МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины» Кафедра ветеринарной генетики и животноводства Дисциплина «Ветеринарная генетика» Реферат на тему: «Современные методы генетических исследований в ветеринарии» Направление подготовки 36.05.01 Ветеринария Выполнил(а) Филипченко Ксения Денисовна Курс 1 Группа 17 Факультет ветеринарной медицины, очная форма обучения. Проверил(а) Ассистент кафедры генетики и животноводства Касаткина Елизавета Витальевна Оценка: Санкт-Петербург 2021 Содержание Введение … .................................................................................................. 3 ГЛАВА I. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ РАЗВЕДЕНИИ …........ 4 1.1 Гибридологический метод … ............................................................... 4 1.2 Популяционно-статистический метод … ............................................ 5 1.3 Близнецовый метод …........................................................................... 6 ГЛАВА 2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ ПОСТАНОВКЕ ДИАГНОЗА ВЕТЕРИНАРНЫМ ВРАЧОМ … ............ 7 2.1 Цитогенетический (кариотипический) метод … ................................ 7 2.2 Биохимический метод … ...................................................................... 8 2.3 Метод ПЦР диагностики … .................................................................. 10 Заключение … .............................................................................................. 18 Список литературы … ................................................................................. 19 Введение. В настоящее время ветеринарии и животноводстве, как и в гуманной медицине, широкое распространение и быстрое развитие получает множество биологических наук. Исключением не стала и генетика, которая с момента своего основания прошла длинный путь, состоящий из различных сложностей, открытий, исследований. С развитием технологий генетика получила возможность реализовываться на практике, став одной из основных и ведущих наук, входящих в общую совокупность медицинских наук. В ветеринарной медицине генетика играет важную роль не только при составлении врачом анамнеза, но и в разведении. Разнообразие методов генетического исследования открывают огромные возможности для врача при исследовании определенных групп заболеваний, именно поэтому развитие ветеринарной генетики актуально и имеет чрезвычайную важность. В данной работе мы рассмотрим генетические методы исследования, применяемые в современной ветеринарии. ГЛАВА I. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ РАЗВЕДЕНИИ Методы генетического исследования, которые имеют массовый характер логично отделить в обособленную группу, так как они отличаются от остальных, не только своей массовостью, но и тем, что по большей части не используются при составлении анамнеза врачом. 1.1 Гибридологический метод Гибридологический метод разработан Г. Менделем и был опубликован в 1856 году. Данный метод является первым в истории генетики, а его автора принято считать основоположником этой науки. Суть гибридологического исследования заключается в использовании системы скрещиваний в ряду поколений для определения характера наследования. Мендель объектом своих экспериментов выбрал растение, полностью отвечающее поставленной задаче: оно имело надежную защиту от посторонней пыльцы во время цветения и обладало нормальной плодовитостью. Такими растениями были различные сорта самоопыляющегося посевного гороха (Pisum sativum). Суть разработанного Менделем метода состоит из нескольких основных постулатов. 1. Подбор исходных «константно различающихся» родительских пар. Для скрещивания использовались растения, отличавшиеся некоторыми признаками: например, окраской цветка (у одного растения пурпурная, у другого — белая), длиной стебля (у одного растения около 2 м, у другого — до 60 см) и т. д. В своих экспериментах Мендель изучал наследование 7 альтернативных пар признаков: окраски цветка, расположения цветков (пазушное или концевое), высоты растений, характера поверхности горошин (гладкая или морщинистая), окраски горошин (желтая или зеленая) и т. д. В каждом поколении Мендель вел учет альтернативных признаков отдельно по каждой паре. До начала экспериментальных скрещиваний Мендель в течение нескольких лет проводил работу на получение «чистых линий», т.