до конца не выяснен. В результате налицо несоответствие между сложившимся представлением об эффективности пробиотиков и растущим распространением дисбиозов, выявляемых у большей части населения России. Новейший микробиологический подход к изучению проблемы, связанной с разработкой средств и методов коррекции нарушений микробиоценоза кишечника, позволил приоткрыть тайну функционирования микробно-тканевого комплекса, определяющего здоровье или болезнь. В наших экспериментах впервые в мире получены убедительные доказательства того, что пробиотические микроорганизмы сертифицированных препаратов гибнут, преодолевая естественные барьеры желудочно-кишечного тракта, и до толстой кишки доходит лишь десятитысячная доля процента от их исходной численности. Те же остаточные количества пробиотических микроорганизмов, которые достигли толстой кишки в жизнеспособном состоянии, являются чужеродными для естественной микрофлоры, не приживаются в биопленке кишечника и отторгаются, оказывая негативное воздействие на иммунную систему и макроорганизм в целом. Для научно обоснованной оценки потенциальной эффективности пробиотикотерапии необходимо было существенно повысить методический уровень исследований. Были разработаны способы изучения выживания пробиотических микроорганизмов в экспериментах in vitro с использованием модельных сред, а также в организме экспериментальных животных. Впервые протестирован и внедрен в практику метод дифференциации пробиотических и индигенных микроорганизмов одного вида в кишечном содержимом in vivo. Предложена модель экспериментального антибиотико-ассоциированного дисбактериоза у лабораторных животных, с использованием которой было доказано, что основным действующим компонентом восстановления нормальной микрофлоры кишечника при дисбиотических состояниях являются продукты жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов – экзометаболиты, а клетки, их продуцирующие, наоборот «тормозят» процесс эффективного восстановления. Нами впервые введено в научный оборот понятие «скорость восстановления (угнетения)» кишечной микрофлоры. Научная новизна исследований подкреплена подачей 5 заявок на предполагаемые изобретения. Важно отметить следующее: выполненные нами исследования являются современной научной базой для разработки биотехнологии нового класса стандартизованных пробиотических препаратов на основе экзометаболитов микроорганизмов. Следует особо подчеркнуть, что наиболее эффективным и безопасным путем коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике является восстановление его собственной микрофлоры, сформированной в процессе онтогенеза, а не попытка его заселения «хорошими», но чужими для него микроорганизмами. Добиться этого, по нашему убеждению, можно путем использования пребиотиков и метаболитных пробиотиков, а также их сочетанием. Исследования пребиотической активности фруктоолиго- и фруктополисахаридов (в составе коммерческого препарата СТИМБИФИД), а также ферментированных пищевых волокон (в составе коммерческого препарата РЕКИЦЕН-РД), проведенные нами в условиях in vitro и in vivo, показали их высокую эффективность в коррекции дисбиотических нарушений кишечника как во время антибиотикотерапии, так и после нее. Впервые продемонстрирована необходимость повышения колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника с целью профилактики и лечения кишечных инфекций на примере псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, достичь которого можно за счет стимуляции размножения собственной (индигенной) микрофлоры путем использования пребиотиков и метаболитных пробиотиков. Объединение научных статей по некоторым аспектам проблемы восстановления микробиоты и подготовленной нами справочной информации в одном сборнике помогут заинтересованным читателям более глубоко проникнуть в суть проблемы, использовать выводы и наши рекомендации в своей научно-исследовательской и лечебной практике. С глубоким уважением, от коллектива соавторов И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский и И.В. Дармов. Комментарии, вопросы и пожелания Вы можете высылать на электронный адрес E-mail: microbiota2012@mail.ru Бесплатная электронная версия по адресу: http://gastroportal.ru/files/mikroflora.pdf СОДЕРЖАНИЕ СОДЕРЖАНИЕ Глава 1. ПРОБИОТИКИ 1.Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2.Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Выживаемость бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом людей.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3.Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Ердякова А.С., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 4.Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Тетерина И.С. Экспериментальное изучение чувствительности микроорганизмов пробиотиков к антибактериальным препаратам.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 5.Ердякова А.С., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Погорельский И.П. Экспериментальная оценка лимфоцитотоксического действия бифидобактерий и лактобактерий... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 6.Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Богачева Н.А., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Шевцов Н.А. Исследование влияния больших доз пробиотика Бифидумбактерин и микроорганизмов аутофлоры кишечника на организм белых мышей и показатели клеточного иммунитета... . . . . . . 25 7.Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дурнев Е.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 9.Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Коррекция экспериментального антибиотико-ассоциированного дисбактериоза у морских свинок пробиотиком Биоспорин... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 10.Погорельский И.П., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А. Экологическая и функциональная маргинальность пробиотических микроорганизмов.. . . . . . . . . 47 11.* Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Погорельский И.П., Гаврилов К.Е., Янов С.Н., Дармов И.В. Влияние подавления секреции желудочного сока препаратом Париет на приживаемость бифидобактерий и лактобактерий в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 12.* Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Бессолицына Е.А., Дармов И.В., Шабалина М.Р. Микроорганизмы пробиотиков и индигенной микрофлоры человека и животных: характер взаимодействия при совместном культивировании на плотной питательной среде... . . . . . . . . . . . . 54 13.* Погорельский И.П., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Дармов И.В., Маракулин И.В. Экспериментальное изучение лимфоцитотоксического действия аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 14.Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Пробиотики: вектор развития.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 2 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 8.Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Заместительное действие пробиотиков: миф или реальность.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 * – отмечены статьи, впервые вошедшие в «Сборник…». 15.Гастроэнтерологический симпозиум. Новые подходы к терапии заболеваний желудочно-кишечной системы. Коррекция и профилактика дисбактериоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 16.Грачева Н.М., Малышев Н.А., Чичерин И.Ю., Аваков А.А., Партин О.С., Щербаков И.Т., Соловьева А.И., Герасимова Н.В. Фруктоолигосахариды и фруктополисахариды в комплексном лечении больных желудочно-кишечными заболеваниями с явлениями дисбактериоза кишечника . . . . . . . . . . . . . . . 80 СОДЕРЖАНИЕ Глава 2. ПРЕБИОТИКИ 17.Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю., Стражев С.В., Минушкин О.Н. Эффективность фруктоолиго- и фруктополисахаридов в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 18.Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Микрофлора кишечника белых мышей и морских свинок при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе и возможность ее коррекции пребиотиком Стимбифид. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 19.Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Лундовских И.А., Погорельский И.П., Маракулин И.В. Протективная активность пребиотика Стимбифид, предотвращающая развитие нарушений микробиоценоза кишечника экспериментальных животных на фоне антибиотикотерапии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 20.* Бредихин В.Н., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Лещенко А.А., Лазыкин А.Г. Микроэкологические изменения в кишечнике при дисбактериозе: экспериментальное обоснование возможности коррекции дисбиотических изменений пребиотиком Стимбифид. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 21.* Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дармов И.В., Маракулин И.В. Сравнительная оценка способности пищевых веществ с пребиотическим действием и пребиотика Стимбифид к восстановлению кишечной микрофлоры у конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 22.Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Кулемин Л.М., Гаврилов К.Е., Дурнев Е.А. Ферментированные пищевые волокна препарата Рекицен-РД: пребиотический эффект в условиях in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 23.Чичерин И.Ю., Кулемин Л.М., Дармов И.В., Лундовских И.А., Погорельский И.П. Рекицен-РД в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника у белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. . . . . . . 118 Глава 3. ПРОТИВОИНФЕКЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕБИОТИКОВ И МЕТАБОЛИТНЫХ ПРОБИОТИКОВ 25.* Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Бессолицына Е.А., Дармов И.В., Шабалина М.Р. Колонизационная резистентность слизистой оболочки кишечника при экспериментальном иерсиниозе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 26.* Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дармов И.В., Малов А.А. Антибактериальная активность и состав надосадочной жидкости нативной культуры Lactobacillus plantarum 8P-A3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 3 Глава 4. СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ О ДИССЕРТАЦИОННЫХ РАБОТАХ РФ ЗА 2000-2012 ГГ., ПОЛНОСТЬЮ ИЛИ ЧАСТИЧНО ПОСВЯЩЕННЫХ ВОПРОСАМ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 сборник научных статей 24.* Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. , Дармов И.В. , Маракулин И.В. Экспериментальный псевдотуберкулез: оценка возможности профилактики, лечения и коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 * – отмечены статьи, впервые вошедшие в «Сборник…». Глава I ПРОБИОТИКИ Глава I ПРОБИОТИКИ ВЫЖИВАЕМОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОБИОТИКОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO, ИМИТИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЧЕЛОВЕКА* Дармов И.В.1, Чичерин И.Ю.2, Погорельский И.П.1, Лундовских И.А.1 1 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии, 2 ООО «МедСтар» SURVIVAL OF PROBIOTIC MICROORGANISMS, INCLUDED IN THE COMMERCIAL MEDICINES BIFIDUMBACTERIN AND LACTOBACTERIN, IN THE CONDITIONS IN VITRO, IMITATING THE PROCESS OF HUMAN DIGESTION I.V. Darmov1, I.Yu. Chicherin2, I.P. Pogorelsky1, Lundovskikh I.A.1 4 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 1 Vyatka State University, 2 LLC «MedStar» РЕЗЮМЕ SUMMARY Цель исследования. Оценка выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro, имитирующих пищеварение в желудке и кишечнике человека, и изучение выживаемости пробиотических и индигенных микроорганизмов в условиях совместного культивирования на плотной питательной среде. Материалы и методы. В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы, выделенные из коммерческих препаратов бифидумбактерин, лактобактерин, клинические изоляты лактобацилл (Lactobacillus acidophilus № 1, L.brevis № 2). Изучение выживаемости микроорганизмов пробиотиков проводили на модели in vitro, имитирующих условия пищеварения в организме человека. Оценку взаимоотношений микроорганизмов пробиотиков и индигенных микроорганизмов проводили в условиях совместного культивирования in vitro на плотной питательной среде. Результаты. Установлено значительное снижение числа жизнеспособных пробиотических микроорганизмов при их инкубации в модельных средах, а также подавление роста пробиотических микроорганизмов культурами клинических штаммов лактобацилл, соответствующее бионесовместимости по типу «хозяин против пробиотика». Заключение. При выборе пробиотиков при лечении дисбактериозов необходимо предварительно изучить характер взаимоотношений микроорганизмов пробиотиков с индигенной микрофлорой пациента, а также стимулировать микроорганизмы собственной микрофлоры с использованием современных пребиотиков. Ключевые слова: индигенные и пробиотические микроорганизмы; выживаемость; антагонизм; биосовместимость; бионесовместимость; пребиотики. Purpose of the study. Assessment of survival bifi dobacteria and lactobacteria under the conditions in vitro, simulating digestion in human stomach and intestine, and study of survival probiotic and indigenous microorganisms in co-cultivation on solid nutrient medium. Materials and methods. Probiotic microorganisms from commercial preparations Bifi dobacterin and Lactobacterin, clinical isolates lactobacillus (Lactobacillus acidophilus № 1, L. brevis № 2) were used in experiments. Survival study of probiotic microorganisms was performed on a model in vitro, simulating the process of digestion in the human body. Assessment of the relationship of probiotic microorganisms and indigenous microorganisms was carried out in co-cultivation in vitro on solid nutrient medium. Results. A signifi cant reduction in the number of viable probiotic microorganisms during their incubation in model media was set as well as suppression of probiotic microorganisms growth by cultures of a clinical strains of lactobacillus, corresponding to biocompatibility by type «host against probiotic». Conclusion. While choosing probiotics in the treatment of dysbacterioses the character of relationship between probiotic microorganisms and indigenous microorganisms of a patient is recommended to be preliminarily tested. Also microorganisms of own microfl ora should be stimulated using modern prebiotics. Keywords: indigenous and probiotic microorganisms; survival; antagonism; biocompatibility; bioincompatibility; prebiotics. * Ссылка для цитирования: Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека. Экспер. и клин. гастроэнтерология.- 2011.- №3.- С. 6 – 11. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы, выделенные из коммерческих препаратов бифидумбактерин (серии 090210, 245, 5074, 288 – 1, 315 – 6), лактобактерин (серии 15 / 6, 125 – 2, 125 – 6), а также два изолята индигенных лактобацилл (Lactobacillus acidophilus № 1, Lactobacillus brevis № 2), выделенные из фекалий больных. Бифидобактерии выращивали на плотной питательной среде, рекомендованной в информационном письме [6]. Выращивание лактобацилл проводили на среде МРС, приготовленной по прописи, представленной в работе [7]. При выращивании пробиотических микроорганизмов в микроаэрофильных условиях использовали систему для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III – LE003 (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными HiAnaero Gas Pacet. При оценке биосовместимости бифидобактерий и лактобацилл различного происхождения использовали плотные питательные среды на основе перевара Хоттингера или триптического гидролизата мяса с добавлением Глава I ПРОБИОТИКИ стимуляторов роста (сульфита натрия, гемина, стимулятора роста Карпузиди). Изучение выживаемости микроорганизмов пробиотиков проводили на модели in vitro, имитирующей условия пищеварения в организме человека. В качестве основы была использована модель, описанная в методических рекомендациях «Оценка безопасности наноматериалов» [8]. Модельные среды готовили на основе цитратнофосфатного буферного раствора и ферментных препаратов ацидин-пепсина, регистрационный номер ЛС-001355; производство РУП «Белмедпрепараты», Минск (Беларусь), панзинорм форте 20000, регистрационный номер П № 014602 / 01; производство ООО «КРКА-РУС», г. Истра Московской области (Россия). Оценку взаимоотношений микроорганизмов пробиотиков и индигенных микроорганизмов в условиях совместного культивирования in vitro на плотной питательной среде проводили согласно методике, описанной в работе [9]. Общее количество микробных клеток в одной дозе препарата пробиотика определяли подсчетом в камере Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец»). Количество живых микроорганизмов в препаратах пробиотиков и в суспензиях после взаимодействия с ферментными препаратами и инкубации модельных сред и суспензий в анаэростате при температуре 37 °С определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений исследуемых суспензий на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчета выросших колоний по истечении времени инкубирования. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И. П. Ашмарина и А. А. Воробьева [10]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основываясь на методических рекомендациях [8], нами была разработана методика изучения выживаемости пробиотических микроорганизмов в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека. Суть методики состоит в инкубации микроорганизмов последовательно в кислой модельной среде с ацидин-пепсином (рН 2,0) и щелочной модельной среде с панзинорм форте 20000 (рН 7,2) в течение среднего времени пребывания смешанной пищи соответственно в желудке и кишечнике с последующим определением числа выживших микроорганизмов и их общего количества в исходной суспензии путем подсчета в камере Горяева. В соответствии с разработанной методикой определяли количество жизнеспособных бактерий в одной дозе препарата (КОЕ·мл — 1) в начале эксперимента (0 час), через 4 часа инкубации в кислой среде в присутствии ацидин-пепсина (0,5 мг·мл — 1) и через 12 часов инкубации в щелочной среде в присутствии панзинорм форте 20000 (2,5 мг·мл — 1). Результаты определений представлены в табл. 1 и 2. Из представленных данных следует, что в результате воздействия на пробиотические микроорганизмы факторов, имитирующих таковые в желудочно-кишечном тракте человека, происходит заметное снижение числа жизнеспособных микробных клеток: сначала в кислой среде с ферментным препаратом ацидин-пепсином число жизнеспособных микроорганизмов снижается на два-три порядка по сравнению с исходным количеством, а затем в щелочной среде с ферментным препаратом панзинорм форте 20000 — еще на один-два порядка. Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных можно с большой долей вероятности утверждать, что в реальных условиях заместительной терапии пробиотическими препаратами бифидумбактерин, лактобактерин в результате пассажа через желудочно-кишечный сборник научных статей Дисбактериозы являются актуальной проблемой медицины, привлекающей пристальное внимание ученых и профильных врачей-клиницистов, ежедневно сталкивающихся с микроэкологическими нарушениями при клинической патологии различного происхождения [1; 2]. С дисбактериозами связаны многочисленные проявления болезней, расстройства в функционировании тех или иных органов и систем [1; 3]. Современные подходы к лечебной коррекции дисбиотических изменений в кишечнике больных и восстановлению нормальной микрофлоры включают ряд мероприятий, связанных как с патогенетическим лечением основного заболевания, так и, в случае необходимости, с избирательной деконтаминацией условнопатогенной и патогенной микрофлоры и последующим усилением местного и системного иммунитета [1; 3]. Параллельно проводится восстановление индигенной микрофлоры путем коррекции нарушений микробиоценоза. Среди множества средств коррекции нарушений микрофлоры кишечника пробиотики занимают особое место в связи с теми эффектами (общего характера, гуморальными и клеточными), которые регистрируются как объективно, так и субъективно — улучшением самочувствия больного [4; 5]. Появление нового поколения пробиотиков связано не только с совершенствованием технологии их производства, но и с имеющимися случаями низкого, а порой и нулевого эффекта от их применения при некоторых дисбиотических состояниях. В этой связи в плане комплексной профилактики и лечения дисбактериозов чрезвычайно важно внедрить в практику новые подходы к нормализации микрофлоры, в частности связанные со стимуляцией собственной индигенной микрофлоры больного [1]. В то же время не решен вопрос о выживаемости пробиотических микроорганизмов при их пероральном применении в ходе продвижения по пищеварительному тракту, что предопределяет необходимость проведения микробиологических исследований в данном направлении. Цель настоящего исследования — оценка выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro, имитирующих пищеварение в желудке и кишечнике человека, и изучение взаимоотношения пробиотических и индигенных микроорганизмов в условиях совместного культивирования in vitro на плотной питательной среде. 5 ВВЕДЕНИЕ Глава I ПРОБИОТИКИ тракт в толстую кишку больного дисбактериозом поступает сниженное количество пробиотических микроорганизмов, недостаточное для получения лечебного эффекта. Н. А. Глушановой и Б. А. Шендеровым [9] в ходе изучения взаимоотношений пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro выявлено 3 типа взаимодействия: отсутствие антагонизма — биосовместимость (15,2%), подавление роста индигенных лактобацилл — биосовместимость по типу «пробиотик против хозяина» (62,3%) и ингибирование роста пробиотических бактерий — биосовместимость по типу «хозяин против пробиотика» (22,5%). В проведенных нами в соответствии с методикой авторов [9] исследованиях с использованием двух клинических изолятов индигенных лактобацилл, изолированных из фекалий больных (L. аcidophilus № 1, L. brevis № 2), было показано, что оба изолята проявляли антагонистические взаимоотношения (по типу «хозяин против пробиотика») с бифидо- и лактобактериями, выделенными из биотических препаратов бифидумбактерин и лактобактерин. Полученные результаты еще раз свидетельствуют о необходимости предварительного исследования взаимоотношения пробиотических культур с индигенными лактобациллами пациента, которому назначают соответствующий пробиотический препарат. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Клинические наблюдения и экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что у многих жителей России, в том числе и у детей, имеет место выраженный дисбаланс нормальной микрофлоры кишечника [1; 9]. Именно от состояния кишечника, его нормальной микрофлоры на 70 – 80% зависит сопротивляемость организма к болезням. В постоянных симбиотических или антагонистических взаимоотношениях микроорганизмы нормальной микрофлоры развиваются, используя перевариваемую пищу и компоненты, секретируемые в желудочно-кишечный тракт организмом, и наконец экскретируются во внешнюю среду [11; 12]. В то же время в научной литературе имеется практически единственное указание [2] на то, что в сознании врача развитие заболевания не всегда ассоциируется с микроэкологическими нарушениями в кишечнике больного, которому планируется назначение пробиотиков с лечебной или профилактической целью. Безусловно, многолетний Таблица 1. ВЫЖИВАЕМОСТЬ БИФИДОБАКТЕРИЙ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА БИФИДУМБАКТЕРИН В МОДЕЛЬНЫХ СРЕДАХ И УСЛОВИЯХ, ИМИТИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЧЕЛОВЕКА (N = 5) Серия Штаммы препарата бифидобактерий 090210 245 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 315–6 288–1 5074 Пористая масса бежевого цвета Пористая масса B. bifidum 1 или беловато-серого цвета Пористая масса светлоB. bifidum 791 коричневого цвета Пористая масса бежевого цвета Пористая масса светлокоричневого цвета Пористая масса бежевого цвета Кристаллическая масса светло-коричневого цвета Пористая масса светлокоричневого цвета Пористая масса бежевого цвета Общее количество бактерий в одной дозе препарата, определенное в камере Горяева Содержание живых бактерий в пробе на…час – эксперимента, КОЕ·мл-1 (Х±I95) 0 4 12 1,9 · 107 (1,7 ± 0,2) · 107 (1,2 ± 0,4) · 104 (1,8 ± 0,5) · 103 1,8 · 107 (1,7 ± 0,2) · 107 (1,1 ± 0,3) ·104 (4,5 ± 0,2) ·102 1,9 · 107 (1,8 ± 0,3) · 107 (1,0 ± 0,4) · 104 (3,9 ± 0,4) · 102 2,0 · 107 (1,1 ± 0,3) · 107 (4,0 ± 0,5) · 105 (2,0 ± 0,3) · 103 2,1 · 107 (1,2 ± 0,3) · 107 (2,0 ± 0,4) · 105 (2,5 ± 0,4) · 103 1,6 · 107 (1,2 ± 0,4) · 107 (2,2 ± 0,5) · 105 (3,1 ± 0,3) · 103 1,4 · 107 (7,8 ± 0,6) · 10 6 (3,6 ± 0,5) · 10 4 (1,5 ± 0,4) · 103 1,2 · 107 (6,4 ± 0,5) · 105 (2,4 ± 0,3) · 104 (1,0 ± 0,3) · 102 1,2 · 107 (6,1 ± 0,4) · 105 (2,6 ± 0,5) · 10 4 (1,6 ± 0,5) · 102 Таблица 2. ВЫЖИВАЕМОСТЬ ЛАКТОБАКТЕРИЙ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ЛАКТОБАКТЕРИН В МОДЕЛЬНЫХ СРЕДАХ И УСЛОВИЯХ, ИМИТИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЧЕЛОВЕКА (N = 5) Серия препарата 15 / 6 125 – 2 125 – 6 6 Внешний вид лиофилизированной микробной массы Штаммы лактобактерий Внешний вид лиофилизированной микробной массы L. plantarum8Р- Пористая масса желтоватобежевого цвета А3, или L. planПористая масса беловатоtarum38, серого цвета или L. fermentum 90Т-С4, Пористая масса желтоватобежевого цвета или L. fermenТо же tum 39 Пористая масса желтоватобежевого цвета То же Кристаллическая масса светло-коричневого цвета Общее количество бактерий в одной дозе препарата, определенное в камере Горяева Содержание живых бактерий в пробе на…час – эксперимента, КОЕ·мл-1 (Х±I95) 4,0 · 109 (2,1 ± 0,4) · 109 (4,0 ± 0,5) · 105 (2,0 ± 0,4) · 103 4,1 · 109 (2,2 ± 0,4) · 109 (3,6 ± 0,5) · 105 (2,2 ± 0,3) · 103 4,5 · 109 (4,6 ± 0,6) · 109 (2,0 ± 0,6) · 106 (2,6 ± 0,4) · 102 4,5 · 109 (4,2 ± 0,5) · 109 (2,2 ± 0,5) · 106 (1,8 ± 0,4) · 102 4,1 · 109 (3,2 ± 0,4) · 109 (2,4 ± 0,5) · 107 (1,2 ± 0,6) · 106 4,0 · 109 (3,1 ± 0,5) · 109 (2,5 ± 0,6) · 107 (1,5 ± 0,6) · 106 3,9 · 109 (3,7 ± 0,6) · 109 (2,1 ± 0,5) · 106 (1,1 ± 0,5) · 105 0 4 12 Глава I ПРОБИОТИКИ ряться в клиническую практику, состоит в использовании пребиотической эффективности инулина и олигофруктозы. Волокна инулина и олигофруктозы, как это экспериментально подтверждено, избирательно стимулируют рост и метаболическую активность только определенных видов бактерий — бифидобактерий и лактобацилл, не влияя на развитие других бактерий (фузобактерий, пропионибактерий, бактероидов и т. д.). Именно таким пребиотическим эффектом обладает созданный в России препарат Стимбифид, содержащий фруктоолигосахариды, фруктополисахариды и премикс витаминно-минеральный. Указанный эффект был продемонстрирован в экспериментах in vitro и на людях разных возрастных категорий — младенцах и детях раннего возраста, на взрослых людях и людях преклонного возраста, о чем свидетельствуют результаты клиниколабораторного исследования пребиотика Стимбифид [5]. С учетом этих результатов и экспериментальных данных, полученных в настоящей работе, можно предположить, что пребиотики на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов могут занять свое особое место в лечении и профилактике микроэкологических нарушений в кишечнике в качестве перспективных препаратов для использования в практической медицине. 1. Воробьев А. А., Абрамов Н. А., Бондаренко В. М., Шендеров Б. А. Дисбактериозы — актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. — 1997. — № 3. — С. 4 – 7. 2. Воробьев А. А., Бондаренко В. М., Лыкова Е. А. и др. Микроэкологические нарушения при клинической патологии и их коррекция бифидосодержащими пробиотиками // Вестн. РАМН. — 2004. — № 2. — С. 13 – 17. 3. Бондаренко В. М., Петровская В. Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестн. РАМН. — 1997. — № 3. — С. 7 – 10. 4. Утемурадова Г. Э. Этиология острых кишечных инфекций у детей и эффект пробиотикотерапии // Журн. микробиол. — 2009. — № 3. — С. 80 – 100. 5. Грачева Н. М., Ардатская М. Д., Аваков А. А., Соловьева А. И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. — М.: Московский НИИЭМ им. Г. Н. Габричевского, 2010. 6. Иванов В. П., Бойцов А. Г., Коваленко А. Д. и др. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. — СПб.: Центр госсанэпиднадзора, 2002. 7. Лихачева А. Ю., Бондаренко В. М., Соколова К. Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus // Журн. микробиол. — 1992. — № 9 – 10. — С. 74 – 78. 8. Методические рекомендации «Оценка безопасности наноматериалов». Утв. приказом Роспотребнадзора от 12.10.2007 г. № 280. — М.: Роспотребнадзор, 2007. 9. Глушанова Н. А., Шендеров Б. А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro // Журн. микробиол. — 2005. — № 2. — С. 56 – 61. 10. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. — Л.: Медгиз, 1962. 11. Mitsuoka T. Intestinal fl ora and host // Asian Med. J. — 1988. — Vol. 31, № 7. — P. 400 – 409. 12. Gorbach S. L. Function of the normal human microfl ora // Scand. J. Infect. Diseases. — 1986. — Vol. 18, Suppl. № 49. — P. 17 – 30. 13. Кузнецов О. Ю. Бактериальная колония как сложно организованное сообщество клеток // Журн. микробиол. — 2005. — № 2. — С. 3 – 7. 14. Минушкин О. Н., Ардатская М. Д., Зверков И. В., Чичерин И. Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. — М.: Учебнометодический центр управления делами Президента Российской Федерации, 2010. сборник научных статей ЛИТЕРАТУРА 7 опыт применения пробиотических препаратов свидетельствует о физиологичности и значимости для больного такой заместительной терапии. Однако, положительный эффект пробиотиков, как свидетельствует опыт клиницистов, носит временный характер, а при ряде дисбиотических состояний эффект отсутствует. Важнейшим фактором, определяющим приживление или элиминацию пробиотических микроорганизмов в кишечнике больного, является состояние колонизационной резистентности [9], что, в свою очередь, связано с биологическими свойствами пробиотических бифидо- и лактобактерий и индигенных представителей кишечной микрофлоры. С одной стороны, между колониями микроорганизмов и кишечной стенкой складывается тесная взаимосвязь, объединяющая их в единый микробно-тканевой комплекс [13; 14], а с другой — между самими микроорганизмами формируется определенный тип взаимоотношений и, как следствие, их конкурентоспособность или совместимость. Именно для лечебной коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике и преодоления бионесовместимости предлагается производить новые поливалентные или комбинированные препараты с иммобилизованными бактериями различных таксономических групп [2] или искать новые оригинальные способы нормализации микрофлоры с помощью лекарственных препаратов. При всей важности указанных подходов практически не изученным остается такой микробиологический аспект заместительной терапии пробиотическими препаратами при дисбактериозах, как выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте больного при пероральном их поступлении. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что на численность пробиотических микроорганизмов отрицательное влияние оказывают кислая и сменяющая ее щелочная модельные среды, содержащие соответственно ацидинпепсин и панзинорм форте 20000, имитирующие in vitro условия пищеварения у человека. Естественно, что в условиях in vivo на пробиотические микроорганизмы воздействует гораздо больше, чем в эксперименте, факторов, приводящих к гибели значительной части их популяций. Снижение численности популяции микроорганизмов пробиотиков ниже критической в соответствии с экологическими принципами ведет к гибели всей популяции. Это одна из причин низкой эффективности пробиотикотерапии либо ее отсутствия. Другой причиной низкой эффективности заместительной пробиотикотерапии может быть бионесовместимость по типу «хозяин против пробиотика» [9]. В наших экспериментах по изучению взаимоотношения пробиотических бифидобактерий и лактобактерий и индигенных лактобацилл (двух клинических изолятов, выделенных из фекалий людей) в условиях совместного культивирования in vitro была однозначно показана их бионесовместимость. Именно такие антагонистически активные лактобациллы больного могут полностью предотвратить приживление пробиотических микроорганизмов. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о необходимости предварительного исследования взаимоотношения пробиотических микроорганизмов, которые будут предписаны врачом больному, с его индигенными микроорганизмами. Это позволит отбирать наиболее активные для конкретного пациента пробиотические препараты. Это во-первых. А во-вторых, необходимо стимулировать существующие в кишечнике больного, хоть и в минимальном количестве, микроорганизмы нормальной микрофлоры. Оригинальность данного способа нормализации микрофлоры, о чем говорится в работе [1], но который только сейчас в силу ряда обстоятельств начинает внед- Глава I ПРОБИОТИКИ ВЫЖИВАЕМОСТЬ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO В ЖЕЛУДОЧНОМ СОКЕ И ДУОДЕНАЛЬНОМ СОДЕРЖИМОМ ЛЮДЕЙ* Чичерин И.Ю.1, Дармов И.В.2, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2, Гаврилов К.Е.2 1 ООО «МедСтар», 2 ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», г. Киров SURVIVAL OF BIFIDOBACTERIA AND LACTOBACILLI UNDER THE CONDITIONS IN VITRO IN HUMAN GASTRIC JUICE AND DUODENAL CONTENTS I.Yu. Chicherin1, I.V. Darmov2, I.P. Pogorelsky2, I.A. Lundovskikh2, K.E. Gavrilov2 1 LLC «MedStar», 2 Vyatka State University 8 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ РЕЗЮМЕ Цель исследования. Оценка выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом. Материалы и методы. В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы в составе коммерческих препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин. Изучение выживаемости бифидобактерий и лактобактерий проводили в условиях in vitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом, полученных от пациентов в клинической лаборатории. Результаты. Установлено значительное снижение, особенно в случае бифидобактерий, числа жизнеспособных пробиотических микроорганизмов после инкубации в желудочном соке и дуоденальном содержимом. Наиболее существенное уменьшение числа жизнеспособных бифидобактерий и лактобактерий происходит в желудочном соке. Заключение. При выборе пробиотиков для коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике предпочтение следует отдавать препаратам, созданным на основе кислотоустойчивых штаммов микроорганизмов, сочетая их применение с пребиотическими препаратами. Ключевые слова: пробиотические микроорганизмы, желудочный сок, дуоденальное содержимое, выживаемость микроорганизмов. Purpose of the study. Assessment of survival of bifidobacteria and lactobacilli under the conditions in vitro in the gastric juice and duodenal contents. Materials and methods. Probiotic microorganisms from commercial preparations Bifidumbacterin and Lactobacterin were used in the experiments. The study of survival of bifidobacteria and lactobacilli was carried out under the in vitro conditions in the gastric juice and duodenal contents obtained from patients in the clinical laboratory. Results. Significant reduction in the number of viable probiotic microorganisms, especially in the case of bifidobacteria, was established after incubation in gastric juice and duodenal contents. The most significant decrease in the number of viable bifidobacteria and lactobacilli occurs in gastric juice. Conclusion. When choosing a probiotic for the correction of dysbiotic violations in the intestine preference should be given for preparations that is created on the basis of acid-resistant strains of microorganisms, combining them with the use of prebiotic preparations. Key words: probiotic microorganisms, gastric juice, duodenal contents, survival of microorganisms. SUMMARY ВВЕДЕНИЕ Одним из существенных вопросов, стоящих перед клиницистами, является вопрос о том, как сохранить нормальный биоценоз человеческого организма, а при необходимости – корректировать его изменения [1-6]. Микроорганизмы, заселяя различные биотопы человеческого организма, являются своеобразным биогенным фактором, определяющим здоровье или болезнь [1–8]. Синдромом, сопутствующим многим заболеваниям, является дисбактериоз, ставший актуальной проблемой медицины [2, 3, 9]. Среди современных средств коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника пробиотики все еще занимают одно из ведущих мест. В то же время в связи с расширением показаний для их назначения все чаще публикуются данные о том, что положительный эффект пробиотиков в лечении дисбактериоза носит временный характер. Одной из главных причин низкой эффективности пробиотикотерапии многими авторами считается чужеродность для человека входящих в их состав микроорганизмов [2, 3, 8]. Высокая видовая специфичность аутох- * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Выживаемость бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом людей. Медицинский альманах.- 2012.- №1.- С. 57-59. В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы, входящие в состав коммерческих препаратов Бифидумбактерин (серия 315-6, производство ФГУП «НПО «Микроген», Россия), Лактобактерин (серия 15/6 производство ФГУП «НПО «Микроген», Россия). Согласно инструкции по медицинскому применению, препарат Бифидумбактерин сухой создан на основе бифидобактерий B. bifidum 1, а препарат Лактобактерин сухой – на основе лактобактерий L. plantarum SP-A3. В одной дозе лиофилизата препарата Бифидумбактерин содержится не менее 1·107 живых бифидобактерий, а в одной дозе лиофилизата препарата Лактобактерин – не менее 2·109 живых лактобактерий. Для оценки выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в биологических средах использовали желудочный сок и содержимое двенадцатиперстной кишки, полученные от пациентов в клинической лаборатории. Выделенные из биологических сред после инкубации в них бифидобактерии и лактобактерии выращивали на плотных питательных средах рекомендованного состава [11, 12]. Выращивание пробиотических микроорганизмов в микроаэрофильных условиях осуществляли при температуре 37°С с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Marc III – LE003 (Hi Media Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Общее количество микробных клеток в одной дозе препарата определяли подсчетом в камере Горяева (модель 851, НПО «Красногвардеец»). Эксперименты по изучению выживаемости пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий проводили по видоизмененной методике, описанной в работе [10]. Суть экспериментов состоит в инкубации пробиотических микроорганизмов последовательно в желудочном соке и в дуоденальном содержимом в течение среднего времени пребывания смешанной пищи соответственно в желудке и кишечнике с последующим определением числа выживших микроорганизмов. Согласно видоизмененной методике, определяли количество жизнеспособных бактерий в одной дозе препарата (КОЕ•мл-1) в начале эксперимента (0 час), через 4 часа инкубации в желудочном соке и через 12 часов инкубации в дуоденальном содержимом. Инокуляцию пробиотических микроорганизмов после их регидратации в количестве одной суточной дозы осуществляли в свежеотобранные от пациентов желудочный сок и дуоденальное содержимое, подвергнутые предварительному центрифугированию (3000 g • 5 минут) для осаждения и последующего удаления остатков плотных компонентов пищи. После инкубирования в желудочном соке и дуоденальном содержимом микроорганизмов производили посев суспензии на плотные питательные среды в чашках Петри для определения количества выросших колоний, их морфологических и видовых характеристик. По морфологии колоний, питательным потребностям, биохимическим характеристикам выросшие микроорганизмы сохранили видовые свойства, присущие бактериям B. bifidum 1 и L. plantarum SP-A3. Результаты определения выживаемости пробиотических микроорганизмов представлены в таблицах 1 и 2. Из представленных в таблицах 1 и 2 данных следует, что под влиянием желудочного сока и содержимого двенадцатиперстной кишки пациентов М., К., Б. происходит значительное снижение числа жизнеспособных клеток, особенно в случае бифидобактерий. В желудочном соке пациента С. с пониженной кислотностью также происходит уменьшение численности жизнеспособных бифидобактерий и лактобактерий, как и в дуоденальном содержимом. Однако, это снижение не столь катастрофично для популяций пробиотических микроорганизмов, что в последующем может содейство- Таблица 1. Выживаемость бифидобактерий пробиотического препарата Бифидумбактерин в желудочном соке и дуоденальном содержимом людей (n=5) Пациент M. К. Б. С. рН желудочного рН дуоденального сока, ед. рН содержимого, ед. рН 1,5 1,6 1,6 7,7 8,2 8,4 8,8 8,0 Общее количество бактерий в одной дозе препарата, определенное в камере Горяева 1,4•107 Содержание живых бактерий в пробе на … – час эксперимента, КОЕ•мл-1 (Х±I95) 0 4 12 (1,2±0,5)•107 502±35 45±7 (1,1±0,4)•107 386±25 28±3 (1,3±0,6)•107 236±10 20±4 (1,4±0,4)•107 (7,6±0,5)•107 (8,3±0,7)•105 Примечание. Здесь и в таблице 2 «n» - количество повторных определений содержания живых бактерий в пробах от каждого пациента. Глава I ПРОБИОТИКИ Результаты исследования сборник научных статей Материалы и методы Количество живых микроорганизмов в препаратах пробиотиков и в биологических средах (желудочном соке и дуоденальном содержимом) по истечении времени инкубирования определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений исследуемых суспензий микроорганизмов на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчетом выросших колоний. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [13]. 9 тонной микрофлоры кишечника пациентов не оставляет шансов пробиотическим микроорганизмам на приживление, особенно если учесть снижение численности популяции последних в результате преодоления защитных барьеров желудочно-кишечного тракта. В выполненных нами исследованиях впервые экспериментально установлено значительное снижение бифидобактерий и лактобактерий, являющихся основой сертифицированных пробиотиков Бифидумбактерин и Лактобактерин, при их инкубации in vitro в модельных средах, имитирующих пищеварение в желудке и кишечнике человека [10]. В этой связи представлялось актуальным, сохранив преемственность, изучить выживаемость тех же бифидобактерий и лактобактерий, входящих в состав коммерческих препаратов, которые назначаются в течение нескольких десятилетий лечащим врачом пациентам, страдающим дисбактериозом, в экспериментах in vitro, но теперь уже в биологических средах, полученных непосредственно от пациентов. Цель настоящего исследования – оценка выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом. Глава I ПРОБИОТИКИ Таблица 2. Выживаемость лактобактерий пробиотического препарата Лактобактерин в желудочном соке и дуоденальном содержимом людей (n=5) Пациент рН желудочного рН дуоденального сока, ед. рН содержимого, ед. рН M. К. Б. С. 1,5 1,6 1,6 7,7 Общее количество бактерий в одной дозе препарата, определенное в камере Горяева 8,2 8,4 8,8 8,0 вать приживлению бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике и проявлению пробиотического эффекта. 10 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Обсуждение У многих жителей России, в том числе и у детей, имеет место выраженный дисбаланс нормальной микрофлоры кишечника [2-5, 8, 9]. По мнению ряда авторов [2, 3, 5, 8], выбор терапии при дисбактериозах должен быть корректным и направленным на то звено нарушенной регуляции, которое утратило возможность самовосстановления. Именно нормальная микрофлора кишечника требует применения эффективных средств и методов, способствующих ее самовосстановлению. С целью регуляции, профилактики и коррекции кишечного микробиоценоза используют пробиотики, пребиотики, синбиотики, микробные метаболиты. Относительно использования пробиотиков нужно отметить следующее. Их эффективность хорошо известна, однако она часто носит транзиторный характер [2, 3, 5, 8]. Исходя из этого, современные принципы лечебной коррекции нормальной кишечной микрофлоры базируются как на использовании пребиотиков в постоянном режиме, так и сочетанного их курсового приема с пробиотиками для лечения и профилактики нарушений микробиоценоза кишечника. Бактериологические исследования по изучению выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в модельных средах в условиях in vitro, имитирующих пищеварение в желудке и кишечнике человека [10], подтвердили факт гибели значительной части пробиотических микроорганизмов. Снижение численности популяции микроорганизмов пробиотиков ниже критической и невозможность занять экологическую нишу в кишечнике больного предопределяют необходимость стимуляции собственной кишечной микрофлоры, что лежит в основе концепции пребиотической терапии, во главу угла которой поставлено стимулирующее влияние преимущественно на популяции бифидобактерий и лактобактерий [14-17]. Настоящими исследованиями, результаты которых представлены в таблицах 1, 2, выполненными также in vitro, но с заменой модельных сред на желудочный сок и содержимое двенадцатиперстной кишки пациентов, проходивших обследование в поликлинике, подтверждены данные, приведенные в работе [10], о негативном воздействии на жизнеспособность пробиотических микроорганизмов секретов желудка и двенадцатиперстной кишки. При этом особо следует отметить более высокую чувствительность бифидобактерий: после пребывания в кислой среде желудочного сока и последующей инкубации в щелочной среде дуоденального содержимого жизнеспособными остаются десятки микробных клеток в сравнении с их исходным количеством, равным (1,1 – 1,3)•107 КОЕ•мл-1. 3,9•109 Содержание живых бактерий в пробе на … – час эксперимента, КОЕ•мл-1 (Х±I95) 0 4 12 (3,4±0,6)•109 (3,5±0,7)•104 (2,4±0,5)•105 (3,2±0,6)•109 (3,6±0,6)•105 (3,6±0,6)•105 (3,4±0,5)•109 (2,1±0,5)•105 (1,8±0,4)•102 (3,5±0,6)•109 (2,4±0,6)•108 (2,6±0,5)•106 С большой долей вероятности можно утверждать, что кислотность желудочного сока относится к разряду критических факторов в отношении пробиотических микроорганизмов. Об этом свидетельствуют результаты бактериологического изучения жизнеспособности бифидобактерий и лактобактерий в желудочном соке пациента С.: при значении рН, равном 7,6, выживаемость исследуемых пробиотических микроорганизмов снижается лишь на порядок, в то время как при рН 1,51,6 жизнеспособность микроорганизмов катастрофически снижается. Хотя в последующем при инкубации в дуоденальном содержимом пациента С. и происходит дальнейшее снижение числа жизнеспособных бифидобактерий и лактобактерий, но и в этом случае их количество примерно на четыре порядка больше, чем в случае инкубации в дуоденальном содержимом, полученном от пациентов М., К., Б. Сделанный нами ранее вывод о необходимости выработки индивидуального подхода при назначении пробиотического препарата конкретному пациенту [10], подкрепленный результатами настоящих исследований, предполагает, с одной стороны, назначение пациенту пробиотиков на основе бактериальных штаммов, способных преодолевать кислотно-щелочной барьер желудочно-кишечного тракта и приживаться в нем, а с другой стороны, создание и применение индивидуальных пробиотиков на основе аутоштаммов или их ассоциаций. В то же время, с учетом результатов бактериологического обследования пациентов и клинико-лабораторных исследований эффективности современных препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта [2-8, 14-18] весьма важно осуществлять своевременную и эффективную коррекцию этих нарушений. Необходимо применять индивидуально подобранные пробиотики в сочетании с современными пребиотическими препаратами, зарекомендовавшими себя с наилучшей стороны с точки зрения восстановления собственной микрофлоры кишечника. Выводы 1. Изучена выживаемость бифидобактерий и лактобактерий, составляющих основу сертифицированных пробиотических препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин, в условиях in vitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом людей. 2. Установлено, что за время инкубирования бифидобактерий и лактобактерий в желудочном соке и дуоденальном содержимом, равном среднему времени пребывания смешанной пищи в пищеварительном тракте человека, происходит значительное сокращение количества жизнеспособных пробиотических микроорганизмов, вплоть до единичных клеток в случае бифидобактерий. 3. Более высокая сохраняемость жизнеспособности бифидобактерий и лактобактерий в случае их инкубирования в желудочном соке пациента с пониженной кислот- Глава I ПРОБИОТИКИ 1. Елизаветина Г.А., Ардатская М.Д., Минушкин О.Н. Хронические заболевания кишечника. Современный взгляд на экологию, патогенез. диагностику и лечение (обзор). Клин вестник 1998; 2: 22–25. 2. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Дубинин А.В. Дисбактериоз кишечника: современные аспекты изучения проблемы, принципы диагностики и лечения. Обзор. Терапевт архив 2001; 2: 67–72. 3. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Дисбактериоз кишечника: эволюция взглядов. Современные принципы диагностики и фармакологической коррекции. Consilium nudicum Приложение Гастроэнтералогия 2006; 2: 4–18. 4. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В. Эффективность коррекции нарушения микробиоценоза толстой кишки у детей с учетом его возрастных особенностей. Сборник матер. науч.-практ. конф. педиатров России «Фармакология и диетология в педиатрии». 2007. Москва; 2007. 5. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про– и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. М: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского; 2010; 23 с. 6. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю. Фруктоолиго – и фруктополисахариды в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника у больных бронхолегочной патологии, получающих антибактериальную терапию. Эксп клин гастроэнтерол 2011; 3: 79–89. сборник научных статей ЛИТЕРАТУРА 7. Guarner F., Malagelada J.R. Gut flora in health and disease. Lancet 2003; 361: 512–519. 8. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта. Дис. … д-ра мед. наук. М; 2003. 9. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины. Вестн РАМН 1997; 3: 4–7. 10. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека. Эксп клин гастроэнтерол 2011; 3: 6–11. 11. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника. Информационное письмо. СПб: ФГУ «Центр госсанэпиднадзора»; 2002; 31 с. 12. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн микробиол 1992; 9-10: 74–78. 13. Ашмарин И.П. Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз; 1962; 280 с. 14. Андреева И.В. Когда следует назначить пробиотики? Клин микробиол антимикроб химиотер 2011; 13 (3): 279–282. 15. Rowland I.R., Tanaka R. The effects of transgalactosylated oligosaccharides on gut flora metabolism in rats associated with a human faecal microflora. J Appl Bacteriol 1993; 74: 667–674. 16. Simmering R., Blaut M. Pro- and prebiotics – the tasty guardian angles? Appl Microbiol Biotechnol 2001; 55: 19–28. 17. Gibson G.R., Probert H.M., Van Loo J.A.E., Roberfroid M.B. Dietary odulation of the human colonic microbiota: Updating the concept of prebiotics. Nutr Res Rev 2004; 17: 257–259. 18. Захаренко С.М., Фоминых Ю.А., Мехтиев С.Н. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром. Эффект фармакотерапия Гастроэнтерология 2011; 3: 14–20. 11 ностью свидетельствует о том, кислотность желудочного сока относится к числу критических факторов, негативно влияющих на жизнеспособность пробиотических микроорганизмов. Глава I ПРОБИОТИКИ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЫЖИВАЕМОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОБИОТИКОВ В СОСТАВЕ КОММЕРЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO* Дармов И.В.1, Чичерин И.Ю.2, Ердякова А.С.1, Погорельский И.П.1, Лундовских И.А.1 1 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии, 2 ООО «МедСтар» COMPARATIVE ASSESSMENT OF SURVIVAL OF PROBIOTIC MICROORGANISMS FROM COMMERCIAL PREPARATIONS UNDER THE CONDITIONS IN VITRO I.V. Darmov1, I.Yu. Chicherin2, A.S. Erdyakova1, I.P. Pogorelsky1, Lundovskikh I.A.1 12 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 1 Vyatka State University, 2 LLC «MedStar» РЕЗЮМЕ SUMMARY Цель исследования. Оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro, имитирующих пищеварение в желудке и кишечнике человека. Материалы и методы. В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы в составе отечественных и зарубежных коммерческих препаратов. Изучение выживаемости микроорганизмов пробиотиков проводили на модели in vitro, имитирующей условия пищеварения в организме человека. Результаты. Установлено значительное снижение числа жизнеспособных микроорганизмов, входящих в состав 20 из 23 изученных пробиотических препаратов, при их инкубации в модельных средах. Хорошей выживаемостью в условиях in vitro обладают микроорганизмы пробиотических препаратов Бактисубтил, Споробактерин и Биоспорин. Заключение. При выборе пробиотиков для коррекции микробиоценоза кишечника необходим индивидуальный подход, учитывающий взаимоотношения микроорганизмов пробиотиков с индигенной микрофлорой, а также возможность использования современных пребиотиков в ходе сочетанной терапии дисбактериоза. Ключевые слова: индигенные и пробиотические микроорганизмы; пребиотики; модельные среды; выживаемость микроорганизмов пробиотиков. Purpose of the study. Assessment of survival of probiotic microorganisms from commercial preparations under the conditions in vitro simulates digestion in human stomach and intestine. Materials and methods. Probiotic microorganisms from domestic and foreign commercial preparations were used in experiments. Study of survival of probiotic microorganisms was carried out on the model in vitro simulates the conditions of digestion in the human body. Results. A significant reduction in the number of viable probiotic microorganisms in the 20 of 23 studied commercial preparations during their incubation in the model media is established. Probiotic microorganisms in the preparations Bactisubtil, Sporobacterin and Biosporin possess a good survival under the conditions in vitro. Conclusion. The selection of probiotics for the correction of intestinal microbiocenosis requires an individual approach that takes into account the character of relations of probiotic microorganisms and indigenous microorganisms of patient as well as the possibility of using advanced prebiotics in the combine treatment of dysbacteriosis. Key words: indigenous and probiotic microorganisms, prebiotics, model media, survival of probiotic microorganisms. ВВЕДЕНИЕ проявления болезней, расстройства в функционировании тех или иных органов и систем часто напрямую связаны с нарушениями микробиоценоза кишечника [1-3]. Увеличение частоты и тяжести острых инфекционных заболеваний, латентное течение воспалительных процессов и переход их в хроническое состояние многими специалистами связываются с нарушениями качественного и количественного состава нормальной микрофлоры, что Внимание терапевтов, педиатров, врачей общей практики, других специалистов привлек проходивший в рамках Российского национального конгресса «Человек и лекарство» гастроэнтерологический симпозиум «Новые подходы к терапии заболеваний желудочно-кишечной системы» [1]. Интерес участников и гостей симпозиума к обсуждаемой тематике связан с тем, что многочисленные * Ссылка для цитирования: Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Ердякова А.С., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro. Экспер. и клин. гастроэнтерология.- 2011.- №9.- С. 96 – 101. В экспериментах исследовали 23 коммерческих пробиотических препарата, характеристика которых и видовой состав микроорганизмов представлены в таблице 1. Срок годности препаратов не превышал сроков, указанных на упаковках (от 34 до 100 %). Выращивание пробиотических микроорганизмов проводили на плотных питательных средах рекомендованного состава [6; 7]. При выращивании пробиотических микроорганизмов в микроаэрофильных условиях использовали систему для анаэробного культивирования Anaerobic system Mark III – LE003 (Нi Media Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Нi Anaero Gas Pacet. