Проектная работа «Экстраклеточные везикулы для улучшения биодоступности лекарственных средств» Ученица 10 «А» класса Смирнова Анастасия Руководитель: Кириллова Инна Владимировна Москва, 2018 г. Экстраклеточные везикулы - экзосомы • Экзосомы – тип внеклеточных везикул, являющихся переносчиками молекулярных сигналов в организме, а также несущих маркеры клеток-продуцентов. Схематичное представление везикулярного транспорта Функция везикул – адресная сохранная доставка вещества между различными компартментами клеток Схематичное представление везикулярного транспорта экзо- и эндоцитоза. Везикулы-пузырьки отпочковываются от одного компартмента (участка мембраны) и позже сливаются с другим. При этом они переносят вещество как груз из «люмена» (пространства внутри замкнутого мембранного отсека) одного компартмента в другой (как внутри клетки, так и по организму) Роль экзосом в эндо- и экзоцитозе Схематичное представление образования везикул и их транспорта (экзо- и эндоцитоза). Везикулы зарождаются в эндоплазматическом ретикулуме, формируются в комплексе Гольджи и затем «дозревают», получая специфическое окаймление белками, в эндосомах Схематичное представление эндоцитоза; роль ионов кальция в адресной доставке. Формирование экзосом – нормальное свойство всех билипидных мембран живых клеток – на границе понижения рН либо изменения ионной силы сред. Роль липидов и рН в образовании экзосом •Спонтанное образование везикул на биологических мембранах происходит в область с более кислой средой (меньшим рН) •Def: фосфолипидная симметрия мембран Молекулы бисмоноацилглицеролфосфата (LBPA) стремятся образовать кластеры при понижении рН, - и стягивают мембрану мультивезикулярного тельца (MVB) до образования складки, а после отпочковывания везикулы остаются на донорской мембране; везикула получает «-» заряд LPC- фосфатидилхолин; PG – фосфатидилглицерин, PE – фосфатидилэтаноламин, PS – фосфатидилсерин, SM – сфингомиелин. Образование экзосом клетками Ультратонкие срезы бактериальной культуры B.fragitis в момент образования везикул. Масштабные отрезки: 1 мкм, 500 нм. Стрелками указаны экзосомы. Последовательные структуры белков окаймления при образовании экзосом АТФ-зависимая самоорганизация белков окаймления Роль мембранных белков в адресной доставке везикул Системы внутриклеточного транспорта везикул у дрожжей и человека устроены одинаковым образом (Джеймс Ротман (Йельский Университет, Коннектикут); Рэнди Шекман Schekman (Калифорнийский Университет в Беркли, Калифорния), 1970-е гг.) Ротман и Золлнер в 1993 году выделили белки SNARE* и показали, что SNARE находятся и на мембране везикулы, и на мембране-мишени, и определяет судьбу везикулы * SNARE – Soluble NSF Attachment Protein REceptor Терапия с помощью экзосом Пути получения терапевтических экзосом Возможные схемы использования экзосом и различные способы загрузки препарата в экзосомы клеточных культур Загрузка экзосом внутренним содержимым липосом при их слиянии Схема формирования информационных экзосом в мозге при образовании круга Пейпеза (Papez) Проведение экспериментов. Общая структура Необходимо по 3 (4) группы сравнения: 0 – интактные объекты (их можно просто оставить в памяти); 1 – негативный контроль (группа с воздействием только везикул); 2 – положительный контроль (чистое ЛВ); 3 – опыт (ЛВ в составе везикул). Проведены опыты на цветах, рыбках и личинках мясных мух (опарышах). Оптимальные условия сбора: •Вторая половина лог-фазы роста; •Преинкубация при температуре 40*С 1-2 часов; •Предварительное удаление клеток центрифугированием 10000g •Отделение везикулярной фракции от остального коллоидного раствора культуральной жидкости химическим осаждением (с повышением рН) и последующим центрифугированием при 30000g