е. сортов, постоянно и устойчиво воспроизводящих анализируемый признак. (Термин «чистые линии» возник много позднее, датский генетик — селекционер В.Иогансен так назвал группу особей с однородной наследственностью.) 2. Количественный анализ полученных гибридов, отличающихся по отдельным признакам от каждой родительской пары. 3. Индивидуальный анализ потомства от каждого скрещивания в ряду поколений. Революционное новшество данного методического приема заключалось в учете и анализе потомства, полученного путем размножения всех без исключения гибридных особей. Данный метод принято использовать в разведении животных, при выведении новой породы тех или иных животных, а также при отслеживании определенных патологий, передающихся по наследству. Будет ошибкой называть гибридологическое исследование современным методом исследования, но и не совсем правильно будет приводить примеры различных методов, не вспомнив основополагающий. 1.2. Популяционно-статистический метод Данный метод используется при изучении наследования признаков и распространения генетических аномалий в популяциях; для анализа генетической структуры популяции, а также для изучения связи между признаками. Оценки степени надежности выводов, полученных при математическом анализе результатов исследований. Имеет значение и при изучении генетики человека. Использование популяционно-статистического метода включает правильный выбор популяции, сбор материала и статистический анализ популяционных результатов. В основе метода лежит закономерность, установленная в 1908 г. англ. математиком Дж. Изучением генетической структуры популяций занимается особый раздел генетики — популяционная генетика. У человека выделяют три типа популяций: 1) панмиктические 2) демы 3) изоляты Они отличаются друг от друга численностью, частотой внутригрупповых браков, долей иммигрантов, приростом населения. Население крупного города соответствует панмиктической популяции. В генетическую характеристику любой популяции входят следующие показатели: 1) генофонд (совокупностьгенотипов всех особей популяции) 2) частоты генов 3) частоты генотипов 4) частоты фенотипов, система браков 5) факторы, изменяющие частоты генов Для выяснения частот встречаемости тех или иных генов и генотипов используется закон Харди-Вайнберга. 1.3 Близнецовый метод Близнецами называют одновременно родившихся детей. Они бывают монозиготными (однояйцевыми) и дизиготными (разнояйцевыми). Монозиготные близнецы развиваются из одной зиготы (1), которая на стадии дробления разделилась на две (или более) части. Поэтому такие близнецы генетически идентичны и всегда одного пола. Монозиготные близнецы характеризуются большой степенью сходства (конкордантностью) по многим признакам. Дизиготные близнецы развиваются из двух или более одновременно овулировавших и оплодотворенных разными сперматозоидами яйцеклеток (2). Поэтому они имеют различные генотипы и могут быть как одного, так и разного пола. В отличие от монозиготных, дизиготные близнецы характеризуются дискордантностью — несходством помногим признакам. Наблюдения за монозиготными близнецами дают материал для выяснения роли наследственности и среды в развитии признаков. Причем под внешней средой понимают не только физические факторы среды, но и социальные условия. II ГЛАВА. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ ПОСТАНОВКЕ ДИАГНОЗА ВЕТЕРИНАРНЫМ ВРАЧЕМ 2.1. Цитогенетические (кариотипические) методы Цитогенетические методы используются, в первую очередь, при изучении кариотипов отдельных особей. Применение дифференциальной окраски позволяет точно идентифицировать все хромосомы. Общее число хромосом в гаплоидном наборе КРС равно 30. Из них 29 хромосомы одинаковы и у самца, и у самки; они называются аутосомы. В диплоидном наборе (2n=60) каждая аутосома представлена двумя гомологами. Тридцатая хромосома является половой хромосомой, она может быть представлена или X или Yхромосомой. Половые хромосомы у самок представлены двумя Xхромосомами, а у самцов одной X-хромосомой и одной Y-хромосомой. Изменение кариотипа, как правило, связано с развитием генетических заболеваний. Благодаря