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков проводили в условиях in vitro, имитирующих условия пищеварения в организме человека. В качестве основы была выбрана модель, описание которой приведено в методических рекомендациях «Оценка безопасности наноматериалов» [8]. Модельные среды готовили на основе цитратно-фосфатного буферного раствора и ферментных препаратов ацидин-пепсина, регистрационный номер ЛС-001355 (производство РУП «Белмедпрепараты», г. Минск, Беларусь), панзинорм форте 20000, регистрационный номер П№014602/01 (производство ООО «КРКА-РУС», г.Истра Московской области, Россия). Количество живых микроорганизмов в препаратах пробиотиков и в суспензиях после взаимодействия с ферментными препаратами и инкубации модельных сред и суспензий бактерий определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений исследуемых препаратов и суспензий на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчета выросших колоний по истечении времени инкубирования. Статистическую обработку результатов исследований проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [9]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Суть экспериментов состояла в инкубировании микроорганизмов изучаемых препаратов пробиотиков после- Глава I ПРОБИОТИКИ сборник научных статей МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ довательно в кислой модельной среде с ацидин-пепсином (рН 2,3) и щелочной модельной среде с панзинорм форте 20000 (рН 7,2) в течение среднего времени пребывания смешанной пищи соответственно в желудке и кишечнике с последующим определением числа выживших микроорганизмов в сравнении с их исходным количеством. Содержание жизнеспособных пробиотических микроорганизмов в одной дозе препарата (КОЕ·мл-1) определяли в начале эксперимента (0 ч), через 4 ч инкубации в кислой модельной среде с ацидин-пепсином (0,5 мг·мл-1) и через 12 ч инкубации в щелочной модельной среде с панзинорм форте 20000 (2,5 мг·мл-1). Результаты определений представлены в таблице 1. Из представленных в таблице 1 данных следует, что практически все пробиотические микроорганизмы, за исключением входящих в состав препаратов Бактисубтил и Споробактерин, претерпевают отрицательное воздействие факторов модельных сред, имитирующих факторы в желудочно-кишечном тракте человека: снижение численности бактерий происходит как в течение 4-часового пребывания в кислой модельной среде с ацидин-пепсином, так и в щелочной модельной среде с ферментным препаратом панзинорм форте 20000. В то же время бактерии B. cereus IP 5832 препарата Бактисубтил и B. subtilis 534 препарата Споробактерин превосходно переносят градиент кислотности / щелочности модельных сред и не снижают своей численности, что подтверждено высевом соответствующих суспензий на плотные питательные среды и подсчетом выросших колоний. Ввиду того, что среди исследованных препаратов у семи (Аципол, Бактисубтил, Бифиформ, Бифолак, Линекс, Наринэ, Примадофилус Бифидус) лекарственная форма – капсулы, представлялось актуальным оценить кислотоустойчивость капсул пробиотических препаратов в сравнительных исследованиях с использованием одинаковых модельных сред. Так, пребывание капсул с пробиотическими микроорганизмами в кислой модельной среде с ацидин-пепсином (рН 2,3) позволило четко разделить их на 2 группы. Капсулы четырех пробиотических препаратов (Аципол, Бактисубтил, Линекс и Наринэ), находясь в кислой модельной среде с ацидин-пепсином, начали разрушаться на 15-17 минуте и полностью разрушились с выходом содержимого в модельную среду к 32-34 минуте. Капсулы трех других препаратов – Бифиформ, Бифолак и Примадофилус Бифидус оказались устойчивыми в кислой модельной среде и, таким образом, их можно отнести к «кишечнорастворимым оболочкам». Распад капсул и выход содержимого в щелочную модельную среду произошел при смене модельных сред в случае пробиотика Бифолак на 10 минуте (капсула разломилась пополам, а затем разрушилась), а в случае пробиотиков Бифиформ и Примадофилус Бифидус к 8 часу. Как продолжение экспериментов с инкапсулированными формами пробиотических препаратов было изучение выживаемости микроорганизмов, находящихся внутри капсул. Выживаемость микроорганизмов оценивали по отработанной методике. Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Представленные в таблице 2 результаты можно интерпретировать следующим образом. Капсулы препаратов Аципол, Линекс и Наринэ, разрушающиеся в кислой модельной среде с ацидин-пепсином, не защищают пробиотические микроорганизмы от инактивации: количество жизнеспособных бактерий снизилось на 4 порядка. Бактерии B. cereus IP 5832 препарата Бактисубтил, судя по полученным результатам, не нуждаются в защите 13 побуждает к поиску новых и эффективных приемов их коррекции [1]. В настоящее время в клиническую практику внедряют новые подходы к нормализации микрофлоры кишечника, связанные, в частности, со стимуляцией собственной индигенной микрофлоры больного [2; 4]. Результаты клинико-лабораторного исследования дали основание рекомендовать сочетанный курсовой прием пребиотиков с пробиотиками для достижения максимального эффекта лечения и профилактики нарушений микробиоценоза кишечника. В то же время при целенаправленном изучении выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro, имитирующих пищеварение в желудке и кишечнике человека [5], было установлено значительное снижение числа этих пробиотических микроорганизмов при их инкубации в модельных средах. В этой связи представлялось целесообразным расширить круг исследуемых пробиотических препаратов в плане изучения выживаемости входящих в их состав пробиотических микроорганизмов в модельных средах in vitro. Цель настоящего исследования – сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro, имитирующих пищеварение в желудке и кишечнике человека. Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 14 Таблица 1. Выживаемость пробиотических микроорганизмов в модельных средах и условиях, имитирующих процесс пищеварения у человека ПорядФирма Название Видовой состав микроорганизмов и их ковый (предприятие) и препарата, серия содержание номер страна изготовитель 1 Ацилакт, 040211 ЗАО «Фирма «Вита- L.acidophilus 100 аш; L.acidophilus NK1, фарма», Россия L.acidophilus К3Ш24; в 1 таблетке 1·107 бактерий 2 Аципол, 08 ЗАО «ФармацевLactobacillus sp., в 1 капсуле 1·107 тическая фирма бактерий «ЛЕККО», Россия 3 Бактисубтил, ЗАО «ФармФирма B.cereus IP 5832; в 1 капсуле 35 мг 0492 «Сотекс», Россия субстанции 4 Биоспорин, 149- Филиал ФГУ 48 B.subtilis 3, B.lichenifornus 31; в 1 дозе 0805 ЦНИИ МО РФ 1·109 бактерий ЦВТП БЗ, Россия 5 Бифидумбакте- ФГУП «НПО B.bifidum № 1 или № 791; в 1 дозе 1·107 рин, 315-6 «Микроген»; Россия бактерий 6 БифидумбакЗАО «Партнер», B.bifidum № 1; в 1 пакете 5·107 бактерий терин форте, Россия 16-40311 7 Бифилиз ООО «Фирма «Фер- B.bifidum № 1; в 1 дозе 1·107 бактерий (ВИГЭЛ), 50 мент», Россия 8 Бификол, 15/4 ФГУП «НПО «Мик- B.bifidum № 1, E.coli М-17; в 1 дозе 1·107 роген», Россия бактерий 9 Бифистим лак- ОАО «Биомед» им. B.adolescens, B.bifidum, B. longum; в 1 г то, 1201 И.И. Мечникова, порошка 1·108 бактерий Россия 10 Бифиформ, «Ферросан А/С», B.longum, E. faecium; в 1 капсуле 1·107 226106 Дания бактерий 11 Бифиформ «Ферросан А/С», Bifidobacterium BBTM 1·109 КОЕ, (комплекс) № Дания L.rhamnosus GG 1·109 КОЕ; L. 30, 227377 acidophilus LA-5 2·108 КОЕ в 1 таблетке 12 Бифолак, «Бифодан А/С DK- L.rhamnosus, L. longum без указания 7950125 3390», Дания количественного содержания в капсуле 13 Колибактерин, ОАО «Биомед» им. E.coli М-17; в 1 дозе 10·109 бактерий 813-20311 И.И. Мечникова, Россия 14 Лактобактерин, ФГУП «НПО «Мик- L.plantarum 8P-A3 (возможны 15/6 роген», Россия L.plantarum 38, L.fermentum 90T-C4, L.fermentum 39); в 1 дозе 2·109 бактерий 15 Линекс, BF 9149 Лек g.g., Словения L.acidophilus, B.infantis, E. faecium; в 1 капсуле 280 мг. В 1 г порошка Либенин по 300 мг каждого из микроорганизмов 16 Наринэ, СДС. ООО «НАРЭКС», L.acidophilus n.v. Ep 317/402; в 1 капсуле 500051 республика Арме100 мг лиофилизированной культуры ния 17 Нормобакт Chr. Hansen A/S, Да- L.acidophilus (La-5), Bifidobacterium (пробиотик + ния, Медана Фарма (BB-12); в 1 саше 4·109 бактерий + пребиотик), А.О., Польша фруктозоолигосахариды 298492 18 Биокомплекс ООО «НПП Бифи- B.bifidum, B.longum; в 1 мл 1·1010 бак«Нормофлорин- люкс+», Россия терий Б1», 0411 19 Биокомплекс ООО «НПП Бифи- L.casei 1·109, B.longum, B. bifidum; 1·108 «Нормофлорин- люкс+», Россия бактерий в 1 мл Д», 0407 20 Биокомплекс ООО «НПП Бифи- L.acidophilus; в 1 мл 1·109 бактерий «Нормофлорин- люкс+», Россия Л», 0410 21 ПримадофиНейчерс Вэй ПроB.breve, B.longum, L.rhamnosus, лус Бифидус, дактс, Инк., США L.acidophilus; в 1 капсуле 3,9·109 бак77.99.23.2 У терий 2809.4.09 22 Пробифор, 2ЗАО «Партнер», B.bifidum № 1; 5·108 бактерий в порош10211 Россия ке 1 пакета 23 Споробактерин ООО «Бакорен», B.subtilis 534; в 1 мл 1·109 КОЕ жидкий, суспен- Россия зия для приема внутрь, 311110 Содержание бактерий в пробе на … час – эксперимента, КОЕ·мл-1 (Х±I95) 0 4 12 (1,2±0,4)·107 (2,0±0,3)·105 (1,8±0,5)·103 (1,0±0,2)·107 (4,2±0,4)·104 (1,2±0,3)·103 (1,3±0,4)·108 (1,8±0,3)·108 (1,6±0,4)·108 (1,1±0,3)·109 (1,0±0,2)·108 (1,4±0,3)·107 (1,8±0,4)·107 (1,0±0,3)·104 (2,6±0,3)·102 (5,0±0,4)·107 (9,0±0,5)·104 (1,5±0,4)·103 (1,2±0,3)·107 (1,6±0,4)·105 (1,6±0,5)·105 (1,1±0,2)·107 (1,4±0,3)·105 (1,6±0,2)·103 (1,4±0,3)·108 (1,6±0,4)·106 (1,8±0,3)·103 (1,0±0,1)·107 (3,0±0,2)·104 (1,5±0,2)·103 (2,2±0,3)·108 (2,5±0,5)·105 (6,5±0,5)·104 (1,4±0,3)·107 (1,8±0,6)·105 (4,6±0,7)·104 (1,0±0,7)·109 (2,0±0,4)·104 (1,0±0,3)·102 (2,1±0,4)·109 (3,5±0,5)·105 (2,1±0,5)·103 (1,9±0,3)·107 (6,0±0,6)·105 (4,0±0,3)·103 (1,5±0,4)·107 (3,6±0,4)·105 (3,8±0,5)·103 (3,6±0,6)·109 (4,2±0,6)·107 (3,1±0,7)·104 (1,0±0,2)·107 (1,5±0,4)·104 (1,7±0,5)·103 (1,2±0,3)·108 (1,6±0,5)·105 (1,5±0,3)·104 (1,4±0,4)·107 (1,5±0,3)·106 (1,4±0,5)·104 (2,0±0,4)·108 (1,5±0,2)·104 (2,0±0,4)·103 (1,5±0,3)·107 (1,4±0,3)·104 (1,8±0,4)·103 (1,6±0,3)·108 (1,7±0,4)·108 (1,8±0,3)·108 1 2 3 4 5 6 7 Содержание бактерий в пробе на … час – эксперимента, КОЕ·мл-1 (Х±I95) 0 4 12 Аципол Lactobacillus sp. (1,1±0,2)·107 (4,4±0,5)·104 (1,3±0,4)·103 Бактисубтил B.cereus IP 5832 (2,1±0,3)·108 (2,2±0,4)·108 (2,0±0,5)·108 Линекс L.acidophilus, B.infantis, E. faecium (1,8±0,4)·107 (4,0±0,3)·105 (1,8±0,4)·103 Наринэ L.acidophilus n.v. Ep 317/402 (1,8±0,3)·107 (3,5±0,5)·105 (2,4±0,4)·103 Бифиформ B.longum, E. faecium (1,2±0,2)·107 (1,3±0,3)·107 (2,3±0,5)·106 Бифолак L.rhamnosus, L. longum (1,5±0,3)·107 (1,5±0,4)·107 (5,0±0,4)·106 Примадофилус Бифидус B.breve, B.longum, L.rhamnosus, L.acidophilus (3,2±0,4)·109 (3,3±0,5)·109 (2,5±0,4)·108 Название препарата Видовой состав микроорганизмов капсулы, которая довольно быстро разрушается в кислой модельной среде с ацидин-пепсином: число жизнеспособных бактерий B. cereus IP 5832 не снизилось к концу срока эксперимента. Пробиотические микроорганизмы препаратов Бифиформ, Бифолак и Примадофилус Бифидус, заключенные в кислотоустойчивые («кишечнорастворимые») капсулы оказались надежно защищенными от кислой модельной среды с ацидин-пепсином, и лишь после разрушения капсулы в щелочной среде с ферментным препаратом панзинорм форте 20000 их численность примерно в 10 раз снизилась по сравнению с исходными значениями. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Оценивая результаты лечения дисбактериоза кишечника и эффективность пробиотикотерапии, клиницисты опираются на клинико-бактериологические исследования, в частности, на объективное ощущение больным уменьшение метеоризма, отчетливую тенденцию к закреплению стула, что положительным образом сказывается при диареях, на уменьшение или полное прекращение выделений из кишечника условно-патогенных микроорганизмов [4]. С привлечением биохимического метода исследований индигенной микрофлоры кишечника у выздоравливающих пациентов отмечается выраженная динамика повышения метаболической активности облигатной микрофлоры [1; 4]. В тоже время, с расширением спектра показаний для назначения пробиотиков стала появляться информация о том, что их положительный эффект даже при длительном применении носит транзиторный характер, а порой и полностью отсутствует [4; 10]. Одной из главных причин снижения или отсутствия пробиотического эффекта называется чужеродность для пациента микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов, а также высокая видовая, индивидуальная и анатомическая специфичность аутохтонной микрофлоры пациента [4; 10]. Безусловно, пробиотики создают положительный эффект при дисбактериозе кишечника, но «… не всегда и не такой, как предполагалось» [10]. Выращенные искусственно и введенные в состав пробиотических препаратов, микроорганизмы становятся чужеродными и они отторгаются вследствие биологической несовместимости с индигенной микрофлорой пациента [10; 11]. Именно на эту сторону проблемы было обращено внимание в работе [5], посвященной изучению выживаемости бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека. Даже генетики, изучающие молекулярно-генетические характеристики и пробиотический потенциал лактобактерий, указывают на необходимость сохранения свойств выживания пробиотических микроорганизмов в неблагоприятных условиях микроэкологического окружения, в том числе с использованием дополнительных средств защиты в виде кислотоустойчивых капсул или сорбентов [12]. Несмотря на то, что пробиотические микроорганизмы в составе препаратов при энтеральном поступлении хорошо переносятся пациентами, описаны случаи их выделения из других биотопов организма людей. В частности, отмечено выделение бацилл B. subtilis из мочи во время лечения пробиотическим препаратом Биоспорин, в состав которого они входят [13]. Таким образом, кишечно-бактериологические исследования являются основой формирования представления об уникальности индивидуального микробного консорциума у людей и разработки концепции создания индивидуальных пробиотиков на основе аутоштаммов и аутоассоциаций симбиотических микроорганизмов [1; 4; 10]. Естественно, что индивидуальный подход к созданию и применению в лечебной практике пробиотических препаратов предполагает проведение специальных исследований по изучению выживаемости таких специализированных пробиотических микроорганизмов как в условиях in vitro, так и in vivo. В этой связи, выполненные нами исследования по оценке выживаемости пробиотических микроорганизмов в составе 23 отечественных и зарубежных препаратов представляют несомненный интерес. Полученные результаты свидетельствуют о том, что практически все пробиотические микроорганизмы чувствительны как к кислой, так и щелочной модельным средам с соответствующими ферментными препаратами. Исключение составляют бактерии B. cereus IP 5832 и B. subtilis 534, в меньшей степени B. subtilis 3 и B. licheniformis 31, входящие в состав пробиотических препаратов Бактисубтил, Споробактерин жидкий и Биоспорин соответственно, которые проявили явную устойчивость к отрицательному воздействию модельных сред, имитирующих условия, складывающиеся в желудочнокишечном тракте человека. Для защиты бактерий B. cereus IP 5832 и B. subtilis 534 в принципе нет необходимости их введения в виде лиофилизированных препаратов в защитные капсулы. В случае необходимости при разработке индивидуальных пробиотиков на основе аутоштаммов микроорганизмов целесообразно для повышения эффективности пробиотикотерапии использовать кислотоустойчивые капсулы из тех же материалов, из которых изготовлены капсулы пробиотических препаратов Бифиформ, Бифолак и Примадофилус Бифидус. Еще одним аспектом, на который следует обратить внимание, исходя из полученных в настоящих исследованиях результатов, является антибиотикотерапия, часто Глава I ПРОБИОТИКИ Порядковый номер сборник научных статей Выживаемость пробиотических микроорганизмов в капсулах, экспонируемых в модельных средах и условиях, имитирующих процесс пищеварения у человека 15 Таблица 2. Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 16 используемая при лечении основного заболевания. Выраженные изменения микробиоценоза кишечника могут быть объяснены прямым воздействием на микрофлору ранее применявшимися антибактериальными препаратами [10]. По данным Б.А.Шендерова [14], концентрация антибиотиков в фекалиях после орального введения терапевтических доз лекарственных препаратов может в значительной мере превысить их минимальную подавляющую концентрацию для большинства микроорганизмов, в том числе пробиотических. Из этого следует, что пробиотические микроорганизмы в составе препарата, принятого пациентом с лечебной или профилактической целью на фоне антибиотикотерапии, будут испытывать мощное селективное давление со стороны антибактериальных препаратов, поступивших в содержимое кишечника. Таким образом, антибактериальные препараты, кислая и щелочная среды и пищеварительные секреты в кишечнике, а также и другие факторы в значительной мере снизят количество жизнеспособных пробиотических микроорганизмов, уменьшат вероятность их проникновения внутрь биопленки кишечника и закрепления в ней. Транзиторность пробиотических микроорганизмов в данном случае будет нивелировать их пробиотический потенциал, что негативно скажется на эффективности заместительной терапии вплоть до ее отсутствия. Осознание данного обстоятельства способствовало появлению в арсенале средств, используемых для коррекции и профилактики нарушений микробиоценоза кишечника, пребиотических препаратов [10], а их применение в клинической практике стало важнейшим направлением современной профилактической и лечебной медицины [15]. Высокой пребиотической эффективностью обладает созданный в России препарат Стимбифид, содержащий фруктоолигосахариды, фруктополисахариды и премикс витаминно-минеральный «Immunity». Указанный эффект был продемонстрирован в экспериментах in vitro и на людях разных возрастных категорий – младенцах и детях раннего возраста, на взрослых людях и людях преклонного возраста, о чем свидетельствуют результаты клинико-лабораторного исследования пребиотика Стимбифид [16, 17]. Целесообразность использования пребиотиков в постоянном режиме, а также в сочетании с пробиотиками, подтверждена клинико-лабораторными исследованиями [1; 4; 10], что позволяет достичь максимального эффекта при лечении и профилактике микроэкологических нарушений кишечника. ЛИТЕРАТУРА 1. Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза // Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 77-84. 2. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. – 1997. – № 3. – С. 4-7. 3. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестн. РАМН. – 1997. – № 3. – С. 7-10. 4. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. – М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010. 5. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека // Эксперимент. и клин. гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 6-11. 6. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д. и соавт. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. – СПб.: Центр госсанэпиднадзора, 2002. – 31 с. 7. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus // Журн. микробиол. – 1992. – № 9-10. – С. 74-78. 8. Методические рекомендации «Оценка безопасности наноматериалов». Утв. Приказом Роспотребнадзора от 12.10.2007 г. № 280. – М.: Роспотребнадзор, 2007. 9. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. – Л.: Медгиз, 1962. – 280 с. 10. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю. Фруктоолиго- и фруктополисахариды в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника у больных бронхолегочной патологией, получающих антибактериальную терапию // Эксперимент. и клин. гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 79-87. 11. Реймерс Н.Ф. Экология (теории, законы, правила, принципы и гипотезы). – М.: Журнал «Россия Молодая», 1994. – 367 с. 12. Ботина С.Г., Ивашкина Н.Ю., Маев И.В. Молекулярно-генетические характеристики и пробиотический потенциал бактерий рода Lactobacillus // Молекул. медицина. – 2011. – № 2. – С. 53-57. 13. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Соловьева А.И. и соавт. Эффективность нового бактериального препарата биоспорина при лечении острых кишечных инфекций // Журн. микробиол. – 1996. – № 1. – С. 75-77. 14. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. – М.: Изд-во ГРАНТЪ, 1998. –288 с. 15. Захаренко С.М., Фоминых Ю.А., Мехтиев С.Н. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром // Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 14-20. 16. Грачева Н.М., Малышев Н.А., Чичерин И.Ю. и соавт. Фруктоолигосахариды и фруктополисахариды в комплексном лечении больных желудочно-кишечными заболеваниями с явлениями дисбактериоза кишечника // Инфекционные болезни. – 2010. – т. 8. - №1. – с. 107-111. 17. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. - М.: ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации, 2010. – 50с. Дармов И.В.1, Чичерин И.Ю.2, Погорельский И.П.1, Лундовских И.А.1, Тетерина И.С.1 1 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии, 2 ООО «МедСтар» Глава I ПРОБИОТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОБИОТИКОВ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ* EXPERIMENTAL STUDY OF SENSITIVITY OF PROBIOTIC MICROORGANISMS TO ANTIBACTERIAL DRUGS I.V. Darmov1, I.Yu. Chicherin2, I.P. Pogorelsky1, I.A. Lundovskikh1, I.S. Teterina1 РЕЗЮМЕ SUMMARY Цель исследования. Изучение чувствительности микроорганизмов пробиотиков к антибактериальным препаратам. Материалы и методы. В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы, входящие в состав отечественных и зарубежных коммерческих препаратов. Изучение чувствительности пробиотических микроорганизмов к антибактериальным препаратам проводили с использованием плотных питательных сред, содержащих расчетные количества антибактериальных препаратов. Результаты. Установлено, что пробиотические микроорганизмы в основном чувствительны к представителям основных классов антимикробных препаратов. Лишь некоторые из исследованных микроорганизмов устойчивы к 1-4 антибактериальным препаратам. Заключение. При выборе пробиотиков при лечении дисбактериозов необходимо учитывать, проводилась ли антибактериальная терапия. Использование антибактериальных препаратов даже в терапевтических дозах снижает жизнеспособность пробиотических микроорганизмов и их приживаемость в кишечнике. Ключевые слова: пробиотические микроорганизмы, антибактериальные препараты, чувствительность, резистентность, выживаемость. Purpose of the study. Investigation of sensitivity of probiotic microorganisms to antibacterial drugs. Materials and methods. Probiotic microorganisms from domestic and foreign commercial preparations were used in experiments. The study of sensitivity of probiotic microorganisms to antibacterial drugs was carried out using solid nutrient medium containing calculated amount of antibacterial drugs. Results. Probiotic microorganisms are mainly sensitive to the representatives of the major classes of antibacterial drugs. Only some of the studied microorganisms are resistant to 1-4 antibiotics. Conclusion. When choosing a probiotic in the treatment of dysbacteriosis need to consider whether the antibiotic therapy was carried out. The use of antimicrobial drugs, even in therapeutic doses, reduces the viability of probiotic microorganisms and their survival in the gut. Key words: probiotic microorganisms, antibacterial drugs, sensitivity, resistance, survival. ВВЕДЕНИЕ жения периферической нервной системы и органов кроветворения, дисбактериозы (дисбиозы), аллергизирующее действие и иммунодепрессивные состояния. К сожалению, порой даже самые безопасные антибактериальные препараты оказывают отрицательное влияние на организм больного и могут вызвать гибель не только патогенных микроорганизмов в естественных биотопах, но и представителей нормальной микрофлоры человека [3; 4]. Естественно, что в ходе антибактериальной терапии следует применять препараты для восстановления нор- Антибиотики и химиотерапевтические препараты являются основными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы [1]. Однако обилие указанных препаратов часто сопровождается их бессистемным использованием [2; 3], что не только снижает эффективность применения антимикробных препаратов различных классов, но и приводит к ряду побочных эффектов. К последним следует отнести токсические реакции, поражения паренхимы печени, поражения почек, пора- * Ссылка для цитирования: Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Тетерина И.С. Экспериментальное изучение чувствительности микроорганизмов пробиотиков к антибактериальным препаратам. Экспер. и клин. гастроэнтерология.2011.- №9.- С. 102 – 107. сборник научных статей Vyatka State University, 2 LLC «MedStar» 17 1 1 2 3 4 5 6 7 8 Бифилиз (ВИГЭЛ), 50 Бификол, 15/4 10 Бифиформ, 226106 11 Бифиформ (комплекс) № 30, 227377 Бифолак, 7950125 ООО «Фирма «Фермент», Россия ФГУП «НПО «Микроген», Россия ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, Россия «Ферросан А/С», Дания «Ферросан А/С», Дания Таблетки Капсулы B.cereus IP 5832; в 1 капсуле 35 мг субстанции 91 Флаконы по 2 дозы B.subtilis 3, B.lichenifornus 31; в 1 дозе 1·109 бактерий 60 Флаконы по 5 доз Пакеты с порошком по 5 доз Флаконы по 5 доз Флаконы по 5 доз Пакеты с порошком по 2 г B.bifidum № 1 или № 791; в 1 дозе 1·107 бактерий 25 B.bifidum № 1; в 1 пакете 5·107 бактерий 100 B.bifidum № 1; в 1 дозе 1·107 бактерий 75 B.bifidum № 1, E.coli М-17; в 1 дозе 1·107 бактерий 16 B.adolescens, B.bifidum, B. longum; в 1 г порошка 1·108 бактерий 58 Капсулы B.longum, E. faecium; в 1 капсуле 1·107 бактерий 75 Таблетки Bifidobacterium BBTM 1·109 КОЕ, L.rhamnosus GG 1·109 КОЕ; L. acidophilus LA-5 2·108 КОЕ в 1 таблетке L.rhamnosus, L. longum без указания количественного содержания в капсуле E.coli М-17; в 1 дозе 10·109 бактерий 83 Флаконы по 5 доз 15 Линекс, BF 9149 Лек g.g., Словения Капсулы 16 Наринэ, СДС. 500051 Нормобакт (пробиотик + пребиотик), 298492 Биокомплекс «Нормофлорин-Б1», 0411 Биокомплекс «Нормофлорин-Д», 0407 Биокомплекс «Нормофлорин-Л», 0410 Примадофилус Бифидус, 77.99.23.2 У 2809.4.09 Пробифор, 2-10211 ООО «НАРЭКС», республика Армения Chr. Hansen A/S, Дания, Медана Фарма А.О., Польша ООО «НПП Бифилюкс+», Россия Капсулы 17 18 19 20 21 22 23 Споробактерин жидкий, суспензия для приема внутрь, 311110 Срок годности, процент 84 Капсулы L.acidophilus 100 аш; L.acidophilus NK1, L.acidophilus К3Ш24; в 1 таблетке 1·107 бактерий Lactobacillus sp., в 1 капсуле 1·107 бактерий «Бифодан А/С DK-3390», Дания Колибактерин, 813- ОАО «Биомед» 20311 им. И.И. Мечникова, Россия Лактобактерин, 15/6 ФГУП «НПО «Микроген», Россия 14 Видовой состав микроорганизмов и их содержание Форма выпуска Фирма (предприятие) и страна изготовитель ЗАО «Фирма «Витафарма», Россия Аципол, 08 ЗАО «Фармацевтическая фирма «ЛЕККО», Россия Бактисубтил, 0492 ЗАО «ФармФирма «Сотекс», Россия Биоспорин, 149-0805 Филиал ФГУ 48 ЦНИИ МО РФ ЦВТП БЗ, Россия Бифидумбактерин, ФГУП «НПО 315-6 «Микроген»; Россия Бифидумбактерин ЗАО «Партнер», форте, 16-40311 Россия Бифистим лакто, 1201 13 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Ацилакт, 040211 9 12 18 Название препарата, серия Характеристика коммерческих пробиотических препаратов, использованных в экспериментах Порядковый номер Глава I ПРОБИОТИКИ Таблица 1. Капсулы Флаконы по 5 доз 92 34 75 25 Пакеты (саше) с порошком по 3 г L.plantarum 8P-A3 (возможны L.plantarum 38, L.fermentum 90T-C4, L.fermentum 39); в 1 дозе 2·109 бактерий L.acidophilus, B.infantis, E. faecium; в 1 капсуле 280 мг. В 1 г порошка Лебенин по 300 мг каждого из микроорганизмов L.acidophilus n.v. Ep 317/402; в 1 капсуле 100 мг лиофилизированной культуры L.acidophilus (La-5), Bifidobacterium (BB-12); в 1 саше 4·109 бактерий + фруктозоолигосахариды Флакон 100 мл B.bifidum, B.longum; в 1 мл 1·1010 бактерий 62 ООО «НПП Флакон 100 мл Бифилюкс+», Россия L.casei 1·109, B.longum, B. bifidum; 1·108 бактерий в 1 мл 70 ООО «НПП Флакон 100 мл Бифилюкс+», Россия L.acidophilus; в 1 мл 1·109 бактерий 80 Нейчерс Вэй Продактс, Инк., США ЗАО «Партнер», Россия ООО «Бакорен», Россия Капсулы B.breve, B.longum, L.rhamnosus, L.acidophilus; в 1 капсуле 3,9·109 бактерий 83 Пакеты с порошком Флакон – капельница 10 мл B.bifidum № 1; 5·108 бактерий в порошке 1 пакета 88 B.subtilis 534; в 1 мл 1·109 КОЕ 79 79 96 91 Перечень использованных антибактериальных препаратов Класс Международное название Фирменное название Фирма (предприятие) и странаизготовитель Лекарственная форма Пенициллины Ампициллин Цефалоспорины 3-го поколения Цефтриаксон Аминогликозиды Амикацин Гентамицин Тетрациклины Доксициклин Анзамицины Рифампицин Ампициллина натриевая соль Цефтриаксона натриевая соль Амикацина сульфат Гентамицина сульфат Доксициклина гидрохлорид Рифампицин-Ферейн Фениколы Хлорамфеникол Левомицетин Налидиксовая кислота Неграм KRKA, Словения П Ципрофлоксацин Ципрофлоксацина гидрохлорид ОАО «СТИ- МЕДСОРБ», Россия П Пабяницкий фармацевтический завод Польфа, Польша П Нефторированные хинолоны Фторхинолоны 2-го поколения Сульфаниламиды, комбинированные с диаминопиримидином Сульфаметоксазол + Бисептол триметоприм (Бисептол) ОАО «Биосинтез», Россия П ЗАО «Брынцалов-А», Россия ИН ОАО «Синтез», Россия Эхо НПАО, Россия ИН ИН ЗАО «Брынцалов-А», Россия П ЗАО «Брынцалов-А», Россия Фармстандарт – Томскхимфарм ОАО, Россия П Глава I ПРОБИОТИКИ Таблица 2. П Примечания: 1. «П» – лекарственная форма для перорального введения. 2. «ИН» – лекарственная форма для парентерального введения. новным антибактериальным соединениям, используемым для экстренной профилактики и лечения системных бактериальных инфекций. В экспериментах исследовали 23 коммерческих пробиотических препарата, характеристика которых и видовой состав микроорганизмов представлены в таблице 1. Выращивание пробиотических микроорганизмов проводили на плотных питательных средах рекомендованного состава [10]. Чувствительность пробиотических микроорганизмов к антибактериальным препаратам определяли с использованием плотных питательных сред, содержащих расчетные количества антибактериальных препаратов [11]. В работе по определению чувствительности пробиотических микроорганизмов использованы представители основных классов антибактериальных препаратов (таблица 2). Концентрация антибактериальных препаратов в питательных средах соответствовала их максимальной концентрации в крови: для гентамицина – 10 мкг·мл-1, что соответствует 8-10 мкг·мл-1 в крови; для амикацина – 8 мкг·мл-1 и 15-25 мкг·мл-1; для доксициклина – 5 мкг·мл-1 и 3-5 мкг·мл-1; для рифампицина – 10 мкг·мл-1 и 7-10 мкг·мл-1; для ципрофлоксацина – 10 мкг·мл-1 и 2-3 мкг·мл-1 соответственно и т.д. При определении чувствительности пробиотических микроорганизмов к антибактериальным препаратам использовали взвеси пробиотических микроорганизмов в изотоническом растворе хлорида натрия в концентрации (1,0±0,3)·107 бактерий·мл-1. После инкубирования чашек Петри с посевом бактериальных взвесей в течение 48 часов при температуре 37 °С сравнивали интенсивность роста бактерий на контрольной и опытной (с антибактериальными препаратами) средах, на основании чего судили об устойчивости или чувствительности пробиотических микроорганизмов к лечебным препаратам. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Результаты экспериментов по определению чувствительности пробиотических микроорганизмов представлены в таблице 3. сборник научных статей МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 19 мальной микрофлоры. В настоящее время при нарушении микробиоценоза кишечника используют современные принципы лечебной коррекции дисбиотических сдвигов, включающие: патогенетическое лечение основного заболевания; селективную деконтаминацию патогенной и условно-патогенной микрофлоры; усиление местного и системного иммунитета; восстановление нормальной микрофлоры с использованием различных средств коррекции нарушений микробиоценоза [4-6]. Основу селективной деконтаминации и заместительной терапии составляют живые бактерии – пробиотики, а также вещества микробного или иного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию его микроэкологического статуса [5; 6]. Одной из наиболее частых причин развития дисбактериоза кишечника является широкое применение антибактериальных средств в соответствии со структурой заболеваемости и современными лечебными стандартами. Как осложнение антибиотикотерапии в первую очередь развивается так называемая антибиотико-ассоциированная диарея [7]. По разным данным, ее диагностируют в 4,9 25 % случаев [8-9]. В этой связи информация об антибиотикорезистентности (антибиотико-чувствительности) пробиотических микроорганизмов имеет немаловажное значение для врача-клинициста, назначающего больному с лечебной или профилактической целью тот или иной пробиотический препарат. Это тем более важно, что в инструкциях по применению пробиотических препаратов часто содержатся однозначные рекомендации относительно применения пробиотиков как на фоне, так и после антибиотикотерапии. В основе таких рекомендаций должны лежать принципы доказательной медицины, а сами рекомендации должны учитывать данные экспериментального изучения чувствительности пробиотических микроорганизмов к различным антибактериальным препаратам. Цель настоящего исследования – оценка чувствительности пробиотических микроорганизмов, входящих в состав коммерческих пробиотических препаратов, к ос- Глава I ПРОБИОТИКИ Таблица 3. Результаты определения чувствительности пробиотических микроорганизмов к представителям основных классов антибактериальных препаратов Порядковый номер Название препарата Ацилакт 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Аципол Бактисубтил Биоспорин Бифидумбактерин Бифидумбактерин форте Бифилиз (ВИГЭЛ) Бификол Бифистим лакто Бифиформ Бифиформ (комплекс) № 30 Бифолак Колибактерин Лактобактерин 14 15 16 17 18 20 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 19 20 21 22 23 Линекс Наринэ Нормобакт Биокомплекс «Нормофлорин Б1» Биокомплекс «Нормофлорин-Д» Биокомплекс «Нормофлорин-Л» Примадофилус Бифидус Пробифор Споробактерин жидкий, суспензия для приема внутрь Пробиотические микроор- Чувствительность / устойчивость микроорганизмов к антибакганизмы териальным препаратам в концентрациях … мкг·мл-1 Ap10 Cef10 Amk8 Gm10 Dox5 Rif10 Cm10 Bis50 Nal10 Cfc10 L.acidophilus 100 аш; L.acidophilus NK1, L.acidophilus К3Ш24 Lactobacillus sp. B.cereus IP 5832 + + B.subtilis 3, B.lichenifornus 31 B.bifidum № 1 или № 791 B.bifidum № 1 B.bifidum № 1 B.bifidum № 1, E.coli М-17 + B.adolescens, B.bifidum, B.longum B.longum, E. faecium + + + + Bifidobacterium BBTM, L.rhamnosus GG, L.acidophilus LA-5 L.rhamnosus, L. longum E.coli М-17 + + L.plantarum 8P-A3 (L.plantarum 38, + + L.fermentum 90T-C4, L.fermentum 39) L.acidophilus, B.infantis, + E.faecium L.acidophilus n.v. Ep 317/402 L.acidophilus (La-5), Bifidobacterium (BB-12) B.bifidum, B.longum L.casei, B.longum, B.bifidum L.acidophilus B.breve, B.longum, L.rhamnosus, L.acidophilus B.bifidum № 1 B.subtilis 534 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - + - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Примечания. 1. Обозначения антибактериальных препаратов: Ap – ампициллин, Cef - цефтриаксон, Amk – амикацин, Gm – гентамицин, Dox – доксициклин, Rif – рифампицин, Cm – хлорамфеникол (левомицетин), Bis – бисептол, Nal – налидиксовая кислота (неграм), Cfc – ципрофлоксацин. 2. «+» - наличие устойчивости к антибактериальному препарату, «-» - отсутствие устойчивости к антибактериальному препарату ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что большинство пробиотических микроорганизмов чувствительны в опытах in vitro к представителям основных классов антимикробных препаратов в концентрациях в плотных питательных средах, соответствующих максимальным концентрациям препаратов в крови. Лишь некоторые пробиотические микроорганизмы устойчивы к 1-4 антибактериальным препаратам: Бификол и Линекс – к одному (рифампицину, ампициллину соответственно); Бактисубтил, Колибактерин и Лактобактерин – к двум (хлорамфениколу и бисептолу, рифампицину и бисептолу, доксициклину и налидиксовой кислоте (неграму) соответственно); Примадофилус Бифидус – к трем (ампициллину, доксициклину и налидиксовой кислоте (неграму)); Бифиформ – к четырем препаратам (гентамицину, рифампицину, бисептолу и налидиксовой кислоте (неграму)). Одновременный прием антибактериальных препаратов с пробиотиками, как это предлагается C. Koning et al. [12], установивших положительное влияние на состав кишечной микробиоты у добровольцев, получавших амоксициллин и многокомпонентные пробиотики на основе Saccharomyces boulardii и Enterococcus SF68, очевидно возможен, но с учетом оценки чувствительности или резистентности пробиотических микроорганизмов к планируемым к назначению антибактериальным препаратам. О необходимости именно такого подхода свидетельствуют данные Б.А. Шендерова, определившего концентрацию антибиотиков в фекалиях людей после орального введения терапевтических доз лекарства [13]. Так, кон- 1. Бондарева Т.А., Калининский В.Б., Борисевич К.В. и соавт. Современное состояние и перспективы решения проблемы повышения эффективности экстренной профилактики и лечения системных бактериальных инфекций // Молекулярная медицина. – 2009. – № 5. – С. 21-25. 2. Оболенский В.Н., Аронов Л.С., Родоман Г.В. и соавт. Антибиотикопрофилактика, антибиотикотерапия и микробиологическая ситуация в хирургическом стационаре // Антибиотики и химиотерапия. – 2004. – Т. 49, № 10. – С. 13-19. Глава I ПРОБИОТИКИ сборник научных статей ЛИТЕРАТУРА 3. Бельмер С.В. Дисбактериоз кишечника как осложнение антибактериальной терапии // Детские инфекции. – 2007. – Т. 6, № 2. – С. 44-48. 4. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии // Антибиотики и медицинская биотехнология. – 1987. – Т. 32, № 2. – С. 18-24. 5. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. – М.: Учебно-методический центр управления делами Президента Российской Федерации, 2010. – 50 с. 6. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю. Фруктоолигои фруктополисахариды в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника у больных бронхолегочной патологией, получающих антибактериальную терапию // Эксперимент. и клин. гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 79-87. 7. Шевяков М.А. Антибиотик-ассоциированная диарея и кандидоз кишечника: возможности лечения и профилактики // Антибиотики и химиотерапия. – 2004. – Т. 49, № 10. – С. 26-29. 8. Wistrom J., Worrby S.R., Myhre E.B. et al. Frequency of antibiotic associated diarrhea in 2462 antibiotic-treated hospitalized patients: a prospective study // J. Antimicrob. Chemother. – 2001. – V. 47. – P. 43-50. 9. Bartlett J.G. Antibiotic-associated diarrhea // New Engl. J. Med. – 2002. – V. 346, № 5. – P. 334-339. 10. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д. и соавт. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. – СПб.: Центр госсанэпиднадзора, 2002. – 31 с. 11. Рыжко И.В., Тришина А.В., Веркина Л.М. Отсутствие эффективности левофлоксацина и моксифлоксацина при экспериментальной чуме белых мышей, вызванной возбудителем, устойчивым к налидиксовой кислоте (Nalr) // Антибиотики и химиотерапия. – 2010. – Т. 55, № 11-12. – С. 22-24. 12. Koning C., Jonkers D., Stobberingh E., Stockbrugger R. The effect of a multispecies probiotic on the intestinal flora and bowel habits in healthy volunteers treated with amoxicillin // Abstracts of 12 UEGW, Gut 2004; 53: Suppl. VI: A207. 13. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. – М.: Изд-во ГРАНТЪ, 1998. – 288 с. 14. Грачева Н.М., Малышев Н.А., Чичерин И.Ю. и соавт. Фруктоолигосахариды и фруктополисахариды в комплексном лечении больных желудочно-кишечными заболеваниями с явлениями дисбактериоза кишечника // Инфекционные болезни. – 2010. – т. 8. - №1. – с. 107-111. 21 центрация в фекалиях ампициллина может достигать 480 мкг·г-1, канамицина – 1000-24000 мкг·г-1, пефлоксацина – 122-645 мкг·г-1, рифампицина – 142-354 мкг·г-1, хлорамфеникола – 500-5000 мкг·г-1, ципрофлоксацина – 185-2200 мкг·г-1 и т.д. Указанные концентрации антибиотиков во много раз превосходят минимальную подавляющую концентрацию препарата, определенную для чувствительного микроорганизма, например, для пробиотического микроорганизма или представителей нормальной микрофлоры, что не может не сказаться на эффективности пробиотикотерапии. С учетом экспериментальных данных, полученных в настоящей работе, можно утверждать, что в адекватном выборе антибактериального средства для комплексной терапии дисбактериозов большое значение имеет оценка чувствительности пробиотических микроорганизмов к назначаемым врачом лечебным препаратам. Правильность их использования в сочетании с пробиотиками позволит с высокой эффективностью проводить коррекцию и профилактику нарушений микробиоценоза в каждом конкретном случае. Необходимо подчеркнуть, что с учетом высокой чувствительности микроорганизмов пробиотиков, входящих в состав коммерческих препаратов, к антибактериальным средствам еще более актуальным становится использование пребиотиков, обладающих устойчивостью к антибиотикам, что позволяет их совместное использование. К таким перспективным препаратам можно отнести пребиотик нового поколения Стимбифид, обладающий высокой эффективностью при нарушениях микробиоценоза кишечника [5, 14], в том числе при одновременном использовании антибиотикотерапии [6]. Глава I ПРОБИОТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЛИМФОЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАКТЕРИЙ* Ердякова А.С.1, Чичерин И.Ю.2, Лундовских И.А.1, Погорельский И.П.1 1 ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru; 2 ООО «МедСтар», Сергиев Посад, Россия (141300, Сергиев Посад, ул. Вознесенская, 55), e-mail: rpatron@mail.ru EXPERIMENTAL EVALUATION OF THE LYMPHOCYTOTOXIC EFFECT OF BIFIDOBACTERIA AND LACTOBACILLI Erdyakova A.S1., Chicherin I.Yu.2, Lundovskikh I.A1, Pogorelsky I.P.1 1 22 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 2 Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru LLC «MedStar», Sergiev Posad, Russia (Voznesenskaya st., 55, Sergiev Posad, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Представлены результаты экспериментальной оценки лимфоцитотоксического действия пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий, входящих в состав сертифицированных пробиотических препаратов Бифидобактерин и Лактобактерин, на лимфоциты морских свинок. В экспериментах использовали регидратированные культуры бифидобактерий и лактобактерий. Выделение фракции лимфоцитов из крови морских свинок для постановки лимфоцитотоксического теста проводили согласно санитарным правилам СП 3.3.2.561-96. Выраженность повреждения лимфоцитов оценивали в баллах и путем подсчета цитотоксического индекса. Результаты экспериментов свидетельствуют о подверженности лимфоцитов морских свинок цитолизу под воздействием больших доз пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий, превышающих суточные дозы, рекомендованные инструкциями по медицинскому применению сертифицированных пробиотических препаратов Бифидобактерин и Лактобактерин, что выводит реакцию лимфоцитов за пределы физиологической нормы. С учетом полученных результатов, при заместительной терапии нежелательно рекомендовать пациентам с дисбиотическими нарушениями микрофлоры кишечника повышать суточные дозы пробиотиков для достижения выраженного пробиотического эффекта. Ключевые слова: пробиотики, бифидобактерии, лактобактерии, лимфоциты, лимфоцитотоксический тест, морские свинки. Results of the experimental evaluation of the lymphocytotoxic effect of probiotic microorganisms bidfidobacteria and lactobacilli, are part of the certified probiotic preparations Bifidumbacterin and Lactobacterin, on lymphocytes of guinea pigs are presented. Rehydrated cultures of bifidobacteria and lactobacilli were used in the experiments. Isolation of the fraction of lymphocytes for lymphocytotoxic test was carried out according to the sanitary rules SP 3.3.2.561-96. Intensity of damage to lymphocytes was assessed by counting the points and the cytotoxic index. The experimental results indicate exposure of lymphocytes of guinea pigs to cytolysis under the influence of large doses of probiotic bifidobacteria and lactobacilli, exceeding the daily doses recommended by the instructions on the medical use of the certified probiotic preparations Bifidobacterin and Lactobacterin that displays the reaction of lymphocytes beyond the physiological norm. In view of the results obtained when substitution therapy is not desirable to recommend that patients with dysbiotic disorders in intestinal microflora increase daily doses of probiotics to achieve pronounced probiotic effects. Key words: probiotics, bifidobacteria, lactobacilli, lymphocytes, lymphocytotoxic test, guinea pigs. ВВЕДЕНИЕ микрофлоры к условно-патогенным микроорганизмам [3]. Обладая определенными механизмами приживления, они способны вызывать заболевание при снижении иммунитета. Именно на иммунную систему падает главная нагрузка по устранению нарушений го- Развивая идею И.И. Мечникова о том, что нормальная микрофлора не является оптимальной и может быть как полезной, так и вредной, В.М. Бондаренко и В.Г. Петровская относят представителей нормальной * Ссылка для цитирования: Ердякова А.С., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Погорельский И.П. Экспериментальная оценка лимфоцитотоксического действия бифидобактерий и лактобактерий. Практическая медицина.- 2012.- №3(58).- С.194-196.. Цель исследования состоит в экспериментальной оценке лимфоцитотоксического действия бифидобактерий и лактобактерий на лимфоциты морских свинок с использованием лимфоцитотоксического теста. Материалы и методы исследования В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы, входящие в состав коммерческих препаратов Бифидумбактерин (серия 315-6, производство ФГУП «НПО «Микроген», Россия), Лактобактерин (серия 15/6 производство ФГУП «НПО «Микроген», Россия). Согласно инструкции по медицинскому применению, препарат Бифидумбактерин сухой создан на основе бифидобактерий B. bifidum 1, а препарат Лактобактерин сухой – на основе лактобактерий L. plantarum SP-A3. В одной дозе лиофилизата препарата Бифидумбактерин содержится не менее 1•107 живых бифидобактерий, а в одной дозе лиофилизата препарата Лактобактерин – не менее 2•109 живых лактобактерий. В работе использовали: гепарин 5000 ЕД•мл-1, ОАО «Синтез Курган», Россия; фиколл, ПанЭКО, Россия; верографин, Спофа: Фарм-Группа, Чехия; трипановый синий, ДИА-М, Россия. Выделение фракции лимфоцитов для постановки лимфоцитотоксического теста проводили согласно санитарным правилам СП 3.3.2.561-96 [5]. Для выделения фракции лимфоцитов использовали кровь прошедших акклиматизацию морских свинок массой 250-300 г, беспородных, обоего пола. Выраженность повреждения лимфоцитов оценивали в баллах (таблица 1) и путем подсчета цитотоксического индекса (ЦТИ) по приведенной ниже формуле [5]. Таблица 1 Выраженность повреждения лимфоцитов [6] Число погибших клеток, процент 0-10 11-20 21-50 51-80 81-100 Балл Результат 1 2 4 6 8 Отрицательный Сомнительный Слабо положительный Положительный Резко положительный погибших клеток в опыте – % погибших клеток в контроле ЦТИ = 100 % • __________________________________________________ 100 – % погибших клеток в контроле Глава I ПРОБИОТИКИ Результаты исследования В предварительных опытах изучения иммуномодулирующего действия пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий было установлено, что их пероральное введение морским свинкам в дозах 1·104 и 1·105 бактерий не вызывало достоверного усиления розеткообразования в опыте в сравнении с контролем (количество Т-розеток в опыте соответственно вводимым дозам бактерий – 25,5 % и 27,1 % против 27,0 % в контроле). С учетом результатов теста спонтанного розеткообразования для постановки лимфоцитотоксического теста были определены следующие дозы бактерий (КОЕ в 1 мл суспензии): для бифидобактерий – 1·105; 2,6·106; 1,3·107; 2,6·107; 2,6·108; для лактобактерий – 1·105; 5,3·108; 2,6·109; 5,3·109; 5,3·1010. Дозы бифидобактерий 2,6·106 КОЕ и лактобактерий 5,3·108 КОЕ являются суточными дозами для морских свинок и использованы нами в качестве контролей. Оценочные показатели лимфоцитотоксического теста с бифидобактериями и лактобактериями представлены в таблицах 2 и 3. Данные, представленные в таблицах 2 и 3, свидетельствуют о подверженности лимфоцитов морских свинок цитолизу под воздействием больших доз пробиотических бактерий, превышающих суточные дозы, рекомендованные инструкциями по медицинскому применению пробиотических препаратов. Некоторое увеличение числа погибших лимфоцитов наблюдается при их инкубировании с бифидобактериями и лактобактериями в рекомендованных суточных дозах (соответственно, 11 % и 19 %, при ЦТИ 4,5 и 13,1). Обсуждение результатов С расширением спектра используемых в клинической практике пробиотических препаратов стали появляться сведения о том, что принципы современного подхода к заместительной терапии, состоящие в применении больших доз пробиотиков длительными курсами (в течение 3-6 месяцев), могут быть причиной недоста- сборник научных статей Цель исследования При постановке лимфоцитотоксического теста были использованы регидратированные культуры бифидобактерий и лактобактерий. Постановку лимфоцитотоксического теста осуществляли в полистироловых планшетах. В лунки панели планшета вносили 0,1 мл взвеси лимфоцитов, в которой предварительно определяли их концентрацию, составившую 4·106 кл•мл-1, а также процент нежизнеспособных лимфоцитов при окраске трипановым синим. В последующем в лунки, содержащие суспензии лимфоцитов, вносили по 0,1 мл суспензии бифидобактерий и лактобактерий в соответствующих концентрациях. Планшеты с заполненными лунками инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 30 минут. По окончании инкубации в каждую лунку планшета добавляли рабочий раствор трипанового синего. Через 2030 секунд взвесь из лунки помещали в счетную камеру Горяева для определения количества погибших лимфоцитов. Выбор доз пробиотических микроорганизмов был осуществлен на основании предварительного изучения их иммуномодулирующего действия при продолжительном (2 недели) пероральном поступлении в организме морских свинок в тесте спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) [9, 10]. Обработку результатов исследования проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [2]. 23 меостаза, вызванных бактериальным антигенным воздействием. Известно, что положительный эффект пробиотиков, сконструированных зачастую на основе микроорганизмов, выделенных из нормальной кишечной микрофлоры, даже при длительном применении носит транзиторный характер, а порой и полностью отсутствует [1, 4]. В то же время в инструкциях по медицинскому применению сертифицированных препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин есть рекомендации по увеличению доз принимаемых препаратов в 5 раз с профилактической целью и в 5-10 раз при воспалительных заболеваниях. С учетом изложенного, представляется целесообразным изучить влияние пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий на иммунную систему в эксперименте с использованием лимфоцитотоксического теста. Данный тест [5, 6, 9] с небольшими вариациями используется как в научных исследованиях, так и при оценке иммунобиологической безопасности вакцин. Глава I ПРОБИОТИКИ точной эффективности лечения дисбиотических состояний и возникновения побочных эффектов применения пробиотиков [4]. Таблица 2 Результаты лимфоцитотоксического теста с бифидобактериями Определяемый показатель Число погибших лимфоцитов, процент ЦТИ Антилимфоцитарная активность бифидобактерий из бактериальных суспензий в концентрациях…КОЕ•мл-1, (Х±I95) 1·105 2·106 1,3·107 2,6·107 2,6·108 7±2 11±3 20±5 69±8 98±10 0,21 4,5 14,2 66,7 97,8 Примечание – Оценочный балл для концентрации 1·105 – 1 (результат отрицательный), для концентрации 2·10 6 – 2 (результат сомнительный), для концентрации 1,3·107 – 2 (результат сомнительный), для концентрации 2,6·107 – 6 (результат положительный), для концентрации 2,6·108 – 8 (результат резко положительный) Таблица 3 Результаты лимфоцитотоксического теста с лактобактериями Определяемый показатель Число погибших лимфоцитов, процент ЦТИ Антилимфоцитарная активность лактобактерий из бактериальных суспензий в концентрациях … КОЕ•мл-1, (Х±I95) 1·105 5,3·108 2,6·109 5,3·109 5,3·1010 8±3 19±6 51±8 85±9 99±10 1,3 13,1 47,4 83,9 98,9 24 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Примечание – Оценочный балл для концентрации 1·105 – 1 (результат отрицательный), для концентрации 5,3·108 – 2 (результат сомнительный), для концентрации 2,6·109 – 6 (результат положительный), для концентрации 5,3·109 – 8 (результат резко положительный), для концентрации 5,3·1010 – 8 (результат резко положительный) Неудачи заместительной терапии пробиотиками, по данным А.И. Хавкина и Н.С. Жихаревой [8], обусловлены недостаточной изученностью механизмов взаимодействия пробиотических микроорганизмов и индигенной микрофлоры с иммунной системой хозяина. Парентеральное введение большого количества микроорганизмов приводит к развитию макрофагальной реакции, что особенно выражено на начальном этапе процесса иммунизации. Однако, длительное использование высоких доз пробиотических микроорганизмов приводит к истощению адаптационных резервов организма хозяина [7] и снижению (или отсутствию) эффективности пробиотикотерапии при длительных курсах [4]. Из представленных в таблицах 2 и 3 данных следует, что при регламентированной суточной дозировке пробиотиков реакция лимфоцитов морских свинок находится в допустимых пределах, не позволяющих считать эту реакцию патологической. Увеличение концентрации пробиотических микроорганизмов в реакционной смеси с лимфоцитами, превосходящей суточную дозу в 5, 10 и 100 раз, сопровождается прогрессирующим увеличением числа погибших лимфоцитов и ростом значений цитотоксических индексов. Балльная оценка числа погибших лимфоцитов позволяет считать результаты лимфоцитотоксического теста как положительные и резко положительные (особенно в случае с лактобактериями), а саму реакцию лимфоцитов, контактирующих с большими дозами пробиотических микроорганизмов, выходящую за пределы физиологической нормы. При этом нарушение целостности клеточных мембран лимфоцитов является неспецифическим. Тем не менее, взаимодействие интактных лимфоцитов с тестируемыми пробиотическими микроорганизмами сопровождается образованием каналов в мембранах лимфоцитов, по которым краситель трипановый синий проникает внутрь лимфоцитов и окрашивает их [6]. Жизнеспособные с интактной мембраной лимфоциты красителем не окрашиваются. Заключение Экспериментальное изучение в опытах in vitro взаимоотношений лимфоцитов крови морских свинок с бифидобактериями и лактобактериями сертифицированных пробиотических препаратов, взятых в дозах, превышающих рекомендованные инструкциями по медицинскому применению, с балльной оценкой гибели лимфоцитов и определением лимфоцитотоксического индекса свидетельствует о нецелесообразности повышения суточных доз пробиотических препаратов при их пероральном применении с целью увеличения возможного пробиотического эффекта заместительной терапии. ЛИТЕРАТУРА 1. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта: дис…. д-ра мед. наук. – М.: Учебно-научный центр Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации, 2003. – 299 с. 2. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. – Л.: Медгиз, 1962. – 280 с. 3. Бондаренко В.М. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры / В.М. Бондаренко, В.Г. Петровская // Вестник РАМН. – 1997. – № 3 – С. 7–10. 4. Воеводин Д.А. Роль дисбактериоза в формировании хронической инфекционной патологии у детей // Д.А. Воеводин, Т.Н. Розанова, М.А. Стенина и др. // Журн. микробиол. – 2001. – № 6. – С. 88-93. 5. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов: Санитарные правила СП 3.3.2.561-96: утв. Постановлением Госкомсанэпиднадзора России 31.10.1996 г., № 33: введ. в действие 31.10.1996 . – М.: Информационноиздательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1996. – 120 с. 6. Лимфоцитотоксический тест. – http://medbiol.ru/medbiol/allerg/ 0019c14a.htm. (дата обращения: 17.02.2012). 7. Панин А.Н. Принципы и перспективы применения эубиотиков в животноводстве / А.