Серологічні реакції базуються на зв'язуванні компонентів реакції антигенантитіло. 1. Реакція нейтралізації (РН) базується на здатності імунної сироватки при додаванні до відповідного вірусу блокувати його здатність до репродукції. В серологічній діагностиці РН застосовується для виявлення наростання титру нейтралізуючих антитіл до певного (відомого) вірусу в парних сироватках крові. Титр імунної сироватки − кінцеве її розведення, яке ще забезпечує оптимальну взаємодію з антигеном. Титр залежить від концентрації в імунній сироватці антитіл певної специфічності. Як правило, при постановці РН з метою серологічної діагностики беруть постійну дозу вірусу і послідовні (зазвичай 2-кратні) розведення досліджуваних сироваток крові. 2. Реакція гемагглютинації (РГА). Гемагглютинація − це феномен склеювання еритроцитів внаслідок дії на них різних мікроорганізмів. Механізм гемагглютинації полягає в склеюванні еритроцитів( тварин або людини), на поверхні яких адсорбувалися мікроорганізми; останні являються містками, які з'єднують сусідні еритроцити. Можливо також, що мікроорганізми, адсорбовані на поверхні еритроцитів, змінюють їх заряд, внаслідок чого еритроцити набувають здатності склеюватися, осідаючи на дно пробірки або лунки планшета тонкою плівкою у вигляді переверненої парасольки(картина повної гемагглютинації). Відношення різних видів мікроорганізмів до аглютинації еритроцитів тварин того або іншого вигляду (або людини) встановлюють емпіричним шляхом. Як правило, мікроорганізми, що становлять одну таксономічну групу, аглютинують еритроцити одних і тих же видів тварин. Видова належність аглютинованих еритроцитів нерідко використовується для індикації мікрооганізмів. 3. Реакція гальмування гемагглютинації (РГГА). Гемагглютинаціязворотній процес. Про специфічність мікробної гемагглютинації роблять висновок по ефекту гальмування або придушення її відповідними антимікробними антитілами. Це явище лежить в основі РГГА. Механізм РГГА полягає в тому, що протимікробні антигемагглютиніни перешкоджають мікроорганізмам аглютинувати еритроцити чутливих видів тварин. Залежно від мети постановки РГГА її результатом є або ідентифікація ізольованого штаму, гемаагглютинацію якого подавила відома сироватка, або виявлення специфічних протимікробних антитіл в досліджуваній сироватці крові. 4.Реакція зв'язування комплементу (РЗК) - це складна реакція, яка протікає в дві фази. Для її постановки необхідні наступні інгредієнти: антиген, антитіло, комплемент, еритроцити барана, гемолітична імунна сироватка. У РЗК беруть участь дві системи антиген- антитіло: специфічна і гемолітична. Специфічна система є: 1 а) відомий антиген (діагностикум) і сироватку крові реконвалісцента (що містить відповідні цьому антигену антитіла); хворого або б) або невідомий антиген і відому діагностичну імунну сироватку крові реконвалісцента. Якщо антиген і антитіло гомологічні, вони утворюють специфічний невидимий комплекс, який сорбує на собі комплемент. Адсорбція комплементу на специфічному комплексі може бути виявлена лише за допомогою гемолітичної системи, складається з антигена (еритроцити барана) і імунної сироватки (антисироватки до нього). Гемоліз еритроцитів в гемолітичній системі наступає лише у присутності вільного комплементу.У разі утворення специфічного комплексу він адсорбує коплемент. При додаванні гемолітичної системи гемолізу еритроцитів не відбувається (позитивний результат). Якщо антиген і антитіло гетерологічні, комплемент знаходитися у вільному вигляді, оскільки окремо ні антигеном, ні антитілом він не сорбується. При додаванні гемолітичної системи відбувається гемоліз еритроцитів (негативний результат). РЗК, як і всі серологічні реакції, універсальна. Вона може бути використана для виявлення вірусних анитигенів в заразливому матеріалі, а також для виявлення антитіл в сироватці крові хворих та реконвалісцентів. 5. Реакція пассивної гемагглютинації (РПГА) або непрямої гемагглютинації (РНГА), широко використовується в вірусологічній практиці при диагностиці кору, респіраторно-синцитіальної вірусної інфекції, захворювань, що викликаються вірусами групи Коксакі В, кліщового енцефаліту, сказу, гепатиту В, аденовірусами і ін. Принцип реакції полягає в тому, що еритроцити (частіше всього людини або барана), сенсибілізовані антигеном (або антитілом) в присутності гомологічного антитіла (або антигену) склеюються, тобто дають феномен пасивної гемагглютинації. Так як всі антигени (антитіла) добре сорбуються на еритроцитах, останні попередньо обробляють таніном, після чого їх здатність сорбувати білки різко зростає. Еритроцити, сенсибілізовані антигенами, називають еритроцитарними діагностикумами, еритроцити, сенсибілізовані антитілами, називають антитільними діагностикумами. РПГА володіє більш високою чутливістю, ніж реакції зв'язування комплементу і зустрічного імуноелектрофорезу. Імунохроматографічний аналіз (ІХА) - це метод визначення наявності певних концентрацій речовин у біологічних матеріалах (сеча, цільна кров, сироватка або плазма крові, слина, кал і т.