Инновационные технологии для гематологического анализа Левина Т., к.б.н. ООО «Рош Диагностика Рус» r.Владивосток Гематология сегодня – это проточная цитофлюориметрия 1. Размер / объем клеток - Импедансный метод (Метод Культера) - Проточная цитометрия - измерение прямого светорассеивания лазерного луча 2. Внутренняя структура - Проточная цитометрия - измерение бокового светорассеивания лазерного луча 3. Содержание нуклеиновых кислот (РНК/ДНК, зрелость и метаболическая активность клетки): - Проточная цитофлюориметрия Гематологические анализаторы X- класса Флюоресцентное окрашивание нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) концентрация нуклеиновых кислот в клетке прямо пропорциональна величине флюоресцентного сигнала Передовая технология– проточная цитофлюориметрия РНК/ДНК содержание сложность размер В настоящий момент только SYSMEX предлагает данную технологию: дифференциация лейкоцитов методом детекции нуклеиновых кислот. Проверенная технология (с 1999 г.) Для каждой клетки 3 типа параметров: Преимущества технологии – преимущества результата ЭФФЕКТИВНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК ТЕХНОЛОГИЯ ДЛЯ : • подсчета незрелых гранулоцитов • детекции активированных лимфоцитов • двойного подсчета тромбоцитов • детекции гипохромных ретикулоцитов УЛУЧШЕНИЕ КАЧЕСТВА ПОДСЧЕТА ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ ФОРМУЛЫ 48 ЧАСОВ СТАБИЛЬНОСТИ ОБРАЗЦА ПОСЛЕ ВЗЯТИЯ ВЫСОКИЙ ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ ИНФОРМАЦИЯ О ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОСТНОГО МОЗГА 5 Незрелые гранулоциты Незрелые гранулоциты определяются как • Метамиелоциты • Миелоциты • Промиелоциты Появляются в крови (патологический левый сдвиг) под действием инфекционно-воспалительных или злокачественных (миелопролиферативные заболевания) процессов Metamyelocyte Myelocyte Promyelocyte 6 Счет IG – Что конкретно считается? Количественное определение незрелых гранулоцитов (IG) • Подсчет IG является быстрым и точным инструментом для мониторинга эффективности различных видов терапии у пациентов с инфекцией или лейкемией. • Чем раньше увеличиваются значения IG у септических пациентов, тем меньше шансов на выживание Синдром системного воспалительного ответа (SIRS): есть или нет инфекция? При SIRS присутствие IG может указывать на инфекцию с начинающимся сепсисом RET-канал новые диагностические возможности Все RBC-параметры, включая MCV, MCH, Hypo-R дают нам историческую информацию об анемии RET%: информация о количестве вновь образованных RBC RET-He: информация о качестве вновь образованных RBC RET-He рассматривается как критерий решения (cut-off = 28 пг ) при лечении анемии хронических заболеваний Новые параметры RET-He 21.9 пг RET-He 29.6 пг RET-He 31.3 пг • RET-He – единственный параметр, позволяющий убедиться в эффективности терапии железодефицита уже через 3 дня. ! • RET-He в отличие от биохимических показателей, не зависит от воспалительных и др. заболеваний. Новые параметры Vorwärtsstreulicht Vorwärtsstreulicht Слева: Ret-скатерограмма 7-летнего ребенка, страдающего от тяжелого хронического воспаления кишечника Справа: 3 дня после терапии r-huEpo + в/в железо. Ретикулоциты (HFR) как и концентрация в них гемоглобина (RET-He) показывают выраженный рост Fluoreszenzlicht 18 November, 2008, Example headline, Page 11, © Roche Fluoreszenzlicht Проточная цитофлюориметрия – подсчёт тромбоцитов Ситуации, когда импедансный подсчет тромбоцитов не достаточен: Псевдотромбоцитопения : • Гигантские тромбоциты • Агрегация тромбоцитов Псевдотромбоцитоз: • Выраженный микроцитоз • Фрагменты Проточная цитофлюориметрия – подсчёт тромбоцитов RET канал Фрагменты эритроцитов Volume Норма RNA content RNA content Volume Meassurement Система флагов: • Аномальные флаги при патологии лейкоцитов • Повышенное или пониженное содержание лейкоцитов • Патологическая