Н. Панин, Н.И. Малик // Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека: тезисы докл. Всерос. конф. с междунар. участием (Москва, 21-23 апреля 1999 г.). – Москва, 1999. – С. 22-23. 8. Хавкин А.И. Коррекция дисбиотических изменений кишечника у детей на современном этапе / А.И. Хавкин, Н.С. Жихарева // Русский мед. журн. – 2004. – Т. 12, № 16. – С. 960-963. 9. Экспериментальное обоснование ПДК микроорганизмов – продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды: методические указания: утв. Начальником Главного санитарно-профилактического Управления Минздрава СССР 11.06.1991 г., № 5789/1-91. – М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1993. – 20 с. 10. Hopfer H. The importance of cell-mediated immunity in course and severity of autoimmune anti-glomerular basement membrane disease in mice / H. Hopfer, R. Maron, U. Butzmann, U. Helmchen et al. // FASEB Journal. – 2003. – Vol. 17. – P. 860-868. Чичерин И.Ю.1, Дармов И.В.2, Богачева Н.В.2, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2, Шевцов А.Н.2 Глава I ПРОБИОТИКИ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БОЛЬШИХ ДОЗ ПРОБИОТИКА БИФИДУМБАКТЕРИН И МИКРООРГАНИЗМОВ АУТОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА НА ОРГАНИЗМ БЕЛЫХ МЫШЕЙ И ПОКАЗАТЕЛИ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА* 1 ООО «МедСтар», Сергиев Посад, Россия (141300, Сергиев Посад, ул. Вознесенская, 55), e-mail: rpatron@mail.ru ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru 2 THE EFFECT OF LARGE DOSES OF PROBIOTIC BIFIDUMBACTERIN AND MICROORGANISMS OF INTESTINAL AUTOFLORA ON THE ORGANISM OF WHITE MICE AND THE INDICES OF CELLULAR IMMUNITY I.Yu. Chicherin1, I.V. Darmov2, N.V. Bogacheva2, I.P. Pogorelsky2, I.A. Lundovskikh2, A.N. Shevtsov2 LLC «MedStar», Sergiev Posad, Russia (Voznesenskaya st., 55, Sergiev Posad, Russia, 141300), e-mail: rpatron@mail.ru, Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Цель исследования. Оценка влияния больших доз пробиотика Бифидумбактерин и микроорганизмов аутофлоры кишечника на организм белых мышей и показатели клеточного иммунитета Материалы и методы. В экспериментах использовали коммерческий препарат Бифидумбактерин и микроорганизмы аутофлоры кишечника белых мышей, выделенные из фекалий. Субпопуляции лимфоцитов выделяли из цельной крови белых мышей, используя моноклональные антитела, меченые флуорохромами: anti-mouse CD45-РЕCy5.5, anti-mouse CD3e-PE-Cy7, anti-mouse CD8a-APC, anti-mouse IFN gamma-FITC, anti-mouse Ly-49C/I/F/HРЕ; а также антивидовые изотипические контроли: Rat IgG1 K isotype control FITC, Golden Syrian Hamster IgG isotype control PE. Результаты. Установлено, что при пероральном введении белым мышам больших доз пробиотических микроорганизмов возникают патологические состояния, приводящие даже к гибели животных. Выявлены субпопуляционные сдвиги и изменения функциональной активности лимфоцитов у белых мышей, свидетельствующие об иммунобиологической перестройке в организме животных на фоне энтерального введения больших доз пробиотиков и микроорганизмов нормальной микрофлоры. Заключение. Наличие у пробиотических штаммов микроорганизмов нежелательных для живого организма свойств предопределяет необходимость индивидуального выбора пробиотических препаратов, правильного подбора их курсовых и разовых доз. Ключевые слова: пробиотические и индигенные микроорганизмы; белые мыши; лимфоциты; субпопуляции лимфоцитов, иммунологическая перестройка; перитонит. Purpose of the study. Assessment of the effect of large doses of probiotic Bifidumbacterin and microorganisms of intestinal autoflora on the organism of white mice and the indices of cellular immunity. Materials and methods. Commercial preparation Bifidumbacterin and the microorganisms of white mice intestinal autoflora isolated from the feces were used in the experiments. Subpopulations of lymphocytes were isolated from whole blood of white mice, using monoclonal antibodies labeled with fluorochromes: anti-mouse CD45-РЕ-Cy5.5, anti-mouse CD3e-PE-Cy7, anti-mouse CD8a-APC, antimouse IFN gamma-FITC, anti-mouse Ly-49C/I/F/H-РЕ; as well as antispecies isotype control: Rat IgG1 K isotype control FITC, Golden Syrian Hamster IgG isotype control PE. Results. It is found that after oral administration of large doses of probiotic microorganisms to white mice pathological conditions appear, leading even to the death of the animals. Subpopulation shifts and changes in the functional activity of lymphocytes are detected, indicating an immunological reorganization in animals against a background of the enteral administration of large doses of probiotics and microorganisms of normal microflora. Conclusion. The presence of undesirable for living organisms properties of the probiotic microbial strains determines the need for individual choice of probiotic preparations, the proper selection of course and single doses. Key words: probiotic and indigenous microorganisms, white mice; lymphocytes, subpopulations of lymphocytes; immunological reorganization; peritonitis * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Богачева Н.А., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Шевцов Н.А. Исследование влияния больших доз пробиотика Бифидумбактерин и микроорганизмов аутофлоры кишечника на организм белых мышей и показатели клеточного иммунитета. Медицинский Советник Поволжья.- 2013.- №1.- C.85-90. сборник научных статей 2 25 1 Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 26 ВВЕДЕНИЕ Выдающийся русский ученый И.И. Мечников первым установил положительное влияние молочнокислых бактерий обычной простокваши, принимаемой с целью нормализации кишечной микрофлоры [1; 2]. Наряду с введением понятия ортобиоз как состояния полного и счастливого цикла жизни, И.И. Мечников ввел в оборот термин пробиозис, обозначающий улучшение здоровья человека в процессе модификации (восстановления) собственной кишечной микрофлоры [1-4]. Придавая огромное значение кишечной микрофлоре, ученый предложил ряд профилактических и гигиенических средств борьбы с «самоотравлением». По И.И. Мечникову, пробиозис является ассоциацией нескольких организмов, стимулирующих ряд жизненно важных процессов каждого из них [5], а живые микробные клетки, оказывающие положительное влияние на микробиоценоз кишечника и здоровье человека или животного, стали именоваться пробиотиком [6]. Со временем были определены критерии, которым должны соответствовать пробиотические микроорганизмы. К ним относят: апатогенность и безвредность; выживаемость в желудочно-кишечном тракте; адгезию на эпителиальных клетках кишечника с последующей колонизацией; способность к размножению, колонизации кишечника, а также персистенции; выраженную способность к стабилизации кишечной микрофлоры; сохранение жизнеспособности как в пищевых продуктах, так и в фармакопейных лиофилизированных препаратах [7]. Указанным критериям соответствуют микроорганизмы нормальной кишечной микрофлоры, в первую очередь лактобактерии, бифидобактерии, кишечная палочка [8; 9]. Эти и другие бактериальные виды, взаимодействующие друг с другом и с организмом хозяина, претерпели отбор в процессе эволюции. Многообразие видового состава кишечной микрофлоры и ее взаимодействие со сложно организованной структурой внутренней поверхности слизистой оболочки кишечника, имеющей важное значение для пищеварения, явились основанием объединения микроорганизмов и кишечной стенки в единый микробно-тканевой комплекс [10; 11]. К заслугам И.И. Мечникова следует отнести и то, что воздавая должное эволюционно сложившимся симбиотическим ассоциациям, составляющим нормальную микрофлору человека и животных, он обосновал положение о том, что состав нормальной микрофлоры не всегда является оптимальным, и в ряде случаев представители нормальной микрофлоры могут оказывать определенное вредное воздействие на организм [1-4; 12; 13]. О нежелательных последствиях приема пробиотических микроорганизмов представлена информация в работе В.М. Бондаренко и В.Г. Петровской [14]. В частности авторы считают, что на современном этапе изучения дисбактериозов и в целом инфекционного процесса накоплено достаточно данных, свидетельствующих о способности представителей нормальной микрофлоры, обладающих определенными механизмами приживления, вызывать заболевание при снижении иммунитета [14]. В связи с этим, по мнению авторов цитируемой работы [14], их можно отнести к условно-патогенным микроорганизмам, способным при снижении естественной резистентности макроорганизма вызывать заболевания, характеризующиеся отсутствием нозологической специфичности. Так, бифидобактерии причастны к развитию бактериемии у новорожденных и инициации гнойновоспалительных процессов. В.М. Бондаренко и В.Г. Петровская [14] приводят данные O. Balint, A. Hudac, A. Bakytova, наблюдавших острый менингит, обусловленный Bifidobacterium adolescentis. Настороженность у клиницистов вызывают данные о -глюкозидазной активности бифидобактерий, которая при изменении диеты человека способствует развитию опухоли толстой кишки. Приведен перечень клинических изолятов лактобактерий (Lactobacillus casei ssp. rhamnosus, L. plantarum, L. brevis, L. lactis, L. fermentum, L. acidoplilus, L. salivarins и др.), являющихся этиологическими агентами различных патологических состояний, часто локальных: кариеса, гнойно-воспалительных процессов, эндокардитов, септицемии, пневмонии, менингита, локальных и генерализованных уроинфекций [14]. Представители нормальной микрофлоры как патогенные агенты вызывают развитие артритов и других заболеваний, относимых к аутоиммунным. С.Р. Резник с соавторами [15] в эксперименте на мышах, которым вводили пробиотик на основе Bacillus subtilis и B.licheniformis (доза микроорганизмов 2,5•107 КОЕ), отмечают существенное повышение уровня серологического ответа на последующее введение сальмонелл. Отмечено стимулирующее влияние на клетки мононуклеарной фагоцитарной системы животных биоспорина и субалина [16; 17]. Предполагается, что метаболиты некоторых бактерий, находящихся в кишечнике, адсорбируются на его слизистой, вызывая серологический ответ макроорганизма путем простой или индуцируемой молекулярной мимикрии. Эти и другие данные, как подчеркивают В.М. Бондаренко и В.Г. Петровская [14], указывают на необходимость соблюдения правила микроэкологической адекватности при назначении препаратов пробиотиков. Очевидно, что под микроэкологической адекватностью понимается оптимальное соотношение представителей микробного сообщества кишечника. При его нарушении, в частности при резком возрастании численности популяций бифидобактерий в кишечнике, отмечается рост активности ряда ферментов в фекалиях (-глюкозидазы, -глюкуронидазы, азоредуктаза) [14], которые при высоких значениях рН среды способны трансформировать прокарциногены в кишечнике в карциногены со всеми вытекающими из этого последствиями. В наших экспериментах по сравнительному изучению биологических характеристик бифидобактерий и лактобактерий с использованием лимфоцитотоксического теста подтверждена необходимость соблюдения соответствия микроэкологической адекватности [18]. Так, было показано, что увеличение концентрации пробиотических микроорганизмов в реакционной смеси с лимфоцитами морских свинок, превосходящей суточную дозу в 5, 10 и 100 раз, сопровождается прогрессирующим увеличением числа погибших лимфоцитов и ростом значений цитотоксических индексов. Балльная оценка числа погибших лимфоцитов позволяет считать результаты лимфоцитотоксического теста как положительные и резко положительные (особенно в случае с лактобактериями), а саму реакцию лимфоцитов, контактировавших с пробиотическими микроорганизмами, выходящей за пределы физиологической нормы. С учетом вышеизложенного, очевидна необходимость дальнейших исследований, связанных с возможным влиянием пробиотических микроорганизмов (сертифицированных и выделенных из состава аутофлоры кишечника) и их метаболитов после адгезии и колонизации слизистой микробами на состояние организма хозяина в целом, а также на состояние иммунитета. Материалы и методы исследования В экспериментах использовали коммерческий препарат Бифидумбактерин, созданный на основе Bifidumbacterium bifidum № 1 (№ 791) в ФГУП «НПО Микроген», Россия (серия 315-6), а также микроорганизмы собственной кишечной микрофлоры экспериментальных белых мышей. Для выращивания бифидобактерий и представителей нормальной микрофлоры, выделенных из фекалий экспериментальных животных, использовали плотные питательные среды рекомендованного состава [20; 21], а также агар Хоттингера и Эндо. Выращивание микроорганизмов в микроаэрофильных условиях проводили при температуре 37 °С с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system MarkIII – LE003 (Hi Media Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Бифидобактерии, содержащиеся в составе пробиотика Бифидумбактерин, вводили животным per os, начиная с суточной дозы, определенной инструкцией по медицинскому применению препарата [21], с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела. Суспензии микроорганизмов собственной нормальной микрофлоры также вводили животным per os в той же дозировке, что и бифидобактерии. Кровь у животных отбирали из ретробульбарного сплетения в пробирку с гепарином (ОАО «Синтез Курган», Россия) из расчета 25 ЕД на 1 мл крови до и через 3 недели после окончания перорального введения бифидобактерий и микроорганизмов нормальной микрофлоры. Использовали гепарин 5000 ЕД•мл-1. Кровь с гепарином хранили не более 2 часов при температуре 6-8 °С. Для выделения из образцов крови популяций (субпопуляций) лимфоцитов использовали моноклональные антитела (МА), меченные флуорохромами («Beckman Coulter», США): anti-mouse CD45-РЕ-Cy5.5, anti-mouse CD3e-PE-Cy7, anti-mouse CD8a-APC, anti-mouse IFN gamma-FITC, anti-mouse Ly-49C/I/F/H-РЕ; для определения границ неспецифического связывания – антивидовые изотипические контроли: Rat IgG1 K isotype control FITC, Golden Syrian Hamster IgG isotype control PE. Пермибиализацию лейкоцитов проводили с помощью IntraPrepTM («Beckman Coulter», США); для промывки клеточной суcпензии использовали фосфатно-солевой буферный раствор. Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответствовали по размерам и гранулярности живым лимфоцитам, вводили необходимые логические ограничения в гистограммы распределения частиц по боковому светорассеянию и CD45-FITC (SS/ CD45-FITC), а также боковому светорассеянию и витальному красителю 7-ААD (SS/7-AAD). При проведении работы применяли одноканальные микропипеточные дозаторы с переменным объемом на Глава I ПРОБИОТИКИ Цель исследования состоит в оценке влияния больших доз пробиотика Бифидобактерин и микроорганизмов аутофлоры кишечника на организм белых мышей и показатели клеточного иммунитета. Результаты исследования Белые мыши, использованные в работе, были разделены на две группы по 13 особей в каждой. До начала введения пробиотических микроорганизмов у подопытных животных осуществляли забор крови для определения фоновых значений показателей клеточного иммунитета. Далее, животным первой группы перорально вводили 2 раза в сутки бифидобактерии пробиотического препарата Бифидумбактерин, начиная с дозы 1,3•105 микробов, соответствующей одной дозе для человека с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела, увеличивая вводимую дозу бифидобактерий каждые 5 дней соответственно в 5, 10 и 100 раз. Животным второй группы вводили перорально суспензию микроорганизмов индивидуальной микрофлоры, выделенных из фекалий и выращенных на плотных питательных средах. Вводимая доза бактерий индивидуальной микрофлоры составляла двукратно в сутки по 1,3•105 микробов с постепенным увеличением в 5, 10 и 100 раз. Наблюдение за животными, помещенными для содержания в индивидуальные кюветы с крышками, велось в течение всего срока экспериментов, включая 10 дней после последнего введения пробиотических микроорганизмов. Следует отметить, что микроорганизмы, выделенные из фекалий животных второй группы на соответствующих плотных питательных средах, образовывали консорциум, состоящий в основном из бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. У отдельных животных были идентифицированы среди выделенных микробов золотистый стафилококк, энтерококк, протеи, неферментирующие грамотрицательные палочки и в двух случаях – бациллы. Таким образом, животным первой группы перорально вводили монокультуру лиофилизированных бифидобактерий в повышающихся концентрациях, а животным второй группы – суспензии индивидуальных живых бактерий, выделенных из кишечного содержимого каждого подопытного животного. В ходе наблюдения за животными отмечено, что в то время, как животные второй группы в течение всего периода наблюдений оставались активными, подвижными, Рисунок – Внешний вид животного с чистой шерстью и хос локальным участком выпадения шерсти на коже брюшной стенки рошо поедали корм, жи- сборник научных статей Цель исследования 10 мкл, 200 мкл, 5000 мкл («Eppendorf», Германия), пробирки для проточной цитометрии («Beckman Coulter», США). Перемешивание клеток крови и моноклональных антител в процессе пробоподготовки осуществляли на вортексе («ELMI», Латвия). Определение относительного уровня содержания в крови анализируемых субпопуляций лимфоцитов (в процентах) проводили на проточном цитофлуориметре Navios («Beckman Coulter», США). Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводили в камере Горяева на световом микроскопе Микмед-2 (ОАО «Ломо», Россия), выражая полученные результаты в единицах измерения – количество клеток•109 л-1, относительное значение – в процентах. В работе использовали прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18-20 г беспородных, обоего пола. Обработку результатов экспериментов проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве [23]. 27 Выбор микроорганизмов аутофлоры кишечника белых мышей в качестве объекта сравнения обусловлен имеющимися данными [19], согласно которым пробиотические микроорганизмы должны быть изолированы из организма тех видов животных и человека, кому они будут предназначаться. Глава I ПРОБИОТИКИ Таблица Содержание в крови белых мышей популяций (субпопуляций) лимфоцитов Уровень содержания в крови относительных и абсолютных значений популяций (субпопуляций) лимфоцитов – (Х±I95) Фон (n=10) Группа 1 (n=11) Группа 2 (n=13) Определяемый Относительное Абсолютное Относительное Абсолютное Относительное Абсолютное показатель значение значение значение значение значение значение показателя, показателя, показателя, показателя, показателя, показателя, процент клеток •109•л-1 процент клеток•109•л-1 процент клеток •109•л-1 Лейкоциты (CD45) 95,0-100,0 8,000±0,9 95,0-100,0 10,475±2,429 95,0-100,0 9,825±1,666 Лимфоциты 59,9±6,9 4,792±0,565 62,3±8,0 6,404±0,874 57,6±5,6 5,600±0,548 54,6±5,5 2,616±0,526 50,2±7,4 3,257±0,870 55,7±5,3 3,100±0,194 CD3+ CD8+ 22,6±2,3 0,591±0,087 27,0±2,4 0,882±0,266 35,5±7,5 1,094±0,183 CD4+ 77,4±2,3 2,025±0,516 73,0±2,4 2,375±0,626 64,5±7,5 2,006±0,315 NK+ 0,8±0,3 0,040±0,011 0,5±0,1 0,030±0,010 0,7±0,3 0,041±0,021 CD4+IFN-␥+ 2,1±0,3 0,043±0,013 7,9±2,9 0,196±0,111 6,6±2,4 0,130±0,047 CD8+IFN-␥+ 13,6±2,6 0,080±0,021 11,9±2,6 0,107±0,042 8,5±2,8 0,091±0,026 NK+IFN-␥+ 5,6±2,6 0,002±0,001 6,4±4,1 0,004±0,005 2,4±1,6 0,001±0,001 28 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Примечание. – Обозначения используемых показателей: CD45 – маркер общего лейкоцитарного антигена; CD3+ - маркер Т-лимфоцитов; CD8+ – маркер Т-лимфоцитов цитотоксических; CD 4+ – общий маркер Т-лимфоцитов хелперов; NK+ – маркер NK лимфоцитов; CD 4+IFN-␥+ – общий маркер Т-лимфоцитов хелперов, продуцирующих IFN-␥+; CD8+IFN-␥+ – маркер Т-лимфоцитов цитотоксических, продуцирующих IFN-␥+; NK+IFN-␥+ – маркер NK лимфоцитов, продуцирующих IFN-␥+ вотные первой группы, получавшие монокультуру регидратированных бифидобактерий в повышающихся дозах, испытывали явный дискомфорт: животные внешне были неопрятными, малоактивными, плохо поедали корм. Более того, две из 13 белых мышей пали при введении бифидобактерий в дозе, в 10 раз превышающей суточную дозу. На вскрытии у павших животных были выявлены манифестные признаки перитонита. У оставшихся 11 животных на коже появились локальные участки выпадения шерсти (рисунок 1). Через 10 дней после окончания перорального введения подопытным животным первой и второй групп соответственно суспензий регидратированных бифидобактерий и индивидуальных микроорганизмов нормальной микрофлоры, у них вновь отбирали кровь для определения уровня показателей клеточного иммунитета. С целью изучения влияния пробиотических микроорганизмов на иммунную систему белых мышей с использованием метода проточной цитофлуориметрии был проанализирован уровень содержания в крови отдельных популяций (субпопуляций) лимфоцитов, таких как CD4+-Т-лимфоцитов хелперов, являющихся помощниками в реализации клеточного (Th1-лимфоциты) и гуморального (Th2-лимфоциты) иммунитета; CD8+-Т-лимфоцитов супрессоров (цитотоксических), принимающих участие в регуляции функции Т-хелперов и исполняющих роль киллеров в отношении интрацеллюлярных патогенов; NК+натуральных киллеров, основной функцией которых в организме является реализация противоопухолевого и противовирусного иммунитета. Кроме того, была оценена продукция соответствующими клетками интерферона ␥ (IFN-␥+), являющегося цитокином, стимулирующим дифференцировку Т-лимфоцитов хелперов в направлении Th1-клеток воспаления, а также участвующих в противоопухолевом и противовирусном иммунитете. Результаты оценки уровня содержания в крови белых мышей популяций (субпопуляций) лимфоцитов, а также уровень продукции данными клетками ␥-интерферона, представлены в таблице. Как следует из данных, представленных в таблице, у животных первой и второй групп выявлено достоверное увеличение в крови CD4+IFN-␥+-лимфоцитов по сравне- нию с фоновым значением. В то же время в крови животных второй группы отмечена явная тенденция к увеличению CD8+-лимфоцитов, снижению CD4+-лимфоцитов и NК+IFN-␥+-лимфоцитов в сравнении с фоновыми значениями. Обсуждение полученных результатов Как известно, пробиотики наряду с вакцинами, иммуноглобулинами, интерферонами, цитокинами, сыворотками, бактериофагами, аллергенами, диагностическими препаратами, иммуномодуляторами бактериального происхождения и на основе экстрактов органов и тканей относятся к медицинским иммунобиологическим препаратам. Они предназначены для специфической профилактики, диагностики и лечения инфекционных, паразитарных болезней и аллергических состояний. Пробиотики, в частности, являются довольно распространенными препаратами, предназначенными для нормализации нарушений микробиоценоза кишечника. Однако, их положительный эффект даже при длительном применении носит транзиторный характер, а порой и полностью отсутствует [24; 25]. Тем не менее, в инструкциях по медицинскому применению, в частности препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин, есть рекомендации по увеличению дозы принимаемого препарата в 5 раз с профилактической целью и в 5-10 раз при воспалительных заболеваниях. Только в инструкции по медицинскому применению пробиотического препарата Лактобактерин при отсутствии положительного эффекта от его применения на протяжении двух недель предписывается в такой ситуации проведение повторного исследования микрофлоры желудочнокишечного тракта и коррекция ее другими препаратами в зависимости от полученного результата [26]. Но как отразится увеличение дозы принимаемого пробиотического препарата в 5, 10 или даже в 100 раз на состоянии пациента? Возможны ли какие-то нежелательные последствия в этом случае? Представленные во введении настоящей работы обобщенные данные по клинико-лабораторным исследованиям дают основание утвердительно ответить на поставленные вопросы. В опубликованной научной статье А.А. Воробьева и В.М. Бондаренко [27] прямо засвидетельствовано, что «…представители нормальной микро- Выводы 1. Изучено влияние больших доз пробиотика Бифидумбактерин и микроорганизмов аутофлоры кишечника при пероральном введении на организм белых мышей и показатели клеточного иммунитета. 2. Установлено, что пероральное введение белым мышам больших доз пробиотика Бифидумбактерин приводит к ухудшению общего состояния животных, в частности к транслокации бактерий в брюшную полость у отдельных животных с развитием перитонита и их гибелью. У выживших животных в крови обнаружена статистически достоверная продукция Т-лимфоцитами и NK-клетками ␥-интерферона, свидетельствующая о направленности иммунного ответа преимущественно по клеточному пути развития с одновременной стимуляцией противомикробной активности макрофагов. Глава I ПРОБИОТИКИ сборник научных статей мы адаптационных механизмов, связанных со структурными, обменными и функциональными изменениями в макроорганизме [28]. В соответствии с современными представлениями о механизмах развития адаптации при любых нарушениях гомеостаза на первый план выступает мобилизация той системы, которая ответственна за адаптацию к данному фактору. Такой системой в нашем конкретном случае выступает иммунная система. При пероральном пути поступления пробиотиков и микроорганизмов нормальной микрофлоры, являющемся физиологическим путем введения антигенов и других биологически активных веществ в организм [29], доминирующую роль играет именно иммунная система, поскольку на нее падает главная нагрузка по устранению нарушений гомеостаза, вызванных антигенным воздействием [30]. Выявленные субпопуляционные сдвиги и изменения функциональной активности лимфоцитов у белых мышей в общем укладываются в рамки иммунобиологической перестройки в организме животных на фоне энтерального введения больших доз микроорганизмов пробиотиков. Однако, как это подчеркнуто в работе А.Н. Панина и Н.И. Малик [31], длительное использование высоких доз пробиотических микроорганизмов (антигена) приводит к истощению адаптационных резервов макроорганизма, возникновению побочных эффектов и снижению эффективности пробиотикотерапии при длительных курсах. В заключение укажем, что полученные нами результаты вполне созвучны опубликованным В.М. Бондаренко и В.Г. Петровской [14] данным о наличии у пробиотических штаммов микроорганизмов нежелательных свойств, к числу которых относят повышенную метаболическую активность, способность синтезировать промежуточные биополимеры, выраженную способность к транслокации из кишечника во внутренние органы, флогогенный эффект пептидогликана. Эти и другие свойства пробиотических микроорганизмов и микроорганизмов аутофлоры, на основе которых могут создаваться индивидуализированные пробиотические препараты, необходимо брать во внимание при решении проблемы выбора пробиотиков, правильного подбора их курсовых и разовых доз. Необходимо также при конструировании индивидуализированных пробиотических препаратов использовать чистые культуры микроорганизмов, выделенных из консорциума кишечной микрофлоры, которые, будучи более адаптированными к организму хозяина, смогут восстановить исходный количественный состав нормальной микрофлоры, в том числе в сочетании с современными пребиотическими препаратами [9; 11]. 29 флоры, даже такие «апатогенные», как бифидобактерии и лактобациллы, способны вызвать разнообразные формы локальных и генерализованных инфекций в основном у лиц с вторичными иммунодефицитами». При этом, как указано в работе [14], в ряде случаев обнаруживается общность бактериальных генов и генов главного комплекса гистосовместимости у человека. Антитела, образующиеся к бактериальному компоненту, перекрестно реагируют с белками клеток кишечника, что ведет к увеличению проницаемости слизистой, нарушению ее барьерной функции в отношении различных молекул и токсинов. Представленные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что пероральное введение животным первой группы монокультуры регидратированных бифидобактерий пробиотика Бифидобактерин в повышающихся концентрациях неблагоприятно сказалось на общем состоянии подопытных белых мышей, две особи из которых пали вследствие развития перитонита. Однако, у оставшихся в живых белых мышей по относительному и абсолютному уровню содержания в крови статистически достоверно выявлена продукция Т-лимфоцитами хелперами и NK-клетками ␥-интерферона (соответственно лимфоциты с фенотипом CD+4IFN-␥ и NК+INF-␥). Данный факт свидетельствует о направленности иммунного ответа преимущественно по клеточному пути развития, стимуляции противомикробной активности макрофагов и, возможно, противоопухолевого иммунитета при введении животным монокультуры регидратированных бифидобактерий пробиотика Бифидумбактерина. Животные второй группы, которым перорально вводили повышающиеся концентрации микроорганизмов собственной индигенной микрофлоры кишечника, вполне удовлетворительно перенесли данную бактериальную и антигенную нагрузку, которая также сопровождалась достоверным по сравнению с фоновым значением ростом относительного и абсолютного количества Т (CD+4IFN-␥+)лимфоцитов хелперов, продуцирующих ␥-интерферон. Одновременно, у животных второй группы в ходе исследования выявлено снижение относительного уровня содержания в крови CD4+-лимфоцитов хелперов и повышение цитотоксических CD8+-лимфоцитов супрессоров. Вполне вероятно, что под влиянием перорально вводимых микроорганизмов индивидуальной индигенной микрофлоры, среди которых присутствовали и условно-патогенные микроорганизмы, такие как золотистый стафилококк, энтерококк, протей и другие, был нарушен баланс в консорциуме микроорганизмов кишечной микрофлоры в сторону увеличения популяции условно-патогенных бактерий. Вследствие избыточной антигенной стимуляции иммунной системы со стороны условно-патогенной микрофлоры и ответной реакции с ее стороны, направленной на восстановление гомеостаза в микробиоценозе кишечника, развилось состояние иммуносупрессии. Таким образом, нами впервые получены экспериментальные доказательства того, что при пероральном введении экспериментальным животным больших доз пробиотических микроорганизмов могут возникать патологические состояния, приводящие даже к гибели животных. Ряд повторных введений экспериментальным животным пробиотических микроорганизмов per os в виде монокультуры или в виде сочетания 4-5 видов микроорганизмов (аутофлоры, выделенной из фекалий животных) можно рассматривать как своеобразный вакцинальный процесс, сопровождающийся активацией сложной систе- Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 30 3. Пероральное введение белым мышам повышающихся концентраций микроорганизмов аутофлоры кишечника не сказывается на общем состоянии животных, однако сопровождается достоверным по сравнению с фоновым значением ростом относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов хелперов, продуцирующих ␥-интерферон в ответ на бактериальную и антигенную нагрузку вводимой аутофлоры кишечника. ЛИТЕРАТУРА 1. Мечнiков I. Лекциiї з порiвняльної патологiї запалення (читанi у квiтнi й травнi 1891 року в Пастерiвському iнститутi). Киiв: ДВОУМЕДВИДАВ УРСР; 1932; 260 с. 2. Шандуренко Г.В. Илья Ильич Мечников Газета Биология. Издательский дом «Первое сентября», № 23. (цитировано 15.01.12). Адрес доступа: httр://bio.1septembr.ru/view-:article/php?1D=200002308. 3. Мечников И.И. Этюды о природе человека. М: Изд-во АН СССР; 1961; 288 с. 4. Мечников И.И. Этюды оптимизма. М: Наука; 1987; 327 с. 5. Biology-Online.org (цитировано 20.01.12). Адрес доступа: http:// www.biology-online.org/dictionary/probiosis. 6. Fuller R. Probiotics in man and animals. A review. J Appl Bacteriol 1989; 66 (5): 365-378. 7. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность. Хим биол безопасность 2007; № 2-3 (32-33): 20-41. 8. Gibson G.R., Roberfroid G.R. Dietary modulation of the human colonic micribiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr 1995; 125: 1401-1412. 9. Fuller R., Gibson G.R. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health. Clin Microbiol Infect 1998; 4: 477-480. 10. Кузнецов О.Ю. Бактериальная колония как сложно организованное сообщество клеток. Журн микробиол 2005; № 2: 3-7. 11. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. М: ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации; 2010; 50 с. 12. Мечников И.И. Невосприимчивость в инфекционных болезнях. Жизнь науки. М: Наука, 1973. с. 374-384. 13. Фролов В.А. Опередивший время. М: Советская Россия, 1980; 267 с. 14. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры. Вестн РАМН 1997; № 3: 7-10. 15. Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Афонская С.В., Смирнов В.В. Серологический ответ макроорганизма на патогенные бактерии под влиянием пробиотика из бацилл. Микробиол журн 1993; 55(1): 81-83. 16. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов. Антибиот химиотер 1998; 43 (2): 20-23. 17. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева Л.В. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков. Журн микробиол 1998; № 6: 68-70. 18. Ердякова А.С., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Погорельский И.П. Лимфоцитотоксическая активность пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий: выявление и характеристика. Общество, наука, инновации (НТК-2012): ежегод. открыт. всерос. науч.-техн. конф. 16-27 апреля 2012 г.: сб. материалов. Вят. гос. ун-т; отв. ред. С.Г. Литвинец. Киров; 2012. 1 электрон. опт. диск (CD-ROM) (Биологический факультет. Секция «Микробиология»). 19. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры. Русский мед журн 2000; 8 (13-14): 572-575. 20. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. СПб: Центр госсанэпиднадзора, 2002; 31 с. 21. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн микробиол 1992; № 9-10: 74-78. 22. Инструкция по медицинскому применению препарата Бифидумбактерин сухой, лиофилизат для приготовления суспензии для приема внутрь и местного применения. ФГУП «НПО Микроген»: утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 16.12.2005 г. № 01-11/243-05. 23. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 24. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта: дис. д-ра мед. наук: защищена в 2003 г. М: Учебно-научный центр Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации, 2003; 299 с. 25. Амерханова А.М. Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности: дисс... д-ра биол. наук: защищена в 2009 г. М: Московский науч.–исслед. ин-т эпидем. и микробиол. им. Г.Н.Габричевского, 2009; 280 с. 26. Инструкция по медицинскому применению препарата Лактобактерин сухой, лиофилизат для приготовления суспензии для приема внутрь и местного применения. ФГУП «НПО Микроген»: утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 14.04.2006 г. № 01-11/50-06. 27. Воробьев А.А., Бондаренко В.М. Роль микробиологии в снижении инфекционной заболеваемости. Эпидем инф болезни, 1997; № 5: 7-11. 28. Богачева Н.В., Дармов И.В., Борисевич И.В., Печенкин Д.В., Крючков А.В. Динамика показателей клеточного иммунитета на фоне введения чумной живой сухой вакцины. Клин лаборат диагн, 2009; № 8: 24-27. 29. Воробьев А.А. Физиологические пути введения антигенов и других биологически активных веществ в организм. Иммунология, 2002; 23 (3): 138-142. 30. Воробьев А.А., Лыкова Е.А., Феклисова Л.В., Боковой А.Г., Целиканова Е.Е. Использование больших доз пробиотика бифидумбактерина форте в лечении ОРВИ у детей. Эпидем. и инф. болезни, 2004; № 5: 43-46. 31. Панин А.Н., Малик Н.И. Принципы и перспективы применения эубиотиков в животноводстве. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Материалы Всероссийской конференции с международным участием; 21-23 апреля 1999 г; М: 1999. с. 22-23. Дармов И.В.1, Чичерин И.Ю.2, Погорельский И.П.1, Лундовских И.А.1, Дурнев Е.А.1 1 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии, 2 ООО «МедСтар» Глава I ПРОБИОТИКИ ВЫЖИВАЕМОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОБИОТИКОВ В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОМ ТРАКТЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ* SURVIVAL OF PROBIOTIC MICROORGANISMS IN THE GASTROINTESTINAL TRACT OF EXPERIMENTAL ANIMALS I.V. Darmov1, I.Yu. Chicherin2, I.P. Pogorelsky1, I.A. Lundovskikh1, E.A. Durnev1 РЕЗЮМЕ SUMMARY Цель исследования. Разработка методики выявления в кишечном содержимом белых мышей и морских свинок сертифицированных пробиотических микроорганизмов и изучение их выживаемости в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Материалы и методы. В экспериментах использовали устойчивые к рифампицину бифидобактерии и лактобактерии. Культуры микроорганизмов, сохранивших видовые признаки, вводили перорально в течение 14 суток и определяли число жизнеспособных бифидобактерий и лактобактерий путем высева фекалий на плотную питательную среду с рифампицином. Результаты. Пробиотические микроорганизмы, вводимые перорально экспериментальным животным в течение 14 суток, обнаруживаются в фекалиях на 2 сутки эксперимента. Живые пробиотические микроорганизмы полностью перестают обнаруживаться в фекалиях животных через 3 суток после окончания их перорального введения. Заключение. С использованием разработанной универсальной методики дифференциации поступающих в живой организм пробиотических микроорганизмов и штаммов собственной кишечной микрофлоры показано существенное на 4-7 порядков снижение выживших в организме экспериментальных животных бифидобактерий и лактобактерий, сопровождающееся отсутствием пробиотического эффекта. Ключевые слова: пробиотические микроорганизмы; кишечная микрофлора; выживаемость в желудочно-кишечном тракте; устойчивость бактерий к рифампицину; белые мыши; морские свинки. Purpose of the study. Development of methodology for the identification of certified probiotic microorganisms in the intestinal contents of white mice and guinea pigs and study of their survival in the gastrointestinal tract of experimental animals. Materials and methods. Rifampicin-resistant bifidobacteria and lactobacilli were used in the experiments. Cultures of microorganisms that have retained the species features were administered orally for 14 days and the number of viable bifidobacteria and lactobacilli were determined by sowing of feces in a dense nutrient medium with rifampicin. Results. Probiotic microorganisms administered orally to experimental animals for 14 days are detected in the feces on the second day of the experiment. Live probiotic bacteria ceases completely to be detected in the feces of animals 3 days after the termination of their oral administration. Conclusion. Using the developed universal method of differentiation of probiotic microorganisms entering the living organisms and strains of their own intestinal microflora a significant decrease (4-7 orders of magnitude) in survival of bifidobacteria and lactobacilli in the organisms of experimental animals was shown, followed by a lack of probiotic effect. Key words: probiotic microorganisms, intestinal microflora, survival in the gastrointestinal tract, resistance of bacteria to rifampicin, white mice, guinea pigs. ВВЕДЕНИЕ Для коррекции и восстановления численности и качественного состава кишечной микрофлоры, особое место на протяжении довольно длительного времени занимают пробиотики – живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при Клиницисты считают крайне важной необходимость восстановления при дисбиотических состояниях собственной микрофлоры кишечника, в первую очередь бифидобактерий и лактобактерий [1; 2]. * Ссылка для цитирования: Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дурнев Е.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Журнал инфектологии.- Т.4.- 2012.№1.- С. 68-74. сборник научных статей Vyatka State University, 2 LLC «MedStar» 31 1 Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 32 естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию его микроэкологического статуса [1; 2]. Однако, как отмечено Ю.А. Малаховым [3], выявилось явное несоответствие между сложившимся представлением о высокой эффективности пробиотиков и растущим распространением дисбактериозов [4]. Более того, даже использование сертифицированного пробиотика может не только не дать положительного результата, но и вызвать ухудшение состояния больного [5]. На возможные причины недостаточной эффективности пробиотической коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры указано в диссертации Н.А. Глушановой [6]. В частности, со ссылкой на работу А.И. Хавкина и Н.С. Жихаревой [7], отмечено, что под действием желудочного сока и желчи пробиотические микроорганизмы теряют до 90 % своей активности к моменту поступления в кишечник. Нами впервые в опытах in vitro с использованием модельных сред, имитирующих процесс пищеварения в желудочно-кишечном тракте человека, было доказано, что происходит заметное снижение числа жизнеспособных бифидобактерий и лактобактерий [8-10]. В этой связи весьма актуальным представляются исследования по оценке выживаемости пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий в желудочнокишечном тракте экспериментальных животных, особенно с учетом данных, представленных в работах [11; 12], о неспособности пробиотических микроорганизмов к длительному существованию в кишечнике конкретного человека. Сдерживающим фактором в плане реализации исследований по оценке выживаемости пробиотических микроорганизмов в пищеварительном тракте человека и экспериментальных животных является отсутствие методического подхода, позволяющего идентифицировать в фекалиях пробиотические микроорганизмы, принятые per os с профилактической или лечебной целью, и отличать их от собственных микроорганизмов нормальной микро- флоры, в частности бифидобактерий и лактобактерий. Таким образом, с учетом изложенного, целью настоящего исследования является разработка методики выявления в кишечном содержимом белых мышей и морских свинок сертифицированных пробиотических микроорганизмов и изучение их выживаемости в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В экспериментах использовали пробиотические микроорганизмы, выделенные из коммерческих препаратов Бифидумбактерин (серия 315-6), Лактобактерин (серия 15/6). Бифидобактерии и лактобактерии выращивали на плотных питательных средах рекомендованного состава [13; 14]. При выращивании пробиотических микроорганизмов в микроаэрофильных условиях использовали систему для анаэробного культивирования (анаэростат) – Anaerobic system Mark III-LE003 «Hi-Media Laboratories Pvt.». Ltd, Mumbai (Индия) с пакетами газогенераторными – HiAnaero Gas Pacet. Количество живых микроорганизмов в препаратах пробиотиков и в суспензиях определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений исследуемых суспензий на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчетом выросших колоний по истечении времени инкубирования. Селекцию спонтанных мутантов пробиотических микроорганизмов проводили по разработанной методике на плотной питательной среде с рифампицином согласно рекомендациям, изложенным в работе [15]. В работе использовали антибиотик Рифампицин-Ферейн (ЗАО «Брынцалов-А», Россия). Стабильность признака антибиотико-резистентности оценивали, характеризуя популяционный состав мутантов пробиотических микроорганизмов по R-признаку. Электронную микроскопию бифидобактерий и лактобактерий проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JEOL JSM 6510LV с платиновым напылением. Таблица 1. Содержание Rif r -микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте белых мышей при пероральном – введении (Х±I 95, n=5) Микроорганизмы Бифидобактерии Лактобактерии 1 0 0 Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 2 4 7 10 12 14 15 16 93±4 122±4 86±8 78±6 69±7 61±4 19±6 12±7 156±6 93±3 424±7 307±7 210±12 151±5 35±8 13±6 17 0 0 Таблица 2 Содержание Rif r -микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте морских свинок при пероральном – введении (Х±I 95, n=5) Микроорганизмы Бифидобактерии Лактобактерии 1 0 0 Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 2 4 7 10 12 14 15 16 105±2 89±4 82±8 53±3 29±7 23±4 14±7 13±7 89±6 93±4 76±7 44±7 21±8 23±5 21±8 12±6 17 0 0 Таблица 3 Выживаемость пробиотических микроорганизмов (Rif r) при транзите по желудочно-кишечному тракту лабораторных животных Микроорганизмы Бифидобактерии Лактобактерии Суточная доза, КОЕ (разовая доза х 2) 2,6х105 5,2х107 Белые мыши Содержание в Выживаемость фекалиях, КОЕ·г-1 – микробов, % (Х, на сутки 2…15 (доля) по данным табл. 1) 75 0,029 (2,88х10-4) 197 0,00038 (3,79х10-6) Суточная доза, КОЕ (разовая доза х 2) 2,6х106 5,3х108 Морские свинки Содержание в фекалиях, КОЕ·г-1 Выживаемость мик– (Х, на сутки 2…15 робов, % (доля) по данным табл. 1) 56 0,0022 (2,15х10-5) 52 0,0000098 (0,98х10-7) Для изучения выживаемости пробиотических микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных необходимо было разработать методику получения маркированных производных этих микроорганизмов и дифференциации вводимых бифидобактерий и лактобактерий от соответствующих штаммов собственной индигенной микрофлоры кишечника (в фекалиях). Маркерный признак должен помочь выявить их и идентифицировать в фекалиях при высеве последних на селективную плотную питательную среду, на которой микроорганизмы индигенной микрофлоры расти не будут [15]. Таким условиям удовлетворяет плотная питательная среда с антибактериальным препаратом, на котором способны расти R+- (устойчивые к этому препарату) микроорганизмы. В качестве селективного антибактериального препарата в экспериментах был использован рифампицин. Суть методики получения маркированных производных бифидобактерий и лактобактерий состоит в выращивании культур пробиотических микроорганизмов на плотных питательных средах с повышающимися концентрациями рифампицина и отборе спонтанных мутантов, сохраняющих видовые признаки. В предварительных опытах было установлено, что представители кишечной микрофлоры практически не растут в микроаэрофильных условиях на селективной плотной питательной среде с рифампицином при его концентрации 110 мкг•мл-1. С учетом этих данных, мутанты бифидобактерий и лактобактерий получали, высевая регидратированные пробиотические препараты Бифидумбактерин и Лактобактерин, а в последующем – отобранные спонтанные мутанты, на плотные питательные среды с повышающимися концентрациями рифампицина от 10 мкг•мл-1 до 150 мкг•мл-1. Отобранные мутанты бифидобактерий и лактобактерий, устойчивые к рифампицину (Rif r -мутанты), стабильно сохраняли признак антибиотико-резистентности. Изучение популяционного состава мутантных бактерий по признаку антибиотико-резистентности на плотных питательных средах, содержащих рифампицин в концентрациях 130 мкг·мл-1, свидетельствовало о сохранении бифидобактериями и лактобактериями наследственно закрепленного признака устойчивости к рифампицину (Rif r -признака). Мутантные бактерии, как и исходные бифидобактерии и лактобактерии, являются грамположительными. Размеры и форма микробных клеток представлены на электронных микрофотографиях (рисунки 1, 2). Размеры исходных бактерий и их Rif r -мутантных производных соответствуют размерам микробных клеток бифидобактерий и лактобактерий, указанным в руководстве Берджи [17]. Более подробное изучение свойств мутантных бактерий свидетельствовало о сохранении ими своих видовых признаков: способность к росту на богатых питательных средах в микроаэрофильных условиях; морфологическая особенность колоний (нежная зернистость, коническая форма, которая более выражена у лактобактерий); бакте- Глава I ПРОБИОТИКИ сборник научных статей РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ рии каталазоотрицательные, активно сбраживают углеводы, желатину не разжижают (видовой признак лактобактерий) [17]. В экспериментах по изучению выживаемости пробиотических микробов в желудочно-кишечном тракте белых мышей и морских свинок использовали устойчивые к рифампицину культуры бифидобактерий и лактобактерий, выросшие на плотной питательной среде в микроаэрофильных условиях при температуре 37 °С в течение 72 часов. Суспензии бактерий на изотоническом растворе хлорида натрия вводили экспериментальным животным per os с помощью туберкулинового шприца с иглой, имеющей оливу на конце для предупреждения травматизации слизистой ротоглотки. Суточную дозу бактерий рассчитывали, исходя из инструкций по медицинскому применению препаратов Бифидумбактерина сухого и Лактобактерина сухого для взрослых, с учетом соотношения доз для различных видов животных в перерасчете на единицу поверхности тела. Белым мышам вводили 2 раза в сутки по 130 тыс. бифидобактерий и по 26 млн. лактобактерий, морским свинкам – также 2 раза в сутки по 1,3 млн. бифидобактерий и по 265 млн. лактобактерий. Каждое из экспериментальных животных (4 группы по 10 животных в каждой) помещали в отдельный кювет и содержали согласно рекомендациям К.П.Ковалевского [18]. Отбор фекалий для бактериологического анализа осуществляли ежедневно на протяжении всего срока экспериментов, составлявшего 14 суток. Отобранные фекалии суспендировали в изотоническом растворе хлорида натрия, помещали в центрифужные пробирки с крышками и после центрифугирования и осаждения непереваренных остатков пищи отбирали надосадочную жидкость, которую высевали на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри, содержащей 110 мкг•мл-1 рифампицина. После инкубации чашек Петри с посевом суспензий фекальных масс в течение 72 часов в микроаэрофильных условиях при температуре 37 °С определяли число выросших колоний и в последующем пересчитывали количество жизнеспособных бактерий на 1 г фекалий экспериментальных животных. Результаты бактериологического изучения фекалий белых мышей и морских свинок после перорального введения Rif r -пробиотических микроорганизмов представлены в таблицах 1, 2 и в обобщенном виде – в таблице 3. Как видно из представленных в таблицах 1 и 2 данных, в фекалиях животных, исследованных в первые сутки после начала перорального введения антибиотико-резистентных бифидобактерий и лактобактерий, не было выявлено соответствующих микроорганизмов, о чем свидетельствовало отсутствие выросших на поверхности плотной питательной среды с рифампицином характерных колоний. Но уже на вторые сутки эксперимента при высеве суспензий фекалий белых мышей и морских свинок на селективную питательную среду с рифампицином выявлялись колонии, соответствующие по морфологическим признакам колониям бифидобактерий и лактобактерий. Далее, из представленных результатов бактериологического исследования фекалий белых мышей и морских свинок следует, что в течение 2 недель экспериментов происходило незначительное в сравнении с вводимыми суточными дозами пробиотических микроорганизмов их выделение с фекалиями из организма экспериментальных животных. Выживаемость бифидобактерий в организме белых мышей и морских свинок составила соответственно 0,029% и 0,0022 %, а лактобактерий – соответственно 33 В исследованиях по изучению приживаемости рифампицинустойчивых (Rif r) мутантов бифидобактерий и лактобактерий в пищеварительном тракте животных использовали белых мышей, беспородных, обоего пола, массой 18-20 г, морских свинок, беспородных, обоего пола, массой 250-300 г, прошедших акклиматизацию в виварии. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [16]. Глава I ПРОБИОТИКИ Рисунок 1 – Микроскопическая картина клеток исходных бифидобактерий (1) и их Rif r -мутантов (2). Электронная микроскопия. х6500 и 8000 соответственно Рисунок 2 – Микроскопическая картина клеток исходных лактобактерий (1) и их Rif r -мутантов (2). Электронная микроскопия. х7000 и 11000 соответственно 0,00038 % и 0,0000098 %. Полностью прекратилось выделение Rif r -мутантных бактерий на 3 сутки после последнего перорального их введения. Сниженная численность популяций антибиотикорезистентных бифидобактерий и лактобактерий, преодолевших существующие барьеры желудочно-кишечного тракта белых мышей и морских свинок, которые впоследствии совсем перестали выделяться из кишечного содержимого животных, свидетельствует о транзиторном характере пребывания пробиотических микроорганизмов в пищеварительном тракте животных. тической в соответствии с экологическими принципами ведет к гибели всей популяции. Другой возможной причиной гибели микроорганизмов пробиотиков, на которую указано в работе, исходя из экспериментальных данных [8], может быть бионесовместимость по типу «хозяин против пробиотика» [19]. Эти и другие причины, на которые указывают теоретические и экспериментальные исследования Н.А. Глушановой [6], в комплексе оказывают негативное влияние на пробиотические микроорганизмы in vivo, что подтверждено настоящими исследованиями с использованием белых мышей и морских свинок. Вводимые в течение 14 суток перорально экспериментальным животным маркированные по признаку устойчивости к рифампицину бифидобактерии и лактобактерии начинают обнаруживаться в фекалиях животных бактериологическим методом на 2 сутки эксперимента. Однако, начиная с 3 суток, после прекращения введения пробиотических микроорганизмов, они перестают обнаруживаться в фекалиях животных. Исходя из полученных результатов, можно заключить, что пробиотические микроорганизмы, уменьшаясь количественно, не приживаются в желудочно-кишечном тракте белых мышей и морских свинок, не включаются в состав биопленки нормальной микрофлоры и в составе внутрипросветной микрофлоры вместе с остатками непереваренной пищи и фекальными массами удаляются из организма. Созвучными с полученными нами результатами являются данные А.А. Ленцнера и др. [20], согласно которым пробиотические микробы не могут стать составной частью резидентной микрофлоры, а лишь способствуют ее восстановлению. Результаты, опубликованные нами ранее [8] по изучению выживаемости пробиотических микроорганизмов в модельных условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения, получили, на наш взгляд, полное подтверждение в экспериментах in vivo в условиях нахождения пробиотиков в желудочно-кишечном тракте белых мышей и морских свинок. Обобщенные данные, представленные в таблице 3, наглядно демонстрируют аналогичное модельным условиям in vitro снижение концентрации живых пробиотических микроорганизмов на 4-7 lg КОЕ во время их транзита по желудочно-кишечному тракту лабораторных животных. 34 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ В выступлениях ученых и клиницистов на гастроэнтерологическом симпозиуме «Новые подходы к терапии заболеваний желудочно-кишечной системы» был затронут один из ключевых моментов, выражающийся в том, что «… выбор терапии должен быть корректным и направлен на то звено нарушенной регуляции, которое утратило возможность самовосстановления» [1; 2]. Таким звеном нарушенной регуляции является нормальная микрофлора, претерпевающая количественные и качественные изменения при дисбактериозах. Безусловно, пробиотики в комплексном лечении дисбактериозов «… создают эффект, но не всегда и не такой, как предполагалось» [1; 2]. Высказанная мысль о чужеродности пробиотических микроорганизмов и их отторжении организмом вследствие биологической несовместимости [11; 12] нашла свое подтверждение в наших исследованиях по изучению выживаемости пробиотических микроорганизмов в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека [8]. Получены экспериментальные доказательства того, что на численность бифидобактерий и лактобактерий отрицательное влияние оказывают кислая и сменяющая ее щелочная модельные среды, содержащие ферментные препараты ацидинпепсин и панзинорм форте 20000 соответственно, имитирующие in vitro условия пищеварения у человека. Естественно, что в условиях in vivo на пробиотические микроорганизмы воздействует гораздо больше, чем в эксперименте in vitro, факторов, приводящих к гибели значительной части их популяции. Снижение численности популяции микроорганизмов пробиотиков ниже кри- Глава I ПРОБИОТИКИ 1. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта: дис… д-ра мед. наук: защищена 2003 г. / М.Д. Ардатская. – М.: ФБУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации, 2003. – 299 с. 2. Ардатская М.Д. Дисбактериоз кишечника: эволюция взглядов. Современные принципы диагностики и фармакологической коррекции / М.Д. Ардатская, О.Н. Минушкин // Consilium medicum. Гастроэнтерология. – 2006. – № 2. – С. 4-18. 3. Малахов Ю.А. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека / Ю.