культивированию клеток КРС in vitro можно быстро получить достаточно большой материал для приготовления препаратов. Для кариотипирования обычно используют кратковременную культуру лейкоцитов периферической крови. Цитогенетические методы используются и для описания интерфазных клеток. Например, по наличию или отсутствию полового хроматина (телецБарра, представляющих собой инактивированные X-хромосомы) можно нетолько определять пол индивидов, но и выявлять некоторые генетические заболевания, связанные с изменением числа X-хромосом. Картирование хромосом КРС. Для картирования генов животных широко используются методы биотехнологии. В частности, методы клеточной инженерии позволяют объединять различные типы клеток. Слияние клеток, принадлежащих к разным биологическим видам, называется соматической гибридизацией. Сущность соматической гибридизации заключается в получении синтетических культур путем слияния протопластов различных видов организмов. Для слияния клеток используют различные физико-химическиеи биологические методы. После слияния протопластов образуются многоядерные гетерокариотические клетки. В дальнейшем при слиянии ядер образуются синкариотические клетки, содержащие в ядрах хромосомные наборы разных организмов. При делении таких клеток in vitro образуются гибридные клеточные культуры. В настоящее время получены и культивируются клеточные гибриды "человек и мышь", "человек и крыса" и многие другие. В гибридных клетках, полученных из разных штаммов разных видов, один из родительских геномов постепенно теряет хромосомы. Эти процессы интенсивно протекают, например, в клеточных гибридах между мышью и человеком. Если при этом следить за каким-либо биохимическим маркером (например, определенным ферментом человека) и одновременно проводить цитогенетический контроль, то, в конце концов, можно связать исчезновение хромосомы одновременно с биохимическим признаком. Это означает, что ген, кодирующий этот признак, локализован в данной хромосоме. Дополнительная информация о локализации генов может быть получена при анализе хромосомных мутаций (делеций). 2.2. Биохимические методы Все многообразие биохимических методов делится на две группы: а) Методы, основанные на выявлении определенных биохимических продуктов, обусловленных действием разных аллелей. Легче всего выявлять аллели по изменению активности ферментов или по изменению какого-либо биохимического признака. б) Методы, основанные на непосредственном выявлении измененных нуклеиновых кислот и белков с помощью гель-электрофореза в сочетании с другими методиками (блот-гибридизации, авторадиографии). Использование биохимических методов позволяет выявить гетерозиготных носителей заболеваний. Например, у гетерозиготных носителей гена фенилкетонурии изменяется уровень фенилаланина в крови. Методы генетики мутагенеза Мутационный процесс у животных, как и у всех других организмов, ведет к возникновению аллелей и хромосомных перестроек, отрицательно влияющихна здоровье. Генные мутации. Около 1% новорожденных заболевают вследствие генных мутаций, из которых часть вновь возникшие. Темп мутирования различных генов в генотипе неодинаков. Известны гены, которые мутирует с частотой 104 на гамету на поколение. Однако большинство других генов мутируют с частотой, в сотни раз меньшей. Хромосомные и геномные мутации в абсолютном большинстве возникают в половых клетках родителей. Один из 150 новорожденных несет хромосомную мутацию. Около 50% ранних абортов обусловлено хромосомными мутациями. Это связано с тем, что одна из 10 гамет являетсяносителем структурных мутаций. Возраст родителей, особенно возраст матерей, играет важную роль в увеличении частоты хромосомных, а возможно, и генных мутаций. Полиплоидия встречается нередко. Известны случая рождения триплоидов эти новорожденные рано умирают. Тетраплоиды обнаружены среди абортированных зародышей. В настоящее время мутационный процесс характеризуется тем, что протекает на фоне повышенной концентрации мутагенных факторов, созданной производственной деятельностью. Важнейшая задача сегодняшнего дня выявление мутагенных свойств загрязнителей, особенно новых химических веществ (лекарств, пестицидов, пищевых добавок, различных видов топлива и т.