д.) та заснований на реакції між антигеном і відповідним йому антитілом. Даний вид аналізу здійснюється за допомогою індикаторних смужок, паличок, панелей або тест-касет, які забезпечують швидкість проведення тестування. ІХА - порівняно молодий метод аналізу, він часто позначається в літературі також як метод сухої імунохімії, стрип-тест, 2 QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, експрес-тест або експрес-аналіз. Ці назви пов'язані з швидкістю проведення цього методу аналізу. Принцип дії імунохроматографічного тесту полягає в тому, що при зануренні тесту в фізіологічну рідину вона починає мігрувати вздовж смужки за принципом тонкошарової хроматографії. Рухомою фазою в даному випадку є фізіологічна рідина. Разом з рідиною рухаються і антитіла з барвником. Якщо в цій рідині присутній досліджуваний антиген (гормон, інфекційний або онкологічний маркер), то відбувається його зв'язування, як з першим, так і з другим типом антитіл, що є вже імунологічним методом аналізу. При цьому відбувається накопичення антитіл з барвником навколо антитіл, жорстко іммобілізованих в тест-зоні ІХА-смужки, що проявляється у вигляді яскравої темної смуги. Незв'язані антитіла з барвником мігрують далі вздовж смужки і неминуче взаємодіють із вторинними антитілами в контрольній зоні, де і утворюється друга темна смуга. Взаємодія (темна смуга) в контрольній зоні повинна виявлятися завжди (якщо аналіз проведений правильно), незалежно від присутності досліджуваного антигену в фізіологічній рідини. Результати визначаються візуально або комп'ютерною обробкою відсканованого зображення. Принцип РІФ базується на виявленні флюорисцуючих антитіл. Адсорбований антиген з’єднують з імунною сироваткою, після чого утворений комплекс антиген-антитіло обробляють γ-глобуліном, з’єднаним із флюорисцинізотіоціанатом. Так як мічені флюорохромом антитіла не втрачають властивості з’єднуватись з антигеном та тим самим обумовлюють світіння препаратів в синьофіолетових променях, джерелом яких є ртутно-кварцева лампа. Цей метод дає можливість поставити діагноз вже через 2-48 годин від початку захворювання. Матеріалами для проведення дослідження можуть бути змиви з носоглотки, кров, спинномозкова рідина та інші біологічні рідини, де може знаходитись збудник. Реакція латекс аглютинації є одним з видів реакції аглютинації, в якій у якості носія антигену або антитіла використовують синтетичні полімерні частинкилатекси. Ця реакція використовується з метою виявлення наявності антитіл в сироватці крові обстежуваних людей, ідентифікації збудника захворювання. Розчинні дрібнодисперсні антигени бактеріальної клітини білкової або полісахаридної природи адсорбують на поверхні монодисперсного латексу. Такі латексні частинки з бактеріальним антигеном під дією імунної сироватики склеюються, що призводить до утворення характерного осаду-тонкої плівки з нерівними краями. Реакція обчислюється візуально(«+» по осаду плівки на дні лунки). Імуноблотинг – якісний метод, який дозволяє з великою вірогідністю визначати Аg або Аt в будь-якому біологічному середовищі організму. Специфічність і чутливість методу - 99-100 %. Метод імуноблотингу схожий на ІФА, проте фінальний етап дослідження полягає у переносі й іммобілізації біополімера (Аg або Аt) на пористу мембрану, де біополімер аналізують за допомогою 3 імуносорбентів. Імуноблотинг завдяки своїй специфічності належить до референстестів (підтверджуючих). Імуноферментний аналіз (ІФА) або, точніше, ферментний імуносорбентний аналіз (англ. enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) — імунологічний метод для визначення наявності певних антигенів, що заснований на ідентифікації комплексів антиген-антитіло. Широко використовується в лабораторній діагностиці. Існує цілий ряд підходів, що дозволяють визначити, чи відбулося зв’язування антитіла з антигеном-мішенню. Один з них — це ферментний іммуносорбентний аналіз (ELISA), що часто використовується для діагностики різноманітних антигенів. Процедура аналізу включає такі етапи: Основний принцип ELISA — специфічне зв'язування першого антитіла з мішенню. Якщо молекула-мішень являє собою білок, то його очищений препарат звичайно використають