А. Малахов // Матер. Всерос. конф. с междунар. участием 21-23 апреля 1999 г. – Москва, 1999. – С. 110. 4. Покровский В.И. Инфекционные болезни в конце ХХ века и санитарно-эпидемиологическое благополучие в России в XXI веке / В.И. Покровский, Г.Г. Онищенко, Б.Л. Черкасский // Журн. микробиол. – 2002. – № 3. – С. 16-23. 5. Кузнецова Г.Г. Пробиотикограмма – новый подход к коррекции дисбиотических отклонений в микробиоценозе толстой кишки / Г.Г. Кузнецова, С.А. Шевелева // Здоровое питание населения России: матер. VII Всерос. конгр. 12-14 ноября 2003 г.; гл ред. В.А. Тутельян. – Москва, 2003. – С. 270-273. 6. Глушанова Н.А. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: дис… д-ра мед. наук: защищена 2006 г. / Н.А. Глушанова. – ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского», 2006. – 260 с. 7. Хавкин А.И. Коррекция дисбиотических изменений кишечника у детей на современном этапе / А.И. Хавкин, Н.С. Жихарева // Русский мед. журн. – 2004. – Т. 12. – № 16. – С. 960-963. 8. Дармов И.В. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. – 2011. – № 3. – С. 6-11. 9. Заявка на выдачу патента РФ. Способ выявления жизнеспособности пробиотических микроорганизмов в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, А.С. Ердякова и др.; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет». № 2011133426/17 (049416): заявл. 09.08.2011. 10. Дармов И.В. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, А.С. Ердякова и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. – 2011. – № 9. – С. 96-101. 11. Коршунов В.М. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника / В.М. Коршунов, В.В. Смеянов, Б.А. Ефимов // Вест. РАМН. – 1996. – № 2. – С. 60-65. 12. Lin J.Y.C. Genetic transformation of rifampicin resistance in Lactobacillus acidophilus / J.Y.C. Lin, D.C. Savage // J. Gen. Microbiol. – 1986. – Vol. 132. – № 8. – P. 2107-2111. 13. Иванов В.П. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо / В.П. Иванов, А.Г. Бойцов, А.Д. Коваленко и др. – СПб.: Центр госсанэпиднадзора, 2002. – 31 с. 14. Лихачева А.Ю. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus / А.Ю. Лихачева, В.М. Бондаренко, К.Я. Соколова // Журн. микробиол. – 1992. – № 9-10. – С. 74-78. 15. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / Пер. с англ. Ю.Н.Зографа, Т.С.Ильиной, В.Г.Никифорова / Дж. Миллер. – М.: Мир, 1976. – 436 с. 16. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. – Л.: Медгиз, 1962. – 280 с. 17. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. / Под ред. Дж. Хоулта и др. / Пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. – М.: Мир. – Т. 2. – 368 с. 18. Ковалевский К.Л. Содержание мелких лабораторных животных в вивариях / К.Л. Ковалевский. – М.: ОГИЗ СЕЛЬХОЗГИЗ, 1949. – 80 с. 19. Глушанова Н.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro / Н.А. Глушанова, Б.А. Шендеров // Журн. микробиол. – 2005. – № 2. – С. 56-61. 20. Ленцнер А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность / А.А. Ленцнер, Х.П. Ленцнер, М.Э. Микельсаар и др. // Антибиот. и мед. биотехнол. – 1987. – Т. 32. – № 3. – С. 173-179. 21. Хильми Г.Ф. Основы биофизики биосферы / Г.Ф. Хильми. – Л.: Гидрометеоиздат, 1966. – 272 с. 22. Воеводин Д.А. Роль дисбактериоза в формировании хронической инфекционной патологии у детей / Д.А. Воеводин, Г.Н. Розанова, М.А. Стенина и др. // Журн. микробиол. – 2001. – № 6. – С. 88-93. сборник научных статей ЛИТЕРАТУРА 35 Полученные в настоящих исследованиях экспериментальные данные вполне согласуются с законом Г.Ф. Хильми [21] – одним из основных законов, регулирующих взаимоотношения в системе «общество - природа». Этот закон действует в любых экосистемах и, являясь по существу общесистемным, вполне применим к микроэкологической системе кишечника экспериментальных животных и человека. В соответствии с этим законом, пробиотические микроорганизмы, выращенные искусственно и поступающие в организм в составе препарата, являются малым системным образованием, которое постепенно меняет свою структуру и через некоторое время «растворяется» в существующей экосистеме. И чем выше разница между уровнем организации «островной биоты» и ее окружения – микроэкологической системы кишечника, тем скорее происходит деградация «островной биоты», в данном конкретном случае популяции пробиотических микроорганизмов. Справедливость закона Г.Ф. Хильми подтверждена данными Д.А. Воеводина и др. [22], согласно которым, при выращивании пробиотических микроорганизмов на искусственных питательных средах происходит их дезадаптация к условиям обитания в кишечнике, ослабление активности и снижение численности. Механизм реализации закона Г.Ф. Хильми (закона обеднения разнородного вещества в островных его сгущениях) [21] применительно к взаимоотношениям пробиотических микроорганизмов и индигенной микрофлоры кишечника включает: – гибель части популяции пробиотических микроорганизмов в ходе преодоления защитных барьеров желудочно-кишечного тракта; – снижение популяции пробиотических микроорганизмов ниже критической, не позволяющей восстановить и увеличить ее численность, а затем интегрироваться в биопленку пристеночной микрофлоры; – колонизационную резистентность кишечника, микрофлора которого отторгает пробиотические микроорганизмы. Представленные результаты ставят под сомнение существующий принцип заместительного действия пробиотикотерапии, что, безусловно, имеет важное практическое значение для реализации положений концепции пребиотической терапии, связанной с необходимостью поддержания и восстановления собственной микрофлоры кишечника, а не с попыткой его заселения хорошими, но «чужими» для него микроорганизмами. В заключение необходимо отметить следующее: – впервые разработана универсальная методика получения маркированных производных пробиотических микроорганизмов, позволяющая дифференцировать поступающие в организм пробиотические микроорганизмы от соответствующих штаммов собственной кишечной микрофлоры; – получены экспериментальные данные о существенном – на 4-7 порядков снижении численности поступающих в организм подопытных животных пробиотических микроорганизмов, подтверждающих ранее полученные данные на модельных средах in vitro о снижении количества жизнеспособных пробиотических микроорганизмов на 3-5 порядков; – с учетом полученных экспериментальных данных, считаем необходимым провести исследования в направлении изучения возможности приживления пробиотических микроорганизмов на основе гомопробиотических штаммов в пищеварительном тракте экспериментальных животных с бактериологически подтвержденным дисбиозом кишечника. Глава I ПРОБИОТИКИ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОБИОТИКОВ: МИФ ИЛИ РЕАЛЬНОСТЬ Чичерин И.Ю.1, Дармов И.В.2, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2, Гаврилов К.Е.2 1 2 ООО «МедСтар», Сергиев Посад, Россия (141300, Сергиев Посад, ул. Вознесенская, 55), e-mail: rpatron@mail.ru ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru SUBSTITUTION EFFECT OF PROBIOTICS: MYTH OR REALITY I.Yu. Chicherin1, I.V. Darmov2, I.P. Pogorelsky2, I.A. Lundovskikh2, K.E. Gavrilov2 1 36 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 2 LLC «MedStar», Sergiev Posad, Russia (Voznesenskaya st., 55, Sergiev Posad, Russia, 141300), e-mail: rpatron@mail.ru, Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Приведены результаты экспериментального изучения приживаемости пробиотических микроорганизмов – гомологичных бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике экспериментальных конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. В экспериментах использовали культуры бифидобактерий и лактобактерий, выделенные от мышей линии BALB/c, на основе которых были получены устойчивые к рифампицину (Rif r) спонтанные мутанты. Приживаемость полученных спонтанных мутантов бифидобактерий и лактобактерий изучена на конвенциональных белых мышах, в том числе и с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Экспериментально установлено, что рифампициноустойчивые мутанты гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий сохранили видовую принадлежность и наследственно закрепленный признак антибиотикорезистентности. Введенные перорально конвенциональным белым мышам, в том числе с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, Rif r-мутанты гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий не приживаются в кишечнике животных и элиминируются соответственно к 3 и 5 суткам после прекращения перорального введения животным. Представленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при дисбактериозах следует стимулировать восстановление собственной микрофлоры кишечника, а не полагаться только на заместительное действие поступающих извне в кишечник пробиотических микроорганизмов, которые с неизбежностью отторгаются эволюционно сложившейся кишечной микрофлорой. Ключевые слова: гомопробиотические микроорганизмы, приживаемость в кишечнике, антибиотико-ассоциированный дисбактериоз, элиминация микроорганизмов. Results of the experimental study of survival rate of probiotic microorganisms – homologous bifidobacteria and lactobacilli – in the intestines of the conventional experimental white mice with antibiotic-associated dysbiosis are presented. Isolated from mice of BALB/c line cultures of bifidobacteria and lactobacilli, based on which the resistant to rifampicin (Rif r) spontaneous mutants were obtained, were used in the experiments. The survival rate of spontaneous mutants of bifidobacteria and lactobacilli were studied on the conventional white mice, including those with antibiotic-associated dysbiosis. It is experimentally found, that the rifampicin-resistant mutants of homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli retained the species identity and hereditarily fixed sign of antibiotic resistance. Administered orally to conventional white mice, including those with antibiotic-associated dysbiosis, Rif r-mutants of homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli do not survive in the intestines of animals and are eliminated to 3 and 5 days respectively after the termination of their oral administration to animals. The experimental data indicate that at dysbacteriosis should stimulate the restoration of one’s own intestinal microflora and not rely only on the substitution effect of coming from outside the intestine probiotic microorganisms, which are inevitably rejected by evolutionarily established intestinal microflora. Key words: homoprobiotic microorganisms, survival in the intestine, antibiotic-associated dysbiosis, elimination of microorganisms. ВВЕДЕНИЕ зиологического состояния организма [1, 2]. При этом транзиторные нарушения микробиоценоза кишечника относят к дисбактериальным реакциям, а выраженные и стойкие изменения количественного и качественного состава микроорганизмов – к дисбактериозам [1-4]. Поддержание нормального биоценоза человеческого организма, в частности численности и функциональной активности микрофлоры в различных отделах пищеварительного тракта, всецело зависит от нормального фи- Глава I ПРОБИОТИКИ ными данными, согласно которому пробиотические микроорганизмы должны быть выделены из организма тех видов животных и человека, для которых они будут предназначены [14, 15]. С учетом приведенных данных, а также результатов исследований В.М. Коршунова и др. [16], показавших эффективность аутоштаммов бактерий при химиотерапевтическом дисбактериозе, представляется целесообразным проведение исследования, связанного с выделением гомологичных бифидобактерий и лактобактерий и оценкой их приживаемости в кишечнике экспериментальных животных. Цель исследования Цель настоящего исследования – изучение приживаемости пробиотических микроорганизмов – гомологичных бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике экспериментальных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. В экспериментах использовали культуры бифидобактерий и лактобактерий, выделенные из экскрементов мышей линии ВАLВ/с – лабораторной линии домашних мышей, традиционно используемых в исследованиях по иммунологии и в онкологии [17]. Чистые культуры бифидобактерий и лактобактерий выделяли на плотных питательных средах рекомендованного состава [18, 19] в чашках Петри после инкубации в микроаэрофильных условиях с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III-LE003 (HiMedia Laboratories Pvt.». LTD, Mumbai, Индия) с пакетами газогенераторными HiAnaero Gas Pacet. Количество живых микроорганизмов в суспензиях определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений исследуемых суспензий на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчетом выросших колоний по истечении времени инкубирования. Селекцию спонтанных мутантов выделенных лактобактерий и бифидобактерий проводили по отработанной методике на плотной питательной среде с рифампицином согласно рекомендациям, изложенным в работе [20], используя антибиотик рифампицин – Ферейн (ЗАО «Брынцалов-А», Россия). Стабильность признака антибиотикорезистентности оценивали, характеризуя популяционный состав мутантов пробиотических микроорганизмов по R-признаку. Электронную микроскопию бифидобактерий и лактобактерий проводили с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEOL JEM-1200EX (Япония). Просмотр препаратов после пробоподготовки вели при ускоряющем напряжении 72 кВ. В исследовании по изучению приживаемости выделенных рифампицинустойчивых (Rifr-мутантов) бифидобактерий и лактобактерий в пищеварительном тракте животных использовали конвенциональных белых мышей, беспородных, обоего пола, массой 18-20 г, прошедших акклиматизацию в виварии. Антибиотикоассоциированный дисбактериоз кишечника у белых мышей инициировали путем перорального введения гентамицина (продукция ОАО «Биохимик», Россия) [21]. Статистическую обработку результатов исследования проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [22]. Результаты исследования Линия мышей-альбиносов ВАLВ/с происходит от белых коммерческих мышей Х. Бэгга, приобретенных им в штате Огайо в 1906 г. [17]. Быстрое размножение, зрелость в возрасте 5-7 недель и ряд других характеристик сборник научных статей Материалы и методы исследования 37 Для коррекции и восстановления численности и качественного состава кишечной микрофлоры на протяжении довольно длительного времени особое место отводится пробиотикам – живым микроорганизмам и веществам микробного происхождения, оказывающим при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию его микроэкологического статуса [1-4]. Одним из основных механизмов действия пробиотиков является заместительная терапия [5], предназначенная для восполнения сниженного уровня соответствующего микроорганизма. По определению Большого медицинского словаря, под заместительным действием понимают введение в организм вещества, естественная выработка которого понижена или прекращена [6]. Таким образом, для того, чтобы заместительная терапия могла реализоваться, необходимо выполнение, как минимум, двух условий. Во-первых, пробиотические микроорганизмы должны достигнуть толстой кишки в жизнеспособном состоянии в количестве, достаточном для преодоления колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника. Во-вторых, они должны прижиться в пристеночном слое (биопленке) и стать составной частью микробиоценоза кишечника. Бесспорно, что интегративным показателем реализации двух вышеперечисленных условий, т.е. существования заместительной терапии как таковой, должно быть бактериовыделение с калом соответствующего пробиотического микроорганизма после окончания курса пробиотикотерапии. Представленные в научных публикациях данные свидетельствуют о необходимости и целесообразности включения пробиотиков в схемы лечения большинства заболеваний [7]. Однако, и до настоящего времени не удается решить проблему коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры [1-3]. Более того, в исследованиях Ю.А. Малахова [8] указано на несоответствие между сложившимся мнением об эффективности пробиотиков и всё увеличивающимся распространением дисбактериозов. Положительный эффект пробиотикотерапии даже при длительном применении носит транзиторный характер или полностью отсутствует [3]. Увеличивается количество публикаций о побочных эффектах пробиотикотерапии при назначении больших доз пробиотиков [9]. Отмечается отсутствие убедительных сведений о положительном действии пробиотиков на организм здорового человека [10] и недостаточную изученность механизмов благоприятного влияния пробиотических микроорганизмов [11]. На возможные причины недостаточной эффективности пробиотической коррекции дисбиозов указано в диссертации Н.А. Глушановой [12]. Среди многих причин, приводящих к неприживаемости пробиотиков и их отторжению, автор цитируемой работы отмечает гетерологичность пробиотических бактерий для организма нового хозяина, которая может быть связана с видовыми различиями первичного и нового хозяина пробиотика. В экспериментах на животных со всей очевидностью установлено, что введение животным микроорганизмов от другого вида животных (гетеропробиотика) приводило к снижению адгезивного потенциала и колонизирующей способности гетеропробиотического микроорганизма, увеличению колонизационной резистентности слизистой кишечника, что приводило к транзиторному характеру взаимодействия вводимого гетеропробиотика с организмом нового хозяина [13]. Существует мнение, подкрепленное эксперименталь- Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 38 делают мышей линии ВАLВ/с и их нелинейных потомков традиционными объектами для клинических и иммунологических исследований. Фекальные массы линейных мышей послужили источником выделения бифидобактерий и лактобактерий – гомопробиотиков для изучения их приживаемости в организме нелинейных белых мышей. Суспендированные фекалии линейных мышей в изотоническом растворе хлорида натрия центрифугировали для осаждения фрагментов непереваренной пищи, а надосадочную жидкость использовали для посева на соответствующие плотные питательные среды и получения роста изолированных колоний. Отобранные колонии микроорганизмов, выросших в микроаэрофильных условиях, после изучения на соответствие видовым характеристикам, присущим бифидобактериям и лактобактериям [23], использовали в дальнейшей работе, в частности для получения маркированных по признаку антибиотико-резистентности (R-признак) производных гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий. Наличие и сохранение наследственно закрепленного R-признака имеет существенное значение для оценки приживаемости гомопробиотических микроорганизмов в кишечнике нелинейных белых мышей и отличия их от бифидобактерий и лактобактерий аутофлоры экспериментальных животных. Для получения маркированных производных по R-признаку гомопробиотических микроорганизмов был выбран антибиотик рифампицин, который добавляли в плотные питательные среды в повышающихся концентрациях от 10 мкг•мл-1 до 150 мкг•мл-1 [20]. Посев на питательные среды, содержащие указанные концентрации рифампицина, гомопробиотических микроорганизмов позволил отобрать спонтанные мутанты бифидобактерий и лактобактерий, устойчивые к рифампицину (Rif r-мутанты). Уровень устойчивости спонтанных мутантов, достигнутый в результате селективного отбора на питательных средах с повышающимися концентрациями рифампицина, обеспечивал рост бактериальных клеток на поверхности плотных питательных сред, содержащих антибиотик в концентрации 150 мкг•мл-1. Отобранные Rif r-мутанты бифидобактерий и лактобактерий стабильно сохраняли признак антибиотико-резистентности. Изучение популяционного состава мутантных бактерий по признаку антибиотико-резистентности на плотных питательных средах, содержащих рифампицин в концентрации 130 мкг•мл-1, свидетельствовало о сохранении ими наследственно закрепленного признака устойчивости к рифампицину (Rif r-признака). Стабильное сохранение мутантными бактериями довольно высокого уровня устойчивости к рифампицину имеет важное практическое значение, поскольку, как показали предварительные исследования, представители кишечной микрофлоры практически не растут в микроаэрофильных условиях на плотных питательных средах с рифампицином при его содержании в среде выращивания 110 мкг•мл-1. Разница в уровнях устойчивости к рифампицину позволяет уверенно отличать гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии от микроорганизмов тех же биологических видов, но являющихся представителями нормальной микрофлоры кишечника нелинейных белых мышей. Мутантные Rif r-бактерии, как и исходные бифидобактерии и лактобактерии, выделенные из фекалий линейных мышей ВАLВ/с, являются грамположительными 1 2 3 4 Рисунок – Электронно-микроскопическая картина клеток исходных бифидобактерий (1, ⫻10000); Rif r-мутантов бифидобактерий (2, ⫻10000); исходных лактобактерий (3, ⫻8000); Rif r-мутантов лактобактерий (4, ⫻8000) Особо следует подчеркнуть, что аутофлора кишечника белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом оставалась чувствительной к рифампицину и не росла на плотной питательной среде с рифампицином в концентрации 110 мкг•мл-1 в микроаэрофильных условиях. Содержание общего количества фекальной микрофлоры, а также бифидобактерий и лактобактерий аутофлоры и антибиотико-резистентных мутантов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий контролировали высевом суспензий фекальных масс, полученных от животных опытной и контрольных групп, на соответствующие плотные питательные среды и подсчетом выросших колоний. Общее содержание микроорганизмов кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей у белых мышей опытной и контрольной групп представлено в таблице 1. Как следует из представленных данных, у белых мышей опытной группы, получавших гентамицин, к 7 дню эксперимента выявлено снижение как общего количества микроорганизмов фекальной микрофлоры, так и бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий в среднем на 4 порядка. У животных контрольной группы, находившихся на обычном пищевом рационе дисбиотических изменений микрофлоры кишечника не выявлено. Для проведения последующих экспериментов обе группы животных, опытная и контрольная, были разделены на две подгруппы. Животным одной подгруппы вводили гомопробиотические Rif r-мутанты бифидобактерий, а животным второй группы – Rif r-мутанты лактобактерий. Отбор фекалий у белых мышей опытной и контрольной групп осуществляли ежедневно на протяжении всего срока экспериментов, составившего 14 суток, и еще 5 суток после прекращения введения мутантных бактерий. Отобранные фекалии суспендировали в изотоническом растворе хлорида натрия, суспензии центрифугировали для осаждения непереваренных остатков пищи, отбирали надосадочную жидкость, которую высевали на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри, содержащей 120 мкг•мл-1 рифампицина. Глава I ПРОБИОТИКИ и имеют все видовые характеристики, свойственные бифидобактериям и лактобактериям. Они сохранили способность к росту на богатых питательных средах в микроаэрофильных условиях. Размеры и форма микробных клеток соответствуют таковым, приведенным в руководстве Берджи [23]. Электронно-микроскопическая картина выделенных пробиотических микроорганизмов и их Rif r-мутантов приведена на рисунке. В экспериментах по изучению приживаемости Rif r-мутантов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике нелинейных белых мышей использовали культуры микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах в микроаэрофильных условиях при температуре 37 °С в течение 72 часов. Суспензии бактерий на изотоническом растворе хлорида натрия вводили двум группам животных перорально с помощью туберкулинового шприца с иглой и оливой на ее конце для предупреждения травматизации слизистой ротоглотки. Одна группа белых мышей в количестве 20 особей была контрольной, а вторая, также в количестве 20 особей, – опытной, в которую были включены животные с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, вызванным пероральным введением антибиотика гентамицина дважды в сутки по 3 мг на одно введение [21]. Продолжительность введения гентамицина белым мышам – 7 суток. Важно отметить, что введение Rif r-мутантных бифидобактерий и лактобактерий животным с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом начинали через 5 суток после прекращения перорального введения гентамицина с целью выведения антибиотика и уменьшения его количества в кишечном содержимом ниже минимальной подавляющей концентрации. Суточная доза вводимых Rif r бифидобактерий составила по 130 тыс. бактерий в 2 приема, а Rif r лактобактерий – 26 млн. бактерий в 2 приема, исходя из инструкций по медицинскому применению препаратов Бифидумбактерина сухого и Лактобактерина сухого для взрослых людей с учетом соотношения доз для белых мышей в перерасчете на единицу поверхности тела. Таблица 1. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом (Х±I95, n=20) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 Начало эксперимента 9 Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Контрольная группа Бифидобактерии белых мышей Лактобактерии Эшерихии (6,9±0,4)•10 (5,6±0,5)•106 (2,8±0,6)•108 (2,1±0,5)•104 (7,0±0,5)•109 (5,7±0,6)•106 (2,7±0,5)•108 (1,8±0,6)•104 Опытная группа белых мышей, получавших гентамицин 2 5 6 (7,3±0,5)•10 (2,6±0,4)•104 (1,8±0,5)•106 (2,1±0,6)•103 (6,5±0,7)•109 (5,9±0,8)•109 (2,8±0,6)•108 (2,1±0,7)•104 7 5 (4,1±0,4)•10 (1,7±0,4)•103 (1,8±0,5)•105 (1,6±0,6)•102 (6,9±0,7)•109 (5,4 ±0,6)•106 (2,6±0,4)•108 (2,4±0,5)•104 (1,1±0,4)•105 (1,3±0,5)•102 (1,3±0,6)•104 (1,3±0,5)•101 (6,4±0,5)•109 (5,1 ±0,6)•106 (2,9±0,7)•108 (2,1±0,7)•104 Таблица 2. Содержание Rif r-микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом (Х±I95, n=10) Группа животных Микроорганизмы Опытная группа Бифидобактерии белых мышей, получавших гентамицин Лактобактерии Контрольная группа Бифидобактерии белых мышей Лактобактерии 1 0 Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 2 4 7 10 12 14 15 16 17 22 136±4 165±15 210±18 220±19 190±10 186±12 90±10 35±5 13±7 0 0 145±16 210±20 396±20 410±21 320±25 290±18 130±12 86±6 20±6 0 0 0 110±10 145±12 139±10 86±7 75±8 71±9 196±12 198±14 369±25 295±15 215±12 160±13 0 0 35±5 46±8 16±6 17±8 0 0 сборник научных статей Микроорганизмы 39 Группа животных Глава I ПРОБИОТИКИ После инкубации чашек Петри с посевом суспензий фекальных масс в течение 72 часов в микроаэрофильных условиях при температуре 37 °С определяли число выросших колоний для пересчета количества жизнеспособных бактерий на 1 г фекалий белых мышей. Результаты бактериологического изучения фекалий животных представлены в таблице 2. Из представленных данных следует, что в первые сутки после начала введения животным Rif r-бифидобактерий и Rif r-лактобактерий в фекалиях антибиотико-резистентных бактерий выявлено не было. Они появились на вторые сутки и выявлялись в фекалиях на протяжении 14 суток, пока соответствующие Rif r-бактерии поступали в организм животных опытной и контрольной групп. В то же время необходимо отметить незначительное в сравнении с вводимыми суточными дозами бифидобактериями и лактобактериями их выделение с фекалиями из организма белых мышей. Важно подчеркнуть и то, что выделение гомопробиотических Rif r-микроорганизмов из кишечника белых мышей контрольной группы полностью прекратилось на 3 сутки после прекращения их перорального введения, в то время как прекращение выделения указанных микроорганизмов из фекалий животных с антибиотикоассоциированным дисбактериозом (белых мышей опытной группы) наступило лишь на 5 сутки. Полученные результаты однозначно свидетельствуют о том, что гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии, поступающие в организм белых мышей в физиологически активном состоянии, не приживаются в кишечнике экспериментальных животных как с нормальной микрофлорой, так и с дисбиотическими изменениями кишечной микрофлоры. 40 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Обсуждение полученных результатов Приживаемость в пристеночном слое (биопленке) и вхождение в состав микробиоценоза кишечника пробиотических микроорганизмов является одним из условий реализации потенциальных возможностей заместительной терапии. Б.Б. Пинегин с соавторами [24] приживаемость пробиотических микроорганизмов напрямую связывают с их способностью к приживлению на эпителиоцитах нового хозяина. Ранее проведенные нами исследования [25] убедительно показали, что гетеропробиотические лактобактерии и бифидобактерии, выделенные от человека и составляющие основу пробиотиков Лактобактерин и Бифидумбактерин соответственно, не приживаются в организме экспериментальных животных – белых мышей и морских свинок. Поскольку часть исследователей считает, что в качестве пробиотических необходимо использовать микроорганизмы, изолированные из кишечного содержимого тех видов животных, для которых они будут предназначены, и относящиеся к фенотипической группе, доминирующей в кишечнике конкретного вида животных, для проведения исследования по изучению приживаемости бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике экспериментальных белых мышей были получены из фекалий мышей-альбиносов линии ВАLВ/с чистые гомопробиотические культуры бифидобактерий и лактобактерий. Ввиду того, что в фекалиях экспериментальных белых мышей невозможно различить и идентифицировать бифидобактерии и лактобактерии собственной микрофлоры от аналогичных микроорганизмов, поступающих перорально, были получены спонтанные антибиотикорезистентные мутанты гомопробиотических микроорганизмов, устойчивые к рифампицину при его содержании в питательной среде 150 мкг•мл-1. Представители нормальной кишечной микрофлоры, выделяемые из кишечника экспериментальных животных, не способны расти на питательных средах, содержащих 110 мкг•мл-1. Следовательно, маркерный признак гомопробиотических микроорганизмов – устойчивость к рифампицину (Rif r-признак) обеспечивает возможность проследить их судьбу в кишечнике экспериментальных животных по выделению на селективных плотных питательных средах с рифампицином, на которых бифидобактерии и лактобактерии нормальной микрофлоры не растут и не формируют колоний. Приживаемость гомопробиотических устойчивых к рифампицину бифидобактерий и лактобактерий, сохранивших свою видовую принадлежность, в кишечнике экспериментальных мышей была оценена на двух группах животных: опытной с экспериментальным антибиотикоассоциированным дисбактериозом и контрольной, в которую вошли лабораторные белые мыши, содержащиеся на обычном пищевом рационе. Таким образом, в первом случае перорально вводимые исследуемые гомопробиотические микроорганизмы попадали в пищеварительный тракт белых мышей с выраженными микроэкологическими нарушениями кишечной микрофлоры, а во втором – в условия обычного микробиоценоза кишечника здоровых нелинейных белых мышей. Как показали результаты исследования, в обоих случаях приживления экзогенно поступивших гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике экспериментальных животных не происходило: их элиминация из кишечника животных контрольной группы происходила к 3 суткам после прекращения перорального введения, а в опытной группе – к 5 суткам. Результаты, полученные на животных контрольной группы, вполне согласуются с данными A. Lidbeck et al [10], показавших в эксперименте на здоровых людях, что при нормальном физиологическом уровне лактобацилл невозможно его повысить сверх нормы путем введения пробиотических лактобацилл. Созвучны результатам, полученным в настоящем исследовании, опубликованные данные работы [13], согласно которым, пероральное введение живых лактобацилл в организм конвенциональных мышей приводит к их рестрикции в кишечном тракте, в то время как у безмикробных мышей живые лактобациллы не разрушаются и колонизируют слизистые. Действительно, введенные перорально гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии животным опытной группы с дисбиотическими изменениями состава кишечной микрофлоры численно превосходят бактерии того же вида в содержимом кишечника животных контрольной группы, однако, и они к 5 дню после прекращения поступления извне в пищеварительный тракт элиминируются вследствие антагонизма с резидентной микрофлорой. Вероятно, экологическая и функциональная маргинальность пробиотических микроорганизмов [26], видовая, тканевая и индивидуальная специфичность, в том числе и гомопробиотических микроорганизмов, и их несовместимость с резидентной микрофлорой нового хозяина объясняют невозможность изменения уже сформировавшейся микрофлоры кишечника вследствие неприживления пробиотических микроорганизмов при пероральном их поступлении [10]. Еще в 2003 г. E. Lebenthal и Y. Lebenthal [27] в научной статье под символическим названием «Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего 1. С использованием разработанной универсальной методики получены маркированные гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии, выделенные из фекалий линейных мышей ВАLВ/с, стабильно наследующие признак устойчивости к рифампицину и сохраняющие видовые характеристики; 2. Изучена приживаемость гомопробиотических маркированных бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике конвенциальных белых мышей, в том числе белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом; 3. Установлено, что гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии, находящиеся в физиологически активном состоянии и вводимые перорально конвенциальным белым мышам, в том числе с антибиотикоассоциированным дисбактериозом, не приживаются в кишечнике нового хозяина и элиминируются соответственно к 3 и 5 суткам после прекращения их перорального введения. ЛИТЕРАТУРА 1. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины. Вестн РАМН 1997; (3): 4-7. 2. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. М: ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации; 2010; 50 с. 3. Ардатская М.Д. Дисбактериоз кишечника: понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции. Consilium medicum 2008; 10 (8): 86-92. 4. Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю., Стражев С.В., Минушкин О.Н. Эффективность фруктоолиго- и фруктополисахаридов в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника. Кремлевская медицина. Клинический вестник 2011; (3): 59-66. Глава I ПРОБИОТИКИ сборник научных статей Выводы 5. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91599.11.0004-2003), утв. приказом № 231 МЗ РФ от 09.06.2003 г. М, 2003. 6. Терапия заместительная. Большой медицинский словарь (цитировано 22.01.12). Адрес доступа: http://www.medslv.ru/html/t/ terapi8-zamestitel5na8.htm1. 7. Воробьев А.А., Лыкова Е.А., Феклисова Л.В., Боковой А.Г., Целиканова Е.Е. Использование больших доз пробиотика бифидумбактерина форте в лечении ОРВИ у детей. Эпидем. и инф. болезни. 2004; (5): 43-46. 8. Малахов Ю.А. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Материалы Всероссийской конференции с международным участием; 21-23 апреля 1999 г; М: 1999; с. 110. 9. Доронин А.Ф. Функциональное питание. М: Издательство ГРАНТЪ, 2002; 296 с. 10. Lidbeck A., Gustafson I.A., Nord C.E. Impact of Lactobacillus acidophilus supplements on the human oropharingeal and intestinal microflora. Scan J Infect Deseases 1987; 19 (5): 531-537. 11. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В., Воробьев А.А. Микроэкологические изменения кишечника и их коррекция с помощью лечебно-профилактических препаратов. Журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. 2003; № 4 (приложение 20): 66-76. 12. Глушанова Н.А. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: дис. д-ра мед. наук: защищена в 2006 г. М: 2006; 260 с. 13. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. М: Издательство ГРАНТЪ, 1998; 288 с. 14. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей. М: Медицина, 1991; 240 с. 15. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 3: Пробиотики и функциональное питание. М: Издательство ГРАНТЪ, 2001; 289 с. 16. Коршунов В.М., Синицина Н.А., Гинодман Г.А., Пинегин Б.В. Коррекция микрофлоры кишечника при химиотерапевтических дисбактериозах с помощью аутоштаммов бифидобактерий и лактобактерий. Журн. микробиол. 1985; (9): 20-25. 17. Potter M. History of the BALB/c family. The BALB/c mouse: Genetic and Immunology. Cur Top Microbiol Immunol 1985; 122: 1-15. 18. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. СПб: Центр госсанэпиднадзора, 2002; 31 с. 19. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн. микробиол. 1992; (9-10): 74-78. 20. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Пер. с англ. Ю.Н.Зографа, Т.С.Ильиной, В.Г.Никифорова. М: Мир, 1976; 436 с. 21. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Ердякова А.С., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Заявка на выдачу патента РФ. Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных. Заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», № 2011149501/17 (074291); заявл. 15.12.2011. 22. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 23. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. Т. 2. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита. Пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. М: Мир, 1997; 368 с. 24. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериоз кишечника. М: Медицина, 1984; 144 с. 25. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дурнев Е.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Журн. инфектологии. 2012; Т.4, №1, с.68-74. 26. Хильми Г.Ф. Основы биофизики биосферы. Л: Гидрометеоиздат, 1966; 272 с. 27. Lebenthal E., Lebenthal Y. Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего признания. Журн. микробиол. 2003; (4): 88-90. 28. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. М: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010; 23 с. 41 признания» констатировали, что «… без рационально спланированных клинических испытаний трудно пропагандировать идею лечения пробиотиками. На сегодняшний день, – утверждали авторы, – имеется превосходная идея профилактического и лечебного применения пробиотиков, истинную конструктивность которой, однако, еще предстоит доказать». Такие рационально спланированные клинические испытания проведены [2-4, 28]. Результатом испытаний стала разработка научного подхода, согласно которому, выбор терапии дисбиотических нарушений должен быть корректным и направлен на то звено нарушенной регуляции, которое утратило возможность самовосстановления. Таким образом, вывод клиницистов о корректности выбора терапии дисбиотических нарушений экспериментально подтвержден результатами настоящего исследования по оценке приживаемости гомопробиотических микроорганизмов в кишечнике конвенциональных белых мышей, в том числе особей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Представленные результаты ставят под сомнение существующий принцип заместительного действия пробиотикотерапии на основе живых микроорганизмов, что, безусловно, имеет важное практическое значение для реализации положений концепции пребиотической терапии, связанной с необходимостью поддержания и восстановления собственной микрофлоры кишечника, а не с попыткой его заселения «хорошими», но «чужими» для него микроорганизмами. Глава I ПРОБИОТИКИ КОРРЕКЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АНТИБИОТИКОАССОЦИИРОВАННОГО ДИСБАКТЕРИОЗА У МОРСКИХ СВИНОК ПРОБИОТИКОМ БИОСПОРИН* Чичерин И.Ю.1, Дармов И.В.2, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2 1 ООО «МедCтар», 2 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии CORRECTION OF THE EXPERIMENTAL ANTIBIOTIC-ASSOCIATED DYSBACTERIOSIS IN GUINEA PIGS BY PROBIOTIC BIOSPORIN I.Yu. Chicherin1, I.V. Darmov2, I.P. Pogorelsky2, I.A. Lundovskikh2 42 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 1 LLC «MedStar», 2 Vyatka State University РЕЗЮМЕ SUMMARY Представлены результаты оценки возможности коррекции экспериментального антибиотико-ассоциированного дисбактериоза у морских свинок пробиотиком Биоспорин. Для инициации дисбактериоза кишечника у морских свинок использовали гентамицин при пероральном введении. Коррекцию дисбиотических нарушений в кишечнике животных осуществляли с использованием пробиотика Биоспорин. Результаты экспериментов свидетельствуют, что пероральное введение морским свинкам гентамицина ведет к выраженному изменению микрофлоры кишечника. Дисбиотические изменения микрофлоры кишечника животных подвергаются коррекции пробиотиком Биоспорин. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности коррекции глубоких дисбиотических изменений микрофлоры кишечника морских свинок с использованием сертифицированного препарата Биоспорин. Ключевые слова: микроорганизмы; дисбактериоз; пробиотик; коррекция микрофлоры; морские свинки. The results are presented of the evaluation of the possibility of correcting the experimental antibiotic-associated dysbacteriosis in guinea pigs with probiotic Biosporin. Gentamicin was used by oral administration for initiation of intestinal dysbacteriosis in guinea pigs. Dysbiotic correction of violations in the intestines of animals was carried out using probiotic Biosporin. The experimental results show that oral administration of gentamicin to guinea pigs leads to a marked change in intestinal microflora. Dysbiotic variation of the intestinal microflora of animals subjected to correction with probiotic Biosporin. The experimental data indicate the possibility of correcting deep dysbiotic changes in the intestinal microflora of laboratory animals with the use of modern certified preparation Biosporin. Key words: microorganisms, dysbacteriosis, probiotic, correction microflora; guinea pigs. ВВЕДЕНИЕ in vitro к бактерицидным факторам модельных сред [3], что может способствовать приживлению бацилл и включению их в состав биопленки кишечника. В этой связи представляет несомненный интерес выяснение некоторых аспектов механизма пробиотического действия при дисбиозах различного генеза пробиотических микроорганизмов, устойчивых к эндогенным факторам желудочно-кишечного тракта. Как известно, дисбактериоз кишечника – это синдром, сопутствующий многим патологическим состояниям и являющийся, в сущности, следствием патологического процесса [4, 5]. Среди многих причин возникновения дисбактериоза значимое место занимают нарушения микробиоценоза вследствие приема антибактериальных препаратов [6-8]. Современные антибиотики и химиотерапевтические При моделировании процесса выживания микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека [1, 2], а также при изучении выживаемости микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных [3], было установлено, что пробиотические микроорганизмы – представители нормальной кишечной микрофлоры обладают крайне низкой выживаемостью. Так, было показано, что живые пробиотические микроорганизмы перестают обнаруживаться в фекалиях экспериментальных животных через 3 суток после окончания их перорального введения [2]. В то же время микроорганизмы пробиотика Биоспорин B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 проявили весьма высокую устойчивость МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ При отработке дозы гентамицина, приводящей при пероральном введении животным к инициации антибиотико-ассоциированного дисбактериоза, мы исходили из данных Б.А. Шендерова [6], свидетельствующих о том, что при энтеральном введении таких представителей аминогликозидов, как канамицин и стрептомицин, их концентрация в 1 г фекалий людей может достигать 20000-24000 мкг. Это значительно превышает минимальную подавляющую концентрацию для большинства представителей фекальной микрофлоры. Ориентируясь на суточные дозы канамицина и стрептомицина при пероральном введении [6], при которых в 1 г фекалий достижима доза препаратов, равная 1000 мкг, морским свинкам вводили туберкулиновым шприцем посредством иглы с оливой на конце per os 30 мг гентамицина 2 раза в сутки в пересчете на единицу поверхности тела. Начиная с первого дня введения антибиотика, у животных отбирали фекалии для определения общего количества фекальной микрофлоры. Кроме того, на 1, 2, 5 и 7 сутки экспериментов помимо общего содержа- 43 сборник научных статей В экспериментах использовали пробиотический препарат Биоспорин (серия 149-0805, произведен в филиале ФГУ «48 ЦНИИ МО РФ – ЦВТП БЗ», Россия), основу которого составляют лиофилизированные бактерии Bacillus subtilis 3 и B. licheniformis 31. Препарат Биоспорин прошел контроль ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также клинические испытания, показав при этом преимущество по эффективности по сравнению с Лактобактерином [13]. Гентамицин для парентерального введения произведен фирмой-изготовителем KRKA, Словения. Выращивание бактерий пробиотического препарата Биоспорин и эшерихий проводили на агаре Хоттингера. Бифидобактерии выращивали на плотной питательной среде, рекомендованной в информационном письме [14]. Выращивание лактобацилл проводили на среде МРС, приготовленной по прописи, представленной в работе [15]. При выращивании бифидо- и лактобактерий в микроаэрофильных условиях использовали систему для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III – LE003 (Hi Media Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с газогенераторными пакетами Hi Anaero Gas Pacet. Общее количество микробных клеток в пересчете на 1 г фекалий животных определяли подсчетом в камере Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец», Россия). Количество жизнеспособных микроорганизмов в пересчете на 1 г фекалий (КОЕ·г-1) определяли высевом соответствующих десятикратных разведений суспензий биоматериала на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчетом выросших колоний бактерий по истечении времени инкубирования при температуре 37 °С. В работе использовали прошедших акклиматизацию морских свинок, беспородных, обоего пола, массой 250-300 г. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [16]. Глава I ПРОБИОТИКИ препараты являются основными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы [9, 10]. Часто вследствие бесконтрольного их использования отмечается гибель не только патогенных микроорганизмов в естественных биотопах, но и представителей нормальной микрофлоры человека [8, 10, 11]. Таким образом, для селективного подавления кишечной микрофлоры и воспроизведения экспериментального дисбактериоза у животных можно использовать такой антибактериальный препарат, который бы при пероральном введении угнетал жизнедеятельность микроорганизмов, вызывая микроэкологические нарушения в кишечнике. Судя по описанию фармакологического действия, приведенному в инструкции по применению [12], такой характеристикой обладает гентамицин. Абсорбция антибиотика при приеме внутрь незначительная – он практически не всасывается в желудочно-кишечном тракте и оказывает местное действие. Данное обстоятельство предопределило использование гентамицина для формирования экспериментального антибиотикоассоциированного дисбактериоза у лабораторных животных – морских свинок. Цель настоящего исследования – оценка возможности коррекции экспериментального дисбактериоза у морских свинок пробиотиком Биоспорин. Рисунок – Морфология колоний B. subtilis3 (1) и B. licheniformis 31 (2), выросших на агаре Хоттингера Глава I ПРОБИОТИКИ Таблица 1. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок при пероральном – введении гентамицина (Х± I95, n=5) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии начало эксперимента (7,6±0,5)·108 (1,0±0,4)·107 (9,0±0,6)·106 (1,0±0,4)·106 1 2 3 4 5 6 7 (2,2±0,3)·108 (2,4±0,4)·108 (3,4±0,5)·107 (2,2±0,6)·106 (1,0±0,5)·106 (2,3±0,4)·105 (3,4±0,4)·103 н н н (1,2±0,5)·106 (3,1±0,6)·105 (1,5±0,4)·104 н н н н н н (9,0±0,3)·104 (6,0±0,5)·104 (1,2±0,6)·102 н н н (1,2±0,3)·102 (6,2±0,5)·101 (1,1±0,6)·101 44 ния фекальной микрофлоры в 1 г экскрементов определяли содержание бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Для определения указанных видов бактерий суспензию фекалий морских свинок высевали на рекомендованные питательные среды и выращивали в соответствующих условиях при температуре 37 °С. Результаты экспериментов представлены в таблице 1. Из представленных в таблице 1 данных следует, что уже на 2 сутки эксперимента отмечается снижение числа жизнеспособных бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий в пересчете на 1 г фекалий. На 3 сутки эксперимента происходит снижение примерно на порядок общего количества жизнеспособных бактерий. На 7 сутки эксперимента общее количество жизнеспособных бактерий понижается до нескольких тысяч. Это же происходит и с бифидобактериями, лактобактериями и эшерихиями, численность которых понижалась до десятков и сотен в 1 г биоматериала. Обращает на себя внимание факт нарушения эвакуаторной функции кишечника у морских свинок. Если в начале эксперимента фекалии как биоматериал для исследования получали непосредственно от животных, то уже на 4 сутки введения гентамицина структурированные экскременты для бактериологического анализа отбирали из подстилки в индивидуальных кюветах для содержания животных. Нарушение эвакуаторной функции кишечни- ка у морских свинок проходило на 4 день после отмены введения гентамицина. На 4 сутки после прекращения перорального введения гентамицина морские свинки с выраженными дисбиотическими изменениями фекальной микрофлоры были разделены на 2 группы. Одной группе животных вводили пробиотик Биоспорин, а вторая группа животных была контрольной – животные этой группы не получали пробиотик Биоспорин и находились на обычном суточном пищевом рационе. Выбор пробиотика Биоспорин для выполнения экспериментов обусловлен сохранением морфологических особенностей колоний бактерий B. subtilis 3 и B. licheniformis 31, входящих в состав пробиотического препарата. Так, для колоний B. subtilis 3, выросших на агаре Хоттингера, характерна голубоватая окраска и плотная консистенция с фестончатыми краями, а для колоний B.licheniformis 31 – астральная форма с коричневым оттенком (рисунок). Сохранение морфологии колоний и их окраски, характерных для указанных пробиотических микроорганизмов, является фактически маркерным признаком, способствующим идентификации и количественной оценке микроорганизмов, в том числе в фекалиях морских свинок при высеве суспензии соответствующего биоматериала на плотные питательные среды. Таблица 2. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок при антибиотико– ассоциированном дисбактериозе на фоне введения препарата Биоспорин (Х± I95, n=5) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 Микроорганизмы начало экс1 2 3 4 5 6 7 перимента Общее количество (2,1±0,5)·103 (8,5±0,6)·104 (5,0±0,4)·105 (7,0±0,4)·106 (9,5±0,6)·106 (5,1±0,3)·107 (6,1±0,4)·107 (9,0±0,5)·107 B.subtilis 3 0 н (1,5±0,5)·104 н н (3,5±0,4)·106 н (2,1±0,4)·106 B.licheni0 н (2,1±0,4)·103 н н (4,6±0,5)·105 н (3,0±0,5)·106 formis 31 Бифидобактерии (1,1±0,3)·102 н (2,2±0,4)·103 н н (3,5±0,4)·104 н (2,2±0,5)·106 Лактобактерии (4,5±0,4)·101 н (1,4±0,5)·102 н н (1,5±0,5)·104 н (8,2±0,3)·105 Эшерихии (1,2±0,4)·101 н (1,5±0,4)·102 н н (3,0±0,4)·104 н (2,6±0,5)·105 Бациллы КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Примечание – Здесь и в таблицах 2-4 «н» - определение не проводили Таблица 3. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом у морских свинок контрольной – группы (Х ±I95, n=5) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 начало экс1 2 3 4 5 6 перимента 3 3 3 4 4 5 Общее количество (2,8±0,7)·10 (3,2±0,5)·10 (4,2±0,6)·10 (1,4±0,5)·10 (2,6±0,8)·10 (4,6±0,7)·10 (4,8±0,8)·105 Бифидобактерии (1,4±0,6)·102 н (1,8±0,6)·102 н н (1,8±0,6)·103 н 1 1 Лактобактерии (4,8±0,5)·10 н (6,4±0,7)·10 н н (2,5±0,5)·103 н Эшерихии (2,1±0,6)·101 н (6,8±0,5)·101 н н (1,2±0,4)·102 н Микроорганизмы 7 (6,8±0,7)·106 (1,6±0,5)·104 (4,5±0,6)·104 (2,8±0,7)·103 М.А. Ардатская, характеризуя проблему эффективности при лечении дисбактериоза кишечника таких распространенных препаратов, как пробиотики, указывает на их доказанную безопасность, отмечая, тем не менее, транзиторный характер положительного эффекта от их применения [17]. Клинические наблюдения, подкрепленные бактериологическим исследованием кала больных, а также другими методами исследований [18, 19] свидетельствуют о выраженных микроэкологических изменениях в кишечнике у больных дисбактериозом. Зачастую эти изменения связаны с приемом антибактериальных препаратов [6-8, 20]. Для более адекватной коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике людей целесообразно в эксперименте на лабораторных животных выявить факторы и условия, способствующие формированию дисбактериоза. Ряд факторов, на которые указывают авторы работы Глава I ПРОБИОТИКИ сборник научных статей ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ [19], могут найти подтверждение в прямых опытах на лабораторных животных при экспериментальном дисбактериозе. Однако экспериментальный дисбактериоз для изучения характера изменений состава и свойств кишечной микрофлоры у лабораторных животных нуждается в определенном обосновании и установлении определенных количественных показателей, свидетельствующих о его становлении и развитии. Необходимо было также установить сроки формирования дисбактериоза под влиянием антибактериальных препаратов. Как известно, формирование антибиотико-ассоциированного дисбактериоза у людей зависит от дозы антибактериального препарата, индивидуальных особенностей больного и его иммунного статуса, от возрастных и половых особенностей, но практически ничего не известно об экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе. Это предопределило необходимость дополнительных исследований, в ходе которых был выбран представитель аминогликозидов – гентамицин для перорального введения морским свинкам с целью формирования антибиотико-ассоциированного дисбактериоза, определены дозы препарата и кратность его введения. Было показано, что вводимый животным антибиотик снижает общее количество микроорганизмов фекальной микрофлоры, а также отдельных ее представителей практически на 5 порядков. Глубокие дисбиотические изменения в кишечнике у морских свинок сопровождались нарушением эвакуационной функции кишечника. Последующие эксперименты по коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры у морских свинок спустя 5 суток после прекращения перорального введения гентамицина с использованием пробиотика Биоспорин свидетельствуют о том, что пероральное его введение обеспечивает не только восстановление нарушений микробиоценоза у животных, но и способствует более длительной персистенции бацилл B. subtilis 3 и B. licheniformis 31, входящих в состав пробиотика Биоспорин. В контрольной группе животных, не получавших указанных препаратов, восстановление нарушений микробиоценоза кишечника имеет затяжной характер, подтверждающий необходимость использования подходов, стимулирующих восстановление собственной микрофлоры кишечника. Таким образом, исследования, выполненные на морских свинках с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, подтвердили данные, полученные с использованием разработанной нами методики для оценки выживаемости пробиотических микроорганизмов в модельных средах in vitro [12], в частности о весьма высокой выживаемости бацилл пробиотика Биоспорин. Однако, несмотря на высокую концентрацию бацилл B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 в кишечном содержимом животных, значительно превышающую таковую у представителей нормальной микрофлоры, они в конечном итоге не приживаются в биопленке кишечника и отторгаются организмом морских свинок. В то же время в период довольно продолжительной персистенции бацилл в кишечнике морских свинок, не менее 14 суток после окончания курса Биоспорина, наблюдается их явное положительное влияние на восстановление кишечной нормофлоры. Этот эффект может быть связан с экзометаболитами, синтезируемыми клетками бацилл во время их пребывания в кишечнике. 