д.), и разработка методов технологии, позволяющих предотвратить возникновение опасных концентраций этих агентов. Одним из сильнейших мутагенов является радиация (ионизирующие излучения). Доказано, что не существует пороговой дозы ионизирующих излучений. Другими словами, индукция мутаций может быть достигнута при действии любых доз, а при увеличении дозы пропорционально растет число мутаций. Мутагенным действием на клетки организма обладают и некоторые вирусы, причем даже в ослабленной форме, которая используется для приготовления вакцин. Известно также, что большинство мутагенов обладают и канцерогенными свойствами, то есть они могут индуцировать развитие злокачественных опухолей. В то же время существуют факторы, которые снижают частоту мутаций антимутагены. К антимутагенам относятся некоторые витаминыантиоксиданты (например, витамин Е, ненасыщенные жирные кислоты), серосодержащие аминокислоты, а также различные биологически активные вещества, которые повышают активность репарационных систем. 2.3 Метод ПЦР-диагностики Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод молекулярной диагностики, ставший для многих инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяют гарантированно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетической информации. Аналитическая чувствительность ПЦР для большинства вирусов и бактерий составляет 1000 микроорганизмов в 1 мл пробы. Специфичность ПЦР для вирусных, хламидийных, микоплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР был разработан сравнительно недавно, но к настоящему времени успел занять передовые позиции как в медицинской, так и в ветеринарной лабораторной диагностике инфекционных и инвазионных заболеваний. Основные принципы ПЦР открыл в 1983 году американский химик Кэри Б. Мюллис, за что и был удостоен Нобелевской премии. ПЦР-анализ состоит из нескольких этапов. Первый этап - пробоподготовка заключается в обработке исследуемого материала (приготовление суспензии, центрифугирование). На втором этапе проводится выделение наследственного материала - ДНК или РНК - из клеток. При этом после лизиса клеток и разрушения комплекса «ДНК-белок» производится осаждение ДНК или РНК на сорбенте с последующим переходом их в элюирующий буфер. На третьем этапе проводится амплификация, то есть умножение количества специфических участков ДНК. Для этого используются тест-системы, в состав которых входят праймеры олигонуклеотиды, которые являются специфическими для каждого возбудителя. К разлитой в микропробирки ПЦР-смеси добавляют образцы и контроли, которые помещают в амплификатор или термоциклер программируемый термостат с высокой скоростью и точностью задаваемой температуры. Процесс амплификации заключает в себе три стадии: денатурация, отжиг и элонгация. При определении в клинических образцах РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует стадия обратной транскрипции, при которой РНК переводят в форму ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Четвертый этап ПЦРдиагностики заключается в проведении электрофоретической детекции продуктов ПЦР - ампликонов. При этом продукты ПЦР помещают в лунки агарозного геля и подвергают действию постоянного электрического тока, в результате чего отрицательно заряженная молекула ДНК движется к положительному электроду. В состав геля входит бромид этидия, который, образуя устойчивый комплекс с ДНК, делает эти полосы хорошо заметными при просмотре под ультрафиолетовым облучением. Следует отметить, что для получения достоверного результата ПЦР-анализа необходимым условием является соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки клинического материала. Несмотря на то, что ПЦР является очень чувствительным методом, желательно наличие определенного количества возбудителя в пробе. Взятие материала для ПЦР-исследования следует проводить в одноразовых неталькованных перчатках (так как тальк угнетает ПЦР). При взятии соскобов и смывов следует пользоваться одноразовыми стерильными зондами с повышенной адсорбцией (имеющими на конце щеточку), так какони отбирают оптимальное количество материала. Соскобы и смывы со слизистых оболочек носа, ротовой полости, влагалища, конъюнктивы отбирают в одноразовые пластиковые микропробирки эппендорфы - объемом 1,5 мл, в которые разлито по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Желательно не использовать зонды с ватными наконечниками. Следует также избегать отламывания кончика зонда в пробирку с физиологическим раствором, так как это затрудняет дальнейшую обработку и повышает риск перекрестной контаминации проб. Для получения необходимого количества материала достаточно вращать зонд в пробирке в течение 1-2 минут, избегая разбрызгивания жидкости. Проба должна быть мутной на вид, а при отстаивании в ней должен образовываться небольшой осадок. Забор крови проводят одноразовой иглой в одноразовый шприц или в стеклянную пробирку без антикоагулянта. При заборе в шприц, кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку. Возможно использование вакуумных систем («Vacuette») для забора крови. Для исследования можно предоставить сыворотку крови: пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка, затем центрифугируют при 3 тыс. об/ мин в течение 10 минут и переносят в количестве не менее 1 мл в стерильные эппендорфы объемом 1,5 мл. Сперму отбирают в стерильные одноразовые пробирки или флаконы. Моча. Отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не менее 20-40 мл в стерильный сухой флакон или пробирку. Фекалии. Отбирают пробы массой 1-3 грамма из предварительно продезинфицированного и вымытого лотка, одноразовыми лопаточками переносят в стерильный флакон. Кусочки пораженных органов от павших животных отбирают в стерильные одноразовые контейнеры или в чистые стеклянные или пластиковые емкости. Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при Т минус 20°С. Наиболее часто встречающимися заболеваниями у кошек и собак являются конъюнктивит, ринотрахеит, а также энтерит. Для того чтобы выяснить этиологию заболевания, требуется провести качественную лабораторную диагностику. Причиной коньюнктивитов или инфекций верхнего респираторного тракта у кошек может быть инфицирование следующими микроорганизмами: герпесвирус типа 1 (FHV1), калицивирус кошек, Chlamediapcittaci. Mycoplasma felis, Bordetella bronchiseptica, Feline reovirus, Staphylococ-cuc aureus, Brohaemolytic streptococcic и Salmonella tephimurium. Наиболее частой причиной, по данным различных авторов и методов исследования, являются герпес-вирус типа FHY1 (от 10% до 34%) и калицивирус кошек (от 20% до 53%). Chlamydia pcittaci (от 10% до 35%). Герпесвирусная инфекция, ассоциирована абортами, высокой смертностью новорожденных (инфицирование почти 60% случаев) с признаками интерстициальной пневмонии. Калицивирус - тяжело протекает у котят, в то же время 25-80% переболевших взрослых животных становятся носителями и являютсяисточником заражения, передавая вирус через слюну. Панлейкопения - контагиозное вирусное заболевание кошек, характеризующееся резким падением уровня лейкоцитов, гастроэнтеритом, ринитами с конъюнктивитами, высокой смертностью (30-90 % заболевших котят). Настоящим бичом для питомников является инфекционный перитонит кошек - тяжелое заболевание, возбудителем которого является РНК-содержащий высокопатогенный вирус. Вирус реплицируется в миндалинах и энтероцитах тонкого кишечника, рассеиваясь по организму через макрофаги и моноциты. Коронавирусы с низкой вирулентностью вызывают энтериты средней тяжести, чаще всего у котят после отъема от матери. Высоковирулентный коронавирус может привести к развитию сухого или выпотного перитонита. Перитонит часто сопровождается почечной недостаточностью, печеночнымии неврологическими симптомами. При инфицировании аденовирусами обоих типов и вирусом чумы плотоядных у собак проявляется общий комплекс симптомов: лихорадка, конъюнктивиты и ринотрахеиты, расстройство желудочно-кишечного тракта,поражение нервной системы. При чуме плотоядных клинические признаки могут включать серознослизистые назальные и конъюнктивальные выделения, кашель, одышку, пневмонию, рвоту и понос, а также лихорадку и гиперкератоз. Аденовирус плотоядных. Возбудитель - ДНК-содержащий аденовирус плотоядных первого типа (вызывает инфекционный гепатит плотоядных) и второго типа (вызывает аденовироз собак). Наблюдаются лихорадка, апатия, анорексия, жажда, рвота и понос, болезненность брюшной стенки при пальпации. Иногда развиваются