для одержання антитіл, за допомогою яких потім і виявляють дану мішень. Раніше використовувались перші антитіла, що були за своєю природою поліклональними. Розробка і застосування моноклональних антитіл дало змогу значно покращити специфічність імуноферментного аналізу. Ферментний імуносорбентний аналіз широко застосовується для діагностики різноманітних інфекційних захворювань, ракових процесів (восновному завдяки специфічним білкам і пептидам), визначення різноманітних низькомолекулярних сполук, таких як токсини, лікарські засоби і т. п. Методи ідентифікації нуклеїнових кислот Існують два способи молекулярно-генетичного аналізу – метод гібридизації і метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Методи виявляють ДНК або РНК у будь-якій біологічній рідині. В основі цих методів лежить властивість нуклеїнових кислот до саморепродукції in vitro. Найбільш широко використовується ПЛР (специфічність 99-100 %, чутливість 98~99 %). При багатьох інфекційних ураженнях ПЛР стала стандартним діагностичним тестом, який використовують замість біопсії мозкової тканини та звичайних методик виділення вірусів, рідко - бактерій. Метод заснований на багатократному виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів in vitro (в штучних умовах). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовільняє задані умови, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку. 4 . Для проведення найпростішої ПЛР потрібні такі компоненти: ДНК-матриця, тобто фрагмент ДНК, що містить ту ділянку, яку потрібно ампліфікувати. Два праймери, комплементарні кінцям необхідного фрагменту. Термостабільна ДНК-полімераза. Дезоксинуклеотидтрифосфати (A, G, C, T). Буферний розчин. Вірусологічний метод включає культивування вірусів, їх індикацію і ідентифікацію. Матеріалами для вірусологічного дослідження можуть бути кров, різні секрети і екскрети, біоптати органів і тканин людини. Дослідження крові часто проводять з метою діагностики арбовірусних захворювань. В слині можуть бути знайдені віруси сказу, епідемічного паротиту, простого герпесу. Носоглоткові змиви служать для виділення збудника грипу, кору, риновірусів, респіраторно-синцитіального вірусу, аденовірусів. В змивах з кон'юнктиви знаходять аденовіруси. З фекалій виділяють ентеровіруси, адено-, рео- та ротавіруси. Для виділення вірусів використовують культури клітин, курячі ембріони, іноді лабораторних тварин. Джерело отримання клітин — тканини, взяті у людини при операції, органи ембріонів, тварин і птахів. Використовують нормальні або злоякісно перероджені тканини: епітеліальні, фібробластичного типу і змішані. Віруси людини краще розмножуються в культурах клітин людини або ниркових клітин мавп. Більшість патогенних вірусів відрізняє наявність тканинної і типової специфічності. Наприклад, поліовірус репродукується тільки в клітинах приматів, що визначає необхідність підбору відповідної культури. Для виділення невідомого збудника доцільне одномоментне зараження 3-4 культур клітин, оскільки тільки одна з них може виявитися чутливою. Бактеріологічний посів (культуральне або мікробіологічне дослідження) — лабораторне дослідження, при якому біоматеріал, в якому імовірно можуть знаходитися патогенні мікроорганізми, поміщають в сприятливе для їх розмноження середовище при певних температурних параметрах з подальшою оцінкою результатів і визначення чутливості до антибактеріальних препаратів. Метод цінний для визначення умовно-патогенної мікрофлори, визначення чутливості до антибіотиків. Зі всіх методів діагностики інфекційних захворювань це найдорожчий і трудомісткий метод. Проте ці його недоліки з лишком компенсуються: якщо аналіз на інфекцію методом посіву дає позитивний результат, можна не сумніватися у присутності цих бактерій в організмі. Матеріал для дослідження може братися з ротової порожнини, прямої кишки, статевих органів. Правила забору аналогічні забору при ПЛР-діагностиці. Терміни 5 виконання різні — від декількох днів до декількох тижнів (залежать від збудника, що визначається). Пряма бактеріоскопія мазка Бактеріоскопія (від лат. — «скопео» — дивлюся) — лабораторний метод дослідження бактерій під мікроскопом. Використовують світло-оптичну та електронну мікроскопію. Матеріал( кров, кістковий мозок, ліквор, пунктати лімфатичних вузлів, фекалії, дуоденальний вміст, жовч, сеча, мокротиння і ін.) після забору центрифугують, забарвлюють і вивчають під мікроскопом. Використовують для діагностики інфекційних хвороб бактеріальної, протозойної етіології і, рідше, вірусних хвороб (малярія, лептоспіроз, менінгококова інфекція, лямбліоз, зворотній тиф, амебіаз і ін.) 6