45 В соответствии с инструкцией по применению пробиотика Биоспорин, препарат морским свинкам вводили per os с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела в дозе 26,5 млн бактерий. Результаты бактериологического изучения у морских свинок с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом фекальной микрофлоры и отдельных ее представителей в опытной и контрольной группах животных представлены в таблицах 2-3. Как следует из результатов, представленных в таблице 2, введение морским свинкам с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом пробиотика Биоспорин способствует неуклонному восстановлению как общего количества кишечной микрофлоры, так и отдельных ее представителей – бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Начиная со второго дня, в кишечном содержимом были выявлены бациллы пробиотика Биоспорин, чему способствовала характерная морфология их колоний, отличная от морфологии колоний бактерий фекальной микрофлоры. Можно также констатировать, что бациллы B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 доминируют в микробном консорциуме вплоть до 7 суток от начала введения животным пробиотика Биоспорин. Это, впрочем, не мешает восстановлению бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий, численные значения которых к 7 дню эксперимента в значительной мере приближаются к физиологической норме. Особо следует отметить, что начиная с 6-7 суток экспериментов по коррекции кишечной микрофлоры пробиотиком Биоспорин, наблюдается увеличение количества бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий, свидетельствующее о постепенном восстановлении собственной нормальной микрофлоры, которое наступало к 12-14 дню после начала введения животным per os препарата. У животных первой группы численность бацилл в эти же сроки составляла 5,6·104 КОЕ·г-1. В последующем, начиная с 14 суток после прекращения введения животным пробиотика Биоспорин, входящие в его состав бациллы B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 постепенно снижаются количественно и не обнаруживаются бактериологическим методом. В фекалиях животных контрольной группы, не получавших пробиотический препарат, как это следует из результатов, представленных в таблице 3, происходит постепенное восстановление естественной кишечной микрофлоры, но этот процесс затянут по времени. Глава I ПРОБИОТИКИ В целом же, подводя итог выполненным исследованиям, необходимо еще раз подтвердить суждение [21] о незыблемости микробиоценоза кишечника, сформировавшегося в процессе онтогенеза. ВЫВОДЫ 1. Пероральное введение морским свинкам антибиотика гентамицина сопровождается выраженными изменениями микробиоценоза кишечника у животных, которые проявляются значительным снижением содержания общего количества микроорганизмов кишечной микрофлоры, а также отдельных ее представителей. 2. Пробиотик Биоспорин при пероральном введении морским свинкам с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом оказывает положительный эффект на восстановление нормальной кишечной микрофлоры у животных. 3. Более высокая резистентность бацилл B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 к естественным барьерам желудочно-кишечного тракта обуславливает более длительную персистенцию в кишечнике животных, не связанную с приживлением бацилл в биопленке кишечника, что сопровождается их отторжением, начиная с 14 суток после прекращения введения животным пробиотика Биоспорин. 46 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ ЛИТЕРАТУРА 1. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека // Эксп. клин. гастроэнтерол. – 2011. – № 3. – С. 6-11. 2. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Ердякова А.С., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro // Эксп. клин. гастроэнтерол. – 2011. – № 9. – С. 96-101. 3. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дурнев Е.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных // Журн. инфектол. – 2012. – Т. 4, № 1. – С. 68-74. 4. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. – 1997. – № 3. – С. 4-7. 5. Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза // Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 77-84. 6. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции – М.: Издательство ГРАНТЪ, 1998. – 288 с. 7. Парфенов А.И. Клинические проблемы дисбактериоза // Рос. гастроэнтерол. журн. – 1999. – № 4. – С. 49-55. 8. Бельмер С.В. Дисбактериоз кишечника как осложнение антибактериальной терапии // Детские инфекции. – 2007. – Т. 6, № 2. – С. 44-48. 9. Бондарева Т.А., Калининский В.Б., Борисевич И.В., Бондарев В.П., Фоменков О.О. Современное состояние и перспективы решения проблемы повышения эффективности экстренной профилактики и лечения системных бактериальных инфекций // Молекул. медицина. – 2009. – № 5. – С. 21-25. 10. Шевелева М.А., Раменская Г.В. Современные представления о применении различных групп пробиотических средств при антибиотикотерапии // Антибиотики и химиотерапия. – 2009. – Т. 54, № 3-4. – С. 61-68. 11. Шевяков М.А. Антибиотик – ассоциированная диарея и кандидоз кишечника: возможность лечения и профилактики // Антибиотики и химиотерапия. – 2004. – Т. 49, № 10. – С. 25-29. 12. Гентамицин-К. Инструкция, применение, описание лекарственного действия, синонимы, аналоги и цена препарата Гентамицин-К (международное название Гентамицин). http://www.rosmed.info. 13. Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Соловьева А.И., Резник С.Р., Чудновская Н.В. Эффективность нового бактериального препарата биоспорина при лечении острых кишечных инфекций // Журн. микробиол. – 1996. – № 1. – С. 75-77. 14. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. – СПб.: Центр госсанэпиднадзора, 2002. – 31 с. 15. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus // Журн. микробиол. – 1992. – № 9-10. – С. 74-78. 16. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. – Л.: Медгиз, 1962. – 280 с. 17. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта: дис. д-ра мед. наук: защищена в 2003 г. М: Учебно-научный центр Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации, 2003; 299 с. 18. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. – М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010. – 23 с. 19. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю. Фруктоолиго- и фруктополисахариды в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника у больных бронхолегочной патологией, получающих антибактериальную терапию // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 79-87. 20. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. – М.: КМК Scientific Press, 2003. – 220 с. 21. Ленцнер Х.П., Янкаускене Р.А., К стабильности лактофлоры стенки кишечника // Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты: Всесоюз. семинар 28-29 июня, Москва. – М.: 1988. – Ч. 1. – С. 59-60. Погорельский И.П.1, Чичерин И.Ю.2, Лундовских И.А.1 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии, 2 ООО «МедСтар» дой среде. Возвращаясь к закону Г.Ф. Хильми, акцентируем внимание на популяции микроорганизмов пробиотиков, поскольку искусственное сохранение микроэкологической системы малого размера (в ограниченном объеме кишечника) приводит к ее полной деструкции и не обеспечивает целей сохранения вида микроорганизма и пробиотического эффекта. Таким образом, законом обеднения разнородного живого вещества Г.Ф. Хильми объясняется бедность интродуцированного вида пробиотического микроорганизма, его экологическая и функциональная маргинальность. Наиболее полно это проявляется при пероральном поступлении, т.е. своеобразной интродукции пробиотических микроорганизмов в желудочно-кишечный тракт больного с выраженными дисбиотическими изменениями кишечной микрофлоры. Если учесть, что в ходе пассажа через пищеварительный тракт происходит снижение численности пробиотических микроорганизмов ниже критической, после которой невозможна выживаемость популяции в целом, то в новом экологическом окружении чуждой среды кишечника со своим устоявшимся консорциумом микроорганизмов, пробиотические микроорганизмы не имеют шансов на выживание, подвергаются рестрикции и элиминируются из кишечника без ожидаемого пробиотического эффекта. В заключение следует подчеркнуть, что действием общесистемного закона Г.Ф. Хильми, подкрепленного результатами исследований видовой, тканевой и индивидуальной специфичности пробиотических микроорганизмов и их несовместимости с резидентной микрофлорой нового хозяина, можно объяснить факт невозможности изменения уже сформировавшейся резидентной микрофлоры как у здоровых людей [5], так и у лиц с дисбиотическими изменениями кишечной микрофлоры [5;6]. ЛИТЕРАТУРА 1. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность // Хим. биол. безопасность. – 2007. – № 2-3 (32-33). – С. 20-41. 2. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П. и др. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. – 2011. – № 3. – С. 6-11. 3. Хильми Г.Ф. Основы биофизики биосферы. – Л.: Гидрометеоиздат, 1966. – 272 с. 4. Реймерс Н.Ф. Экология (теории, законы, правила, принципы и гипотезы). – М.: Журнал «Россия Молодая», 1994. – 367 с. 5. Lidbeck A., Gustafson I.A., Nard C.E. Impact of Lactobacillus acidophilus supplement on the human oropharingeal and intestinal microflora // Scan. J. Infect. Diseases. – 1987. – V.19, № 5. – P. 531-537. 6. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Буданова Е.В. и др. Популяционно-генетические аспекты микробиологического фенотипа кишечника здорового человека // Журн. микробиол. – 1995. – № 4. – С. 30-35. * Ссылка для цитирования. Погорельский И.П., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А. Экологическая и функциональная маргинальность пробиотических микроорганизмов. Общество, наука, инновации (НТК-2012): ежегод. открыт. всерос. науч.-техн. конф. 16-27 апреля 2012 г.: сб. материалов. Вят. гос. ун-т; отв. ред. С.Г. Литвинец. Киров; 2012. 1 электрон. опт. диск (CD-ROM) (Биологический факультет. Секция «Микробиология»). сборник научных статей Одним из критериев, которым должны соответствовать пробиотические микроорганизмы, является их способность выживать при пассировании через желудочно-кишечный тракт, что предполагает наличие резистентности к кислотно-щелочной среде [1]. Нами в опытах in vitro с использованием модельных сред, имитирующих процесс пищеварения у человека, было показано значительное снижение числа жизнеспособных бифидобактерий и лактобактерий сначала в кислой, а затем в щелочной модельных средах, что составляет величину 3-5 порядков [2]. В последующем эти данные были подтверждены нами в экспериментах in vitro, в которых вместо модельных сред использовали желудочный сок и дуоденальное содержимое людей. Выполненные исследования показали, что численность пробиотических микроорганизмов при пассировании через желудочный сок и дуоденальное содержимое, полученные от людей в лаборатории, снижается до сотен микробных клеток. Наконец, в прямых опытах на экспериментальных животных с использованием маркированных производных бифидо- и лактобактерий были подтверждены результаты экспериментов in vitro о снижении численности популяции пробиотических микроорганизмов при пассаже через желудочно-кишечный тракт и отсутствии их приживаемости, что связано с низкой колонизирующей способностью, недостаточно быстрым размножением и персистенцией в кишечнике. Данное обстоятельство налагает определенные ограничения на взаимоотношения с нормальной или видоизмененной микрофлорой кишечника. Рассмотреть складывающиеся взаимоотношения пробиотических микроорганизмов и микробного сообщества кишечника достаточно полно можно на основе одного из основных экологических законов – закона обеднения разнородного вещества в островных его сгущениях Г.Ф. Хильми [3]. В соответствии с этим законом, индивидуальная система, существующая в среде с иным уровнем организации, постепенно теряет свою структуру, как бы растворяется в окружающей среде. Существуют и другие названия обобщения, сделанного Г.Ф. Хильми: принцип организационной деградации или закон растворения системы в чуждой среде. Фактически закон Г.Ф. Хильми – это общесистемный закон и, следовательно, чем выше разница между уровнем организации «островной» биосистемы и ее окружения, тем скорее происходит деградация «островной» биосистемы. Поэтому сохранить ее изолированно на малых территориях при любых условиях в длительном интервале времени практически невозможно [3]. Закон Г.Ф. Хильми тесно связан с другим законом – оптимальности [4] и в значительной мере отражает термодинамику малой системы, находящейся в чуж- 47 1 Глава I ПРОБИОТИКИ ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МАРГИНАЛЬНОСТЬ ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ* Глава I ПРОБИОТИКИ ВЛИЯНИЕ ПОДАВЛЕНИЯ СЕКРЕЦИИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА ПРЕПАРАТОМ ПАРИЕТ НА ПРИЖИВАЕМОСТЬ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАКТЕРИЙ В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОМ ТРАКТЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ* Чичерин И.Ю.1, Лундовских И.А.2, Погорельский И.П.2, Гаврилов К.Е.2, Янов С.Н.2, Дармов И.В.2 1 2 Научное общество «Микробиота», Сергиев Посад, Россия (141306, Сергиев Посад-6 МО, ул. Октябрьская,19-3), e-mail: rpatron@mail.ru ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru EFFECT OF THE SUPPRESSION OF GASTRIC JUICE SECRETION BY PREPARATION PARIET ON THE SURVIVAL RATE OF BIFIDOBACTERIA AND LACTOBACILLI IN THE GASTROINTESTINAL TRACT OF EXPERIMENTAL ANIMALS I.Yu. Chicherin1, I.A. Lundovskikh2, I.P. Pogorelsky2, K.E. Gavrilov2, S.N. Yanov2, I.V. Darmov2 1 48 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 2 Scientific society «Microbiota», Sergiev Posad, Russia (Oktyabrskaya st., 19-3, Sergiev Posad-6, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru, Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Представлены результаты изучения приживаемости гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий, выделенных от белых мышей линии ВАLВ/с, в кишечнике конвенциональных белых мышей с антибиотикоассоциированным дисбактериозом в условиях подавления секреции желудочного сока препаратом Париет (ингибитором протонного насоса в желудке, блокирующим финальную стадию продукции кислоты). Установлено, что функционально активные, маркированные по признаку устойчивости к рифампицину гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии, введенные перорально экспериментальным конвенциональным белым мышам с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом и медикаментозным подавлением секреции желудочного сока, не приживаются в кишечнике животных и элиминируются к 10 суткам после прекращения их введения. Представленные экспериментальные данные свидетельствуют о необходимости стимулирования восстановления собственной кишечной микрофлоры при дисбактериозах различного генеза ввиду неприживления и отторжения пробиотических микроорганизмов, поступающих энтерально с лечебной или профилактической целью. Ключевые слова: гомопробиотические микроорганизмы, приживаемость в кишечнике, дисбактериоз, подавление секреции желудочного сока, элиминация. The results are presented of studying the survival rate of homoprobiotic lactobacilli and bifidobacteria isolated from the feces of white mice of BALB/c line, in the intestine of conventional white mice with antibiotic-associated dysbacteriosis under conditions of the suppression of gastric juice secretion by preparation Pariet (proton pump inhibitor in the stomach, blocking the final step of acid production). It is found that functionally active, labeled on the basis of rifampicin resistance homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli that administered orally to the conventional white mice with antibiotic-associated dysbacteriosis under conditions of the suppression of gastric juice secretion, do not survive in the intestines of animals and eliminates to 10 days after the cessation of administration. The experimental data indicate the need to stimulate the restoration of their own intestinal microflora at dysbacteriosis of various origins due to rejection of probiotic microorganisms received enterally for therapeutic or prophylactic purposes. Key words: homoprobiotic microorganisms, survival rate in the intestine, dysbacteriosis, suppression of gastric juice secretion, elimination Key words: experimental dysbacteriosis, laboratory animals, intestinal microflora, microflora correction, prebiotic Stimbifid. ВВЕДЕНИЕ онной резистентности слизистой оболочки кишечника, и прижились в пристеночном слое, став составной частью микробиоценоза кишечника. В то же время одним из основных выводов, сформулированных нами в ходе изучения выживаемости про- Для реализации концепции заместительной терапии [1] необходимо, чтобы пробиотические микроорганизмы достигли толстой кишки в жизнеспособном состоянии в количестве, достаточном для преодоления колонизаци- * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Погорельский И.П., Гаврилов К.Е., Янов С.Н., Дармов И.В. Влияние подавления секреции желудочного сока препаратом Париет на приживаемость бифидобактерий и лактобактерий в желудочнокишечном тракте экспериментальных животных. Журнал Международной Медицины.- 2012.- №1(1).- С.98-104. В экспериментах использовали культуры бифидобактерий и лактобактерий, выделенные из фекалий мышей линии ВАLВ/с – лабораторной линии домашних мышей, используемых в исследованиях по иммунологии и в онкологии [7]. Выделенные чистые культуры микроорганизмов были идентифицированы с использованием комплекса микробиологических и биохимических методов как бифидобактерии и лактобактерии. Выращивание гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий проводили на плотных питательных средах рекомендованного состава [8, 9] в микроаэрофильных условиях с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark IIILE003 (HiMedia Laboratories Pvt. LTD, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными HiAnaero Gas Pacet. Общее количество микробных клеток в пересчете на 1 г фекалий животных определяли подсчетом в камере Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец», Россия). Глава I ПРОБИОТИКИ Результаты исследования Экспериментальные данные, представленные в работе В.М. Коршунова и др. [13], а также данные, опубликованные нами в работе [14], свидетельствуют о целесообразности использования гомопробиотических микроорганизмов для изучения их приживаемости в кишечнике экспериментальных животных. Кроме того, дисбиотические изменения в кишечнике, вызванные пероральным введением гентамицина [4, 11], позволяют проследить судьбу гомопробиотических микроорганизмов и их маркированных производных (Rif r-мутантов) при энтеральном поступлении в организм животных в условиях подавления секреции желудочного сока препаратом Париет. Гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии выделяли из фекалий белых мышей линии ВАLВ/с. Отобранные фекалии суспендировали в изотоническом растворе хлорида натрия, после чего центрифугировали в центрифужных пробирках для осаждения фрагментов непереваренной пищи. Надосадочную жидкость использовали для посева на соответствующие плотные питательные среды для получения роста морфологически однородных изолированных колоний, их выделения, изучения морфологических и тинкториальных свойств бактерий, соответствия видовым характеристикам [14, 15]. На основании комплексного изучения свойств выделенных бактерий они были идентифицированы как сборник научных статей Материалы и методы Количество живых бифидобактерий и лактобактерий в содержимом кишечника, а также гомопробиотических микроорганизмов в суспензиях, определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений изучаемых суспензий на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчетом выросших колоний по истечении времени инкубирования. Выращивание эшерихий и подсчет выросших колоний проводили на агаре Эндо. Селекцию спонтанных мутантов выделенных гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий проводили по отработанной методике [4, 10] на плотной питательной среде с рифампицином, используя антибиотик рифампицин – Ферейн (ЗАО «Брынцалов-А», Россия). Стабильность признака антибиотико-резистентности оценивали, характеризуя популяционный состав мутантов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий по признаку антибиотико-резистентности (R-признаку). Электронную микроскопию исходных бифидобактерий и лактобактерий и их Rif r-производных (мутантов, устойчивых к рифампицину) проводили с помощью просвечивающего электронного микроскопа JЕОL JЕМ-1200 ЕV. Просмотр препаратов после пробоподготовки вели при ускоряющем напряжении 72 кВ. Для подавления секреции желудочного сока у белых мышей использовали препарат Париет (международное непатентованное название рабепразол), производитель «Эсаи Ко», ЛТД, Япония, Токио [6]. В экспериментах по изучению выживаемости и приживаемости выделенных рифампицинустойчивых (Rif r-мутантов) бифидобактерий и лактобактерий в желудочно-кишечном тракте животных использовали конвенциональных белых мышей, обоего пола, массой 18-20 г, прошедших акклиматизацию в виварии. Антибиотико-ассоциированный дисбактериоз кишечника у белых мышей инициировали путем перорального введения гентамицина (продукция ОАО «Биохимик», Россия) [11]. Статистическую обработку результатов исследований проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [12]. 49 биотических микроорганизмов в модельных средах [2, 3], а также в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных [4], был вывод о значительном снижении количества жизнеспособных пробиотических бифидобактерий и лактобактерий, что является одной из причин, которая не позволяет им приживаться в кишечнике экспериментальных животных. Использование в экспериментах в качестве модельных сред желудочного сока и дуоденального содержимого людей подтвердило факт значительного сокращения количества пробиотических микроорганизмов в исследуемых пробах, вплоть до единичных клеток в случае бифидобактерий [5]. При этом была установлена более высокая сохраняемость жизнеспособности бифидобактерий и лактобактерий в случае их инкубирования в желудочном соке пациента с пониженной кислотностью [5]. С учетом признания того, что кислотность желудочного сока может быть отнесена к разряду критических факторов, негативно влияющих на жизнеспособность пробиотических микроорганизмов, а также наряду с широким использованием кислотоустойчивых капсул с сухими коммерческими пробиотиками, представлялось целесообразным изучить выживаемость и приживаемость пробиотических микроорганизмов в пищеварительном тракте экспериментальных животных в условиях подавления секреции желудочного сока. Таким действием обладает препарат Париет (международное непатентованное название рабепразол) [6]. Механизм действия препарата состоит в подавлении секреции желудочного сока путем специфического ингибирования Н+/R+-АТФазы на секреторной поверхности париетальных клеток желудка. Н+/R+-АТФаза представляет собой белковый комплекс, который функционирует как протонный насос, и, таким образом, Париет (рабепразол) является ингибитором протонного насоса (помпы) в желудке и блокирует финальную стадию продукции кислоты в желудке. После перорального приема Париета антисекреторный эффект развивается в течение часа. Величина ингибирующего действия Париета на секрецию кислоты в желудке достигает плато после трех дней приема. После прекращения приема секреторная активность восстанавливается в течение 1-2 дней [6]. Цель настоящего исследования – оценка выживаемости и приживаемости гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий в желудочно-кишечном тракте белых мышей в условиях подавления секреции желудочного сока препаратом Париет. Глава I ПРОБИОТИКИ 50 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 1 2 1 2 Рисунок 1 – Микроскопическая картина клеток исходных бифидобактерий (1) и их Rif r-мутантов (2). Электронная микроскопия. Ув. х 5000 Рисунок 2 – Микроскопическая картина клеток исходных лактобактерий (1) и их Rif r-мутантов (2). Электронная микроскопия. Ув. х 6000 Lactobacillus plantarum и Bifidobacterium bifidum [15], которые были использованы в дальнейшей работе по получению их маркированных по устойчивости к рифампицину (Rif r-мутантов) производных. С учетом проведенных ранее экспериментов, результаты которых опубликованы в работе [4], мутанты бифидобактерий и лактобактерий получали, высевая выделенные гомопробиотические бактерии, а в последующем – отобранные спонтанные мутанты, на селективные плотные питательные среды с повышающимися концентрациями рифампицина от 10 мкг•мл-1 до 150 мкг•мл-1 [10]. Отобранные мутанты гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий, устойчивые к рифампицину, стабильно сохраняли признак антибиотикорезистентности. Изучение популяционного состава мутантных бактерий по признаку антибиотико- резистентности на плотных питательных средах, содержащих рифампицин в концентрации 140 мкг•мл-1, свидетельствовало о сохранении бифидобактериями и лактобактериями наследственно закрепленного признака устойчивости к рифампицину (Rif r-признака). Мутантные бактерии, как и исходные бифидобактерии и лактобактерии, являются грамположительными. На электронных микрофотографиях (рисунки 1, 2) представлены исходные и мутантные микробные клетки. Их размеры соответствуют размерам типовых видов бифидобактерий и лактобактерий, указанным в руководстве Берджи [15]. Так, размер исходных бифидобактерий составляет 0,5-0,7 х 1,4-1,6 мкм, а их Rif r-мутантов 0,8-0,9 х 1,7-2,1 мкм; исходных лактобактерий 0,8-0,9 х 1,6-1,9 мкм, а их Rif r-мутантов 0,8-0,9 х 1,8-2,2 мкм. Мутантные бифидобактерии и Таблица 1. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом конвенциональных белых мышей – при пероральном введении гентамицина (Х±I 95, n=6) Микроорганизмы Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 7 Общее количество (7,2±0,5)•109 (7,6±0,6)•105 (3,6±0,7)•104 Бифидобактерии (6,5±0,5)•106 (2,2±0,5)•104 (1,6±0,6)•102 Лактобактерии (2,0±0,6)•108 (1,4±0,4)•106 (1,2±0,5)•103 4 3 (1,9±0,7)•101 Эшерихии (1,5±0,5)•10 (2,2±0,5)•10 Примечание – здесь и в таблице 2 «n» – количество повторных определений Таблица 2. Содержание Rif r-микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом на фоне введения препарата Париет, – подавляющего секрецию желудочного сока (Х±I 95, n=10) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 2 4 7 9 12 14 15 16 17 Группа животных Микроорганизмы Опытная группа белых мышей, получавших препарат Париет Бифидобактерии 0 196±15 246±19 654±46 810±35 996±30 230±18 106±12 84±10 24±5 0 Лактобактерии 0 232±19 288±22 696±40 845±40 1015±45 210±15 116±15 76±9 32±6 0 Контрольная группа белых мышей Бифидобактерии 0 126±10 140±16 151±18 180±15 210±15 105±12 98±10 Лактобактерии 0 132±6 148±12 160±19 196±20 220±20 118±15 96±12 32±7 Единичные клетки 24±6 Единичные клетки 1 24 0 0 Глава I ПРОБИОТИКИ сборник научных статей 26 млн. бактерий в 2 приема с учетом переводного коэффициента для суточных доз препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин, указанных в инструкциях по их медицинскому применению у взрослых людей. Введение гомопробиотических Rif r микроорганизмов животным опытной группы осуществляли через 3 часа после перорального введения препарата Париет согласно инструкции по его медицинскому применению [6]. Отбор фекалий у животных опытной и контрольной подгрупп осуществляли ежедневно на протяжении всего срока наблюдения, составившего 14 суток и еще 5 суток после прекращения введения мутантных бактерий. Отобранные фекалии использовали для обнаружения в них гомопробиотических микроорганизмов, устойчивых к рифампицину. Особо следует отметить, что аутофлора кишечника конвенциональных белых мышей с антибиотикоассоциированным дисбактериозом оставалась чувствительной к рифампицину и не росла на плотной питательной среде с антибиотиком в концентрации 150 мкг•мл-1 в микроаэрофильных условиях. Результаты бактериологического изучения фекалий животных опытной и контрольной групп представлены в таблице 2. Как следует из представленных в таблице 2 данных, в первые сутки после начала введения животным устойчивых к рифампицину бифидобактерий и лактобактерий в отобранных фекалиях не было обнаружено микробных клеток, способных расти на селективной плотной питательной среде с рифампицином в концентрации 150 мкг•мл-1. Появившиеся в фекалиях животных на вторые сутки после начала введения Rif r-бифидобактерии и Rif r-лактобактерии возрастали количественно, особенно в группе белых мышей, получавших препарат Париет: на 12 сутки их численность достигала примерно одной тысячи в перерасчете на 1 г фекалий. К этому же сроку численность устойчивых к рифампицину бифидобактерий и лактобактерий в 1 г фекалий животных контрольной группы была примерно в 5 раз меньше. К 14 дню перорального введения гомопробиотических Rif r- микроорганизмов отмечено их понижение в фекалиях как опытной группы, так и контрольной группы. Начиная с 15 дня экспериментов, когда прекратили введение гомопробиотических Rif r-микроорганизмов животным обеих групп, происходило последовательное снижение их численности в фекалиях животных. В частности, на 17 день экспериментов в фекалиях животных контрольной группы были выявлены лишь единичные микробные клетки, а у животных опытной группы – не более трех десятков микробных клеток. Необходимо отметить, что выделение гомопробиотических Rif r- микроорганизмов из кишечного содержимого белых мышей контрольной группы прекратилось на 4 день после окончания их перорального введения. В то же время выделение Rif r-микроорганизмов из кишечного содержимого животных опытной группы, получавших препарат Париет, продолжалось вплоть до 24 дня экспериментов (т.е. до 10 дня после прекращения их перорального поступления в организм подопытных животных). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в условиях подавления секреции желудочного сока у белых мышей опытной группы под влиянием перорального введения препарата Париет гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии продолжают персистировать в кишечнике животных довольно продолжительное время. Наличие их более высоких концентраций в кишечном содержимом позволяет утверждать, что микроорганизмы 51 лактобактерии сохранили свои видовые признаки: способность к росту на богатых питательных средах при температуре 37°С в микроаэрофильных условиях, морфологическую особенность колоний; бактерии каталазоотрицательные, активно сбраживают углеводы, желатину не разжижают (видовой признак лактобактерий) [15]. Культуры маркированных гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий, выросшие на плотных питательных средах при температуре 37°С в микроаэрофильных условиях, использовали в экспериментах по изучению их приживаемости в организме конвенциональных белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Для инициации дисбактериоза кишечника конвенциональным белым мышам в течение 7 дней перорально вводили дважды в сутки гентамицин в дозе 3 мг. В начале введения, на 2 и 7 сутки введения антибиотика у животных отбирали фекалии для бактериологического исследования. Всего в опытах было использовано 40 животных. Результаты опытов представлены в таблице 1. Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о выраженных дисбиотических изменениях микрофлоры кишечника у конвенциональных белых мышей под влиянием перорального введения гентамицина. Это проявляется снижением (на 5 порядков) как общего содержания микроорганизмов в пересчете на 1 г фекалий, так и отдельных представителей фекальной микрофлоры (на 3-5 порядков). Для проведения последующих экспериментов животные с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом были разделены на 2 группы по 20 особей в каждой. Животные первой группы были контрольными. Животным второй опытной группы перорально вводили препарат Париет сразу по завершении введения гентамицина. Суточную дозу препарата рассчитывали, исходя из инструкции по медицинскому применению для взрослых людей с учетом соотношения доз для различных видов животных в перерасчете на единицу поверхности тела, что составило 0,052 мг на одно животное. Оценку влияния препарата Париет на понижение секреции желез желудка конвенциональных белых мышей исследовали на 4 сутки его введения животным. Оказалось, что у животных опытной группы кислотность содержимого в просвете желудка составила 6,1-6,9 ед. рН, а у животных контрольной группы 1,8-3,6 ед. рН, что в целом соответствует данным, представленным в работе Т.А. Замощиной с соавторами [16]. Животным опытной и контрольной групп пероральное введение гомопробиотических маркированных (Rif r) бифидобактерий и лактобактерий начинали на 5 сутки после завершения введения гентамицина реr оs, в течение которых его концентрация в кишечном содержимом животных значительно понизилась. Важно подчеркнуть, что в отличие от животных контрольной группы животным опытной группы ежедневно в течение 5 суток перорально вводили препарат Париет для максимального проявления ингибирующего действия на базальную и стимулируемую секрецию кислоты в желудке [6]. В день начала введения гомопробиотических микроорганизмов обе группы животных, опытная и контрольная, были разделены на две подгруппы. Животным одной подгруппы вводили гомопробиотические Rif r-мутанты бифидобактерий, а животным второй подгруппы – Rif r-мутанты лактобактерий. Суточная доза вводимых Rif r-бифидобактерий составила 130 тыс. бактерий в 2 приема, а Rif r-лактобактерий – Глава I ПРОБИОТИКИ успешно преодолевают кислотный барьер желудка, и вся популяция гомопробиотических микроорганизмов имеет потенциальную возможность для приживления. Однако щелочной барьер кишечника, колонизационная резистентность, антагонизм резидентной микрофлоры и другие естественные механизмы не позволяют в полной мере проявиться потенциалу гомопробиотических микроорганизмов, которые постепенно, особенно после прекращения их перорального введения животным, элиминируют из кишечника, и на 24 день эксперимента не обнаруживаются в кишечном содержимом. 52 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Обсуждение полученных результатов Настоящие исследования являются прямым продолжением выполненных нами ранее исследований, в ходе которых было экспериментально установлено, что рифампициноустойчивые мутанты гомопробиотических микроорганизмов – бифидобактерий и лактобактерий в полной мере сохранили свою видовую принадлежность и могут быть использованы для оценки их приживаемости в кишечнике конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Этими исследованиями было показано, что рифампициноустойчивые бифидобактерии и лактобактерии не приживаются в кишечнике животных и элиминируются соответственно к 3 и 5 суткам после прекращения перорального введения животным. В этой связи было сделано заключение о необходимости стимулирования при дисбактериозах восстановления собственной кишечной микрофлоры, а не полагаться только на возможное заместительное действие поступающих извне в кишечник пробиотических микроорганизмов. Тем не менее закономерна постановка вопроса о влиянии на выживаемость, а в последующем и на приживление в биопленке кишечника гомопробиотических микроорганизмов, кислоты желудочного сока. Логично предположить, что устранение кислотного барьера (имитация использования кислотоустойчивых капсул) на пути гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий будет способствовать сохранению максимально возможного их количества при пероральном введении как в желудке лабораторных животных, так и в кишечнике. При этом более высокая численность популяций гомопробиотических микроорганизмов, преодолевших кислотно-щелочной барьер желудочно-кишечного тракта, возможно будет содействовать и преодолению колонизационной резистентности естественной микрофлоры кишечника или ее измененного видового и количественного состава при экспериментальном антибиотикоассоциированном дисбактериозе. В последнем случае создаются более предпочтительные условия для приживления гомопробиотических микроорганизмов. С целью изучения приживаемости выделенных гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий были получены их маркированные производные с наследственно закрепленным признаком устойчивости к антибиотику рифампицину. Указанные рифампициноустойчивые мутанты сохранили свои видовые признаки, что обусловило возможность их дальнейшего использования в экспериментах на конвенциональных белых мышах с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом в условиях медикаментозного ингибирования секреторной деятельности желудка препаратом Париет. Активным веществом препарата Париет является рабепразол натрия, относящийся к классу антисекреторных веществ, производных бензимидазола [6]. Рабепразол натрия является ингибитором протонного насоса в желудке и блокирует финальную стадию продукции кислоты. Таким образом, у подопытных конвенциональных белых мышей был инициирован антибиотикоассоциированный дисбактериоз и медикаментозно была подавлена секреция желудочного сока. Обеспечение данных условий позволило с одной стороны проследить судьбу гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий, устойчивых к рифампицину, после их перорального введения подопытным животным, а с другой – создать условия для их максимальной выживаемости в ЖКТ и возможного приживления. Вводимая доза гомопробиотических микроорганизмов соответствовала, с учетом переводного коэффициента, суточной дозе пробиотиков Бифидумбактерин и Лактобактерин для людей. Бактериологическое изучение фекалий животных опытной и контрольной (без введения препарата Париет) групп путем посева на специальную селективную плотную питательную среду с рифампицином (150 мкг•мл-1) и подсчета выросших на ней колоний бактерий позволило установить, что гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии появляются в содержимом толстой кишки на 2 сутки после начала их перорального введения животным. В дальнейшем количество гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий в кишечном содержимом нарастало. Причем в группе животных, получавших препарат Париет, уже на 4 сутки после начала перорального введения гомопробиотических микроорганизмов численность последних в перерасчете на 1 г фекалий примерно в 2 раза превышала численность аналогичных микроорганизмов в фекалиях животных контрольной группы. Более быстрые темпы роста гомопробиотических микроорганизмов в фекалиях животных опытной группы отмечались вплоть до 12 суток от начала их перорального введения животным: в 1 г фекалий их количество достигало примерно 1000 КОЕ; в фекалиях животных контрольной группы количество гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий в 1 г фекалий было меньше примерно в 5 раз. Таким образом, в условиях подавления секреции желудочного сока у животных опытной группы перорально вводимые гомопробиотические микроорганизмы получали определенное селективное преимущество перед аналогичными микроорганизмами, введенными в желудок животных контрольной группы. Тем не менее, перорально вводимые гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии, начиная с 14 суток эксперимента, когда было прекращено их поступление в желудок, стали снижаться численно в кишечном содержимом животных опытной и контрольной групп. Полное прекращение выделения с фекалиями гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий в контрольной группе животных наступило на 8 сутки, а в опытной группе животных – на 10 сутки после прекращения введения. Таким образом, несмотря на специально созданные условия в организме подопытных конвенциональных белых мышей – фактическое устранение кислотного барьера в желудке и значительное уменьшение (конкуренции) численности естественной кишечной микрофлоры, которые, казалось бы, должны обеспечить сохранение численности популяции вводимых гомопробиотических микроорганизмов и их приживление в составе биопленки кишечника, в действительности приживления не произошло. Это еще раз подтверждает существование видовой, тканевой и индивидуальной специфичности пробиотических, а также гомопробиотических микроорганизмов и их несовместимость с резидентной микрофлорой кишечника нового хозяина, что является основанием для ЛИТЕРАТУРА 1. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91599.11.0004-2003), утв. приказом № 231 МЗ РФ от 09.06.2003 г. М., 2003. 2. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.В., Лундовских И.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека. Эксп. клин. гастроэнтерол. 2011; (3): 6-11. 3. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Ердякова А.С., Погорельский И.В., Лундовских И.А. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro. Эксп. клин. гастроэнтерол. 2011; (9): 96-101. Глава I ПРОБИОТИКИ 1. Получены маркированные гомопробиотические бифидобактерии и лактобактерии, выделенные из фекалий линейных белых мышей ВАLВ/с, стабильно сохраняющие видовые характеристики и признак устойчивости к рифампицину. 2. Изучена приживаемость маркированных гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике конвенциональных белых мышей с антибиотикоассоциированным дисбактериозом в условиях подавления секреции желудочного сока препаратом Париет – ингибитором протонного насоса в желудке, блокирующим финальную стадию продукции кислоты. 3. Установлено, что функционально активные гомопробиотические рифампициноустойчивые бифидобактерии и лактобактерии, введенные перорально конвенциональным белым мышам с антибиотикоассоциированным дисбактериозом и медикаментозным подавлением секреции желудочного сока, не приживаются в кишечнике нового хозяина и элиминируются к 10 суткам после прекращения их введения, что в очередной раз ставит под сомнение существующий принцип заместительной терапии. сборник научных статей Выводы 4. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.В., Лундовских И.А. Дурнев Е.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Журн. инфектологии 2012; 4 (1): 68-74. 5. Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.В., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Выживаемость бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом людей. Медицинский альманах 2012; (1): 57-59. 6. Инструкция по медицинскому применению препарата Париет. Производитель Эсаи Ко. ЛТД, Япония. Регистрационный номер П NО118890/01. 7. Potter M. History of the BALB/c family. The BALB/c mouse: Genetic and immunology. Cur Top Microbiol Immunol. 1985; 122: 1-15. 8. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Г., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо, СПб: Центр госсанэпиднадзора 2002; 31 с. 9. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн. микробиол. 1992; (9-10): 74-78. 10. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Пер. с англ. Ю.Н.Зографа, Т.С.Ильиной: М: Мир, 1976. – 436 с. 11. Заявка на выдачу патента РФ. Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных. И.В.Дармов, И.Ю.Чичерин, И.В.Погорельский, И.А.Лундовских; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», № 2011149501/17 (074291); заявл. 15.12.2011. 12. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 13. Коршунов В.М., Синицына Н.А., Гинодман Г.А., Пинегин Б.В. Коррекция микрофлоры кишечника при химиотерапевтических дисбактериозах с помощью аутоштаммов бифидобактерий и лактобактерий. Журн. микробиол. 1985; (9): 20-25. 14. Чичерин И.Ю., Погорельский И.В., Дармов И.В., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Пробиотики: вектор развития. Практич. медицина 2012; (3): 185-193. 15. Определитель бактерий Берджи: Девятое издание в 2 т. Т.2. Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Смита, Дж.Стейли, С.Уилльямса. Пер. с англ. под ред. Г.А.Заварзина; М: Мир, 1997; 368 с. 16. Замощина Т.А., Никифоров Л.А., Просекина Е.Ю., Томова Т.А. Биологическая активность спиртовых извлечений из ряски малой (Zemma minor L.) в отношении процесса воспаления. Вестн. Томского гос. университета. Биология. 2011; (2): 73-80. 53 корректировки взглядов на существующий принцип заместительного действия пробиотикотерапии на основе живых микроорганизмов. Глава I ПРОБИОТИКИ МИКРООРГАНИЗМЫ ПРОБИОТИКОВ И ИНДИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ: ХАРАКТЕР ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ СОВМЕСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ* Чичерин И.Ю.1, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2, Бессолицына Е.А.2, Дармов И.В.2, Шабалина М.Р.2 1 2 Научное общество «Микробиота», Сергиев Посад, Россия (141306, Сергиев Посад-6 МО, ул. Октябрьская,19-3), e-mail: rpatron@mail.ru ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru PROBIOTIC MICROORGANISMS AND INDIGENOUS MICROORGANISMS OF HUMANS AND LABORATORY ANIMALS: TYPE OF INTERRELATION AT COCULTIVATION ON AGAR NUTRIENT MEDIUM Chicherin I.Yu.1, Pogorelsky I.P.2, Lundovskikh I.A.2, Bessolitsyna E.A.2, Darmov I.V.2, Shabalina M.R.2 1 54 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 2 Scientific society «Microbiota», Sergiev Posad, Russia (Oktyabrskaya st., 19-3, Sergiev Posad-6, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru, Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Изучены взаимоотношения 23 коммерческих пробиотических препаратов с клиническими изолятами, выделенными из кишечной микрофлоры больных людей. В 67 случаях взаимодействие между пробиотическими микроорганизмами и клиническими изолятами характеризовались бионесовместимостью по типу «пробиотик против хозяина». В условиях попарного совместного культивирования на плотной питательной среде бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий, выделенных из фекалий мышей линии BALB/c и С57 Black, около половины изолятов проявили бионесовместимость, что характеризует индивидуальность индигенной микрофлоры. Аналогичные исследования проведены с использованием 26 изолятов бифидобактерий, 28 изолятов лактобактерий и 19 изолятов эшерихий из кишечного содержимого 23 разных людей. Выраженной антагонистической активностью обладали 13 изолятов лактобактерий, 9 изолятов бифидобактерий и 6 изолятов эшерихий. Антагонистические взаимоотношения между индигенными бифидобактериями, лактобактериями и эшерихиями, выделенными из одного биотопа разных здоровых людей, зависят от источника выделения и индивидуальных особенностей микробных культур. Ключевые слова: пробиотики, индигенная микрофлора человека и лабораторных животных, бионесовместимость, мыши линии BALB/c и С57 Black. Interrelations between 23 commercial probiotic preparations and clinical isolates from intestinal microflora of patients were studied. In 67 cases, the interrelations between probiotic microorganisms and clinical isolates were characterized by the type of bioincompatibility «probiotic against host» (growth suppression of indigenous isolates). At pairwise co-cultivation on agar nutrient medium Bifidobacteria, Lactobacilli and Escherichia isolated from the feces of mice BALB/c and С57 Black lines, about half of isolates showed bioincompatibility that characterizes individuality of indigenous microflora. Similar studies were performed using 26 isolates of Bifidobacteria, 28 isolates of Lactobacteria and 19 isolates of Escherichia from intestinal contents of 23 different people. 13 isolates of Lactobacteria, 9 isolates of Bifidobacteria and 6 isolates of Escherichia possessed evident antagonistic activity. Antagonistic interrelations between the indigenous Bifidobacteria, Lactobacteria and Escherichia isolated from the same biotope of different healthy people depend on the source of isolation and individual characteristics of microbial cultures. Key words: probiotics, indigenous microflora of humans and laboratory animals, bioincompatibility, mice of BALB/c and С57 Black lines. ВВЕДЕНИЕ действие со сложно организованной структурой внутренней поверхности слизистой оболочки кишечника явились основанием объединения микроорганизмов и стенки кишечника в единый микробно-тканевой комплекс [4-6]. Организм взрослого человека обильно заселен различного вида микроорганизмами, из числа которых более 60 % колонизируют кишечник [1-3]. Многообразие видового состава кишечной микрофлоры и ее взаимо- * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Бессолицына Е.А., Дармов И.В., Шабалина М.Р. Микроорганизмы пробиотиков и индигенной микрофлоры человека и животных: характер взаимодействия при совместном культивировании на плотной питательной среде. Журнал Международной Медицины.- 2013.- №1(2).- C.122-130. Глава I ПРОБИОТИКИ выращивании на плотной питательной среде авторами цитируемой работы [10] было выявлено 3 типа взаимоотношений: биосовместимость (отсутствие антагонизма), бионесовместимость по типу «пробиотик против хозяина» (подавление роста индигенных лактобацилл), бионесовместимость по типу «хозяин против пробиотика» (угнетение роста пробиотических бактерий). Основной вывод, который сделали авторы, изучив в опытах in vitro 556 культур индигенных лактобацилл, состоит в том, что взаимоотношения индигенных лактобацилл, изолированных из различных биотопов одного хозяина, из одного биотопа различных хозяев, а также между отдельными штаммами разных видов при совместном культивировании на плотной питательной среде зависят от индивидуальных особенностей культур, а также видовой специфичности хозяина и биотопа, из которого получены культуры. С учетом экспериментальных данных о возможности антагонизма между пробиотическими штаммами лактобактерий и бифидобактерий и собственной микрофлорой кишечника [18], в результате чего происходит элиминация пробиотических бактерий из организма нового хозяина после прекращения их применения [19], было целесообразно провести более расширенные исследования по оценке взаимоотношений между различными категориями пробиотических микроорганизмов в экспериментах in vitro. Цель исследования – изучение взаимоотношений микроорганизмов, входящих в состав коммерческих пробиотических препаратов, с микроорганизмами, выделенными из кишечного содержимого людей и животных, при их совместном культивировании на плотных питательных средах. В экспериментах исследовали 23 коммерческих пробиотических препарата, характеристика которых и видовой состав микроорганизмов представлены в таблице 1. В таблице 1 приведен также перечень выделенных от людей микроорганизмов для изучения взаимоотношений с коммерческими пробиотическими препаратами и входящими в их состав производственными штаммами пробиотических микроорганизмов. Выделение микроорганизмов индигенной микрофлоры из кишечного содержимого здоровых людей и от мышей линии BALB/c [20] и линии С57 Black [21], определение их видовой принадлежности, проводили согласно рекомендациям работы [10]. Выделенные от людей с различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта изоляты микроорганизмов были использованы для изучения симбиотических или конкурентных взаимоотношений с входящими в состав коммерческих пробиотических препаратов производственными штаммами микроорганизмов, выполненного в соответствии с описанным в работе [22] методом. Оценку биосовместимости индигенных микроорганизмов, выделенных из фекалий людей и линейных мышей путем совместного попарного культивирования бактерий на плотной питательной среде, проводили по разработанной Н.А. Глушановой и Б.А. Шендеровым методике [10]. Культуры считали биосовместимыми в случае обнаружения роста двух исследуемых попарно культур, сходного с ростом в контроле. При задержке или отсутствии роста одной из культур (при росте контрольных) взаимоотношения между ними рассматривались как антагонистические, а культуры считали бионесовместимыми [10]. Выращивание микроорганизмов проводили на питательных средах рекомендованного состава [10, 23, 24], а также на агаре Хоттингера и агаре Эндо. При выращи- сборник научных статей Материалы и методы исследования 55 Функционирование единого микробно-тканевого комплекса обусловлено не только работой кишечника, находящегося под постоянным нейро-гуморальным контролем, но и межклеточными взаимодействиями в микробных популяциях. Количественное соотношение видов микрофлоры является важной характеристикой микробиоценоза кишечника. Одни виды встречаются редко, другие – часто, определяя облик микробиоценоза. Доминирующими в составе микробного сообщества являются анаэробные и микроаэрофильные группы микроорганизмов. Именно они составляют «видовое ядро» микробиоценоза, формируя среду обитания для всего сообщества. Однако редкие и малочисленные виды важны для жизнедеятельности микробного сообщества: они создают его видовое разнообразие, увеличивают количество биоценотических связей, служат резервом для наполнения и замещения доминирующих, т.е. придают микробиоценозу устойчивость в разных условиях [7, 8]. Как только происходит рассогласование взаимоприемлемых отношений между микрофлорой и слизистой оболочкой и развитие вследствие этого микроэкологических нарушений в кишечнике, наступает расстройство пищеварения, нарушение функции детоксикации и выведения токсических веществ, нарушение эндо- и экзосекреторной регуляции гомеостаза, кроветворения, иммунной защиты [9]. Как свидетельствуют данные клинико-лабораторных исследований, у значительной части населения России имеет место выраженный дисбаланс кишечной микрофлоры, который увеличивает рост числа заболеваний, в разной степени связанных с этими нарушениями [6, 7, 10, 11]. Для коррекции и восстановления численности и качественного состава кишечной микрофлоры на протяжении длительного периода используют пробиотики – живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при энтеральном пути поступления благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию микроэкологического состояния кишечника [12, 13]. Однако, наблюдается явное несоответствие между сложившимся представлением об эффективности пробиотиков и растущим распространением дисбактериозов [10, 14, 15]. Возможные причины недостаточной эффективности пробиотиков при дисбиотических нарушениях кишечной микрофлоры указаны в работах [10, 16], в которых одной из главных выделена чужеродность пробиотических микроорганизмов для пациентов, которым они предназначались [17]. Более того, даже использование сертифицированных пробиотиков может не только не дать положительного результата, но и вызвать ухудшение состояния пациента [7, 8]. Важнейшим фактором, определяющим положительный или побочный эффекты, сроки приживления или элиминации пробиотических микроорганизмов, является, по мнению Н.А. Глушановой и Б.А. Шендерова [10], колонизационная резистентность слизистой оболочки кишечника. В свою очередь, колонизационная резистентность связана с биологическими свойствами пробиотических микроорганизмов и индигенными представителями кишечной микрофлоры, которые определяют характер взаимоотношений между ними – совместимость или конкурентность. В проведенных исследованиях по оценке взаимоотношений лактобацилл, входящих в состав коммерческого пробиотического препарата «Наринэ», и индигенных лактобацилл человека и животных при их совместном Media Laboratories Pvt. Ltd. Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Таблица 1. Взаимоотношения коммерческих пробиотических препаратов с клиническими изолятами микроорганизмов, выделенных из фекалий больных людей 3 4 5 6 7 8 9 10 11 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 56 23 L. acidophilus 100 аш; L. acidophilus NK1, L. acidophilus К3Ш24; в 1 таблетке н н 1·107 бактерий Аципол, 08 ЗАО «Фармацевтическая Lactobacillus sp., в 1 капсуле 1·107 с н фирма «ЛЕККО», Россия бактерий Бактисубтил, 0492 ЗАО «ФармФирма B. cereus IP 5832; в 1 капсуле 35 мг с н* «Сотекс», Россия субстанции Биоспорин, 149-0805 Филиал ФГУ 48 ЦНИИ МО B. subtilis 3, B. lichenifornus 31; в 1 дозе н* н* РФ - ЦВТП БЗ, Россия 1·109 бактерий 7 Бифидумбактерин, ФГУП «НПО «Микроген»; B. bifidum № 1 или № 791; в 1 дозе 1·10 н* н 315-6 Россия бактерий Бифидумбактерин ЗАО «Партнер», Россия B. bifidum № 1; в 1 пакете 5·107 бактес с форте, 16-40311 рий Бифилиз (ВИ-ГЭЛ), 50 ООО «Фирма «Фермент», B. bifidum № 1; в 1 дозе 1·107 бактерий с н Россия Бификол, 15/4 ФГУП «НПО «Микроген», B. bifidum № 1, E. coli М-17; в 1 дозе с н Россия 1·107 бактерий Бифистим лакто, 1201 ОАО «Биомед» им. B. adolescens, B. bifidum, B. longum; н н И.И. Мечникова, Россия в 1 г порошка 1·108 бактерий Бифиформ, 226106 «Ферросан А/С», Дания B. longum, E. faecium; в 1 капсуле 1·107 н н бактерий Бифиформ (комплекс) «Ферросан А/С», Дания Bifidobacterium BBTM 1·109 КОЕ, № 30, 227377 L. rhamnosus GG 1·109 КОЕ; н н L. acidophilus LA-5 2·108 КОЕ в 1 таблетке Бифолак, 7950125 «Бифодан А/С DK-3390», L. rhamnosus, L. longum без указания н н Дания количественного содержания в капсуле 9 Колибактерин, ОАО «Биомед» им. И.