WBC-скатерограмма • Флаги, подозрительные на патологию лейкоцитов • • • • • • Blasts (бластные клетки)? Left Shift (левый сдвиг)? Atypical Lympho (атипичные лимфоциты)? Abn Lympho/Blasts (патол. Лимф./Бласты)? RBC Lyse Resistance (лизис-резистентные эритроциты)? NRBC (нормобласты)? Дифференцировка и IP сообщения по DIFF каналу Информация каждого флага Дополнительная полуколичественная система флагов (Qflag): Изменение чувствительности флага к индивидуальным требованиям каждой лаборатории Лаконичное сообщение о статусе здоровья пациента для каждого флага Строгая индикация патологии IG. Незначительная индикация патологии для Левого сдвига Концепция Sysmex Мировой лидер в области производства и продаж гематологических анализаторов, реагентов и программного обеспечения. Ежегодный запуск новых продуктов Уникальная технология дифференцировки лейкоцитов – метод проточной цитофлуориметрии (все анализаторы Х-класса) Все анализаторы X-класса - схожие функции, характеристики, технологии, аналогичные реагенты и системы флагов. Отличия - число каналов, скорость и способ загрузки проб Расширенный набор параметров (Мастера) XT-4000i XE-2100 & XT-2000i & XT-1800i XS-1000i & XS-800i Гематологические анализаторы Sysmex XE-2100 CBC + Diff + Ret + IPF + NRBC +HPC BF XT-4000i XT-2000i CBC + Diff + Ret CBC + Diff (5 Part) XT-1800i XS-800i/1000i CBC + Diff (3 Part) KX-21N 100 BF Body Fluid Analysis 250 750 [Samples [Samples/Day] 19 Гематологический анализатор XS-800i/1000i • Полноценный 5 Diff гематологический анализатор 26 параметров (включая IG), 3 гистограммы, 1 скатерограмма Производительность Ручной или с закрытыми пробирками: 60 образцов/час Автоматический (автосэмплер): 20 образцов/23 мин Очень низкий объем аспирации во всех режимах что особенно важно для педиатрических образцов: Капиллярная Венозная Автосэмплер 20 мкл 20 мкл 20 мкл Педиатрия, перинатальные центры, онкологические и гематологические клиники, больницы широкого профиля и поликлиники, женские консультации, родильные дома, частные центры репродукции, клиники Меню на русском языке Гематологический анализатор XT- 2000i/1800i 44 и 26 параметров (вкл. расширенное меню RET (XT-2000i), IG) 5 и 2 скатерограммы, 2 гистограммы Производительность 80 проб/час в любом выбранном режиме в т.ч. RET Объём образца: 85 мкл - из открытой пробирки 150 мкл - в автоматическом режиме 40 мкл- капиллярный метод Память - 10 000 образцов (вкл. графики) Меню на русском языке Гематологический анализатор ХЕ-2100 51 параметр, 7 скатерограмм, 2 гистограммы (вкл. NRBC, расширенное меню RET, IG, HPC, IPF) Самая быстрая система в мире: 150 проб/час. Объём образца: 130 мкл из открытой пробирки 200 мкл в автоматическом режиме Память - 10 000 образцов (вкл. графики) ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ХЕ-2100 • NRBC (нормобласты) • ХЕ-2100 позволяет осуществить точный подсчет нормобластов, который важен для правильного определения количества лейкоцитов, особенно в грубо патологических образцах. Помимо этого, точное определения количества нормобластов важно при многих клинических ситуациях: содержание нормобластов может быть использовано как дополнительный диагностический метод для выявления миелодиспластического синдрома. Фракция незрелых тромбоцитов (IPF) - отражает состояние костномозгового тромбоцитопоэза В норме составляет - 1,0-10,3% IPF повышается при ДВС-синдроме, идиопатической тромбоцитопенической пурпуре, регенерации костномозгового гемопоэза после химиотерапии ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ХЕ-2100 Гемопоэтические Клетки-предшественники (HPC)коррелируют с содержанием CD34+ клеток: Выбор оптимального времени для афереза, Мониторинг приживления клеток после трансплантации, Оценка восстановления стволовых клеток после их обработки в банках пуповинной крови Позволяет минимизировать число дорогостоящих определений СD34+. