177, 179 129 198 156 140 37 156 Т Диспетчер задач п Фенотипические анализы стеатоз Анализ субпопуляции 73 17 16 44–45 Переэкспонировано Сценическое движение сложены Компенсировать по горизонтали и вертикали Сложенная подгруппа населения W Хорошее положение WFOV Возможность широкого поля зрения 14 36 36 Z Z-проекция Z-укладка Как снимать Zip файл 60 35, 57 57 год 178 лист регистраций изменений Rev Дата Изменения А 5/2015 Первый выпуск. B 10/2015 Добавлены инструкции для куба Laser AutoFocus. Мелкие правки текста. C 06/2016 Представлен Lionheart FX в семействе тепловизоров; добавлена поддержка его компонентов, например, новых наконечников дозатора, вставок предметного столика, масляных объективов и т.д. параметры группирования, создание фильмов, аннотации, маяки, настраиваемое лабораторное оборудование, вторичные маски, параметры настраиваемых объектов и улучшенное управление файлами. Добавлена таблица определений Image Analysis Data Reduction. D 06/2017 Удалены все темы, не связанные напрямую с визуализацией. Реорганизованы темы, чтобы лучше соответствовать целям обучения, и создан раздел «Подробное описание», который можно использовать после обучения. Добавлены инструкции для новых функций клеточного анализа, включая графики разброса и гистограммы; точечный подсчет с новым модулем «add-on»; новый функционал для вторичных масок; и более гибкая фильтрация субпопуляции. Добавлено описание новой функции обработки изображений: деконволюция. Пересмотренные инструкции по использованию ручного режима для определения захвата Z-стека, а затем «Создание эксперимента». Добавлена рекомендация по определению «Толщина дна» и других параметров изображения для типа пластины. Добавлены ссылки Cytation 1. Добавлены новые планшеты Greiner в список «рекомендуемых микропланшетов». E 11/2017 Реструктуризация контента для лучшего удовлетворения потребностей пользователей. Повсюду добавлены пошаговые инструкции. F 4/2018 Обновлены скриншоты и описания функций для Match Gen5 v. 3.04. Основные обновления пользовательского интерфейса (UI) касаются получения данных в ручном режиме, средства анализа и других источников. Новые функции включают возможность создания кинетического Z-стека, мгновенные измерения подсчета клеток и слияния в ручном режиме и два новых способа определения субпопуляции: инструмент поиска и использование графика. Добавлены специальные инструкции по запуску «Автофокусировки, обученной пользователем» в HCBF. Добавлен Lionheart LX в таблицу сравнения функций. грамм 6/2019 Улучшения обработки автофокуса, включая новые пользовательские параметры. Z-stack теперь поддерживает до 200 срезов. Новая функция множественных маяков / областей интереса. Поддержка моделей Cytation 5 «WFOV». Добавлены примечания относительно опции медленной связи; Приложение Scratch Assay не может использовать базу данных Gen5 для хранения файлов, поддерживается только файловая система Windows; Новый контроль качества от создателя фильмов. Добавлены подсказки для точечного подсчета. ЧАС 1/2020 Обновленные описания функций для сопоставления Gen5 v. 3.09, включая новые эксперименты по обнаружению ROI и поддержку вертикальных тепловизоров. Добавлен Cytation 7 в таблицу сравнения функций. Удалены описания обученной пользователем AF, направляя читателей к справке Gen5 по этой теме. В разделе «Тип плашки» добавлены инструкции автокарта. Описан новый вариант прошивки. Добавлены рекомендации по настройке экспозиции для образцов с низким уровнем сигнала. я 2020 г. Добавлены описания новых функций и улучшений удобства использования, представленных в Gen5 v. 3.10, включая новый менеджер ROI для анализов со сканированием слайдов и аналогичную пакетную обработку ROI с использованием BioStack. Добавлены инструкции по увеличению размера миниатюр в amatrix. Исправлены опечатки и другие ошибки форматирования. 199 Контактная информация BioTek Инструменты, Inc. Хайленд-Парк, а / я 998 Винуски, Вермонт 05404-0998 США Обслуживание клиентов и продажи Интернет: www.biotek.com Телефон: 888-451-5171 (бесплатно в США) 802-655-4740 (за пределами США) Факс: 802-655-7941 Эл. адрес: customercare@biotek.com Центр обслуживания / технической поддержки (TAC) Телефон: 800-242-4685 (бесплатно в США) 802-655-4740 (за пределами США) Факс: 802-654-0638 Эл. адрес: tac@biotek.com Европейский координационный центр / Уполномоченный европейский представитель BioTek Instruments GmbH Kocherwaldstrasse 34 D-74177 Бад-Фридрихсхалль Германия Интернет: www.biotek.de Телефон: + 49 (0) 7136 9680 Факс: + 49 (0) 7136 968 111 Эл. адрес: info@biotek.de 200