И. E. coli М-17; в 1 дозе 10·10 бактерий с н* 813-20311 Мечникова, Россия Лактобактерин, 15/6 ФГУП «НПО «Микроген», L. plantarum 8P-A3 (возможны L. Россия plantarum 38, L. fermentum 90T-C4, L. н н fermentum 39); в 1 дозе 2·109 бактерий Линекс, BF 9149 Лек g.g., Словения L. acidophilus, B. infantis, E. faecium; в 1 капсуле 280 мг. В 1 г порошка Либенин н н по 300 мг каждого из микроорганизмов Наринэ, СДС. 500051 ООО «НАРЭКС», L. acidophilus n.v. Ep 317/402; в 1 республика Армения капсуле 100 мг лиофилизированной н н культуры Нормобакт (пробиотик Chr. Hansen A/S, Дания, L. acidophilus (La-5), Bifido-bacterium + пребиотик), 298492 Медана Фарма А.О., (BB-12); в 1 саше 4·109 бактерий + н н Польша фруктозоолигосахариды Биокомплекс «НорООО «НПП Бифилюкс+», B. bifidum, B. longum; в 1 мл 1·1010 н н мофлорин-Б1», 0411 Россия бактерий 9 Биокомплекс «НорООО «НПП Бифилюкс+», L. casei 1·10 , B. longum, B. bifidum; н н мофлорин-Д», 0407 Россия 1·108 бактерий в 1 мл 9 Биокомплекс «НорООО «НПП Бифилюкс+», L. acidophilus; в 1 мл 1·10 бактерий н н мофлорин-Л», 0410 Россия Примадофилус Нейчерс Вэй Продактс, B. breve, B. longum, L. rhamnosus, L. Бифидус, 77.99.23.2 У Инк., США acidophilus; в 1 капсуле 3,9·109 бактерий н н 2809.4.09 Пробифор, 2-10211 ЗАО «Партнер», Россия B. bifidum № 1; 5·108 бактерий в пон н рошке 1 пакета 9 Споробактерин жидООО «Бакорен», Россия B. subtilis 534; в 1 мл 1·10 КОЕ н н кий, суспензия для приема внутрь, 311110 K. planticola 2 ЗАО «Фирма «Витафарма», Россия B. ureoliticus Ацилакт, 040211 1 P. mirabilis Видовой состав микроорганизмов и их содержание S. faecium Фирма (предприятие) и страна изготовитель S. aureus Название препарата, серия B. mesentericus № п/п Y. enterocolitica Тип взаимодействия с микроорганизмами E. coli Глава I ПРОБИОТИКИ вании пробиотических микроорганизмов в микроаэрофильных условиях использовали систему для анаэробного культивирования Anaerobic system Mark III – LE003 (Hi н н н с с н н с с с с н с с с н* с н* н н н с н* н с с с с с н* н с с с с н* с с с с с н н с с с с н* с с с с с н* с с с с с с с с н н* н* н* н с с с с н* н н с с с с с с с н с с с с с н* н* н* с с с с н н* с с н с с с с н н с н н н н н с н н с с н с с с с с н с с с с с с с н* н* с с н с н н* Примечание: «с» – биосовместимость; «н» – бионесовместимость; «н*» – бионесовместимость с экспансивным ростом пробиотического микроорганизма В выполненных Н.А. Глушановой и Б.А. Шендеровым исследованиях [10] с использованием штамма лактобацилл L. acidophilus Ep 317/402, выделенного из пробиотического препарата «Наринэ», и 335 культур свежевыделенных лактобацилл человека при их совместном культивировании на плотной питательной среде биосовместимость микроорганизмов была выявлена в 15,2 % случаев, бионесовместимость по типу «пробиотик против хозяина» – в 62,3 % случаев и бионесовместимость по типу «хозяин против пробиотика» – в 22,5 % случаев. В настоящей работе пробиотик «Наринэ» наряду с 22 другими коммерческими пробиотическими препаратами были протестированы на биосовместимость с 8 клиническими изолятами микроорганизмов, выделенных из фекалий больных с различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Пробиотические препараты отличались один от другого как по биотехнологии получения и форме выпуска, так и по количественному и видовому составу микроорганизмов. Результаты определений представлены в таблице 1. Из представленных в таблице 1 результатов следует, что в 94 случаях (51,1 %) взаимодействие коммерческих пробиотических препаратов с микроорганизмами клинических изолятов характеризовалось биосовместимостью, в 67 случаях (36,4 %) – бионесовместимостью по типу «про- биотик против хозяина» с формированием различной выраженности зон ингибирования роста микроорганизма хозяина, и в 23 случаях (12,5 %) – бионесовместимостью по типу «пробиотик против хозяина» с экспансивным ростом пробиотических микроорганизмов, чего в опытах Н.А. Глушановой и Б.А. Шендерова [10] отмечено не было. В целом, как это видно из данных, приведенных в таблице 1, взаимодействие сравниваемых микроорганизмов в 51,1 % случаев носило характер биосовместимости, а в 48,9 % случаев – бионесовместимости с ингибированием роста бактерий хозяина или с экспансивным ростом пробиотических микроорганизмов. Бионесовместимости по типу «хозяин против пробиотика» не было выявлено ни в одном случае. В следующей серии экспериментов были использованы бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии, выделенные из фекалий мышей линии BALB/c и линии С57 Black одного помета [20, 21]. Мыши обеих указанных линий отличаются друг от друга не только своим поведением: более агрессивными являются мыши линии С57 Black. В то же время от мышей линии BALB/c чаще всего (примерно в 35% случаев) из фекалий выделяются культуры микроорганизмов в сочетании с протеем (P. mirabilis). Именно культуры протея, выделенные из фекалий мышей линии BALB/c, во всех случаях подавляли рост индигенной микрофлоры кишечника мышей линии С57 Black. 2 3 4 Рисунок – Микрофотографии биосовместимых (1, 3) и бионесовместимых (2, 4) культур лактобактерий при постановке теста с бульонными культурами (1, 2; х10) и методом отпечатков колоний (3, 4; х100) 57 сборник научных статей 1 Глава I ПРОБИОТИКИ Результаты исследования Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 58 Всего из фекалий мышей линии BALB/c и С57 Black было выделено по 15 культур бифидобактерий, по 16 культур лактобактерий и по 10 культур эшерихий. Поскольку животные каждой линии были одного помета, в фекалиях от них обнаруживали бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии одной таксономической принадлежности, в частности B. bifidum, B. longum, B. breve, L. plantarum, L. fermentum, L. casei и лактозонегативные эшерихии. При оценке биосовместимости микроорганизмов, выделенных от мышей линии BALB/c, при их совместном попарном культивировании на плотных питательных средах по методу Н.А. Глушановой и Б.А. Шендерова [10] было обнаружено, что все бифидобактерии и эшерихии, выделенные от разных животных, оказались биосовместимыми. Из 16 культур лактобактерий три подавляли рост лактобактерий, выделенных из фекалий разных животных, проявляя бионесовместимость. На рисунке приведены фотографии культур с разным типом взаимодействия при совместном выращивании на плотной питательной среде. Индигенные культуры бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий, выделенные от мышей линии С57 Black, оказались биосовместимыми как в пределах одного вида, так и при межвидовом тестировании. Последующее изучение взаимодействия культур микроорганизмов, выделенных от мышей линии С57 Black и линии BALB/c между собой в процессе их попарного культивирования на плотной питательной среде, показало следующее: из 15 изолятов бифидобактерий, выделенных из фекалий мышей линии С57 Black, 8 выявили бионесовместимость с бифидобактериями, выделенными из фекалий мышей линии BALB/c; из 16 соответствующих изолятов лактобактерий от мышей линии С57 Black 6 проявили бионесовместимость с лактобактериями от мышей линии BALB/c; из 10 соответствующих изолятов эшерихий от мышей линии С57 Black 4 проявили бионесовместимость с эшерихиями от мышей линии BALB/c. Таким образом, на взаимоотношения между бифидобактериями, лактобактериями и эшерихиями, выделенными из одного биотопа, но разных животных, оказывают влияние факторы, связанные с организмом хозяина. Весьма интересные результаты получены при совместном культивировании на плотной питательной среде свежевыделенных индигенных бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий из кишечника человека с теми же бактериальными видами, выделенными от мышей линии С57 Black. Те же изоляты, которые проявили бионесовместимость с представителями индигенной микрофлоры – бифидобактериями, лактобактериями и эшерихиями мышей линии BALB/c, оказались бионесовместимыми с представителями кишечной микрофлоры, выделенными из одного биотопа разных людей. В то же время лишь единичные бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии, выделенные из фекалий мышей линии BALB/c, оказались несовместимыми с изолятами соответствующих видов бактерий, выделенных из фекалий людей. Всего в исследованиях по оценке биосовместимости изолятов индигенной микрофлоры, выделенных из одного биотопа 23 разных людей, было протестировано 26 изолятов бифидобактерий (B. bifidum, B. adolescens, B. longum, B. breve), 28 изолятов лактобактерий (L. acidophilus, L. casei, L. fermentum, L. plantarum), 19 изолятов эшерихий (17 лактозонегативных изолятов и 2 гемолитических изолята). Структура основных видов микроорганизмов в составе кишечной микрофлоры соответствует таковой у лиц средней и старшей возрастных групп [11]. Исследование 26 культур бифидобактерий показало, что при совмест- ном их выращивании попарно на плотной питательной среде 9 культур (34,6 %) проявили бионесовместимость различной выраженности (угнетение или ингибирование роста, экспансивный рост). Из 28 исследованных культур лактобактерий у 13 (46,4 %) наблюдали четкие антагонистические взаимоотношения, проявившиеся либо угнетением роста парной культуры лактобактерий с формированием разной степени выраженности зоны задержки роста, либо экспансивным ростом одной из культур. Из 19 изолятов эшерихий у 6 (31,6 %), в том числе у двух гемолитических изолятов, при совместном попарном выращивании выявились бионесовместимые (антагонистические) взаимоотношения. В таблице 2 в обобщенном виде представлены результаты оценки взаимоотношений микроорганизмов индигенной микрофлоры людей, выделенных из одного биотопа. Сопоставляя представленные в таблице 2 результаты, касающиеся взаимоотношения лактобактерий, выделенных из одного биотопа разных людей, с результатами, полученными Н.А. Глушановой и Б.А. Шендеровым [10] при аналогичном изучении изолятов лактобактерий кишечного происхождения, тоже выделенных от разных людей, можно утверждать, что среди лактобактерий антагонистические взаимоотношения различной выраженности встречаются от 23 % до 46 % случаев. Среди выделенных нами бифидобактерий и эшерихий кишечного происхождения бионесовместимость внутри пула указанных микроорганизмов составляет 34,6 % и 31,6 % соответственно. Таким образом, проведенные исследования дают основание говорить о том, что выделенные от различных людей основные представители нормальной кишечной микрофлоры при их совместном выращивании проявляют разнонаправленные – как антагонистические, так и нейтральные (биосовместимые) взаимоотношения. Обсуждение полученных результатов В выполненных нами исследованиях по изучению выживаемости пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных было установлено, что вводимые перорально пробиотические микроорганизмы обнаруживаются в фекалиях животных на 2 сутки эксперимента. Однако после окончания их перорального введения уже через 3 суток они перестают обнаруживаться в фекалиях животных [23]. Среди ряда факторов значительное влияние на приживление пробиотика в организме нового хозяина могут оказать генетически обусловленные факторы. В частности, показано, что формирование видовой, индивидуальной, тканевой специфичности резидентной микрофлоры тесно связано с иммуногенетическими взаимодействиями внутри микробно-тканевого комплекса, которые приводят к развитию индивидуальной иммунологической толерантности [5, 24, 25]. При этом важно подчеркнуть, что на формирование индивидуальной резидентной микрофлоры влияет система гистосовместимости, которая в свою очередь определяет специфичность рецепторов для адгезии бактерий нормальной (резидентной) микрофлоры. Результатом последовательной череды указанных событий является становление собственных резидентных микробных ассоциаций на генетически индивидуальном для каждого человека субстрате слизистых оболочек [26, 27]. Микроорганизмы нормальной кишечной микрофлоры, по-видимому, наряду с видовой специфичностью обладают индивидуальной специфичностью организма хозяина, что проявляется антагонизмом между производственными штаммами лактобацилл и бифидобактерий Тип взаимодействия микроорганизмов … при совместном культивировании in vitro Всего Биосовместимые Бионесовместимые Бифидобактерии (B. adolescens, B. bifidum, B. breve, B. longum) 26 17 9 Лактобактерии (L. acidophilus, L. casei, L. fermentum, L. plantarum) 28 15 13 Эшерихии (E. coli: лактозонегативные и гемолитические) 19 13 6 и резидентной микрофлорой кишечника [18]. Именно с антагонизмом резидентной микрофлоры связана, как это указано в работе [19], элиминация пробиотических бактерий из организма нового хозяина после прекращения их применения, что и было показано нами в прямых экспериментах на животных [23]. На основании собственных экспериментальных данных, полученных in vitro, Н.А. Глушанова и Б.А. Шендеров [10] высказали предположение о том, что и в условиях in vivo при энтеральном (вагинальном или ректальном) введении больших концентраций пробиотических лактобацилл последние могут вызвать дисбаланс в индигенной лактофлоре хозяина. В наших исследованиях количество изученных коммерческих пробиотических препаратов составило 23, включая пробиотик «Наринэ» (республика Армения), микроорганизмы которого L. acidophilus Ep 317/402 были использованы в экспериментах Н.А. Глушановой и Б.А. Шендерова [10] и по результатам которых авторами были предложены типы взаимодействия пробиотических лактобактерий с лактобактериями, выделенными из кишечного содержимого разных людей. В количественном отношении в 48,9 % случаев исследованные нами пробиотики проявили антагонистические свойства по отношению к микроорганизмам, выделенным от людей с различными заболеваниями желудочнокишечного тракта. Биосовместимость пробиотиков в 51,1% случаев с выделенными культурами наводит на мысль о том, что у половины назначаемых с лечебной или профилактической целью пробиотиков их потенциал реализован не будет и эффект от пробиотикотерапии может оказаться нулевым. Характеризуя взаимодействие представителей индигенной микрофлоры (бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий) кишечника мышей линии ВАLВ/с и линии С57/Black, можно в целом назвать его симбиотическим (биосовместимым), за исключением культур протея (P. mirabilis) от мышей линии ВАLВ/с, подавляющих рост микроорганизмов, выделенных из кишечника мышей линии С57/Black, а также трех культур лактобактерий от мышей линии ВАLВ/с, проявивших бионесовместимость с аналогичными культурами, выделенными из фекалий разных животных той же линии. Высокий уровень биосовместимости in vitro представителей кишечной микрофлоры, выделенных из фекалий мышей линий ВАLВ/с и С57/Black, можно связать с совместным содержанием животных хоть и в разных кюветах, но в пределах одного помещения вивария. Проводя третью серию экспериментов по изучению взаимодействия важнейших представителей кишечной микрофлоры, выделенных из одного биотопа, но от разных здоровых людей, мы ориентировались на опубликованные результаты исследований A. Lidbeck et al [28], согласно которым у здоровых взрослых людей, имеющих уже сформировавшуюся резидентную микрофлору, невозможно ее изменить, назначая пробиотические препараты, содержащие, в частности, лактобациллы. В основе стабильности консорциума микроорганизмов кишечной микрофлоры лежит индивидуальная конформация поверхностей структур бактерий, ответственных за адгезию к комплементарным рецепторам эпителиоцитов слизистой оболочки кишечника [5]. Углеводы, входящие в состав гликопротеидов муцина, служащего рецептором для фиксации бактерии, генетически предопределены организмом хозяина [29]. При этом генотип хозяина играет существенную роль в становлении генотипически предопределенной специфичности адгезинов бактерий [5, 30]. Эксперименты по совместному культивированию на плотных питательных средах индигенных бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий, выделенных в наших экспериментах из одного биотопа различных хозяев, проявили не менее чем в 30 % случаев (а лактобактерии – в 46,4 % случаев) выраженную бионесовместимость, что, конечно, подчеркивает индивидуальный характер выраженности антагонизма представителей индигенной микрофлоры, который может проявиться in vivo как в отношении близкородственных, так и потенциально патогенных бактерий [5]. Свидетельством того, что микроорганизмы индивидуальной кишечной микрофлоры характеризуются видовой, индивидуальной и тканевой специфичностью, являются опубликованные данные [5], согласно которым перорально введенные живые лактобактерии в желудочно-кишечный тракт конвенциональных белых мышей подвергаются рестрикции и удаляются, в то время как у безмикробных животных живые лактобактерии не разрушаются и колонизируют слизистую кишечника. Весьма вероятно, что выявленный в наших экспериментах in vitro антагонизм между микроорганизмами индигенной микрофлоры, выделенными из одного биотопа разных людей, может отражать проявляемое in vivo сочетанное действие видовой, тканевой и индивидуальной специфичности микроорганизмов в виде выраженной несовместимости с индигенной микрофлорой нового хозяина и невозможности кардинальной смены микробного пейзажа. В этой связи важным критерием эффективности существующих производственных пробиотических штаммов и вновь предлагаемых для целей биотехнологии пробиотических препаратов должна рассматриваться их биосовместимость с резидентной микрофлорой потенциального реципиента. Выводы 1. Исследованы взаимоотношения 23 коммерческих пробиотических препаратов отечественного и зарубежного производства с 8 клиническими изолятами микроорганизмов, выделенных из фекалий людей с различными Глава I ПРОБИОТИКИ Микроорганизмы сборник научных статей Взаимоотношения микроорганизмов кишечной микрофлоры, выделенных от разных людей, при совместном культивировании попарно на плотной питательной среде 59 Таблица 2. Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 60 заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Установлено, что в 67 случаях взаимоотношение между исследованными коммерческими пробиотическими препаратами и клиническими изолятами микроорганизмов из одного биотопа различных людей носило характер бионесовместимости по типу «пробиотик против хозяина». 2. В условиях попарного совместного культивирования на плотной питательной среде оценена биосовместимость бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий, выделенных из одного биотопа 23 разных здоровых людей. Из 26 изолятов бифидобактерий B. bifidum, B. adolescens, B. longum, B. breve 9 (34,6 %) проявили бионесовместимость различной степени выраженности; из 28 изолятов лактобактерий L. acidophilus, L. casei, L. fermentum, L. plantarum у 13 (46,4 %) наблюдали антагонистические взаимоотношения разной степени выраженности; из 19 изолятов E. coli (лактозонегативные и гемолитические) у 6, в том числе у двух гемолитических изолятов, характер взаимоотношений был антагонистическим. 3. Бионесовместимые (антагонистические) взаимоотношения между исследованными бифидобактериями, лактобактериями и эшерихиями, выделенными из кишечного содержимого здоровых людей, проявлялись либо угнетением роста парной культуры разной интенсивности, либо экспансивным ростом одной из тестируемых культур. 4. При оценке биосовместимости 15 изолятов бифидобактерий B. bifidum, B. longum, B. breve, 16 изолятов лактобактерий L. plantarum, L. fermentum, L. casei, 10 изолятов лактозонегативных эшерихий, выделенных из кишечного содержимого мышей линии BALB/c и мышей линии C57 Black, в условиях совместного попарного культивирования на плотной питательной среде было установлено, что для 8 изолятов бифидобактерий, 6 изолятов лактобактерий и 4 изолятов эшерихий характерен бионесовместимый тип взаимодействия с различной выраженностью задержки роста парной культуры. 5. Индивидуальные особенности основных представителей индигенной микрофлоры, несущие отпечаток видовой специфичности организма хозяина и биотопа, из которого были выделены микроорганизмы, диктуют необходимость предварительного изучения взаимоотношения микроорганизмов и создаваемых на их основе пробиотических или синбиотических препаратов с микроорганизмами индигенной микрофлоры человека, которому планируется их назначение. ЛИТЕРАТУРА 1. Salminen S., Isolauri E., Onela T. Gut flora in normal and disordered states. Chemotherapy 1995; 41 (Suppl. 1): 5-15. 2. Ардатская М.Д. Дисбактериоз кишечника: понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции. Concilium medicum 2008; 10(8): 86-92. 3. Шендеров Б.А. Функциональное и персональное питание. Современное состояние и перспективы. Журн. ГАСТРОэнтерология Санкт-Петербурга 2010; (2-3): 2-5. 4. Олескин А.В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях. Микробиология 1993; 62(3): 389-405. 5. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции; М.: Издательство ГРАНТ, 1998; 288 с. 6. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей; М.: ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации; 2010; 50 с. 7. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины. Вестник РАМН 1997; (3): 4-7. 8. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса. Вестник РАМН 1997; (3): 7-10. 9. Kelly D., Conway S., Aminov R. Commensal gut bacteria: mechanism of immune modulation. Trends Immunol 2005; 26: 326-333. 10. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro. Журн. микробиол 2005; (2): 56-61. 11. Захаренко С.М., Фоминых Ю.А., Мехтиев С.Н. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология 2012; 3: 14-20. 12. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта: дис… д-ра мед. наук: защищена в 2003 г. / М.Д.Ардатская. – М.: ФБУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации; 2003; 299 с. 13. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н. Дисбактериоз кишечника: эволюция взглядов. Современные принципы диагностики и фармакологической коррекции. Concilium medicum. Гастроэнтерология 2006; (2): 4-18. 14. Малахов Ю.А. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Матер. Всерос. конф. с междунар. участием 21-23 апреля 1999 г. – М.: 1999: 110. 15. Кузнецова Г.Г., Шевелева С.А. Пробиотикограмма – новый подход к коррекции дисбиотических отклонений в микробиоценозе толстой кишки. Здоровое питание населения России: матер. VII Всерос. конгр. 12-14 ноября 2003 г.; гл. ред. В.А.Тутельян. – М.: 2003: 270-273. 16. Глушанова Н.А. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: дис… д-ра мед. наук: защищена в 2006 г. / Н.А.Глушанова. – М.: ФГУН «Московский НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского», 2006: 260 с. 17. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к коррекции микрофлоры кишечника. Вестник РАМН 1996; (2): 60-65. 18. Анохин В.А., Тюрин Ю.А. Роль основных представителей анаэробной кишечной микрофлоры в норме и патологии. Казанский мед. журн. 2001; 82(2): 149-151. 19. Ефимов Б.А., Коршунов В.М. Использование тотально деконтаминированных мышей в условиях общей гнотобиологической изоляции для получения высокоадгезивных штаммов Streptococcus faecium. Журн. микробиол. 1992; (5-6): 9-11. 20. Potter M. History of the BALB/c family. The BALB/c mouse: Genetic and Immunology. Cur. Top. Microbiol. Immunol. 1985; 122: 1-15. 21. Осетрова Т.Д., Кондрина Л.П., Евсиков В.И. Роль генетически контролируемых взаимоотношений мать-потомок в становлении воспроизводительной функции мышей. Тезисы докл. 111 съезда генетиков и селекционеров Украины. Киев: Наук. Думка, 1976; (часть 2): 180-181. 22. Jorgensen J.H., Turnidge J.D. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. Manual of clinical microbiology. 9th-ed ASM Press Washington; 2007: 1152-1172. 23. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дурнев Е.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Журн. инфектологии 2012; 4(1): 68-74. 24. Хавкин А.И., Жихарева Н.С. Коррекция дисбиотических изменений кишечника у детей на современном этапе. Российский мед. журн. 2004; 12(16): 960-963. 25. Van der Waaij D. The apparent role of the mucos membrane and the gut-associated lymphoid tissue in the selection of the normal resident flora of the digestive tract. Clin. Immunol. News 1986; 7(1): 4-7. 26. Van der Waaij D. The colonization resistance of the digestive tract in different animal species and in man: a comparative study Epidemiol. Infect. 1990; 105(2): 237-243. 27. Куваева И.Б. Микроэкологическая система в оценке эффективности биологически активных добавок и продуктов с пробиотическим действием. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека: Матер. Всерос. конф. с междунар. участием 21-23 апреля. М.: 1999: 18-20. 28. Lidbeck A., Gustafson I.A., Nord C.E. Impact of Lactobacillus acidophilus supplements on the human oropharingeal and intestinal microflora. Scan J.Infect. Diseases 1987; 19 (5): 531-537. 29. Lenoir-Wijnkoop I. The intestinal microflora. Understanding the symbiosis Ed. Mark Aopkins. Danone Vitapole: John Libbey Eurotext. 2003; 48 p. 30. Бургасов П.Н., Румянцев С.Н. Антимикробный конституциональный иммунитет. М.: Медицина; 1985; 256 с. Погорельский И.П.1, Чичерин И.Ю.2, Лундовских И.А.1, Дармов И.В.1, Маракулин И.В.1 1 2 ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru, Научное общество «Микробиота», Сергиев Посад, Россия (141306, Сергиев Посад-6 МО, ул. Октябрьская,19-3), e-mail: rpatron@mail.ru Глава I ПРОБИОТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛИМФОЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ АУТОШТАММОВ ГОМОПРОБИОТИЧЕСКИХ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАКТЕРИЙ* EXPERIMENTAL STUDY OF THE LYMPHOCYTOTOXIC EFFECT OF HOMOPROBIOTIC BIFIDOBACTERIA AND LACTOBACILLI AUTOSTRAINS Pogorelsky I.P.1, Chicherin I.Yu.2, Lundovskikh I.A.1, Darmov I.A.1, Marakulin I.V.1 Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru, Scientific society «Microbiota», Sergiev Posad, Russia (Oktyabrskaya st., 19-3, Sergiev Posad-6, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Представлены результаты экспериментального изучения лимфоцитотоксического действия аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий на лимфоциты крови морских свинок. В экспериментах использовали аутоштаммы гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий, выделенных из фекалий подопытных морских свинок. Выделение фракций лимфоцитов из крови морских свинок для постановки лимфоцитотоксического теста проводили согласно санитарным правилам СП 3.3.2.561-96. Выраженность повреждения лимфоцитов оценивали в баллах и путем подсчета цитотоксического индекса. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что под воздействием больших доз аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий происходит цитолиз лишь небольшого количества лимфоцитов и, таким образом, реакция лимфоцитов с аутоштаммами гомопробиотических микроорганизмов не выходит за пределы физиологической нормы. Ключевые слова: аутоштаммы, гомопробиотики, бифидобактерии, лактобактерии, лимфоциты, лимфоцитотоксический тест, морские свинки. The results of the experimental studies of the lymphocytotoxic effect of homoprobiotic bidfidobacteria and lactobacilli autostrains on lymphocytes of guinea pigs are presented. Autostrains of homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli isolated from the feces of guinea pigs were used in the experiments. Isolation of the fraction of lymphocytes from the blood of guinea pigs for lymphocytotoxic test was carried out according to the sanitary rules SP 3.3.2.561-96. Intensity of damage in lymphocytes was assessed by counting the points and the cytotoxic index. The experimental results indicate that under the influence of large doses of homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli autostrains cytolysis occurs of only a small number of lymphocytes, and thus, the reaction of lymphocytes with autostrains of homoprobiotic bifidobacteria and lactobacilli is within the physiological range. Key words: autostrains, homoprobiotics, bifidobacteria, lactobacilli, lymphocytes, lymphocytotoxic test, guinea pigs ВВЕДЕНИЕ Однако лишь отдельные из большого числа клинических испытаний пробиотиков дали приемлемые оценки их эффективности [5]. Положительный эффект пробиотиков, созданных на основе микроорганизмов, зачастую выделенных из нормальной кишечной микрофлоры, даже при длительном применении носит транзиторный характер, а то и вовсе отсутствует [2-4, 6]. В то же время в инструкциях по медицинскому применению сертифицированных препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин есть рекомендации по увеличению доз принимаемых пробиотических препаратов в 5 раз с профилактической целью и в 5-10 раз при воспалительных заболеваниях. Неотъемлемой частью практической медицины стали разработанные микроэкологические подходы к профилактике и лечению многих заболеваний человека, в частности заболеваний желудочно-кишечного тракта [1, 2]. При этом пробиотики относят к одному из важнейших экзогенных факторов экологической реабилитации больных [3]. На протяжении многих лет они занимают особое место в комплексном лечении людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта в связи с теми эффектами, которые регистрируются как объективно, так и субъективно – улучшением самочувствия больного [4]. * Ссылка для цитирования: Погорельский И.П., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Дармов И.В., Маракулин И.В. Экспериментальное изучение лимфоцитотоксического действия аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий. Журнал инфектологии.- Т.4.- 2012.- №4.- С.25-31. сборник научных статей 2 61 1 Глава I ПРОБИОТИКИ С учетом данных о том, что большие дозы пробиотиков при длительных курсах применения (в течение 2-6 месяцев) могут стать причиной недостаточной эффективности лечения дисбиотических состояний и развития побочных эффектов [6], нами было изучено влияние пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий на иммунную систему лабораторных животных в экспериментах с использованием лимфоцитотоксического теста. Этот тест [7-9] с некоторыми вариациями используется как в научных исследованиях, так и при оценке иммунобиологической безопасности вакцин [7] и технофильных микроорганизмов [10]. Результаты экспериментов свидетельствуют о подверженности лимфоцитов крови морских свинок цитолизу под воздействием больших доз пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий, превышающих суточные дозы, рекомендованные инструкциями по медицинскому применению сертифицированных препаратов Бифидубактерин и Лактобактерин, что выводит реакцию лимфоцитов за пределы физиологической нормы [11]. С учетом данных по изучению гомопробиотических микроорганизмов, свидетельствующих о том, что наряду с видовой они обладают индивидуальной специфичностью организма хозяина [12], представлялось целесообразным продолжить исследования в направлении изучения влияния аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий морских свинок на иммунную систему в эксперименте с использованием лимфоцитотоксического теста. Цель настоящего исследования состоит в экспериментальной оценке лимфоцитотоксического действия аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий, выделенных из фекалий морских свинок, на лимфоциты крови животных с использованием лимфоцитотоксического теста. 62 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Материалы и методы исследования В экспериментах использовали аутоштаммы гомопробиотических микроорганизмов, идентифицированных как бифидобактерии и лактобактерии, выделенные из фекалий морских свинок. Чистые культуры гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий выделяли из суспензий фекалий на изотоническом растворе хлорида натрия на плотных питательных средах рекомендованного состава [14, 15] при инкубации в микроаэрофильных условиях с использованием системы для анаэробного культивирования Anaerobic system Mark IIILE003 (HiMedia Laboratories Pvt. LTD, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Packet. Таблица 1 Выраженность повреждения лимфоцитов [6] Число погибших клеток, процент 0-10 11-20 21-50 51-80 81-100 Балл Результат 1 2 4 6 8 Отрицательный Сомнительный Слабо положительный Положительный Резко положительный % погибших клеток в опыте – % погибших клеток в контроле ЦТИ = 100 • ____________________________________________________ 100 – % погибших клеток в контроле В работе использовали: гепарин 5000 ЕД•мл-1, ОАО «Синтез Курган», Россия; фиколл, ПанЭКО, Россия; верографин, Спофа: Фарм-Группа, Чехия; трипановый синий, ДИА-М, Россия. Выделение фракции лимфоцитов для постановки лимфоцитотоксического теста проводили согласно санитарным правилам СП 3.3.2.561-96 [7]. Для выделения фракции лимфоцитов использовали кровь шести прошедших акклиматизацию морских свинок массой 250300 г, беспородных, обоего пола. Выраженность повреждения лимфоцитов оценивали в баллах (таблица 1) и путем подсчета цитотоксического индекса (ЦТИ) по приведенной ниже формуле [7]. При постановке лимфоцитотоксического теста были использованы агаровые культуры выделенных гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий. Постановку лимфоцитотоксического теста осуществляли в полистироловых планшетах. В лунки панели планшета вносили 0,1 мл взвеси лимфоцитов, в которой предварительно определяли их концентрацию, составившую 4,0•106 кл•мл-1, а также процент нежизнеспособных лимфоцитов при окраске трипановым синим. В последующем в лунки, содержащие суспензии лимфоцитов, вносили по 0,1 мл суспензии аутоштаммов гомопробиотических бифидобактериий и лактобактерий в соответствующих концентрациях. Планшеты с заполненными лунками инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 30 минут. По окончании инкубации в каждую лунку планшета добавляли рабочий раствор трипанового синего. Через 20-30 секунд взвесь из лунки помещали в счетную камеру Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец», Россия) для определения количества погибших лимфоцитов. Выбор доз пробиотических микроорганизмов был осуществлен на основании предварительного изучения их иммуномодулирующего действия при продолжительном (2 недели) пероральном поступлении в организм морских свинок в тесте спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) [9, 15]. Обработку результатов исследования проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [2]. Результаты исследования В предварительных опытах изучения иммуномодулирующего действия регидратированных пробиотических микроорганизмов бифидобактерий и лактобактерий было установлено, что их пероральное введение морским свинкам в дозах 1•104 и 1•105 бактерий не вызывало достоверного усиления розеткообразования в опыте в сравнении с контролем (количество Т-розеток в опыте соответственно вводимым дозам бактерий – 25,5 % и 27,1 % против 27,0 % в контроле [11]. С учетом результатов теста спонтанного розеткообразования для постановки лимфоцитотоксического теста были определены следующие дозы гомопробиотических микроорганизмов (КОЕ в 1 мл суспензии): для бифидобактериий – 1,0•105; 2,6•106; 1,3•107; 2,6•107; 2,6•108; для лактобактерий – 1,0•105; 5,3•108; 1,3•107; 2,6•109; 5,3•109; 5,3•1010. Дозы аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий 2,6•106 КОЕ и лактобактерий 5,3•108 КОЕ соответствуют суточным дозам препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин для морских свинок с учетом переводного коэффициента и использованы нами в качестве контролей. Оценочные показатели лимфоцитотоксического теста с гомопробиотическими бифидобактерииями и лактобактериями представлены в таблицах 2 и 3. Данные, представленные в таблицах 2 и 3, свидетельствуют о том, что лимфоциты морских свинок лишь в минимальной степени подвержены цитолизу под воздействием больших доз аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий. Так, при максимальной концентрации 1 2 3 4 Число погибших лимфоцитов, процент (ЦТИ) 5 6 Антилимфоцитарная активность бифидобактерий из бактериальных суспензий в концентрациях…КОЕ•мл-1, (Х±I95) 1·105 2·106 1,3·107 2,6·107 2,6·108 9±2 12±3 13±4 14±3 19±10 (7,1) (10,2) (11,3) (13,9) (20,9) 7±3 10±4 12±4 13±3 16±4 (4,1) (7,2) (9,2) (10,3) (13,4) 8±3 9±4 14±5 16±3 19±5 (5,1) (6,1) (11,3) (13,4) (16,5) 9±4 11±5 13±4 15±4 18±5 (5,2) (6,2) (7,3) (9,4) (12,5) 8±4 9±5 11±4 12±5 18±6 (4,2) (5,2) (7,3) (8,3) (12,5) 9±3 10±4 11±5 11±4 19±4 (4,2) (5,3) (7,3) (7,3) (16,5) Примечание – Оценочный балл для концентрации 1·105 – 1 (результат отрицательный), для концентрации 2·10 6 – 2/1 (результат сомнительный/ отрицательный); для концентрации 1,3·107-2,6·108 – 2 (результат сомнительный) Таблица 3 Результаты лимфоцитотоксического теста с аутоштаммами гомопробиотических лактобактерий Номер Опредеживот- ляемый ного показатель 1 2 3 4 5 6 Число погибших лимфоцитов, процент (ЦТИ) Антилимфоцитарная активность лактобактерий из бактериальных суспензий в концентрациях … КОЕ•мл-1, (Х±I95) 1,0•105 5,3•108 2,6•109 5,3•109 5,3•1010 8±3 12±4 16±4 18±5 30±4 (5,1) (7,4) (12,5) (14,6) (27,1) 9±4 18±3 17±4 16±5 32±5 (5,2) (14,6) (13,5) (12,5) (29,1) 7±3 16±4 19±4 17±4 33±3 (3,1) (12,5) (15,6) (13,5) (29,5) 6±3 19±4 19±5 18±4 35±5 (3,1) (15,6) (15,6) (14,6) (31,6) 9±4 18±4 20±4 16±5 37±6 (4,2) (14,6) (16,7) (12,5) (34,3) 10±3 12±4 14±5 15±4 38±5 (5,2) (7,4) (9,5) (10,5) (35,4) Примечание – Оценочный балл для концентрации лактобактерий 1,0·105 – 1 (результат отрицательный); для концентрации 2,0·108, 2,6·109-5,3·109 – 2 (результат сомнительный); для концентрации 5,3·1010 – 2 (результат слабо положительный) При использовании для постановки лимфоцитотоксического теста гомопробиотических лактобактерий в дозе 5,3•108 КОЕ•мл-1 реакция лимфоцитов оказалась слабо положительной. При этом аутоштаммы гомопробиотических лактобактерий в больших дозах оказывают более выраженное повреждающее действие на лимфоциты: число погибших лимфоцитов при максимальной концентрации лактобактерий 5,3•1010 в среднем составило 34,2 % (при цитотоксическом индексе 31,2) против аналогичных показателей, полученных при использовании Глава I ПРОБИОТИКИ Результаты лимфоцитотоксического теста с аутоштаммами гомопробиотических бифидобактерий Поиск новых эффективных методов коррекции нарушений микробиоценоза кишечника, возникающих как при острых инфекционных заболеваниях и хронических воспалительных процессах, так и при заболеваниях желудочно-кишечного тракта различного генеза, дает возможность клиницистам целенаправленно проводить патогенетическое лечение основного заболевания [2,4,5]. Корректность терапии основного заболевания предполагает также ее направленность против того звена нарушений регуляции, которое утратило возможность самовосстановления. Зачастую таким звеном является кишечная микрофлора, для восстановления которой в современных условиях применяют пробиотики, пребиотики, синбиотики (сочетание пробиотиков и пребиотиков) и микробные метаболиты. С расширением спектра используемых в клинической практике пробиотиков стали появляться сведения о том, что принципы современной заместительной терапии, состоящие в применении больших доз пробиотика длительными курсами, могут быть причиной недостаточной эффективности лечения дисбиотических состояний и возникновения побочных эффектов [6]. Так, при пероральном приеме пробиотиков, являющимся физиологическим путем введения антигенов и других биологически активных веществ в организм [17], наблюдается развитие выраженной макрофагальной реакции, что характерно для начала процесса иммунизации [18]. Важно при этом отметить, что длительное использование высоких доз пробиотических микроорганизмов (и, соответственно, их антигенов) может привести к истощению адаптационных резервов организма [19]. Механизм действия пребиотиков – препаратов немикробного происхождения – основан на избирательном стимулировании роста или активации метаболической активности нормальной кишечной микрофлоры [2-4]. Синбиотики и микробные метаболиты также, в основном, оказывают стимулирующее влияние на собственную кишечную микрофлору. Таким образом, пробиотические микроорганизмы и, в определенной степени, синбиотики могут оказать отрицательное влияние на иммунную систему и макроорганизм в целом. Ответная реакция микроорганизмов кишечной микрофлоры проявляется незамедлительно. Стремясь сохранить гомеостаз внутренней среды организма хозяина, крайне необходимый для поддержания жизнедеятельности, они осуществляют весьма эффективную дифференциацию представителей нормофлоры от экзогенных, в том числе условно-патогенных, симбионтов [20]. В масштабе целостного организма за функцию распознавания «своего» и «чужого» отвечает иммунная система, защищающая посредством различных механизмов врожденного и приобретенного иммунитета организм хозяина и обеспечивая гомеостаз его внутренней среды [21]. Именно на иммунную систему падает главная нагрузка по устранению нарушений гомеостаза, вызванных антигенным воздействием [22]. Вслед за экспериментальным изучением в опытах in vitro взаимоотношений лимфоцитов крови морских свинок с бифидобактерииями и лактобактериями сертифи- сборник научных статей Обсуждение результатов Таблица 2 Номер Опредеживот- ляемый ного показатель лактобактерий пробиотика Лактобактерин [11], составивших соответственно 99 % и 98,9 %. Бальная оценка результатов лимфоцитотоксического теста с аутоштаммами гомопробиотических бифидобактерий в указанных дозах характеризует реакцию лимфоцитов морских свинок как сомнительную, а с аутоштаммами гомопробиотических лактобактерий как слабо положительную. 63 гомопробиотических бифидобактерий 2,6•108 КОЕ•мл-1 число погибших лимфоцитов в среднем по 6 морским свинкам составило 18,9 % (при среднем цитотоксическом индексе 15,4), в то время как аналогичные показатели при взаимодействии лимфоцитов морских свинок с бифидобактериями из пробиотика Бифидумбактерин [11] при одинаковых концентрациях бактерий составили 98 % (ЦТИ 97,8). Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 64 цированных пробиотических препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин, результаты которого однозначно свидетельствовали о том, что реакция лимфоцитов, контактирующих с большими дозами пробиотических микроорганизмов, выходит за пределы физиологической нормы [11], нами были продолжены исследования в этом направлении. Так, при оценке влияния больших доз пробиотика Бифидумбактерин и микроорганизмов аутофлоры кишечника на организм белых мышей и показатели клеточного иммунитета была установлена возможность возникновения патологических состояний, приводящих даже к гибели животных [23]. Кроме того, были выявлены субпопуляционные сдвиги и изменения функциональной активности лимфоцитов у белых мышей, свидетельствующие об иммунобиологической перестройке в организме животных на фоне энтерального введения больших доз пробиотиков и микроорганизмов нормальной микрофлоры. В последнем случае антигенная нагрузка у животных сопровождалась достоверным по сравнению с фоновым значением ростом относительного и абсолютного количества Т (СD+4IFN-␥+)-лимфоцитов хелперов, продуцирующих ␥-интерферон. Выявленные субпопуляционные сдвиги и изменения функциональной активности лимфоцитов у белых мышей в общем укладываются в рамки иммунобиологической перестройки в организме животных на фоне энтерального введения больших доз микроорганизмов пробиотиков. Сопоставляя полученные ранее результаты ответной реакции лимфоцитов морских свинок, контактирующих in vitro с большими дозами пробиотических микроорганизмов из коммерческих препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин [11], с результатами ответной реакции лимфоцитов, взаимодействующих с аутоштаммами гомопробиотических бифидобактериий и лактобактерий, выделенными из фекалий морских свинок и взятых в тех же дозах, можно заметить существенные различия. Так, при дозе пробиотических бифидобактерий, соответствующей суточной дозе для морских свинок, число погибших лимфоцитов составляет 11 %, что не выходит за пределы ответной «нормальной» реакции [8]; увеличение дозы бифидобактерий в 10 раз приводит к возрастанию числа погибших лимфоцитов в 6,3 раза, составляя 69 %. Пробиотические лактобактерии в дозе, соответствующей суточной дозе для морских свинок, инициируют в лимфоцитотоксическом тесте повреждение 19 % лимфоцитов, а при возрастании дозы в 10 раз – 85 % лимфоцитов (увеличение числа погибших лимфоцитов в 4,5 раза). При постановке лимфоцитотоксического теста с аутоштаммами гомопробиотических бифидобактерий, взятых в дозе, соответствующей суточной дозе для морских свинок, количество погибших лимфоцитов составило 10 %, а при увеличении дозы бифидобактерий в 10 раз – достигло 14 %, что в 4,9 раза меньше значения, полученного с пробиотическими бифидобактериями. В случае использования аутоштаммов гомопробиотических лактобактерий в лимфоцитотоксическом тесте в дозе, равной суточной дозе для морских свинок, число поврежденных лимфоцитов составляет 16 %; с увеличением дозы лактобактерий в 10 раз число поврежденных лимфоцитов – всего 17 %, что в 5,0 раз меньше значения, полученного при постановке лимфоцитотоксического теста с пробиотическими лактобактериями. Результаты лимфоцитотоксических тестов с пробиотическими бифидобактериями и лактобактериями, а также с аутоштаммами гомопробиотических микроорганизмов тех же видов, свидетельствуют о существенных различиях в реакции лимфоцитов на взаимодействие с пробиотическими бифидобактериями и лактобактериями, выделенными из коммерческих препаратов Бифидобактерин и Лактобактерин, и с аутоштаммами бифидобактерий и лактобактерий, выделенными из кишечного содержимого тех животных, с лимфоцитами крови которых осуществлялась постановка лимфоцитотоксического теста. Совершенно очевидно, что на собственную микрофлору (аутофлору) организма клетки иммунной системы морских свинок реагируют спокойно, т.е. в пределах «нормальной» реакции. Действительно, увеличение дозы аутоштаммов бифидобактерий в 10 раз повлекло за собой увеличение числа погибших лимфоцитов в 1,4 раза, а в случае аутоштаммов лактобактерий – в 1,1 раза. В то же время при постановке лимфоцитотоксического теста с пробиотическими бифидобактериями и лактобактериями при 10-кратном увеличении дозы этих микроорганизмов отмечалось соответствующее увеличение числа разрушенных лимфоцитов в 6,3 и 4,5 раза. Таким образом, исходя из полученных результатов, становится очевидной гетерологичность пробиотических микроорганизмов для морских свинок: выделенные из другого организма и прошедшие стадию лиофилизации пробиотические микроорганизмы не только хуже приживаются в кишечнике нового хозяина [24], но и проявляют лимфоцитотоксические свойства, фиксируясь специфически на лимфоцитах и в присутствии комплемента нарушают целостность клеточных мембран, что приводит к гибели лимфоцитов [7, 8]. Патологическая реакция лимфоцитов на пробиотические микроорганизмы – это признание их чужеродности по отношению к организму нового хозяина – морских свинок. Это означает, что аутоштаммы бифидобактерий и лактобактерий, доминирующие в кишечнике морских свинок, не являются чужеродными и не инициируют повреждения их клеточных мембран. Полученные результаты согласуются с имеющимися в научной литературе данными, согласно которым формирование видовой индивидуальной и тканевой специфичности индивидуальной микрофлоры кишечника тесно связано с иммуногенетическими взаимодействиями микрофлоры и хозяина, что ведет к развитию индивидуальной иммунологической толерантности [25, 26]. Кроме того, настоящими исследованиями подтвержден вывод, сделанный нами ранее [27] о том, что существующий принцип заместительного действия пробиотикотерапии на основе живых гетерологичных микроорганизмов должен быть критически переосмыслен в направлении обеспечения безопасного и эффективного положительного воздействия на нормальную микрофлору при дисбиотических нарушениях со стороны желудочнокишечного тракта. Выводы 1. В опытах in vitro изучено взаимодействие лимфоцитов крови морских свинок с аутоштаммами гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий с балльной оценкой повреждения лимфоцитов и определением лимфоцитотоксического индекса. 2. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что под воздействием больших доз аутоштаммов гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий происходит повреждение лишь небольшого количества лимфоцитов, что характеризует ответную реакцию лимфоцитов крови морских свинок как реакцию, не выходящую за пределы физиологической нормы. 3. Ответная реакция лимфоцитов на аутоштаммы гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий Глава I ПРОБИОТИКИ 1. Покровский В.И. Человек и микроорганизмы. Здоровье и болезнь. Вестн. РАМН 2000; (11): 3-6. 2. Грачева Н.М., Малышев Н.А., Чичерин И.Ю., Аваков А.А., Партин О.С., Щербаков И.Т., Соловьева А.И., Герасимова Н.В. Фруктоолигосахариды и фруктополисахариды в комплексном лечении больных желудочно-кишечными заболеваниями с явлениями дисбактериоза кишечника. Инф. болезни 2010; 8 (1): 107-111. 3. Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Пробиотики: вектор развития. Практическая медицина 2012; (3): 180-188. 4. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании; М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 2010; 23 с. 5. Lebenthal E., Lebenthal Y. Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего признания. Журн. микробиол. 2003; (4): 88-90. 6. Воеводин Д.А., Розанова Г.Н., Стенина М.А., Чередеев А.Н. Роль дисбактериоза в формировании хронической инфекционной патологии у детей. Журн. микробиол. 2011; (6): 88-93. 7. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов: Санитарные правила СП 3.3.2.561-96: утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора России 31.10.1996 г., № 33: введ. в действие 31.10.1996 г. – М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1996: 120 с. 8. Лимфоцитотоксический тест. – http://medbiol.ru/medbiol/allerg/ 0019c.14a.htm (дата обращения: 10.08.2012). 9. Экспериментальное обоснование ПДК микроорганизмовпродуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды: методические указания: утв. Начальником Главного санитарно-профилактического Управления Минздрава СССР 11.06.1991 г. № 5789/1-91. – М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1993: 20 с. 10. Стяжкин К.К., Дармов И.В., Бредихин В.Н., Воробьев К.А., Погорельский И.П., Лещенко А.А., Лазыкин А.Г. Экспериментальная оценка иммунотоксического действия штамма Pseudomonas fluorescens ЕК-5-93 – деструктора токсичных фосфорорганических соединений. Теорет. и прикладн. экология 2012; (2): 54-58. 11. Ердякова А.С., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Погорельский И.П. Экспериментальная оценка лимфоцитотоксического действия бифидобактерий и лактобактерий. Практическая медицина 2012; (3): 194-196. сборник научных статей ЛИТЕРАТУРА 12. Tannock G.W. The normal microflora: new concepts in health promotion. Microbiol. Sci 1988; 5(1): 4-8. 13. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Г., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо, СПб: Центр госсанэпиднадзора 2002; 31 с. 14. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн. микробиол. 1992; (9-10): 74-78. 15. Hopfer H., Maron R., Butzman U., Helm U., Weiner H.L., Kalluri R. The importance of cell-mediated immunity in cource and severity of autoimmune anti-glomerular basement membranc disease in mice FASEB Journal 2003; 17: 860-868. 16. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 17. Воробьев А.А. Физиологические пути введения антигенов и других биологически активных веществ в организм. Иммунология. 2002; 23 (3): 138-142. 18. Куваева И.Б. Основные принципы отбора микроорганизмов для создания биологически активных добавок к пище с пробиотическим действием. Матер. Всерос. конф. с междунар. участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (21-23 апреля 1999 г.). – М.: 1999. С. 77-79. 19. Панин А.Н., Малик Н.И. Принципы и перспективы применения эубиотиков в животноводстве. Матер. Всерос. конф. с междунар. участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (21-23 апреля 1999 г.). – М.: 1999. С. 22-23. 20. Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микробное распознавание «свойчужой» в условиях кишечного микросимбиоценоза человека. Журн. микробиол. 2011; (6): 46-51. 21. Ройт А. Основы иммунологии. М: Мир, 1991; 328 с. 22. Воробьев А.А., Лыкова Е.А., Феклисова Л.В., Боковой А.Г., Целиканова Е.Е. Использование больших доз пробиотика Бифидумбактерина форте в лечении ОРВИ у детей. Эпидем. и инф. болезни, 2004; (5): 43-46. 23. Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Богачева Н.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Исследование влияния больших доз пробиотика Бифидумбактерин и микроорганизмов аутофлоры кишечника на организм белых мышей и показатели клеточного иммунитета. http://gastroportal.ru/files/mikroflora.pdf 24. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дурнев Е.А. Выживаемость организмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Журн. инфектологии 2012; 4 (1): 68-74. 25. Van der Waaij D. The apparent role of the mucous numbrane and the gut – associated lumphoid tissul in the selektoin of the normal resident flora of the digestive tract 1986; 7 (1): 4-7. 26. Подопригора Г.И. Медицинская гнотобиология. М: Мед. информ. агентство, 2003; 272 с. 27. Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Заместительное действие пробиотиков: миф или реальность. – http://gastroportal.ru/files/mikroflora.pdf. 65 морских свинок подтверждает важность реализации положений концепции пребиотической терапии, связанной с необходимостью поддержания и восстановления собственной микрофлоры кишечника, а не с попыткой интродукции «хороших», но чужеродных для него микроорганизмов. Глава I ПРОБИОТИКИ ПРОБИОТИКИ: ВЕКТОР РАЗВИТИЯ* Чичерин И.Ю.1, Погорельский И.П.2, Дармов И.В.2, Лундовских И.А.2, Гаврилов К.Е.2 1 2 ООО «МедСтар», Сергиев Посад, Россия (141300, Сергиев Посад, ул. Вознесенская, 55), e-mail: rpatron@mail.ru ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru PROBIOTICS: DIRECTION OF THE DEVELOPMENT I.Yu. Chicherin1, I.P. Pogorelsky2, I.V. Darmov2, I.A. Lundovskikh2, K.E. Gavrilov2 1 66 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 2 LLC «MedStar», Sergiev Posad, Russia (Voznesenskaya st., 55, Sergiev Posad, Russia, 141300), e-mail: rpatron@mail.ru, Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Представлены результаты оценки эффективности различных компонентов жидких нативных культур гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника у конвенциональных белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. В экспериментах использовали гомопробиотические лактобактерии и бифидобактерии, выделенные из фекалий белых мышей линии BALB/c. Выделенные микроорганизмы выращивали в жидкой питательной среде в микроаэрофильных условиях. Нативные культуры гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий и их компоненты (нативные микробные клетки, инактивированные микробные клетки, надосадочная жидкость), а также жидкую питательную среду вводили перорально конвенциональным белым мышам с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом и оценивали динамику общего содержания микроорганизмов в 1 г фекалий и отдельных представителей кишечной микрофлоры. Установлено, что надосадочная жидкость, содержащая экзометаболиты, оказывает наиболее выраженное влияние на восстановление нормальной кишечной микрофлоры у подопытных животных. Полученные результаты создают предпосылку для экспериментально обоснованной разработки новых пробиотических препаратов на основе экзометаболитов микроорганизмов. Ключевые слова: пробиотики, пребиотики, экзометаболиты, экспериментальный дисбактериоз, кишечная микрофлора. The results are presented of evaluation of the efficiency of the various components of homoprobiotic lactobacilli and bifidobacteria liquid native cultures in the correction of intestinal microbiocenosis of conventional white mice with antibiotic-associated dysbacteriosis. Homoprobiotic lactobacilli and bifidobacteria isolated from the feces of white mice of BALB/c line were used in the experiments. The isolated microorganisms were grown in liquid nutrient medium under microaerophilic conditions. Homoprobiotic lactobacilli and bifidobacteria native cultures and their components (native microbial cells, inactivated microbial cells, supernatant) and liquid cultures medium were administered orally to white mice with antibiotic-associated dysbacteriosis, and the dynamics of the total content of microorganisms and the number of some representatives of intestinal microflora in 1 g of feces were evaluated. Results showed that the supernatant, containing exometabolites, has the most pronounced effect on the renewal of the normal intestinal microflora in experimental animals. These results provide the experimental background for the sound development of new probiotic products based on exometabolites of microorganisms. Key words: probiotics, prebiotics, exometabolites, experimental dysbacteriosis, intestinal. ВВЕДЕНИЕ нозологических единиц, но стали актуальной проблемой медицины [1, 7]. В соответствии с Отраслевым стандартом «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника», утвержденного приказом № 232 МЗ РФ (2003 г.), современные подходы к лечебной коррекции дисбиотических изменений в кишечнике включают ряд важных мероприятий, в том числе направленных на восстановление нормальной кишечной микрофлоры [8]. Микроэкологические нарушения в желудочно-кишечном тракте сопровождают большинство заболеваний [1-6]. С другой стороны, многочисленные проявления болезней, а также расстройства в функционировании ряда органов и систем часто напрямую связаны с нарушениями микробиоценоза кишечника, которые, в частности дисбактериоз и синдром избыточного бактериального роста, хоть и не приобрели статус самостоятельных * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Пробиотики: вектор развития. Практическая медицина.