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ХЕ-2100 • IRF (immature reticulocyte fraction / фракция незрелых ретикулоцитов) • ХЕ-2100 предоставляет информацию не только об абсолютном количестве ретикулоцитов, но также и о содержании незрелых ретикулоцитов – параметра, характеризующего эритропоэтическую активность костного мозга. Доказано, что содержание незрелых ретикулоцитов является прогностическим параметров супрессии или же восстановления активности эритрона. Гематологические анализаторы Sysmex CBC + Diff + Ret + IPF + NRBC +HPC XE-2100 BF XT-2000i CBC + Diff + Ret XT-4000i CBC + Diff (5 Part) XE-2100D XT-1800i XS 800i/1000i CBC + Diff (3 Part) KX-21N 100 BF Body Fluid Analysis 250 750 [Samples [Samples/Day] 26 XT- 4000i – новый анализатор экспертного класса Технические характеристики Измеряемые параметры 73 параметра 3 скатерограммы 2 гистограммы Диагностические 40 Исследовательские 33 XT- 4000i – новый анализатор экспертного класса ПАРАМЕТРЫ СBC WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT, RDW-SD, RDW-CV, MPV, P-LCR, PDW, PCT, PLT-О О % MicroR – микроциты, % % MacroR – макроциты, % % Hypo-He – гипохромные эритроциты, % % Hyper-He – гиперхромные эритроциты, % XT- 4000i – новый анализатор экспертного класса ПАРАМЕТРЫ DIFF NEUT (%, #), LYMPH (%, #), MONO (%, #), EO (%, #), BASO (%, #), IG (%, #), HFL (%, #) RET RET(%, #), HFR, MFR, LFR, IRF, RET-He – содержание гемоглобина в ретикулоците D-He - Дельта-Гемоглобин RPI – индекс продукции ретикулоцитов FRC (%, #) – фрагменты (шизоциты) BF - новые диагностические возможности Параметры режима биологических жидкостей: Диагностические параметры: лейкоциты • WBC-BF = • PMN (% and #) = полиморфноядерные клетки: нейтрофилы + базофилы + эозинофилы • MN (% and #) = мононуклеары: лимфоциты + моноциты эритроциты • RBC-BF = Дополнительные параметры: • HF-BF (% and #) = высокофлуоресцирующие клетки (клетки с высоким содержание РНК в цитоплазме) общий цитоз • TC-BF = • EO (% and #) = количество эозинофилов 18 November, 2008, Example headline, Page 30, © Roche 30 Синовиальная жидкость Воспаление?: WBC >2x109/л, (%PMN >75%) Отсутствие воcпаления: остеоартриты, травматические артриты Воспаление: септические артриты, подагра, аутоиммунные артриты Плевральная жидкость • WBC >1x109/л: экссудат; WBC <1x109/л: транссудат • WBC >10x109/л: плеврит, опухоль • NEUT >10x109/л: бактериальная пневмония, острый плеврит, эмпиема, туберкулез • LYMPH >50%: лимфома, туберкулез • EO >10%: гемоторакс, пневмоторакс, асбестоз, паразиты Асцитная жидкость • PMN ≥0.25x109/л: Бактериальный перитонит Перитонеальный диализ Бактериальный перитонит?: WBC >0.1-0.2х109/л (PMN!) Спинномозговая жидкость • Нормальные значения • Лейкоциты • до 5 WBC/мкл у взрослых • до 20 WBC/мкл у новорожденных • Эритроциты • отсутствуют Ликвор – сложный материал для анализа Ликвор – ценная жидкость малого объема: • Взятие сложно и болезненно • Общий объем в теле мал (~150 ml) • Прозрачная бесклеточная жидкость, в норме цитоз менее 5 клеток / µl Время критично: • Инфекции угрожают жизни и лечение должно быть начато БЫСТРО (в течение часов) • Влияние результата анализа на клиническое решение велико • Т.к. клетки погибают быстро (в течение часа) образец должен быть проанализирован быстро 36 Анализ ликвора сегодня: вручную 1. Визуальная оценка образца – проверка взятия • Только информация о контаминации кровью 2. Счетная камера Фукса-Розенталя – для подсчета • Длительно по времени • Осуществляется только опытным персоналом • Воспроизводимость разнится (зависит от количества клеток и уровня навыков) 3. Цитоцентрифуга – для оценки морфологии • Возможно повреждение клеток • Клетки выглядят иначе, чем в мазке крови • Осуществляется только опытным персоналом 37 Результаты испытаний: Автоматический подсчет vs счетной камеры • Результаты обоих методов сопоставимы • Оба метода способны различить нормальное и патологическое содержание клеток • Отрицательная и положительная прогностическая значимость сравнима с таковой для счетной камеры • Чувствительность = 99% • Специфичность = 79% 38 Анализ ликвора завтра: автоматически Автоматизация может помочь в • Стандартизации метода • Улучшении воспроизводимости • и качества результата 39 • Размер клеток не имеет значения при подсчете лейкоцитов в DIFF канале; • Остатки разрушенных клеток (дебрис) не оказывают влияния на анализ, т.