конъюнктивит, кератит, светобоязнь. Могут быть точечные кровоизлияния на слизистой оболочке и коже. Редко наблюдаются неврологические нарушения. Все перечисленные заболевания имеют высокий индекс контагиозности и ассоциированы с высокой смертностью среди щенков, от парвовирусного энтерита погибает 10-50% заболевших щенков, при инфицировании не вакцинированных щенков вирусом чумы плотоядных смертность доходит до 100%. Токсоплазмоз. Возбудитель - простейшее Toxoplasma gondii. Размножение возбудителя происходит у кошек на стенках кишечника. С калом они выделяют во внешнюю среду ооцисты. Промежуточными хозяевами могут быть кошка, собака, человек. У кошек развитие паразита в кишечнике обычно проходит бессимптомно, изредка вызывая «легкий» понос. Тканевые цисты могут вызывать анорексию, угнетение, кератиты, желтуху, рвоту, понос и неврологические симптомы в зависимости от пораженных органов. У собак клинические симптомы зависят от пораженных органов: могут наблюдаться неврологические нарушения (тремор, атаксия, паралич) или токсоплазмозный миозит (нарушение походки, атрофия мышц, ригидность), а также миокардит и гепатит. Хламидиоз и орнитоз. Возбудители у кошек - Chlamydophila felts, у собак Chlamydophila abortus, Ch. pecorum, у тех и у других заболевание может вызывать Ch. psittaci. У птиц - Ch. psittaci. У кошек заболевание проявляется в основном в форме гнойных и негнойных конъюнктивитов и кератитов, также могут наблюдаться ринит, пневмония, вагинит, аборты и бесплодие. У котят встречается неонатальныи хламидиозный конъюнктивит. У собак симптомы разнообразны и проявляются воспалительными заболеваниями конъюнктивы, половых органов, гастритами, артритами, абортами и бесплодием. Есть данные о роли хламидий в патогенезе атеросклероза у собак. Микоплазмоз. Возбудители - микроорганизмы рода Mycoplasma. Протекает с признаками бронхопневмонии, кератоконъюктевитов и кератитов. Вирусный иммунодефицит кошек. Иммунодефицит кошек - тяжелое заболевание, вызываемое вирусом из семейства Retrovoridae, рода Lentivirus. Вирус поражает иммунную и нервную системы. Обладает тропизмом к Тлимфоцитам. В результате иммунодепрессии организм становится беззащитным против бактерий, грибов, вирусов и погибает от вторичной инфекции. Клинические признаки развиваются медленно, и заболевание чаще регистрируется среди кошек 6-10 лет. Встречаются у домашних животных и такие заболевания как: лептоспироз собак, листериоз кошек и собак, иерсиниоз щенков, бруцеллез, ротовирусный энтерит, бешенство. Правильность постановки ПЦР-анализа и качественное выделение инфекции зависит, в первую очередь, от правильности взятия материала, во-вторых, от соблюдения температурного режима хранения и транспортирования проб. Поступившая в лабораторию проба регистрируется, проходит все стадии ПЦР, подвергается электрофоретической детекции с последующей выдачей конечного результата. Таким образом, высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволяет гарантированно обнаруживать единичных возбудителей в биологическом материале за короткий промежуток времени, что позволяет поставить точный диагноз, назначить адекватное лечение и разработать профилактические мероприятия. Заключение В результате проведенной работы мы рассмотрели различные методы генетического исследования, начиная от основополагающих, и заканчивая теми, которые широко используются в современной ветеринарной медицине. Изучив каждый метод, мы пришли к выводу, что за генетическим исследованием стоит будущее ветеринарной медицины. Разнообразие методов генетического исследования открывают огромные возможности для врача при исследовании определенных групп заболеваний, именно поэтому развитие ветеринарной генетики актуально и имеет чрезвычайную важность. Список литературы 1. Бакай, А.В. Генетика / А.В. Бакай, И.И. Кочиш, Г.Г. Скрипниченко. – М.: КолосС, 2009. 448 с. 2. Ерѐмина, И.Ю. Селекционно-ветеринарная генетика / И.Ю. Ерѐмина. – Красноярск, 2013. – 214 с. 3. Жученко, А.А. Генетика / А.А. Жученко, Ю.Л. Гужов, В.А. Пухальская, и др.. - М.: Колос, 2004. - 480 c. 4. И. А. Паронян, П.Н. Прохоренко. Генофонд домашних животных России. Лань, 2008. – 25 с. 5. Михаэлис А., Ригер Р. Генетический и цитогенетический словарь. Колос. 2000 – 56 с.