- 2012.- №3(58). - С.180-188. Глава I ПРОБИОТИКИ коммерческих пробиотиков для обоснования подходов к повышению безопасности, профилактического и лечебного эффекта данного класса иммунобиологических препаратов. Теоретическое и экспериментальное обоснование таких подходов возможно при наличии соответствующего биологического объекта изучения без отягощения сопутствующими заболеваниями, вызвавшими и влияющими на дисбиотические изменения в кишечнике. На человеческом организме проведение экспериментальных исследований невозможно, во-первых, из этических соображений, а, во-вторых, дисбиотические изменения у людей в естественных условиях проявляются как клинико-лабораторный синдром, сопутствующий основному заболеванию. Поэтому чистоты эксперимента добиться на людях нельзя вследствие наличия у них ряда основных заболеваний, т.е. невозможно найти для данных исследований контингент здоровых людей с выраженным дисбиозом кишечника. Замена человеческого организма вполне обоснованно может быть произведена на организм животных. Важно при этом иметь в виду, что микроорганизмы из сертифицированных пробиотических препаратов часто не способны к длительному существованию в кишечнике человека и животных [24, 25]. Поэтому для приживления в данном биотопе предложено использовать гомопробиотические микроорганизмы, относящиеся к фенотипической группе, доминирующей в кишечнике животных или людей [26]. Для конвенциональных белых мышей такими гомопробиотическими микроорганизмами могут быть лактобактерии и бифидобактерии, выделенные от белых мышей линии BALB/c, полученных из иногороднего питомника. Для проведения исследований нами разработана модель здоровых экспериментальных животных (конвенциональных белых мышей) с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, получаемым в стандартных условиях путем перорального введения не всасывающегося из желудочно-кишечного тракта антибиотика и, к тому же, не вызывающего системных реакций со стороны организма [27]. Разработанная модель с использованием экспериментальных животных позволяет получать у них воспроизводимые от опыта к опыту однотипные глубокие изменения микробиоценоза кишечника. Цель настоящего исследования – сравнительное изучение эффективности различных компонентов жидких нативных культур гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника у конвенциональных белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Исходя из литературных данных, максимальную эффективность живых пробиотических микроорганизмов можно ожидать от гомопробиотических бактериальных культур [11, 12, 28], находящихся в физиологическом состоянии без деструкции клеточной стенки бактерии, наблюдающейся в процессе лиофилизации [13, 20, 21], и потери большей части экзогенных метаболитов в ходе лиофилизации и приготовления сухих препаратов [13]. Материалы и методы исследования При отработке условий культивирования пробиотических микроорганизмов в жидкой питательной среде использовали регидратированные культуры сертифицированных пробиотиков Лактобактерин (серия 15/6, производство ФГУП НПО «Микроген», Россия) и Би- сборник научных статей Цель исследования 67 Пробиотики среди средств коррекции нарушений микрофлоры кишечника в течение многих лет занимают особое место в связи с теми эффектами, которые регистрируются как объективно, так и субъективно – улучшением самочувствия больного [9]. Однако еще в 2003 г. E. Lebenthal и Y. Lebenthal отметили противоречивость данных об эффективности многих разработанных и испытанных пробиотиков и сделали вывод о том, что лишь отдельные из большого числа клинических испытаний пробиотиков дали приемлемые оценки их эффективности [10]. Считается, что основным действующим началом пробиотических препаратов являются живые микробные клетки [11, 12]. Поэтому все биотехнологические приемы по разработке и производству пробиотиков направлены на получение высококонцентрированных суспензий пробиотических микроорганизмов, сред высушивания и стабилизации свойств лиофилизированных микроорганизмов, поддержание и доставку в дистальные отделы желудочнокишечного тракта пробиотических микроорганизмов в максимально возможном жизнеспособном состоянии, в том числе в инкапсулированной форме [11-15]. Появление нового поколения пробиотиков связано не только с совершенствованием биотехнологии их производства, но и с имеющимися случаями низкого, а порой и нулевого эффекта от их применения при некоторых дисбиотических состояниях. Анализ возможных причин недостаточной эффективности пробиотической коррекции дисбиотических состояний кишечника проведен Н.А. Глушановой [16]. Автором, в частности, указывается со ссылкой на опубликованные результаты исследований других авторов [17, 18], что пробиотик может реализовать свои потенциальные свойства в том случае, если он поступает в кишечник в активном жизнеспособном состоянии в виде жидкой культуры или в виде кисломолочного продукта. Опубликованы данные о том, что лиофилизированные в составе пробиотических препаратов микроорганизмы плохо приживаются в кишечнике, а по своей активности – значительно уступают пробиотическим микроорганизмам, входящим в состав молочнокислых продуктов [19]. Сравнительное изучение свойств микроорганизмов в составе жидких и лиофилизированных пробиотических препаратов позволило выявить деструкцию клеточной стенки микроорганизмов в результате лиофилизации, что сказывается на более медленной их адаптации в кишечнике и удлинении лаг-фазы [20, 21]. Как следует из опубликованных результатов исследований [22], повреждению клеточной стенки пробиотических микроорганизмов способствует лиофилизация микробных клеток и, в частности, замена культуральной жидкости на специальную среду высушивания. С учетом данных о том, что лиофилизированные пробиотики недостаточно точно стандартизируются по количеству жизнеспособных микроорганизмов [22], которые в процессе сублимационной сушки испытывают определенное негативное воздействие ряда факторов, вполне ожидаемой является информация о том, что положительный эффект пробиотиков даже при длительном применении носит временный характер или вовсе отсутствует. Поэтому для коррекции дисбиотических нарушений все чаще стали применять сочетание пробиотических и пребиотических препаратов [7, 9, 23]. Таким образом, в связи с вышеизложенным, особенно с противоречивостью данных о действительной эффективности пробиотических препаратов, представляется крайне важным изучение вклада в пробиотический эффект каждого в отдельности компонента (субстанции) Глава I ПРОБИОТИКИ 68 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Рисунок – Микрофотография гомопробиотических лактобактерий (1) и бифидобактерий (2). ⫻ 1000 фидумбактерин (серия 315-6, производство ФГУП НПО «Микроген», Россия). Согласно инструкции по медицинскому применению, препарат Лактобактерин сухой создан на основе лактобактерий L. plantarum SP-A3, а препарат Бифидумбактерин сухой – на основе бифидобактерий B. bifidum 1. В одной дозе лиофилизата препарата Лактобактерин содержится не менее 2•109 живых лактобактерий, а в одной дозе лиофилизата Бифидумбактерин – не менее 1•107 живых бифидобактерий. В экспериментах использовали культуры гомопробиотических бактерий, идентифицированных как бифидобактерии и лактобактерии, выделенные из экскрементов белых мышей линии ВАLВ/с – лабораторной линии домашних мышей, традиционно используемых в исследованиях по иммунологии и в онкологии [29]. Изолированное содержание белых мышей линии BALB/c не допускает перекрестного спаривания с беспородными (конвенциональными) белыми мышами, использованными для получения антибиотико-ассоциированного дисбактериоза, что исключает появление и циркуляцию аутоштаммов кишечных микроорганизмов. Чистые культуры гомопробиотических бифидобактерий и лактобактерий выделяли на плотных питательных средах рекомендованного состава [30, 31] в чашках Петри после инкубирования в микроаэрофильных условиях с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III-LE003 (Hi Media Laboratories Pvt.». LTD, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Общее количество микробных клеток в пересчете на 1 г фекалий животных определяли подсчетом в камере Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец», Россия). Количество живых микроорганизмов (КОЕ) в суспензиях определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений исследуемых суспензий на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчетом выросших колоний по истечении времени инкубирования. Выращивание эшерихий и подсчет выросших колоний проводили на агаре Эндо. В качестве контрольного препарата использовали биоряженку «Целебная радуга», произведенную ООО МНПК «Вятка биопром» (ТУ 9222-001-10922226-09). Содержание бифидобактерий 1•108 КОЕ•г-1 и лактобактерий 1•107 КОЕ•г-1. Антибиотико-ассоциированный дисбактериоз кишечника у конвенциональных белых мышей, беспородных, обоего пола, массой 18-20 г, воспроизводили путем перорального введения гентамицина (продукция ОАО «Биохимик», Россия) [27]. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [32]. Результаты исследования Эксперименты по оптимизации условий культивирования пробиотических микроорганизмов сертифицированных пробиотиков Лактобактерин и Бифидобактерин в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса с добавлением дрожжевого экстракта, солей и стимуляторов роста (гемина и сульфита натрия) показали, что в созданных оптимальных микроаэрофильных условиях регидратированные лактобактерии хорошо растут, размножаются и за 2 суток роста при температуре 37 °С их концентрация в 1 мл культуральной среды достигает (2-2,8)•109 КОЕ. Бифидобактерии, регидратированные из сухого препарата Бифидумбактерин, ко 2 суткам роста в жидкой питательной среде значительно отстали в скорости роста. Очевидно, что вакуумная сушка оказала негативное влияние на клетки бифидобактерий, как об этом говорится в уже цитируемой работе [13], что безусловно сказалось на адаптации бифидобактерий к условиям выращивания. Потребовалось 4 суток выращивания бифидобактерий в микроаэрофильных условиях, чтобы их концентрация в жидкой питательной среде достигла уровня (8-9)•108 КОЕ•мл-1, что выше концентрации бифидобактерий в одной дозе пробиотика Бифидумбактерин. Необходимо отметить следующее: если в качестве посевного материала взять культуру бифидобактерий первой генерации в жидкой питательной среде, то скорость роста бифидобактерий возрастает и оптимальный выход биомассы наблюдается к исходу 3 суток культивирования в микроаэрофильных условиях. При микроскопии мазков, приготовленных из выросших в жидкой питательной среде лактобактерий, окрашенных по Граму, наблюдаются грамположительные палочки до 7-10 мкм в длину, а бифидобактерий – грамположительные палочки, вариабельные по форме до 7-9 мкм в длину. Для выделения гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий от белых мышей линии ВАLВ/с, традиционно используемых в клинических и иммунологических исследованиях [29], отбирали фекальные массы животных. Суспендированные фекалии линейных мышей в изотоническом растворе хлорида натрия центрифугировали в центрифужных пробирках для осаждения фрагментов непереваренной пищи, а надосадочную жидкость Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на ... сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 7 (6,6±0,4)•109 (7,1±0,6)•105 (2,4±0,5)•104 (6,1±0,5)•106 (2,0±0,5)•104 (1,4±0,5)•102 8 6 (2,6±0,5)•10 (1,6±0,3)•10 (1,3±0,6)•103 4 3 (1,8±0,6)•10 (2,0±0,5)•10 (2,1±0,7)•101 Примечание – здесь и в таблицах 2, 3 «n» – количество повторных определений использовали для посева на соответствующие плотные питательные среды для получения роста изолированных колоний, изучения морфологических и тинкториальных свойств бактерий, соответствия их видовым характеристикам. На основании комплексного изучения свойств выделенных бактерий они были идентифицированы как Lactobacillus plantarum и Bifidobacterium bifidum [33]. Чистые культуры гомопробиотических микроорганизмов в дальнейшем выращиванили в жидкой питательной среде. На рисунке представлены микрофотографии выращенных микроорганизмов, окрашенных по Граму. Отработанные условия выращивания гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса с дополнительными добавками позволили получить нативные культуры, в которых концентрация гомопробиотических L. plantarum составила 2,6•109 КОЕ•мл-1, а гомопробиотических B. bifidum – 8,1•108 КОЕ•мл-1. Полученные нативные культуры гомопробиотических микроорганизмов с многокомпонентным составом были необходимы для сравнительной оценки эффективности каждого из компонентов в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Для инициации антибиотико-ассоциированного дисбактериоза кишечника конвенциональным белым мышам в течение 7 дней перорально вводили дважды в сутки гентамицин в дозе по 3 мг. До введения антибиотика, на второй и седьмой день введения у животных отбирали фекалии для бактериологического изучения. Всего в опытах было использовано 72 животных. Результаты опытов представлены в таблице 1. Представленные в таблице 1 данные однозначно свидетельствуют о существенных дисбиотических изменениях микрофлоры кишечника у конвенциональных белых мышей под влиянием перорально вводимого гентамицина, что проявляется снижением (на 5 порядков) как общего содержания микроорганизмов в пересчете на 1 г фекалий, так и отдельных представителей фекальной микрофлоры (на 3-5 порядков). Для проведения последующих экспериментов все животные с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом были разделены на группы по 6 особей в каждой. Через 5 дней, в течение которых животным не вводили перорально гентамицин с целью снижения его концентрации в кишечном содержимом, для воздействия на кишечную микрофлору каждому животному в составе группы начинали вводить перорально: а) нативную культуру гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий по 0,1 мл 2 раза в сутки (1 группа); б) нативные живые гомопробиотические лактобактерии и бифидобактерии 2 раза в сутки по 0,1 мл (суточная доза, соответствующая таковой для людей с учетом переводного коэффициента, составила для бифидобактерий 130 тыс., для лактобактерий 26 млн.). Микробные клетки получали центрифугированием (1000g, 15 минут) и ресуспендированием полученного осадка в аналогичном объеме изотонического раствора хлорида натрия (2 группа); в) инактивированные в парах хлороформа гомопробиотические лактобактерии и бифидобактерии 2 раза в сутки по 0,1 мл также по 130 тыс. бифидобактерий и 26 млн. лактобактерий (3 группа). Изучение инактивированных лактобактерий и бифидобактерий свидетельствовало, что пары хлороформа щадящим образом инактивируют микробные клетки, не нарушая их целостности, в том числе поверхностных структур клеточной стенки; г) надосадочная жидкость, полученная при центрифугировании жидкой культуры гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий, в объеме 0,1 мл 2 раза в сутки (4 группа); д) жидкая питательная среда в объеме 0,1 мл 2 раза в сутки (5 группа); е) биоряженка «Целебная радуга» 2 раза в сутки по 0,1 мл (6 группа). В начале введения животным жидких культур гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий и их компонентов, биоряженки «Целебная радуга», жидкой питательной среды, а также на вторые, седьмые и четырнадцатые сутки, у животных в каждой из групп отбирали фекалии для бактериологического исследования. Результаты экспериментов представлены в таблицах 2 и 3, из которых следует, что наиболее благоприятное действие на микрофлору кишечника белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом оказывает надосадочная жидкость, полученная в результате центрифугирования нативных культур («жидких пробиотических комплексов») гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий. При этом на 14 сутки экспериментов зафиксировано не только значительное увеличение общего содержания микроорганизмов в фекалиях животных, но и восстановление в близких к физиологическим параметрам численности лактобактерий, бифидобактерий и эшерихий. Нативные культуры гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий также оказывают стимулирующее воздействие на микрофлору кишечника белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, хотя и в меньшей степени, нежели надосадочная жидкость. В то же время в сравнении с нативными живыми клетками L. plantarum и B. bifidum стимулирующее действие нативных культур на кишечную микрофлору белых мышей отчетливо выше. Инактивированные бактерии L. plantarum и B. bifidum практически не инициируют восстановление кишечной микрофлоры у белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, уступая в этом отношении вводимой животным перорально жидкой питательной среде, взятой в качестве контроля. Биоряженка «Целебная радуга», в составе которой присутствуют живые лактобактерии и бифидобактерии, Глава I ПРОБИОТИКИ Микроорганизмы сборник научных статей Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей при пероральном – введении гентамицина (Х±I 95, n=6) 69 Таблица 1. Глава I ПРОБИОТИКИ Таблица 2. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом на фоне введения нативной культуры – с гомопробиотическими лактобактериями и ее компонентов (Х±I 95, n=6) Группа Нативная культура и животее компоненты ных 1 2 3 4 5 6 Микроорганизмы Общее количество Нативная культура L. Бифидобактерии plantarum («жидкий пробиотический Лактобактерии комплекс») Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Нативные живые клетки L. plantarum Лактобактерии Эшерихии Общее количество Инактивированные Бифидобактерии клетки L. plantarum Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Надосадочная жидкость Лактобактерии Эшерихии Общее количество Жидкая питательная Бифидобактерии среда (контроль) Лактобактерии Эшерихии Общее количество Биоряженка Бифидобактерии «Целебная радуга» Лактобактерии (контроль) Эшерихии Содержание живых бактерий в 1г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 Начало эксперимента 2 7 14 (2,6±0,7)·104 (1,8±0,5)·102 (2,1±0,7)·103 (1,8±0,6)·101 (2,8±0,6)·104 (1,5±0,7)·102 (2,1±0,7)·103 (1,8±0,4)·101 (2,4±0,6)·104 (1,6±0,5)·102 (2,8±0,7)·103 (1,3±0,8)·101 (2,8±0,7)·104 (1,7±0,5)·102 (1,7±0,6)·103 (2,1±0,6)·101 (2,1±0,5)·104 (1,5±0,7)·102 (1,4±0,5)·103 (1,5±0,6)·101 (2,4±0,5)·104 (1,5±0,6)·102 (1,9±0,6)·103 (1,4±0,7)·101 (2,9±0,4)·104 (2,6±0,5)·102 (3,8±0,6)·103 (2,9±0,7)·101 (2,9±0,7)·104 (1,6±0,7)·102 (2,0±0,5)·103 (1,6±0,7)·101 (2,0±0,6)·104 (1,5±0,5)·102 (2,4±0,6)·103 (1,9±0,5)·101 (6,7±0,8)·105 (2,7±0,5)·103 (1,9±0,7)·104 (3,1±0,7)·101 (2,0±0,6)·104 (1,4±0,7)·102 (2,2±0,6)·103 (1,8±0,7)·101 (4,3±0,6)·104 (6,9±0,8)·102 (7,3±0,7)·103 (4,3±0,5)·101 (5,1±0,7)·105 (6,1±0,4)·103 (6,8±0,5)·104 (3,1±0,6)·102 (3,2±0,7)·104 (7,0±0,8)·102 (4,9±0,7)·103 (8,1±0,7)·101 (1,9±0,8)·104 (1,3±0,7)·102 (1,8±0,7)·103 (3,0±0,7)·101 (4,5±0,7)·107 (2,8±0,7)·104 (6,3±0,8)·105 (3,1±0,6)·103 (2,8±0,7)·104 (5,5±0,6)·102 (5,1±0,7)·103 (6,8±0,6)·102 (6,1±0,6)·105 (4,3±0,7)·104 (6,3±0,5)·104 (2,3±0,6)·102 (6,2±0,7)·106 (8,1±0,7)·104 (6,1±0,5)·105 (4,9±0,6)·103 (1,8±0,6)·105 (3,0±0,5)·103 (5,1±0,7)·104 (8,8±0,6)·102 (4,0±0,6)·104 (1,9±0,5)·102 (1,9±0,6)·103 (3,5±0,6)·101 (9,1±0,7)·108 (7,5±0,6)·106 (9,8±0,7)·107 (1,0±0,6)·104 (1,6±0,5)·105 (1,7±0,6)·104 (2,0±0,7)·104 (1,7±0,5)·102 (5,1±0,7)·106 (2,0±0,6)·104 (2,8±0,5)·105 (1,5±0,4)·103 Таблица 3. 70 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом на фоне введения нативной культуры – с гомопробиотическими бифидобактериями и ее компонентов (Х±I 95, n=6) Группа Нативная культура и животее компоненты ных 1 Нативная культура B. bifidum («жидкий пробиотический комплекс») 2 Нативные живые клетки B. bifidum 3 Инактивированные клетки B. bifidum 4 Надосадочная жидкость 5 Жидкая питательная среда (контроль) 6 Биоряженка «Целебная радуга» (контроль) Содержание живых бактерий в 1г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии началоэксперимента 2 7 14 (3,8±0,7)·104 (1,5±0,5)·102 (2,1±0,6)·103 (1,5±0,5)·101 (3,9±0,5)·104 (1,6±0,6)·102 (2,5±0,5)·103 (2,4±0,7)·101 (2,5±0,5)·104 (1,4±0,7)·102 (2,6±0,7)·103 (2,9±0,8)·101 (2,6±0,7)·104 (1,5±0,6)·102 (1,5±0,8)·103 (2,0±0,5)·101 (2,0±0,6)·104 (1,1±0,8)·102 (1,6±0,5)·103 (1,7±0,6)·101 (2,8±0,4)·104 (1,4±0,5)·102 (1,8±0,6)·103 (3,0±0,6)·101 (1,8±0,6)·105 (2,0±0,4)·102 (3,1±0,6)·103 (2,0±0,5)·101 (2,7±0,6)·104 (1,8±0,6)·102 (2,0±0,7)·103 (1,5±0,6)·101 (2,5±0,6)·104 (1,6±0,5)·102 (2,0±0,6)·103 (3,3±0,6)·101 (6,1±0,6)·105 (2,6±0,4)·103 (1,5±0,6)·104 (3,4±0,6)·102 (2,9±0,7)·104 (1,6±0,5)·102 (2,4±0,6)·103 (2,4±0,5)·101 (4,1±0,5)·104 (6,9±0,6)·102 (5,1±0,6)·103 (4,6±0,7)·101 (4,6±0,6)·106 (5,7±0,5)·103 (7,6±0,7)·104 (4,1±0,6)·102 (2,9±0,5)·104 (6,5±0,6)·102 (3,5±0,7)·103 (7,5±0,8)·101 (1,6±0,7)·104 (2,2±0,7)·102 (2,0±0,8)·103 (5,6±0,7)·101 (3,5±0,6)·108 (2,6±0,6)·104 (7,0±0,7)·105 (2,9±0,5)·103 (3,1±0,6)·104 (8,1±0,8)·102 (5,4±0,6)·103 (8,6±0,6)·102 (5,3±0,7)·105 (4,9±0,8)·104 (4,6±0,7)·104 (2,1±0,7)·102 (9,6±0,5)·106 (8,5±0,6)·104 (5,2±0,4)·105 (2,0±0,6)·103 (1,4±0,6)·105 (2,2±0,5)·103 (3,6±0,6)·104 (2,6±0,5)·102 (3,0±0,6)·104 (1,6±0,5)·102 (2,8±0,6)·103 (6,1±0,7)·101 (9,8±0,7)·108 (9,6±0,8)·106 (6,1±0,67)·107 (1,2±0,5)·104 (1,8±0,7)·105 (1,6±0,6)·104 (2,3±0,6)·104 (1,8±0,4)·102 (4,9±0,6)·106 (1,7±0,7)·104 (3,1±0,4)·105 (1,6±0,5)·103 Недостаточная убедительность эффективности современных пробиотических препаратов, а также наличие побочных проявлений со стороны организма в ходе приема пробиотиков, приводят к снижению интереса к бактериотерапии [38] и даже ставят под сомнение целесообразность использования живых пробиотических микроорганизмов [11, 38]. Одной из главных причин недостаточной эффективности пробиотиков является чужеродность для человека входящих в их состав микроорганизмов, высокая видовая, индивидуальная и анатомическая специфичность аутохтонной микрофлоры пациента. Выращенные искусственно, пробиотические микроорганизмы являются чужеродными и отторгаются вследствие биологической несовместимости [13, 20, 21, 39, 40]. Однако, современная наука не исключает пробиотики из арсенала средств лечения дисбактериозов. Более того, в комплексной терапии острых кишечных инфекций для своевременной и эффективной коррекции дисбиотических нарушений особое место отводится сочетанному использованию пробиотических и пребиотических препаратов [40]. С учетом недостатка данных о механизмах пробиотической эффективности сертифицированных препаратов, постоянно уточняются знания о функциональной активности пробиотических микроорганизмов и свойствах их экзометаболитов. Так, относительно недавно были опубликованы экспериментальные данные, касающиеся выраженного увеличения активности E. faecalis и B. subtilis после добавления компонентов клеточной стенки S. aureus в среду культивирования, а также стимуляции пробиотической активности E. coli М17 после обработки ее экзометаболитами стафилококка [41]. Разработан и запатентован комплексный обогатитель пищевых продуктов на основе нативных культур пробиотических микроорганизмов – представителей нормальной микрофлоры человека, из которых центрифугированием удалены клетки микроорганизмов [42]. Полученный продукт характеризуется наличием таких основных экзометаболитов, как экзополисахариды, органические кислоты и витамины группы B, которые активно участвуют в усвоении макро- и микронутриентов. Лактобактерии L. plantarum пробиотика Лактобактерин, а также бифидобактерии и энтерококки (B. longum, E. faecium) пробиотика Бифиформ обнаружили свойства микробных стимуляторов бактериального антагонизма, который осуществляется за счет экзометаболитов и пептидогликана бактериальных клеток исследуемых видов [43]. Микробное распознавание «свой-чужой» в условиях кишечного микросимбиоза человека определяется экзометаболитами микросимбионтов. При этом экзометаболиты индигенных и транзиторных эшерихий по-разному распознаются доминантными бифидобактериями [44]. Низкомолекулярные экзометаболиты E. coli М17 и аутостимуляторы ускоряют рост естественных симбионтов человека – B. adolescentis MC-42, L. acidophilus A-91 в 10-15 раз, увеличивают их антагонистическую актив- Глава I ПРОБИОТИКИ Обсуждение полученных результатов сборник научных статей ния нативных культур L. plantarum и B. bifidum («жидких пробиотических комплексов» на основе гомопробиотических микроорганизмов). Зафиксированный положительный эффект, состоящий в стимуляции восстановления нормальной микрофлоры кишечника белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, может быть отнесен на счет экзометаболитов, накапливающихся в культуральной среде в процессе роста и размножения L. plantarum и B. bifidum при оптимальных микроаэрофильных условиях. 71 хотя и уступает по стимулирующему эффекту на восстановление кишечной микрофлоры надосадочной жидкости, однако является явно предпочтительной в сравнении с нативными бактериями L. plantarum и B. bifidum, а тем более с инактивированными бактериальными клетками тех же видов. С учетом приведенных в таблицах 2 и 3 данных уместно будет представить результаты определения скорости восстановления кишечной микрофлоры у подопытных животных под влиянием перорального введения нативных культур гомопробиотических макроорганизмов и соответствующих компонентов нативных культур. Данный показатель, впервые введенный нами в научный оборот для оценки скорости восстановления (или угнетения) микрофлоры [34], определяется как частное от деления разницы значений концентраций микроорганизмов в 1 г фекалий в конце и начале экспериментов на 14 (количество дней между двумя временными точками определения концентрации микроорганизмов в фекалиях животных), и характеризует скорость восстановления фекальной микрофлоры (КОЕ•г-1•сут-1) под влиянием стимулирующих факторов (таблица 4). Как следует из представленных в таблице 4 данных, скорость восстановления общего содержания микрофлоры в кишечнике белых мышей под влиянием перорального введения нативных культур гомопробиотических микроорганизмов в 40-60 раз выше, чем в контроле. При этом необходимо подчеркнуть следующее: достаточно удалить из нативных культур центрифугированием клеточный компонент, как скорость восстановления кишечной микрофлоры возрастает еще примерно в 100-150 раз (итого до 6500 раз по отношению к контролю). Таким образом, наличие живых пробиотических бактериальных клеток в «жидком пробиотическом комплексе» явно отрицательно сказывается на восстановлении кишечной микрофлоры при дисбиозе. В случае же с инактивированными микробными клетками, что может происходить в реальных условиях под воздействием агрессивных эндогенных факторов желудочно-кишечного тракта [25, 35-37], четко прослеживается угнетение восстановления кишечной микрофлоры: скорость восстановления микрофлоры в 10-300 раз меньше, чем в контроле. Выявленная тенденция прослеживается и при анализе результатов, представленных в таблицах 5 и 6. Нативные культуры, введенные перорально экспериментальным животным с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, увеличивают скорость восстановления лактобактерий, бифидобактерий и эшерихий по сравнению с контролем в 4,8-33,1 раза. Надосадочная жидкость, лишенная клеточных элементов после центрифугирования, при пероральном введении экспериментальным животным ускоряет восстановление числа представителей нормальной микрофлоры (лактобактерий, бифидобактерий и эшерихий) по сравнению с контролем в широком диапазоне от 64,6 до 5385 раз в зависимости от вида бактерий индигенной микрофлоры. Нативные лактобактерии и бифидобактерии, выделенные из «жидких пробиотических комплексов», а также те же, но инактивированные бактерии, не являются стимуляторами восстановления численности представителей собственной микрофлоры кишечника. Представленные в таблицах 4-6 результаты дают основание полагать, что наиболее существенное положительное влияние на восстановление кишечной микрофлоры конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом оказывает надосадочная жидкость, освобожденная от клеточных элементов лактобактерий и бифидобактерий в процессе центрифугирова- Глава I ПРОБИОТИКИ ность, что послужило основанием для разработки общей схемы получения новых пребиотиков на основе аутостимуляторов роста нормальной микрофлоры кишечника человека [45]. Очевидно, что описанные положительные эффекты компонентов клеточной оболочки микроорганизмов и их экзометаболитов могут быть объяснены тем, что продукты жизнедеятельности микроорганизмов и структурные компоненты клеточной стенки характеризуются высокой питательной активностью и биоусвояемостью [42] и сообщают дополнительные преимущества полезной микрофлоре кишечника [23]. Таким образом, истинная конструктивность идеи профилактического и лечебного применения пробиотиков, по-видимому, стала наполняться новым содержанием [10]. Именно с этой точки зрения следует оценивать полученные нами результаты. Сами по себе гомопробиотические лактобактерии и бифидобактерии, выделенные от белых мышей линии BALB/c, по своему происхождению не являются чужеродными для конвенциональных белых мышей и поэтому способны приживаться в биопленке их кишечника. Получение на основе гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий жидких нативных культур («жидких пробиотических комплексов») позволило в Таблица 4. Влияние нативных культур гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий на скорость восстановления кишечной микрофлоры в целом у конвенциональных белых мышей с антибиотикоассоциированным дисбактериозом Нативные культуры и их компоненты, введенные реr оs Нативная культура («жидкий пробиотический комплекс») Нативные живые клетки Инактивированные клетки Надосадочная жидкость Жидкая питательная среда (контроль) Биоряженка «Целебная радуга» (контроль) Скорость увеличения общего количества кишечной микрофлоры соответственно вводимому пробиотическому микроорганизму … L. plantarum B. bifidum КОЕ•г-1•сут-1 Кратность к контролю КОЕ•г-1•сут-1 Кратность к контролю 4,1•105 41,4 6,8•105 61,8 1,1•104 1,1•103 6,5•107 1,1 0,1 6566 7,2•103 3,6•102 6,9•107 0,7 0,03 6273 9,9•103 1 1,1•104 1 3,6•105 36,4 3,5•105 31,8 Таблица 5. Влияние нативных культур гомопробиотических лактобактерий L. plantarum на скорость восстановления отдельных представителей кишечной микрофлоры у конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом 72 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Нативные культуры и их компоненты, введенные реr оs Нативная культура («жидкий пробиотический комплекс») Нативные живые клетки Инактивированные клетки Надосадочная жидкость Жидкая питательная среда (контроль) Биоряженка «Целебная радуга» (контроль) Скорость восстановления индигенных микроорганизмов… Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Кратность к Кратность к Кратность к КОЕ•г-1•сут-1 КОЕ•г-1•сут-1 КОЕ•г-1•сут-1 контролю контролю контролю 5,8.103 2 4,8 4,3.104 3 33,1 3,5.102 31,8 1 2,0.10 0,21.101 5,4.105 0,2 0,002 450 3,5.10 - 6,4.101 7,0.106 2,7 – 5385 6,2.10 0,16.101 7,1.102 5,6 0,15 64,6 1,2.103 1 1,3.103 1 1,1.101 1 1,4.103 1,2 2,0.104 15,4 1,1.102 10,0 Таблица 6. Влияние нативных культур гомопробиотических бифидобактерий B. bifidum на скорость восстановления отдельных представителей кишечной микрофлоры у конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом Скорость восстановления индигенных микроорганизмов… Нативные культуры и их компоненты, введенные реr оs Нативная культура («жидкий пробиотический комплекс») Нативные живые клетки Инактивированные клетки Надосадочная жидкость Жидкая питательная среда (контроль) Биоряженка «Целебная радуга» (контроль) Бифидобактерии КОЕ•г-1•сут-1 Кратность к контролю 6,1.103 5,6 2 Лактобактерии Эшерихии КОЕ•г-1•сут-1 Кратность к контролю КОЕ•г-1•сут-1 Кратность к контролю 3,7.104 24,7 1,4.102 11,7 1 3 1,5.10 0,14.101 6,9.105 0,1 0,001 627 2,4.10 1,4.101 4,4.106 1,6 0,01 2933 1,7.10 0,23.101 8,6.102 1,4 0,19 71,7 1,1.103 1 1,5.103 1 1,2.101 1 1,2.103 1,1 2,2.104 14,7 1,1.102 9,2 Глава I ПРОБИОТИКИ В связи с этим открывается перспектива исследований, связанных с разработкой регламентированных питательных сред, обеспечивающих при выращивании пробиотических микроорганизмов выработку и накопление в культуральной среде тех или иных экзометаболитов, проявляющих максимальную эффективность в коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике. Документальное подтверждение значения микробных экзометаболитов, активно участвующих в восстановлении кишечной микрофлоры макроорганизма при различных дисбиотических состояниях, дает мощный импульс к развитию новых уникальных технологий выделения из бесклеточных фильтратов или супернатантов биологически активных экзометаболитов, перспективных для конструирования нового класса пробиотических препаратов, лишенных ряда недостатков, присущих современным пробиотикам и в целом пробиотикотерапии. Очевидно, что эти пробиотические препараты будут характеризоваться возросшей эффективностью при существенном снижении антигенной и аллергизирующей нагрузки на макроорганизм. Исчезнет необходимость в поддержании субнулевых температур для сохранения жизнеспособности микроорганизмов, на основе которых создаются современные пробиотики, что может повлиять на сроки хранения новых препаратов в сторону их увеличения. В конечном итоге появится возможность качественной стандартизации разрабатываемых пробиотиков на основе экзометаболитов по норме суточного потребления не живых микроорганизмов, а биологически активных химических соединений. 1. Из кишечного содержимого белых мышей линии BALB/c выделены чистые культуры гомопробиотических лактобактерий (L. plantarum) и бифидобактерий (B. bifidum), изучены их свойства и способность расти в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса с добавлением дрожжевого экстракта, солей и стимуляторов роста. 2. Получены нативные культуры гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий («жидкие пробиотические комплексы») с концентрацией 2,6•109 КОЕ• мл-1 и 8,1•108 КОЕ•мл-1 соответственно, использованные для сравнительной оценки эффективности самих нативных культур и их компонентов в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. 3. Наиболее существенное положительное влияние на восстановление кишечной микрофлоры конвенциональных белых мышей оказывает надосадочная жидкость, освобожденная центрифугированием нативных культур от клеток лактобактерий и бифидобактерий. 4. Скорость восстановления общего содержания микрофлоры в кишечнике животных под воздействием перорального введения надосадочной жидкости относительно контроля возрастает до 6500 раз. Аналогичный стимулирующий эффект надосадочной жидкости установлен и в отношении восстановления численности лактобактерий, бифидобактерий и эшерихий собственной кишечной микрофлоры животных. 5. Полученные результаты являются научной базой экспериментально обоснованной разработки биотехнологий нового класса стандартизованных пробиотических препаратов на основе биологически активных микробных экзометаболитов, лишенных ряда недостатков, присущих современным пробиотическим препаратам, содержащим живые, в том числе лиофилизированные микроорганизмы. сборник научных статей Выводы 73 опытах на конвенциональных белых мышах с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом выявить вклад как нативных культур, так и отдельных их компонентов (нативных и инактивированных микробных клеток, надосадочной жидкости, жидкой питательной среды) в восстановлении кишечной микрофлоры. В обобщенном виде восстановление кишечной микрофлоры выглядит следующим образом. Надосадочная жидкость нативных культур лактобактерий и бифидобактерий оказывает наиболее выраженное стимулирующее действие на кишечную микрофлору, обеспечивая по сравнению с дисбиотическим состоянием увеличение общего содержания микроорганизмов в 1 г фекалий на 4 порядка, а бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий – на 3-4 порядка. При этом скорость восстановления общего содержания микрофлоры в кишечнике животных под влиянием перорального введения надосадочной жидкости относительно контроля увеличивается до 6500 раз. Аналогичный стимулирующий эффект надосадочной жидкости установлен и в отношении восстановления численности лактобактерий, бифидобактерий и эшерихий собственной кишечной микрофлоры. В меньшей степени стимулирующий эффект на рост собственной микрофлоры кишечника выявлен у нативных культур и нативных клеток лактобактерий и бифидобактерий (соответственно, на два и один порядок в сравнении с дисбиотическим состоянием на фоне введения гентамицина или по величине скорости восстановления общего содержания кишечной микрофлоры соответственно в 41,4–61,8 и 0,7-1,1 раза по сравнению с контролем). Инактивированные лактобактерии и бифидобактерии не оказывают положительного влияния на восстановление кишечной микрофлоры. Жидкая питательная среда по оказываемому эффекту сравнима с нативными живыми клетками лактобактерий и бифидобактерий: скорость увеличения общего содержания кишечной микрофлоры под влиянием нативных лактобактерий и бифидобактерий превышает контроль соответственно в 1,1 и 0,7 раза. Кисломолочный продукт биоряженка «Целебная радуга», содержащий лактобактерии и бифидобактерии, по эффективности восстановления собственной кишечной микрофлоры (в том числе скорости увеличения количества кишечной микрофлоры) белых мышей сравним с нативными культурами гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий, но уступает по этим показателям надосадочной жидкости. Таким образом, в прямых опытах на конвенциональных белых мышах с экспериментальным антибиотикоассоциированным дисбактериозом впервые установлено, что основной вклад в эффективность пробиотических препаратов вносят продукты жизнедеятельности микроорганизмов – экзометаболиты, а микробные клетки, их продуцирующие, не участвуют в восстановлении микробиоценоза кишечника. Кроме того, чужеродные микробные клетки являются для макроорганизма мощной антигенной и аллергенной нагрузкой, выделяя при разрушении токсические субстанции (эндотоксин – ЛПС в случае грамотрицательных бактерий), что может привести к усугублению нарушений микробиоценоза кишечника и возникновению сопутствующих заболеваний [12, 46]. Можно без преувеличения говорить о том, что полученные результаты являются основой для экспериментально обоснованной разработки новых пробиотических препаратов, в состав которых войдут экзометаболиты микроорганизмов. Глава I ПРОБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 74 ЛИТЕРАТУРА 1. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины. Вестн РАМН 1997; (3): 4-7. 2. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры. Вестн РАМН 1997; (3): 7-10. 3. Парфенов А.И. Клинические проблемы дисбактериоза. Рос гастроэнтерол журнал 1999; (4): 49-55. 4. Воробьев А.А., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А., Григорьев А.В., Мацулевич Т.М. Микроэкологические нарушения при клинической патологии и их коррекция бифидосодержащими пробиотиками. Вестн РАМН 2004; (2): 13-17. 5. Маев И.В., Самсонов А.А. Терапевтическая тактика при синдроме избыточного бактериального роста в тонкой кишке. Consilium medicum 2008; 9(7): 44-50. 6. Tillman R., King C., Toskes P. Continued experience with the xylose breath test: Evidence that the small bowel culture as a gold standart for bacterial overgrowth may be tarnished. Gastroenterology 1981; 80: 1304 7. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей; М: ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации; 2010; 50 с. 8. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91599.11.0004-2003), утвержден приказом № 231 МЗ РФ от 09.06.2003 г. М: 2003. 9. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании; М: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010; 23 с. 10. Lebenthal E., Lebenthal Y. Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего признания. Журн микробиол 2003; (4): 88-90. 11. Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Пробиотики и функциональное питание. Микроэкологические аспекты. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Материалы Всероссийской конференции с международным участием; 21-23 апреля 1999 г; М: 1999; с. 23-24. 12. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 3: Пробиотики и функциональное питание; М: Издательство ГАРАНТЪ, 2001; 289 с. 13. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. М: Медицина 1969; с. 152-219. 14. Малахов Ю.А. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Материалы Всероссийской конференции с международным участием; 21-23 апреля 1999 г; М: 1999; с. 110. 15. Козьминых Ю.В., Малков А.В., Марков А.В. Подбор и конструирование питательных сред для производства жидких пробиотиков. Сборник материалов Международной научно-практической конференции, посвященной памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования»; Москва: 2002; с. 77-78. 16. Глушанова Н.А. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: дис. д-ра мед. наук: защищена в 2006 г. М: 2006; 260 с. 17. Ефимов Б.А. Дисбактериозы кишечника и их коррекция кисломолочными продуктами, приготовленными с использованием индигенных микроорганизмов: автореф. дис. канд. мед. наук: защищена в 1993 г. М.: 1993; 24 с. 18. Петров Л.Н. Витафлор. Бактерийный препарат нового поколения для лечения и профилактики дисбактериозов. СПб: СанктПетербургская торгово-промышленная палата, 2003; 68 с. 19. Суворов А.Н. Дисбактериоз с позиций современной медицинской микробиологии. Тезисы докладов научной конференции «Актуальные проблемы дисбактериозов» Барнаул, 1997; с. 3-8. 20. Вахитов Т.Я., Момот Т.Н., Шалаева О.Н., Петров Л.Н. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escheriсhia соli М-17. Журн микробиол 2003; (6): 20-25. 21. Lankford C.E., Walker V.R., Reeves V.B., Nabbut N.H., Byers B.R. Inoculum-dependent division lag of Bacillus cultures and its relation to an endogenous factors («schizokinen») J Bacteriol 1966; 57(3): 620-626. 22. Larkin M. Probiotics strain for credibility Lancet 1999; 354 (9193): 1884. 23. Захаренко С.М., Фоминых Ю.А., Мехтиев С.Н. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром. Эффективная фармакотерапия Гастроэнтерология 2011; 3: 14-20. 24. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника. Вестн РАМН 1966; (2): 60-65. 25. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дурнев Е.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных. Журн инфектологии 2012; 4 (1): 68-74. 26. Панин А.Н., Малик Н.И. Селекция штаммов для изготовления пробиотика ветеринарного назначения. Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. Сборник материалов международной научной конференции; 2-4 июня 2004 г; М: 2004; с. 18-10. 27. Заявка на выдачу патента РФ. Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных. И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский, И.А. Лундовских; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», № 2011149501/17 (074291); заявл. 15.12.2011. 28 Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры. Русский мед. журн. 2000. Т. 8 (№ 13-14). С. 572-575. 29. Potter M. History of the BALB/c family. The BALB/c monse: Genetic and Immunology. Cur Top Microbiol Immunol 1985; 122: 1-15. 30. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. СПб: Центр госсанэпиднадзора, 2002; 31 с. 31. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн микробиол 1992; (9-10): 74-78. 32. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 33. Определитель бактерий Берджи: Девятое издание в 2 т. Т.2. Под ред Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. Пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина; М: Мир, 1997; 368 с. 34. Заявка на выдачу патента РФ. Способ оценки воздействия экзогенных факторов на микрофлору кишечника. И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский, И.А. Лундовских, С.Н. Янов; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», № 2012101059/17 (001468); заявл. 11.01.2012. 35. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека. Эксп клин гастроэнтерол 2011; (3): 6-11. 36. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Ердякова А.С., Погорельский И.П., Лундовских И.А.Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro. Эксп клин гастроэнтерол 2011; (9): 96-101. 37. Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Выживаемость бифидобактерий и лактобактерий в условиях in vitro в желудочном соке и дуоденальном содержимом людей. Журн инфектологии 2012; (1): 57-59. 38. Probiotics: a critical review. Ed. Tannok G.W. Wymondham (United Kingdom): Horizont Scientific press, 1999. 39. Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю., Петров Л.Н., Королюк А.М. Изучение действия препарата аутостимуляторов роста Escheriсhia соli М-17 (препарат «Актофлор») на рост чистых и смешанных культур бактерий. Журн микробиол 2000; (3): 88-90. 40. Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Эффективная фармакотерапия Гастроэнтерология 2011; (3): 77-85. 41. Семенов А.В. Способ повышения антагонистической активности бактерий. Вестник ОГУ.2007; (6): 100-103. 42. Патент РФ 2397246 С1 Комплексный обогатитель пищевого продукта. Б.А. Шендеров, Я.В. Иванова, И.М. Сорокина. Патентообладатель ООО «Бактотех», Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, РОСНАУКА. заявка: 2009123993/13, 24.06.2009, опубл. 20.08.2010. 43. Семенов А.В. Условия выявления микробной стимуляции антагонистической активности пробиотиков. Вестник ОГУ 2009; (12): 115-117. 44. Бухарин О.В., Перунова Н.П. Микробное распознавание «свой-чужой» в условиях кишечного микросимбиоза человека. Журн микробиол 2011; (6): 46-51. 45. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Биотехнология: разработка новых пребиотиков на основе аутостимуляторов роста нормальной микрофлоры человека (цитировано 22.02.12). Адрес доступа: aidsconference.spb.ru/cgi-bin/sort.pl?ses=10&abs=3&year=5&ang=rus. 46. Salminen M.K., Rautelin H., Tynkkynen S., Poussa T., Saxelin M., Valtonen V., Jarvinen A. Lactobacillus bacteremia, species, identification, and antimicrobial susceptibility of 85 blood isolates. Clin Infect Dis 2006; 42: 35-44. ПРЕБИОТИКИ КОРРЕКЦИЯ И ПРОФИЛАКТИКА ДИСБАКТЕРИОЗА. НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОЙ СИСТЕМЫ* Глава II ПРЕБИОТИКИ Глава II Причины дисбактериоза В симбиозе с организмом человека существует 1014 (сто биллионов) клеток микроорганизмов (в 100 раз больше количества собственных клеток человека). Практически ни один биохимический процесс, ни одна функция организма не обходятся без их прямого или опосредованного участия, то есть это главный биогенный фактор, определяющий здоровье или развитие заболеваний. Как поддерживать нормальный биоценоз человеческого организма, как корректировать его изменения? Этим вопросам был посвящен симпозиум «Новые подходы к терапии заболеваний желудочно-кишечной системы». Увеличение частоты и тяжести острых инфекционных заболеваний, латентное течение и хронизация воспалительных процессов, которые многими специалистами связываются с нарушениями нормальной микрофлоры, или дисбактериозами, заставляют клиницистов искать новые и эффективные приемы их коррекции. В числе докладчиков были выдающиеся специалисты в этой области: заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Н.М. ГРАЧЕВА, д.м.н., профессор М.Д. АРДАТСКАЯ и др. В докладах подчеркивалось, что дисбактериоз – это синдром, сопутствующий многим патологическим состояниям. Это означает, что дисбактериоз является следствием патологического процесса. Поэтому начинать надо с патогенетического лечения основной патологии. Так, при синдроме раздраженного кишечника в первую очередь необходимо проводить мероприятия, направленные на коррекцию моторноэвакуаторной функции кишечника (применение миотропных спазмолитиков, блокаторов Na/Са-каналов и т.д.); при воспалительных заболеваниях кишечника, в частности НЯК, – на купирование воспаления (препараты 5-АСК или глюкокортикоидные гормоны и т.д.). В ряде случаев правильно назначенное лечение основного заболевания уже приводит к нормализации кишечного микробиоценоза или способствует его восстановлению. Так, М.Д. Ардатская считает, что «при купировании моторноэвакуаторных расстройств кишечника происходит восстановление окислительновосстановительного Н.М. Грачева, руководитель потенциала внутрипоклинического отдела ФГУН лостной среды, что, в МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского свою очередь, способпроф. ствует повышению активности и численности облигатных микроорганизмов и приводит к нормализации баланса аэробных и анаэробных популяций микроорганизмов». И еще один ключевой момент: «выбор терапии должен быть корректным и направлен на то звено нарушенной регуляции, которое утратило возможность самовосстановления». Известно, что для коррекции, профилактики и регуляции кишечного микробиоценоза сегодня используются пробиотики (бифидо- и лактобактерии, энтерококки); пребиотики (неперевариваемые вещества, стимулирующие активность определенных микроорганизмов); синбиотики (комбинация пробиотиков и пребиотиков); микробные метаболиты. В последнее время ученые и клиницисты все чаще затрагивают проблему эффективности таких распространенных препаратов, как пробиотики. Безопасность их использования – достаточно хорошо установленный факт. Но, к сожалению, с расширением спектра показаний для их назначения стала появляться информация о том, что их положительный эффект даже при длительном применении нередко носит транзиторный характер, а порой и полностью отсутствует. Одной из главных причин этих «провалов» многие авторы считают чужеродность для че- * Ссылка для цитирования: Сателлитный симпозиум. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Новые подходы к терапии заболеваний желудочно-кишечной системы. Под ред. Н.А.Токаревой. Эффект. фармакотерапия. Гастроэнтерология.- 2011.- №3.С. 77-84. 75 Гастроэнтерологический симпозиум «Новые подходы к терапии заболеваний желудочно-кишечной системы», проходивший в рамках Российского национального конгресса «Человек и лекарство», привлек внимание самых разных специалистов – терапевтов, педиатров, врачей общей практики. Интерес к этой тематике связан с тем, что существуют теснейшие связи между нарушениями микробиоценоза кишечника и органическими или функциональными патологиями не только желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), но и других органов и систем организма. сборник научных статей Материалы медфорума подготовила Н.А. Токарева Глава II ПРЕБИОТИКИ ловека входящих в их состав микроорганизмов, высокую видовую, индивидуальную и анатомическую специфичность автохтонной микрофлоры пациентов. Некоторые специалисты считают, что коллективный иммунитет биопленки практически сводит на нет результат коррекции дисбактериозов пробиотиками. Несомненно, они создают эффект, но не всегда и не такой, как предполагалось. Микробы, выращенные искусственно, являются инородными, как инородны пересаживаемые человеку органы и ткани других людей – доноров – или животных. Они отторгаются вследствие биологической несовместимости. Есть проблемы и у биотехнологических пробиотиков – они «не имеют “пароля” для входа микробов внутрь биопленки кишечника и поэтому пребывают в нем транзиторно, как микрофлора пищи». Кроме того, широкое лечебно-профилактическое применение пробиотиков имеет еще ограничивающий фактор – экономический, связанный с высокой стоимостью препаратов. Представления об уникальности индивидуального микробного или штаммового пейзажа микрофлоры человека привели в последние годы к разработкам концепции создания индивидуальных пробиотиков на основе аутоштаммов и аутоассоциаций симбиотических микроорганизмов. 76 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Пребиотики для нормализации микрофлоры кишечника В последнее время для профилактики и коррекции микроэкологических нарушений в пищеварительном тракте все шире стали использоваться пребиотики (термин появился в начале 1990-х гг.). Это препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина путем селективной стимуляции роста или активизации метаболической функции нормальной микрофлоры. Пребиотики относятся к различным фармакотерапевтическим группам (пищевые волокна – целлюлоза, гемицеллюлоза, пектины; олигосахариды – 2–10 углеводных остатков природного или синтетического происхождения), но обладают общим свойством – селективно стимулировать рост и развитие нормальной микрофлоры кишечника. Особенно популярные среди этих препаратов – поли- и олигофруктаны, соевые олигосахариды, галактоолигосахариды, получаемые из природных источников или с помощью биотехнологических или синтетических методов. Сегодня существует широкий спектр препаратов для коррекции, профилактики и регуляции кишечного микробиоценоза. Врач общей практики, к которому в первую очередь обращается пациент с проблемами, так или иначе связанными с дисбактериозом, должен хорошо ориентироваться во всех этих новинках, предлагаемых производителем. И главным «путеводителем» для специалиста должны быть серьезные сравнительные клинические исследования. Эффективность современных препаратов Сравнительной оценке клиникобактериологической эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта был посвящен доклад заслуженного деятеля науки РФ, д.м.н., профессора, руководителя клинического отдела Н.М. Грачевой и ее коллег из МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского А.А. Авакова и А.И. Соловьевой. Профессор кафедры гастроэнтерологии Учебно-научного медицинского центра Управления делами Президента РФ, д.м.н. М.