к.: • Клетки не содержащие нуклеиновых кислот, например, эритроциты не окрашиваются • Нет влияния устойчивых к лизису эритроцитов • Не клеточные компоненты, например, пузырьки воздуха не определяются Содержание РНК/ДНК Преимущества проточной цитофлюориметрии гранулярность дебрис • Фоновый счет всегда очень низок, что крайне важно для анализа образцов с низким цитозом! 40 Технические аспекты анализа биологических жидкостей Доступность • 24 часа в день • при доступности опытного персонала Воспроизводимость • Великолепная • Не зависит от оператора • Может быть хорошей/великолепной в специализированных лабораториях • Зависит от персонала Время анализа • ~ 1 минута • зависит от исполнителя • всегда несколько минут 41 MN PM N Экран: Экран диагностические параметры 42 HF TC WBC Экран: Экран исследовательские параметры 43 Некоторые примеры: Панкреатит - асцит • Асцитная жидкость содержит кровь, носит признаки воспаления, большая часть клеток - нейтрофилы (~ 80%) 44 Некоторые примеры: вирусный менингит - ликвор • Присутствуют как мононуклеары, так и полиморфноядерные лейкоциты • Реактивные лимфоциты указывают на иммунный ответ 45 BF - новые диагностические возможности XT-4000i • Объём пробы всего 85 мкл •Доступен 24 часа/день •Время выполнения анализа – 1 мин •Выполняется немедленно после поступления образца в лабораторию, т.к. не требуется предварительная пробоподготовка и специальное обучение персонала Рутинные исследования в гематологии Staining 47 Автоматизация рутинных исследований в гематологии Staining 48 Автоматизация рутинных исследований в гематологии Станция приготовления и окраски мазков SP-1000i Качество мазков, приготовленных ручным методом Мазок приготовленный на SP-1000i Основные преимущества • Полностью автоматизированный процесс для приготовления и окраски стандартизированных мазков • Высокое качество мазков за счёт автоматической корректировки HCT, 8 уровней • Высокая производительность: 120 мазков в час • Нет контакта оператора с кровью • Положительные образцы идентифицируются при считывании штрихкода • Штрих-код идентификации печатается на стекле • Гибкие протоколы окрашивания: 7 протоколов Автоматизация гематологического анализа XE-Alpha N Автоматизация рутинных исследований в гематологии Staining 54 Можете вы найти то, что я увидел? 55 Автоматизированная цифровая микроскопия сегодня CellaVision DM96 CellaVision DM1200 56 Мазки для DM96 / DM1200 Подготовленные автоматически SP-1000i Подготовленные п/автоматически HemaPrep Подготовленные вручную 57 Современные тенденции в гематологии Современные информационные технологии позволяют хранить графические данные Фотографии клеток крови сохраняются для: • • • • Пересмотра Приложений телегематологии (E-mail, Server) Документации в истории болезни пациента Образовательных целей Уменьшение количества ручной микроскопии Решение: Автоматизированная цифровая микроскопия 58 Почему автоматизированная цифровая микроскопия? Стандартизация и автоматизация дифференцировки клеток В комбинации с автоматизацией подготовки и окраски мазка цифровая микроскопия улучшает качество дифференцировки Подсчет на большое число клеток (определяется пользователем) Неограниченное время хранения графических результатов дифференцировки Оптимально для подсчета образцов с цитопенией Оптимизация рабочих потоков в лаборатории Наличие телегематологических приложений 59 `````` 60 We Innovate Healthcare