Д. Ардатская рассказала об исследовании по сравнению эффективности Стимбифида, Линекса и Лактусана на основе результатов изучения метаболитов индигенной микрофлоры кишечника. Не противопоставляя пробиотики (с усовершенствованием биотехнологических процессов появились препараты, обладающие высокой клинической эффективностью) и пребиотики, докладчики напомнили слушателям, что «крайне важной является необходимость восстановления собственной микрофлоры кишечника, в частности бифидофлоры, а не вынужденное заселение его чужими штаммами». Оба доклада были выстроены на данных последних (2010 г.) клинико-лабораторных исследований эффективности современных препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта. При исследованиях обращалось особое внимание на корригирующее действие пребиотиков Стимбифида и Лактусана (лактулоза), а также пробиотика Линекса на микробиоценоз кишечника. Сравнительному изучению подлежали динамика клинических проявлений, бактериологическая картина содержимого кишечника, биохимические аспекты жизнедеятельности кишечной микрофлоры. Также изучалось количественное и качественное содержание метаболитов индигенной микрофлоры (короткоцепочечных жирных кислот – КЖК) в кале у пациентов на фоне приема этих препаратов. Результаты проведенных бактериологических исследований показали, что у больных до начала лечения в 100% случаев был выявлен дисбактериоз кишечника (1–3-й степени выраженности). После окончания курса лечения (2 недели) Стимбифидом у 30% пациентов отмечались нормальные показатели кишечной флоры; у 70% – слабо выраженные явления дисбактериоза 1-й степени. Содержание микроорганизмов индигенной микрофлоры в фекалиях значительно возросло (бифидобактерии: до 108 у 80%, до 109 у 20%; лактобактерии: до 106 у 55%; E. сoli: до 108 у 60% пациентов), а выделение условнопатогенных микроорганизмов (гемолизирующих эшерихий, клебсиелл, стафилококков, цитробактеров, грибов рода Candida) полностью прекратилось. У пациентов, получавших лечение Линексом, до начала лечения дисбактериоз кишечника (1-й и 2-й степени) был выявлен в 95% случаев; после окончания курса лечения (2 недели) число пациентов с дисбактериозом кишечника сократилось до 30%, у 70% наблюдалась нормализация микрофлоры. При этом (в отличие от применения Стимбифида) значительно возросло количество лактобактерий (до 106 у 45%, до 107 у 50% пациентов), умеренно – бифидобактерий (до 108 у 80%, до 109 у10% пациентов) и E. coli (до 108 у 90% пациентов). В то же время в отношении элиминации условно-патогенных микроорганизмов на фоне и после окончания терапии получены худшие результаты, чем у Стимбифида. На фоне терапии Лактусаном также наблюдались положительные сдвиги со стороны кишечной микрофлоры, хотя и в значительно меньшей степени – отмечено лишь исчезновение случаев выраженного дисбактериоза 3-й степени и возрастание числа лиц с 1-й степенью дисбактериоза. Влияние Лактусана на содержание индигенных микроорганизмов проявилось лишь незначительным увеличением количества бифидобактерий (до 108 у 45%). Одновременно с первым этапом изучалось (методом ГЖХ-анализа) количественное и качественное содержание КЖК – исходно, на 7-й и 14-й дни. Данные исследования показывали, что до лечения во всех подгруппах отмечается достоверное снижение суммарного абсолютного содержания кислот – признак сниженной активно- Эффективность Стимбифида в терапии у детей В ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (заместитель директора по научной работе,членкорреспондент РАМН, д.м.н., профессор Н.А. Семина) было проведено клиническое исследование эффективности Стимбифида в комплексной терапии острых кишечных инфекций (ОКИ) у детей. Дело в том, что по распространенности ОКИ стоят на втором месте после острых респираторных вирусных заболеваний, причем наиболее высокая заболеваемость регистрируется у детей раннего возраста: 2,46 случая заболевания в год на 1 ребенка в возрасте до 3 лет. По данным Глава II ПРЕБИОТИКИ сборник научных статей лериановой (изоС5/С6) и уровень изокислот (изоСн), образующиеся в результате жизнедеятельности микроорганизмов, утилизирующих пептиды. Исходно у пациентов эти параметры были повышены, что свидетельствовало о чрезмерной протеолитической активности условнопатогенных микроорганизмов. Результаты терапии красноречиво показали, что у всех пациентов наблюдались нормализация (или тенденция к ней) процессов протеолиза и естественная элиминация остаточных микроорганизмов. Но эффективность этих процессов более выражена у тех больных, кто принимал Стимбифид. Выступавшие представили данные по сравнительной оценке розничной стоимости тестируемых препаратов (из расчета на двухнедельный курс). В августе прошлого года курс Стимбифида пациенту обходился в 259 рублей, Лактусана – в 279 рублей, а Линекса – в 978 рублей! И это при том, что, по мнению ученых, все три препарата являются эффективными средствами для восстановления нарушений микробиоценоза кишечника, но при применении Стимбифида наблюдается наиболее отчетливый положительный клинический эффект (менее выраженный – у Лактусана). Докладчиками было подчеркнуто, что на фоне лечения Стимбифидом выделение из кишечника условнопатогенных микроорганизмов полностью прекратилось, а при использовании Линекса и Лактусана – сохранялось. В отличие от применения Линекса и Лактусана, проведение 2-недельного курса Стимбифида приводило к длительному – до 2 месяцев – пребиотическому эффекту после лечения. После проведенного курса лечения у пациентов отмечалось плавное нарастание суммарного абсолютного содержания КЖК, но наиболее выраженное было у тех, кто получал Стимбифид. При использовании Стимбифида отмечается более выраженная динамика повышения метаболической активности облигатной микрофлоры, в том числе бифидои лактобактерий (по сравнению с «заселяемыми извне» микроорганизмами пробиотика). Стимбифид в равной степени эффективно корригирует различные типы нарушений (анаэробный и аэробный) состава микроорганизмов, в то время как Линекс максимально эффективен при I типе, а Лактусан – при II. Таким образом, был сделан вывод, что Стимбифид, Линекс и Лактусан являются эффективными средствами для восстановления нарушений микробиоценоза кишечника. Эффект от их применения (по ряду показателей, характеризующих восстановление качественного состава микроорганизмов, баланса аэробных/анаэробных популяций микроорганизмов, восстановления внутрипросветной среды обитания, процессов протеолиза) отмечается к 7-му дню использования. Докладчики подчеркнули, что они считают целесообразным использование пребиотиков в постоянном режиме, а также сочетанный курсовой прием с пробиотиками для достижения максимального эффекта лечения и профилактики нарушений микробиоценоза кишечника. 77 сти (или численности) облигатной микрофлоры. А после курса лечения тремя исследуемыми препаратами начинается его плавное увеличение, которое достигает своего максимума к 14-му дню лечения. Наиболее выраженным этот показатель был в группе пациентов, принимавших Стимбифид. Докладчики подчеркивали еще один интересный момент: исходно М.Д. Ардатская, профессор кафедры гастроэнтерологии ФГУ можно было выделить 2 «Учебно-научный медицинский типа изменения профиля центр» УД Президента РФ КЖК: I тип – повышение относительного содержания пропионовой (С3) и масляной кислот (С4) (по сравнению с контролем), II тип – рост количества уксусной кислоты (С2). Это связано с резкой активизацией анаэробных микроорганизмов (бактероидов, пропионибактерий, фузобактерий, эубактерий и клостридий, продуцирующих С3 и С4, или аэробных микроорганизмов, продуцирующих С2), которые представляют факультативную и остаточную микрофлору. Значения анаэробных индексов (АИ – отношение суммы концентраций пропионовой и масляной кислот к концентрации уксусной кислот) показывают изменения среды обитания микрофлоры в пользу либо анаэробов (I тип), либо аэробов (II тип). У пациентов с I типом изменения профиля кислот к 7-му дню лечения препаратом Стимбифид (АИ +0,135 ед.) происходила нормализация уровня С3, отмечались достоверное снижение уровня С4 и повышение уровня С2. У пациентов, принимавших Линекс (АИ +0,064 ед.) и Лактусан (АИ +0,56 ед.), с аналогичными изменениями профиля кислот к этому же периоду наблюдались достоверное снижение уровня С4, тенденция к повышению уровня С2, а также к снижению содержания С3. К концу терапии (14-е сутки) у пациентов (I тип), принимавших Стимбифид (АИ +0,170 ед.) и Линекс (АИ +0,191 ед.), профиль С2– С4 кислот нормализовался, что свидетельствовало о восстановлении соотношения аэробных/анаэробных популяций бактерий. У пациентов, принимавших Лактусан (АИ +0,126 ед.), хотя и наметился прогресс, однако нормальных значений данные параметры не достигали, следовательно, факультативные анаэробные микроорганизмы все еще сохраняли повышенную активность. Разность этих значений с нормой: Стимбифид +0,018 ед.; Линекс +0,190 ед.; Лактусан + 0,055 ед. В подгруппе пациентов со II типом к концу лечения Стимбифидом также наблюдалась нормализация профиля С2–С4, а вот у Линекса результаты хуже – отмечена нормализация уровня С3 при достоверно положительных изменениях относительного содержания С2 и С4 (но не значений нормы). При приеме Лактусана происходила нормализация уровней С2 и С3 при достоверном положительном изменении содержания С4. Разность значений АИ с нормой: Стимбифид + 0,011 ед.; Линекс + 0,059 ед.; Лактусан + 0,030 ед., что свидетельствует о восстановлении среды обитания индигенной микрофлоры (при приеме Стимбифида и Лактусана) или о тенденции к ее восстановлению в случае с Линексом. Учеными также были рассмотрены отношение абсолютного содержания изовалериановой кислоты к ва- Глава II ПРЕБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 78 ВОЗ, ежегодно в мире от ОКИ и их осложнений умирают более 5 млн детей. В патогенезе острых кишечных инфекций особое место занимает нарушение нормальной микрофлоры кишечника, регистрируемое у 95–97% больных. Поэтому в комплексной терапии ОКИ особое место следует отводить своевременной и эффективной коррекции дисбиотических нарушений – применению пробиотических и пребиотических препаратов. Но в остром периоде ОКИ пробиотики оказались эффективными только в отношении ротавирусной инфекции, а при бактериальных кишечных инфекциях результаты были неоднозначными. Исследователи из ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора в комплексной терапии ОКИ бактериальной природы использовали пребиотик Стимбифид. Под наблюдением находились 60 детей, больных ОКИ (от 6 месяцев до 6 лет). Сопоставив динамику клинических симптомов ОКИ, исследователи установили, что включение Стимбифида в схему терапии основной группы детей с первых дней заболевания позволило быстрее купировать гастроинтестинальные симптомы. При этом специалисты отметили хорошую переносимость препарата (как в монотерапии, так и в комбинации с Бифидумбактерином), а также отсутствие каких-либо негативных побочных, в том числе аллергических, реакций. При монотерапии Стимбифидом было отмечено повышение клинической эффективности на 20%, а также улучшение микроэкологического пейзажа, в том числе восстановление нормального уровня бифидобактерий у 50% больных, нормальной кишечной палочки – также у 50% пациентов. Положительные изменения в составе облигатной микрофлоры способствовали элиминации E. coli с измененной ферментативной активностью у 30% пациентов, Staphylococcus aureus – у всех больных этой группы, уменьшению уровня дрожжевых грибов – у 30%. Еще более явный эффект был достигнут у пациентов, принимавших Стимбифид в комплексе с препаратом бифидобактерий: дефицит бифидобактерий ликвидирован у 70% больных, нормализация уровня E. coli достигнута у 50% детей, а также у всех пациентов – полная элиминация условнопатогенных бактерий (клебсиелла, цитробактер) и St. aureus. В группе пациентов, принимавших только пробиотик, содержащий бифидобактерии, у 60% детей сохранялся дефицит лакто- и бифидобактерий, уровень нормальной кишечной палочки не изменился, как и количество дрожжевых грибов и St. aureus. После окончания лечения среди детей, получавших Стимбифид, не было выявлено ни одного пациента с 3-й степенью дисбактериоза (для сравнения: в группе, получавшей пробиотик в виде монотерапии, выраженность микроэкологических нарушений не изменялась и не было ни одного случая восстановления эубиоза). Резюмируя полученные результаты, исследователи отметили: «Включение в комплексную терапию ОКИ у детей 1–12 лет Стимбифида в возрастных дозировках курсом не менее 14 дней повышает эффективность терапии и способствует сокращению длительности диарейного синдрома и метеоризма. Использование Стимбифида в остром периоде ОКИ у детей (как в виде монотерапии, так и в сочетании с препаратом бифидобактерий) оказывает положительное влияние на состояние микроэкологии толстой кишки, обеспечивая восстановление нормального уровня бифидобактерий, повышение уровня нормальной кишечной палочки, а также элиминацию условно-патогенных микроорганизмов. Для повышения эффективности биоценозкорригирующего потенциала монотерапии Стимбифидом необходимо увеличение длительности курса приема препарата до 30 дней». В многочисленных медицинских исследованиях показано, что фруктоолигосахариды, содержащиеся в Стимбифиде, не только прекрасно защищают и восстанавливают микрофлору кишечника, но и на 20% увеличивают усвоение кальция, что особенно важно для детей в период формирования скелета. Они эффективно повышают иммунитет, снижая О.Н. Минушкин, главный частоту респираторных гастроэнтеролог Главного и вирусных инфекций, медицинского управления УД улучшают умственную Президента РФ, проф. деятельность и общее самочувствие, способствуют нормализации массы тела. Стимбифид рекомендован к применению с 6 месяцев жизни и практически не имеет противопоказаний. Коррекция заболеваний легких Стимбифидом Выступавшая на симпозиуме с докладом профессор М.Д. Ардатская рассказала о клинических испытаниях Стимбифида, проведенных в Учебно-научном медицинском центре Управления делами Президента РФ. Этот пребиотик показал высокую клиническую эффективность в коррекции нарушений микробиоценоза у пациентов с хроническими и острыми заболеваниями легких на фоне и после проведения антибактериальной терапии (АБТ). Было проведено несколько исследований. К примеру, ученые рассматривали возможности препарата в группе здоровых лиц, но с выявленным дефицитом облигатной флоры (бифидобактерий – в 50%, лактобактерий – в 30% случаев). Результаты бактериологического исследования были весьма показательными: после 18 дней приема отмечено повышение количества бифидобактерий до нормальных значений у 4 человек (из 5), лактобактерий – у 3 (из 3). У 1 человека со сниженной численностью бифидобактерий их количество возросло на 1 порядок (с 106 до 107). Повышения числа микроорганизмов остаточной флоры не было выявлено ни у одного человека. ГЖХ-анализ показал повышение абсолютного содержания кислот, что также говорит о восстановлении численности и активности облигатных представителей толстокишечной микрофлоры. Второе исследование включало две группы больных (обострение хронического бронхита и острые пневмонии) с разными вариантами лечения: 2А – Стимбифид на фоне антибактериальной терапии (АБТ); 2Б – группа сравнения (только антибактериальные препараты). Основу схем лечения в обеих группах составили антибактериальные средства широкого спектра действия в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов (полусинтетические пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды). У 86,7% и 90% больных исходно были выявлены симптомы кишечной диспепсии, в основном связанные с предшествующим приемом антибиотиков, сопутствующей патологией и т.д. У пациентов 2А группы на фоне 10-дневного курса лечения, кроме эффекта терапии основного заболевания, отмечены положительные сдвиги в клинической симптоматике: болевой симптом купирован у 13,3% (исходно – 26,7%), урчание – у 33,3% (исходно – 40%), метеоризм – у 26,7% (исходно – 40%). Нормализовалась консистенция стула и частота дефекаций у 46,7% (исходно – 67,7%); Глава II ПРЕБИОТИКИ ласть резко отрицательных значений (-0,681 и -0,644 ед. соответственно). По мнению М.Д. Ардатской, «данный феномен может быть объяснен косвенным воздействием на микрофлору, обусловленным легочной патологией (развитие гипоксии), за счет изменения циркуляции водорода. Неполное высвобождение Н2 в легких, обусловленное наличием патологии, приводит к возврату и накоплению его в полости кишечника. Это, в свою очередь, вызывает смещение окислительно-восстановительного потенциала внутрипросветной среды в сторону резко отрицательных значений, при которых блокируются ферредоксинсодержащие ферменты, обеспечивающие жизнедеятельность облигатных анаэробов. На этом фоне начинают активно продуцировать условнопатогенные анаэробы, в частности штаммы условно-патогенных бактероидов». На фоне проводимой комплексной терапии у больных группы 2А была отмечена тенденция к повышению абсолютной концентрации КЖК (тенденции к восстановлению микробиоценоза кишечника), при этом в группе 2Б она практически не изменялась на фоне лечения АБ. В основной группе явно просматривалась тенденция к формированию нормального профиля кислот: достоверно повышались доли уксусной и масляной кислот при снижении доли пропионовой кислоты. АИ смещались в сторону нормальных значений. А в группе 2Б увеличивалась доля пропионовой кислоты, возрастало содержание масляной кислоты (за счет активизации остаточной анаэробной микрофлоры и, в частности, условно-патогенных штаммов рода Clostridium). Соответственно, значения АИ отклонялись в более отрицательные области, то есть дисбаланс между аэробными/анаэробными популяциями микроорганизмов нарастал. В серии следующих испытаний подобным образом была оценена эффективность Стимбифида в коррекции микроэкологических нарушений, возникших вследствие АБТ. Специалисты и пациенты высоко оценили этот пребиотик. «Можно констатировать высокую эффективность Стимбифида в качестве средства профилактики и коррекции нарушений микробиоценоза. Препарат эффективно стимулирует рост числа бифидобактерий у практически здоровых лиц как с измененным составом кишечной микрофлоры, так и без него. Он является препаратом, который обеспечивает профилактику и коррекцию дисбиотических нарушений во время проведения антибактериальной терапии и после нее. Происходят положительные сдвиги в составе экосистемы толстой кишки, заключающиеся в изменении метаболической активности и родового состава толстокишечной микрофлоры, нормализации анаэробно-аэробных взаимоотношений, восстановлении внутриполостного окислительно-восстановительного потенциала внутрипросветной среды. Этот пребиотик устраняет явления кишечной диспепсии, опосредованно приводит к устранению болевого синдрома и восстановлению двигательной активности кишечника. Он характеризуется хорошей переносимостью и отсутствием побочных эффектов. Все это позволяет рекомендовать Стимбифид для применения с целью стимуляции роста облигатной флоры у практически здоровых лиц, а также для профилактики и восстановления нарушений микробиоценоза, связанных с проведением антибактериальной терапии». сборник научных статей Стимбифид и микроэкологические нарушения 79 периодическое послабление сохранилось после лечения у 13,3%. Время транзита карболена по пищеварительному тракту увеличилось с 14,5 ± 4,5 ч до 19,3 ± 3,7 ч. В группе сравнения 2Б отмечалось нарастание симптомов кишечной диспепсии после проведения АБТ. Болевой симптом констатирован у 30% (исА.А. Аваков, старший научный ходно – 20%), урчание сотрудник клинического отдела ФГУН МНИИЭМ – у 7 человек (исходно им. Г.Н.Габричевского – у 4), метеоризм – у 6 человек (исходно – у 4). Кашицеобразный стул и увеличение частоты дефекаций зафиксированы у 80% (исходно – у 60%). Патологические примеси в кале (слизь) выявлены у 40% (исходно – 20%). Исходно у пациентов обеих групп бактериологическое исследование показало в составе микрофлоры (главной, факультативной и остаточной) толстой кишки снижение количества бифидо- и лактобактерий (100% в обеих подгруппах); появление кишечной палочки с измененными свойствами (лактозонегативной, гемолитической) – у 40% (2А) и у 70% (2Б); факультативных и условно-патогенных энтерококков – у 53,3% (2А) и 60% (2Б); золотистого стафилококка – у 2 пациентов из каждой подгруппы; повышенного количества клостридиальной флоры – у 33,3% (2А) и 40% (2Б); грибов рода Candida – у 40% (2А) и 70% (2Б). А вот ситуация после лечения: у пациентов основной (2А) группы отмечено: увеличение количества облигатной флоры (бифидобактерий, лактобактерий) – у 46,7%, нормализация – у 13,3%, уменьшение выявления неполноценной и гемолизирующей кишечной палочки – у 20%, клостридий – у 20%. Уменьшилось также количество условно-патогенных энтеробактерий у 26,7% и грибов рода Candida у 40%. В группе 2Б: микробиологический статус сохранился или имел тенденцию к ухудшению показателей – дальнейшее снижение количества облигатной молочнокислой флоры, сохранилась (или увеличилась у 30% пациентов) частота выявления неполноценной и гемолизирующей кишечной палочки, клостридий, условно-патогенных энтеробактерий, грибов рода Candida. Исходно в группе 2А 1-я степень дисбактериоза констатирована у 6,7% больных, 2-я степень – у 73,3%, 3-я степень – у 20%. После комплексного лечения: 1-я степень установлена у 33,3%, 2-я – у 53,3%, 3-я – у 13,4%. Исходные показатели в группе 2Б: 1-я степень констатирована у 10% больных, 2-я степень – у 70%, 3-я степень – у 20%. После проведения АБТ: 1-я степень – 10%, 2-я – 50%, 3-я – 40%. Методом газо-жидкостного хроматографического анализа были исследованы КЖК в кале больных исследуемых подгрупп до и после курсов лечения. Результаты изучения абсолютного содержания КЖК (С2–С6) также оказались вполне предсказуемыми. Исходно абсолютная концентрация КЖК у больных была снижена в 2,5–3 раза по сравнению с нормой. Более того, при заболеваниях легких исходно наблюдалось изменение профиля С2–С4, выражающееся в снижении доли уксусной и масляной кислот и повышении доли пропионовой кислоты. Значения АИ отклонены в об- Глава II ПРЕБИОТИКИ ФРУКТООЛИГОСАХАРИДЫ И ФРУКТОПОЛИСАХАРИДЫ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ С ЯВЛЕНИЯМИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА* Грачева Н.М.1, Малышев Н.А.2, Чичерин И.Ю.3, Аваков А.А. 1, Партин О.С.1, Щербаков И.Т.1, Соловьева А.И.1, Герасимова Н.В. 2 1 Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора; 2Инфекционная клиническая больница №1 г. Москвы; 3ООО «МедСтар», Московская обл., Сергиево-Посадский район, п/о Тураково FRUCTOOLIGOSACCHARIDES AND FRUCTOPOLYSACCHARIDES IN A COMPLEX TREATMENT OF PATIENTS WITH GASTRO-ENTERIC DISEASES WITH SIGNS OF ENTERIC DYSBIOSIS N.M.Gracheva1, N.A.Malyshev2, I.Yu.Chicherin3, A.A.Avakov1, O.S.Partin1, I.T.Shcherbakov1, A.I.Solov’eva1, N.V.Gerasimov2 80 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 1 G.N.Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Federal Supervision Service for Consumer Rights Protection and People’s Welfare; 2 Moscow Infectious Clinical Hospital No.1; 3 «MedStar, Ltd.», Moscow region, Sergievo-Posadskiy district, Turakovo РЕЗЮМЕ SUMMARY Проведена клинико-лабораторная оценка эффективности нового отечественного пребиотика Стимбифид на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов растительного происхождения. Отмечен положительный эффект препарата в комплексной терапии взрослых больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), выражающийся в более быстром купировании диспептического синдрома и лабораторных показателей дисбиотических нарушений по сравнению с бифидумбактерином. Ключевые слова: заболевания желудочно-кишечного тракта, дисбиотические проявления, пребиотики, Стимбифид. The authors carried out a clinico-laboratory assessment of the efficacy of a new Russian prebiotic Stimbifid based on fructooligo- and fructopolysaccharides of vegetative origin. A positive effect of the drug in a complex therapy of adult patients with disorders of the gastrointestinal tract (GIT) has been noted, which is manifested by a more rapid coping with dyspeptic syndrome and laboratory indices of dysbiotic disorders as compared to bifidumbacterin. Key words: disorders of gastrointestinal tract, dysbiotic manifestations, prebiotics, Stimbifid. Дисбактериоз кишечника сопровождает различные заболевания и характеризуется изменением состава нормальной микрофлоры, а также транслокацией ее различных видов в несвойственные биотопы и их избыточным ростом. Для современных условий характерен полный набор причин, вызывающих дисбиотические изменения, и спектр их возрастает: массивное и часто бесконтрольное применение различных антибактериальных препаратов, нерациональное питание, неблагоприятная экологическая обстановка, многообразие стрессовых ситуаций и др. Среди препаратов, корригирующих различные дисбиотические изменения в микрофлоре, в настоящее время широко применяются пробиотики, реже – пребиотики. Пребиотики – это препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм человека через селективную стимуляцию роста или метаболической активности нормальной микрофлоры человека. В эту группу входят препараты, относящиеся к различным фармакотерапевтическим группам, но обладающие общим действием – возможностью стимулировать рост собственной нормальной микрофлоры кишечника. Наиболее известные пребиотики – лактулоза и пектин – уже давно применяются в клинической практике. Значительно менее известны клиницистам и пока еще не нашли широкого применения в нашей стране такие пребиотики растительного происхождения, как фруктополисахариды (инулин) и фруктоолигосахариды (олигофруктоза), также обладающие способностью стимулировать рост бактерий собственной нормофлоры кишечника, преимущественно бифидобактерий. Известно, что растительные волокна – фруктополисахариды (инулин) и получаемые на их основе фруктоолигосахириды (олигофруктоза) содержатся во многих овощных культурах и таким образом входят в повседневный рацион человека на протяжении многих столетий. Они не перевариваются в желудке и тонком кишечнике и доходят до толстого кишечника практически в неизмененном виде, где полностью превращаются, главным образом, в КЖК – * Ссылка для цитирования: Грачева Н.М., Малышев Н.А., Чичерин И.Ю., Аваков А.А., Партин О.С., Щербаков И.Т., Соловьева А. И., Герасимова Н.В. Фруктоолигосахариды и фруктополисахариды в комплексном лечении больных желудочно-кишечными заболеваниями с явлениями дисбактериоза кишечника. Инф. болезни.- 2010.- Т. 8.- №1.- С. 107 -111. Глава II ПРЕБИОТИКИ сборник научных статей диагноза также проводились вирусологические, серологические, инструментальные исследования. С целью контроля эффективности проводимой терапии осуществлялось эндоскопическое исследование – ректороманоскопия с взятием биоптатов СО толстой кишки (СОТК) и их последующим гистологическим и гистохимическим изучением. Как показали проведенные клинические наблюдения, на фоне лечения во всех трех группах наблюдавшихся больных отмечается отчетливый положительный клинический эффект, более выраженный в группах пациентов, получавших Стимбифид, и особенно в группе Стимбифид + бифидумбактерин. Уже на 3-й день приема Стимбифида у 31 больного и на 4-й день лечения у 9 пациентов наблюдалась стойкая нормализация стула и исчезновение диспептических явлений. В группе больных, получавших только бифидумбактерин, отмечались худшие клинические результаты, проявлявшиеся на более поздних сроках (6–7-й день и более от начала лечения) нормализации стула и исчезновении диспептических явлений (боли, урчание, дискомфорт, метеоризм и др.). Следует отметить, что на фоне применения Стимбифида как в монотерапии, так и в комбинации с бифидумбактерином у наблюдавшихся больных не отмечалось каких-либо негативных побочных, в том числе аллергических реакций. Препарат в этих группах хорошо переносился больными. Результаты проведенных бактериологических исследований представлены в табл. 1–4. Как видно из табл. 1, у всех наблюдавшихся больных до начала лечения имели место явления дисбактериоза кишечника, оцененные как 1–3-я степени выраженности. После проведенного лечения во всех трех группах больных отмечалась тенденция к нормализации показателей микрофлоры кишечника, что проявлялось увеличением количества больных с нормальными показателями, а также со слабо выраженными явлениями дисбактериоза 1-й степени. Параллельно уменьшалось число больных с дисбактериозом 3-й степени. Вместе с тем, обращает на себя внимание, что наиболее выраженные положительные сдвиги в плане нормализации состояния микробиоценоза кишечника наблюдались в группах больных, получавших Стимбифид или Стимбифид совместно с бифидумбактерином (число больных с нормальными показателями микрофлоры кишечника и слабо выраженными явлениями дисбактериоза 1-й степени составило после проведенного лечения 90%). Количество бифидобактерий после лечения Стимбифидом достигало 1010 КОЕ/г кишечного содержимого. Худшие результаты в плане нормализации состояния микрофлоры кишечника отмечены в группе больных, получавших только бифидумбактерин, проявляющиеся незначительным снижением числа больных с выраженным дисбактериозом 3-й степени. Количество бифидобактерий не превышало 109 КОЕ/г. Нами также было изучено количественное содержание в фекалиях больных других видов микроорганизмов – представителей индигенной микрофлоры: лактобактерий, эшерихий (табл. 2–4). Как следует из данных таблиц, на фоне применения Стимбифида и при его сочетании с бифидумбактерином в указанных группах больных одновременно наблюдались положительные сдвиги со стороны лактобактерий и эшерихий. В группе больных, получавших только бифидумбактерин, положительные количественные сдвиги в отношении содержания лактобактерий и эшерихий в процессе лечения были менее значительными и наблюдались значительно реже. Мы изучили влияние терапии Стимбифидом на частоту выделения микроорганизмов – представителей условно- 81 короткоцепочечные жирные кислоты (уксусную, пропионовую и масляную), бактериальную биомассу и газы. В последнее время убедительно показано при исследованиях на добровольцах, что инулин и олигофруктоза улучшают метаболизм липидов, в частности, понижают содержание триглицеридов и холестерина в сыворотке крови по сравнению с контрольными группами [1, 2]. У пациентов, страдающих раком и полипозом кишечника, подавляются различные маркеры, связанные с этими заболеваниями [3]. Эти пребиотики стали применяться для профилактики остеопороза, учитывая существенное увеличение адсорбции некоторых микроэлементов в кишечнике, особенно Са, Fe, Mg, при их применении [4–7]. Особенно целесообразно назначение фруктоолиго- и фруктополисахаридов в группе больных желудочно-кишечными заболеваниями с явлениями дисбактериоза кишечника, учитывая их пребиотический эффект, улучшение пищеварительной функции кишечника, снижение воспаления в слизистой оболочке (СО) ЖКТ [8–10]. В связи с этим приводим собственные наблюдения по применению пребиотика Стимбифида, представляющего собой комплекс высокоочищенных природных фруктоолигосахаридных и фруктополисахаридных растительных волокон, объединенных в препарате по специально разработанной формуле. Исследование проводилось открытым рандомизированным методом среди стационарных больных, а также в амбулаторных условиях. Под наблюдением находилось 60 взрослых больных, преимущественно в возрасте старше 40 лет. В исследуемую группу вошли 5 больных с острыми кишечными инфекциями (ОКИ) вирусно-бактериальной природы, а также больные с хроническими заболеваниями ЖКТ, ассоциированными с дисбактериозом кишечника (19 пациентов с хроническим гастритом, 14 – с колитом, 10 – с холециститом, дискинезией желчевыводящих путей, 9 – с хроническим панкреатитом, 3 – с синдромом раздраженного кишечника). Все наблюдавшиеся больные были разделены на 3 группы в зависимости от вида лечебных мероприятий: 1-я группа больных (20 человек) получала Стимбифид в виде монотерапии, 2-я группа (20 пациентов) – Стимбифид в комбинации с бифидумбактерином и 3-я (20 больных) – только бифидумбактерин. Течение заболевания в большинстве случаев было среднетяжелым, обследованные группы пациентов были сопоставимы по полу, возрасту и тяжести заболеваний, что позволило провести их сравнительный анализ. Стимбифид назначался по 3 таблетки 3 раза в день, бифидумбактерин – по 5 доз 3 раза в день. Курс лечения составлял 10–12 дней в зависимости от характера и выраженности клинических проявлений основного заболевания и степени тяжести дисбактериоза; при выраженных явлениях последнего – 3–4 недели. Все больные получали наряду со Стимбифидом только базисную терапию, соответствующую диагнозу заболевания: режим, диета, симптоматические средства. На период лечения исключался прием антибиотиков, а также других про- и пребиотических препаратов. Клиническая эффективность Стимбифида оценивалась на основании клинических наблюдений за сроками нормализации стула и исчезновения диспептических явлений в ЖКТ – болей и урчания в животе. У всех наблюдавшихся больных в динамике (до и после окончания курса лечения) проводились бактериологические исследования фекалий. Полученные данные по состоянию кишечного биоценоза оценивались по степеням выраженности дисбактериоза кишечника в соответствии с «Отраслевым стандартом» (2002 г.). Для уточнения Глава II ПРЕБИОТИКИ патогенной флоры. Как показали проведенные исследования, лучшие результаты в плане прекращения бактериовыделения после окончания курса лечения наблюдались в группе больных, получавших Стимбифид вместе с бифидумбактерином, в то время как в группах больных, получавших только Стимбифид, а также только бифидумбактерин, отмечалась более высокая частота продолжения бактериовыделения гемолитических эшерихий, цитробактеров, дрожжеподобных грибов рода Кандида, стафилококка, протея. Учитывая то, что при применении лечебных препаратов у больных ОКИ с дисбактериозом кишечника большое значение имеют репаративные процессы в СО ЖКТ, были исследованы морфологические изменения СОТК у одного больного в динамике – до и после лечения Стимбифидом во время проведения ректороманоскопии. Биоптаты СОТК фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной не более 5 мкм окрашивали альциановым синим, гематоксилином Эрлиха и эозином для гистологического, гистохимического и морфометрического изучения полученных препаратов. Основным фуксином по Цилю-Нильсену в препаратах определяли криптоспоридии, акридиновым оранжевым по Уолтерсу в препаратах выявляли кампилобактеры. До назначения Стимбифида в комплексную терапию у больного ОКИ неустановленной этиологии в СОТК выявили острый фолликулярно-геморрагический колит (рис. 1). При этом в поверхностных субэпителиальных отделах собственной пластинки выявляли геморрагии. Мукоциты поверхностного эпителия и кишечных желез продуцировали слабо альциан-позитивную слизь. Плотность воспалительного клеточного инфильтрата в субэпителиальной и межжелезистой собственной пластинке была значимо выше нормальных показателей. В воспалительном инфильтрате в убывающей степени присутствовали лимфоциты, плазмоциты, макрофаги, фибробласты, фиброциты, эозинофильные и нейтрофильные гранулоциты. Криптоспоридии и кампилобактеры в биоптатах СОТК не обнаружены. После применения комплексной терапии с включением Стимбифида у наблюдавшегося пациента в СОТК выявили острый катаральный колит в стадии обратного развития патологического процесса (рис. 2). При этом из поверхностных отделов собственной пластинки СОТК исчезли кровоизлияния. Мукоциты поверхностного и железистого эпителия продолжали продуцировать слабо альциан-позитивную слизь. Плотность воспалительного клеточного инфильтрата субэпителиальной и межжелезистой собственной пластинки практически не отличалась от таковой в норме. В воспа- Таблица 1. Состояние микрофлоры кишечника у наблюдавшихся больных до и после лечения Исследуемые препараты Время обследования Дисбактериоз, % Стимбифид (n = 20) До лечения После лечения До лечения После лечения До лечения После лечения 90,0 ± 6,9 75,0 ± 9,9 100,0 75,0 ± 9,9 95,0 ± 5,0 95,0 ± 5,0 Стимбифид + бифидумбактерин (n = 20) Бифидумбактерин (n = 20) Состояние микрофлоры кишечника Норма Степень дисбактериоза, % 1-Я 2-Я 3-Я 10,0 ± 6,9 45,0 ± 11,4 35,0 ± 10,9 10,0 ± 6,9 25,0 ± 9,9 40,0 ± 11,2 30,0 ± 10,5 5,0 ± 5,0 – 50,0 ± 11,5 30,0 ± 10,5 20,0 ± 9,2 25,0 ± 9,9 65,0 ± 10,9 10,0 ± 6,9 – 5,0 ± 5,0 35,0 ± 10,9 30,0 ± 10,5 30,0 ± 10,5 5,0 ± 5,0 35,0 ± 10,9 35,0 ± 10,9 25,0 ± 9,9 Таблица 2. Содержание бифидобактерий в фекалиях больных различных групп 82 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Исследуемые препараты Стимбифид (n = 20) Стимбифид + бифидумбактерин (n = 20) Бифидумбактерин (n = 20) Время обследования До лечения После лечения До лечения После лечения До лечения После лечения Количество бифидобактерий, КОЕ/г 107 108 % абс. % абс. % 20,0 ± 9,2 9 45,0 ± 11,4 7 35,0 ± 10,9 – 1 5,0 ± 5,0 10 50,0 ± 11,5 25,0 ± 9,9 13 65,0 ± 10,9 2 10,0 ± 6,9 – – – 8 40,0 ± 11,2 35,0 ± 10,9 10 50 ± 11,5 3 15,0 ± 8,2 25,0 ± 9,9 7 35,0 ± 10,9 8 40,0 ± 11,2 <107 абс. 4 – 5 – 7 5 109 абс. – 9 – 12 – – % – 45,0 ± 11,4 – 60,0 ± 11,2 – – Таблица 3. Cодержание лактобактерий в фекалиях больных различных групп Исследуемые препараты Стимбифид (n = 20) Стимбифид + бифидумбактерин (n = 20) Бифидумбактерин (n = 20) Время обследования До лечения После лечения До лечения После лечения До лечения После лечения <105 абс. 7 3 7 4 9 5 % 35,0 ± 10,9 15,0 ± 8,2 35,0 ± 10,9 20,0 ± 9,2 45,0 ± 11,4 25,0 ± 9,9 Количество лактобактерий, КОЕ/г 105 10 6 абс. % абс. % 7 35,0 ± 10,9 6 30,0 ± 10,5 9 45,0 ± 11,4 7 35,0 ± 10,9 7 35,0 ± 10,9 6 30,0 ± 10,5 9 45,0 ± 11,4 7 35,0 ± 10,9 7 35,0 ± 10,9 2 10,0 ± 6,9 10 50,0 ± 11,5 4 20,0 ± 9,2 107 абс. – 1 – – 2 1 % – 5,0 ± 5,0 – – 10,0 ± 6,9 5,0 ± 5,0 Таблица 4. Содержание эшерихий в фекалиях больных разных групп Исследуемые препараты Стимбифид (n = 20) Стимбифид + бифидумбактерин (n = 20) Бифидумбактерин (n = 20) Время обследования До лечения После лечения До лечения После лечения До лечения после лечения 10 6 абс. 2 – 3 – 4 2 % 10,0 ± 6,9 – 15,0 ± 8,2 – 20,0 ± 92 10,0 ± 6,9 Количество эшерихий, КОЕ/г 107 108 абс. % абс. % 3 15,0 ± 8,2 15 75,0 ± 9,9 7 5,0 ± 5,0 19 95,0 ± 5,0 3 15,0 ± 8,2 14 70,0 ± 10,5 3 15,0 ± 8,2 17 85,0 ± 8,2 7 35,0 ± 10,9 9 45,0 ± 11,4 7 35,0 ± 10,9 11 55,0 ± 11,4 109 абс. – – – – – – % – – – – – – Глава II ПРЕБИОТИКИ Рис. 1. Гистологическая картина биоптата СОТК до лечения. Острый фолликулярно-геморрагический колит (окраска: альциановый синий, гематоксилин и эозин. Увеличение х 160). Рис. 2. Гистологическая картина биоптата СОТК после лечения. Острый катаральный колит в стадии обратного развития (окраска: альциановый синий, гематоксилин и эозин. Увеличение х 160). лительном инфильтрате в убывающей степени присутствовали лимфоциты, плазмоциты, макрофаги, фибробласты и фиброциты, тогда как эозинофильные и нейтрофильные гранулоциты в нем не обнаружили. Также в биоптатах не выявили криптоспоридии и кампилобактеры. Таким образом, назначение Стимбифида в комплексную терапию оказало положительное влияние на репаративные процессы в СОТК. 5. Tahiri M., Tressolj C., Arnaud J., Bornet F., Bouteloup-Demange C., Feillet-Coudrayc, Ducros V., Pepin D., Brouns F., Rayssiguiera M., and Coudrayc. Five-week intake of short-chain fructo-oligosaccharides increases intestinal absorption and status of magnesium in postmenopausal women. J Bone Miner. Res. 2001; 16: 2152–60. 6. Holloway l, Moynihan S., Abrams S. A., Kent K., Hsua R., Friedlandera L. Effects of oligofructose-enriched inulin on intestinal absorption of calcium and magnesium and bone turnover markers in postmenopausal women. Brit. J Nutr. 2007; 97; 365–72. 7. Abrams S.A., Hawthorne K.M., Aliuo, Hicks P.D., Chen Z., Griffin I.J. An inulin-type fructan enhances calcium absorption primarily via an effect on colonic absorption in humans. J Nutr. 2007; 137: 2208–12. 8. Tuohyk M., Finlayr K., Wynne A.G., Gibson G.R. A human volunteer study on the prebiotic effects of HP-inulin – faecal bacteria enumerated using fluorescent in situ hybridisation (FISH). Anaerobe. 2001; 7: 113-8. 9. Langlands S.J., Hopkins M.J., Coleman N., Cummings J.H. Prebiotic carbohydrates modify the mucosa associated microflora of the human large bowel. Gut. 2004; 53: 1610–6. 10. Waligora-Dupriet A.J., Campeotto F., Nicolis I., Bonet A., Soulaines P., Dupontc, Butelm-J. Effect of oligofructose supplementation on gut microflora and wellbeing in young children attending a day care center. Int. J of Food Microbiology. 2007; 113: 108–13. ЛИТЕРАТУРА 1. Beylot M. Effects of inulin-type fructans on lipid metabolism in man and in animal models. Br. J Nutr. 2005; 93; 163–8. 2. Letexier D, Diraison F., Beylot M. Addition of inulin to a moderately highcarbohydrate diet reduces hepatic lipogenesis and plasma triacylglycerol concentrations in humans. Am. J Clin. Nutr. 2003; 77; 559–64. 3. Klinder A, Forster A, Caderni G., Femia A.P., Pool-Zobelb L. Fecal water genotoxicity is predictive of tumor-preventive activities by inulin-like oligofructoses, probiotics (Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis), and their synbiotic combination. Nutr. Cancer. 2004; 49: 144–55. 4. Griffin I.J., Davila P.M., Abrams S.A. Non-digestible oligosaccharides and calcium absorption in girls with adequate calcium intakes, Br. J. Nutr. 2002; 87(2): 187–91. _____________________________________________________ Для корреспонденции: Грачева Нина Михайловна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель клинического отдела Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского Адрес: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10. Телефон: (495) 452-1816 Статья поступила 12.11.2009 г., принята к печати 04.03.2010 г. Информация о соавторах: Малышев Николай Александрович, доктор медицинских наук, профессор, главный врач инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы Адрес: 125367, Москва, Волоколамское ш., 63. Телефон: (495) 490-1414 Чичерин Игорь Юрьевич, кандидат медицинских наук, директор ООО «МедСтар» Адрес: 141300, Московская обл., Сергиево-Посадский район, п/о Тураково Телефон: (496) 547-5300 Аваков Александр Александрович, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник клинического отдела Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского Адрес: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10. Телефон: (495) 452-1816 Партин Олег Сергеевич, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник клинического отдела Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского Адрес: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10. Телефон: (495) 452-1816 Соловьева Алина Ивановна, научный сотрудник клинического отдела Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского Адрес: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10. Телефон: (495) 452-1816 Щербаков Иван Тимофеевич, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского Адрес: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10. Телефон: (495) 452-1816 Герасимова Нелля Васильевна, врач-лаборант инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы Адрес: 125367, Москва, Волоколамское ш., 63. Телефон: (495) 490-1414 Статья поступила 12.11.2009 г., принята к печати 04.03.2010 г. сборник научных статей У больных ОКИ вирусно-бактериальной природы и хроническими заболеваниями ЖКТ, ассоциированными с дисбактериозом кишечника, назначение Стимбифида как в монотерапии, так и особенно в сочетании с бифидумбактерином, оказывает положительный клинический эффект, проявляющийся в нормализации стула и исчезновении диспептических явлений, более существенный, чем у больных, получающих бифидумбактерин в монотерапии. Назначение Стимбифида как в монотерапии, так и при его сочетании с бифидумбактерином оказывает более выраженное влияние на показатели количественного содержания бифидобактерий. Кроме того, отмечено его положительное влияние на количественное содержание лактобактерий и эшерихий. Применение Стимбифида в комплексной терапии оказывало положительное влияние на репаративные процессы в СОТК, способствуя угасанию в ней воспалительного процесса. На фоне лечения Стимбифидом нами не наблюдалось каких-либо нежелательных побочных или аллергических реакций. Препарат хорошо переносился больными. Таким образом, расширение комплекса лечебных средств с включением в него фруктоолиго- и фруктополисахаридов, корригирующих микрофлору у больных с различными заболеваниями ЖКТ, протекающими на фоне дисбактериоза кишечника, является весьма эффективным, что имеет большое практическое значение. 83 Заключение Глава II ПРЕБИОТИКИ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ФРУКТООЛИГО- И ФРУКТОПОЛИСАХАРИДОВ В КОРРЕКЦИИ И ПРОФИЛАКТИКЕ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА* Ардатская М.Д.1, Чичерин И.Ю.2, Стражев С.В.1, Минушкин О.Н.1 1 ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр» УД Президента РФ, 2ООО «МедСтар» EFFECTIVENESS OF FRUCTOOLIGO- AND FRUCTOPOLYPOLYSACCHARIDES IN CORRECTION AND PROPHYLACTICS OF INTESTINAL MICROBIOCENOSIS 84 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Ardatskaya M.D.1, Chicherin I.Yu.2, Strazhev S.V.1, Minushkin O.N.1 РЕЗЮМЕ SUMMARY Объектом исследования послужили 60 человек, из них 10 практически здоровых лиц на фоне приема БАД «Стимбифид», содержащей фруктоолиго- и фруктополисахариды (инулин), витамины и минералы, и 50 больных бронхолегочной патологией на фоне и после проведения антибактериальной терапии. На основании результатов проведенного комплексного исследования установлена высокая клиническая эффективность «Стимбифида» в качестве стимулятора роста бифидобактерий у практически здоровых лиц, а также в коррекции нарушений микробиоценоза у пациентов с хроническими и острыми заболеваниями легких на фоне и после проведения антибактериальной терапии. Ключевые слова: микробиоценоз кишечника, «Стимбифид». 60 patients (10 of them were practically healthy) who took nutraceutical “Stimbifid” consisting of fructooligo- and fructpolypolysaccharides (inulin), vitamins and minerals as well as 50 patients with pulmonary pathology who had antibacterial therapy have been taken into the study. Results of our complex research have shown that Stimbifid has a high clinical effectiveness as a stimulator for bifidus bacteria growth in practically healthy subjects; it is also effective for correcting micorbiocenosis misbalance in patients with chronic and acute diseases during and after antibiotical therapy. Key words: intestinal micobiocenosis, Stimbifid. Организм человека обильно заселен микроорганизмами, численность которых составляет 1013–15 и видовой состав приближается к 1000 различных видов. Более 60% представителей микрофлоры колонизирует кишечник хозяина [1, 4, 8, 9, 11, 12–15, 17]. Функции микробиоты (более широкое понятие, включающее в себя не только представителей микрофлоры, но и вирусов, простейших и т.д.) многочисленны [1, 3, 8, 9, 11] и включают: – Трофические и энергетические функции – тепловое обеспечение организма. – Энергообеспечение эпителия. – Регулирование перистальтики кишечника. – Участие в регуляции дифференцировки и регенерации тканей, в первую очередь эпителиальных; обеспечение цитопротекции. – Детоксикация и выведение эндо- и экзогенных ядовитых соединений, разрушение мутагенов, активация лекарственных соединений. – Образование сигнальных молекул, в том числе нейротрансмиттеров. – Стимуляция иммунной системы, в том числе и местной; образование иммуноглобулинов. – Повышение резистентности эпителиальных клеток к мутагенам (канцерогенам). – Ингибирование роста патогенов и их адгезии к эпителию. – Перехват и выведение вирусов. – Поддержание ионного гомеостаза организма и физикохимических параметров гомеостаза приэпителиальной зоны. – Регуляция газового состава полостей. – Поставка субстратов глюконеогенеза и липогенеза. – Участие в метаболизме белков, в энтерогепатической циркуляции желчных кислот, стероидов и других макромолекул. – Хранилище микробных плазмидных и хромосомных генов. – Синтез витаминов группы В, пантотеновой кислоты и др. Поддержание количества и состава микрофлоры и ее функциональной активности в различных отделах пищеварительного тракта является прерогативой нормального физиологического состояния организма [1, 3, 8, 9, 13, 15]. Кратковременные (преходящие) нарушения микробиоценоза кишечника рассматриваются с позиции «дисбактериальных реакций», более стойкие изменения коли- * Ссылка для цитирования: Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю., Стражев С.В., Минушкин О.Н. Эффективность фруктоолиго- и фруктополисахаридов в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника. Кремлевская медицина. Клин. вестник.2011.- №3.- С. 59 – 66. Глава II ПРЕБИОТИКИ генной флоры, важной для организма хозяина в функциональном отношении. Кроме того, пребиотики относятся к одной из основных категорий функционального питания и, таким образом, являются основной частью профилактики развития нарушений микробиоценоза кишечника. Целью настоящего исследования являлась оценка пребиотической эффективности БАД «Стимбифид» (ООО «В-МИН»/ООО «МедСтар», Россия), содержащей инулин, олигофруктозу, витамины (С, В1, В6, В12, Е, РР, фолиевую кислоту, пантотеновую кислоту, биотин) и микроэлементы (цинк, селен), в качестве стимулятора роста бифидобактерий у практически здоровых лиц, а также его клиническую эффективность в коррекции нарушений микробиоценоза у пациентов с заболеваниями легких, получающих антибактериальную терапию (АБТ). Состав препарата: • фруктополисахариды – инулин (РафтилинТМ, Бельгия); • фруктоолигосахариды – олигофруктоза (РафтилозаТМ, Бельгия); • премикс витаминно-минеральный «Immynity» производства компании «DSM Nutritional Products Europe Ltd.» (Швейцария). Вспомогательные вещества: натрия бикарбонат, лактоза, кальция стеарат. Материалы и методы 1-я группа – 10 практически здоровых лиц (ПЗЛ), получающих БАД «Стимбифид»; 2А – 15 пациентов с заболеваниями легких на фоне АБТ, получавших БАД «Стимбифид»; 2Б группа (группа сравнения) – 10 пациентов с заболеваниями легких на фоне АБТ; 3А группа – 15 пациентов с заболеваниями легких после АБТ, получавших БАД «Стимбифид»; 3Б группа (группа сравнения) – 10 пациентов с заболеваниями легких после АБТ (наблюдение в динамике). Патология легких была верифицирована современными лабораторно-инструментальными методами. Средний возраст в группе практически здоровых лиц (1-я группа) составил 29,5±4 года, из них мужчин – 2, женщин – 8. Возраст пациентов 2-й группы (основная группа и группа сравнения) составил 48±11 и 46,3± 7,6 года соответственно (от 23 лет до 71 года). Соотношение мужчин и женщин – 1:2 в обеих подгруппах. Возраст пациентов 3-й группы (основная группа и группа сравнения) составил 45± 9,5 и 47,2± 8,3 года соответственно (от 24 лет до 71 года). Соотношение мужчин и женщин – 1:2 в обеих подгруппах. Критериями оценки эффективности БАД «Стимбифид» служили: – динамика клинических симптомов; – время транзита по кишечнику активированного угля – “карболеновая проба” (у пациентов 2-й и 3-й групп). В норме время транзита составляет 24–48 ч; – бактериологическое исследование кала до и после лечения; – определение короткоцепочечных жирных кислот (КЖК1) в кале до и после лечения. Оценка переносимости и безопасности проводилась на основании регистрации побочных эффектов, отмеченных в регистрационных картах и дневниках наблюдения, сборник научных статей Исследуемые группы: 85 чественного и качественного состава микроорганизмов объединяют понятием «дисбактериоз». К наиболее значимым факторам, приводящим к нарушению микробиоценоза кишечника, можно отнести [1, 6–9, 11, 13, 15]: 1. Ятрогенные воздействия (антибактериальная терапия, гормонотерапия, лечение цитостатиками, лучевая терапия, оперативные вмешательства). 2. Фактор питания (дефицит пищевых волокон; потребление пищи, содержащей антибактериальные компоненты, консерванты, красители и другие ксенобиотики; не сбалансированное по составу нутриентов и минорных компонентов питание; нерегулярное питание; резкая смена рациона и режима питания). 3. Стрессы различного генеза. 4. Острые инфекционные заболевания ЖКТ. 5. Снижение иммунного статуса различного генеза. 6. Ксенобиотики различного происхождения. 7. Нарушение биоритмов, дальние поездки. 8. Заболевания внутренних органов, прежде всего органов ЖКТ. 9. Функциональные нарушения моторики кишечника. С учетом широкой распространенности неблагоприятных факторов, оказывающих негативное влияние на состояние микрофлоры, остро стоит вопрос коррекции и профилактики нарушений микробиоценоза кишечника. Основными принципами лечебно-профилактических мероприятий при нарушении микробиоценоза кишечника являются [1, 8, 9]: 1) диетическая коррекция; 2) лечение патологии, приведшей к его развитию; 3) деконтаминация условно-патогенной флоры (невсасывающиеся кишечные антибиотики/антисептики, энтеросорбенты, фаги, культуры бактерий, обладающие антагонистической активностью, и др.); 4) восстановление эубиоза; 5) поддерживающая терапия основного заболевания и профилактика нарушений микробиоценоза кишечника (в период ремиссии). Спектр средств, используемых для восстановления численности и качественного состава микрофлоры кишечника, включает в себя две большие группы препаратов [1, 4, 8, 9, 11] – пробиотики (живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятнoе влияние на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию его микроэкологического статуса); – пребиотики, к которым относят препараты или биологически активные добавки немикробного происхождения, неперевариваемые в кишечнике, способные оказывать позитивное действие на организм через стимуляцию роста и/или стимуляцию метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника. Типичными представителями пребиотиков являются соединения, относящиеся к классу низкомолекулярных углеводов – поли- и дисахариды, олигосахариды, которые широко распространены в природе. К пребиотикам предъявляются строгие требования: –они не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами человека; – не должны абсорбироваться в верхних отделах пищеварительного тракта; – должны селективно стимулировать один вид или определенную группу микроорганизмов, резидентных для толстой кишки. Основная цель включения в терапию этого класса препаратов заключается в создании оптимальной среды обитания микроорганизмов и стимуляции роста инди- Глава II ПРЕБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 86 а также по результатам общего и биохимического исследования крови. «Стимбифид» назначали по 3 таблетки 3 раза в день в течение 18 дней (1-я и 3-я группы). Во 2-й группе БАД «Стимбифид» назначали в той же дозе во время проведения антибактериальной терапии (7–10 дней). Таблица 1. Влияние БАД «Стимбифид» на состав микробной флоры у ПЗЛ Микроорганизмы Бифидобактерии Результаты и обсуждение Шесть человек из группы практически здоровых лиц не предъявляли никаких жалоб со стороны ЖКТ. Отметили периодическое вздутие живота в сочетании с изменением консистенции кала (более плотной консистенции) 2 человека, периодическое послабление – 2 человека. После применения БАД «Стимбифид» данные симптомы были полностью купированы. При бактериологическом исследовании кала (табл. 1) у ПЗЛ до начала приема БАД «Стибифид» выявлялся дефицит облигатной флоры: бифидобактерий в 50% случаев (у 5 человек), лактобактерий в 30% (у 3 человек). У 1 человека выявлено повышение количества лактозонегативных эшерихий. После приема отмечено повышение количества бифидобактерий до нормальных значений у 4 человек (из 5), лактобактерий – у 3 (из 3). У 1 человека со снижением численности бифидобактерий их количество возросло на 1 порядок (с 106 до 107) после лечения БАД «Стимбифид». Повышение числа микроорганизмов остаточной флоры после приема «Стимбифида» не установлено. Таким образом, нормализация численности бифидои лактобактерий достигнута в 90 и 100% случаев соответственно. Необходимо отметить, что повышение количества бифидобактерий отмечалось не только у лиц с исходно сниженным их числом до лечения, но и у остальных наблюдаемых (с 108–9 до 1010 ). Вышеуказанное отразилось на изменении степени выраженности изменений состава микрофлоры (табл. 2), из которой видно, что на фоне приема БАД «Стимбифид» количество практически здоровых лиц с дисбактериозом 1-й степени уменьшилось с 5 до 1 (с 50 до 10% соответственно); увеличилось число лиц с 0 степенью с 5 до 9 человек (с 50 до 90% соответственно). Методом ГЖХ-анализа было исследовано количественное и качественное содержание КЖК в кале, являющихся метаболитами индигенной микрофлоры кишечника [10]. Результаты исследования абсолютного содержания КЖК в кале у ПЗЛ до и после приема БАД «Стимбифид» представлены в табл. 3, из которой видно, что исходно отмечается незначительное снижение абсолютного содержания кислот, что свидетельствует о снижении активности и численности облигатной микрофлоры, в том числе молочнокислой (бифидо- и лактобактерий) [2, 5, 11, 16]. Причем данные изменения обусловлены снижением концентрации КЖК у лиц с дефицитом бифидо- и лактобактерий по данным бактериологического исследования. После проведенного курса лечения БАД «Стимбифид» отмечено повышение абсолютного содержания кислот, что характеризует восстановление численности и активности облигатных представителей толстокишечной микрофлоры и соотносится с результатами бактериологического исследования кала. Результаты изучения профилей С2–С4, вносящих основной вклад в общий пул КЖК, и рассчитанных значений анаэробных индексов2, отображающих окислительно-восстановительный потенциал внутрипросветной среды, на фоне приема БАД «Стимбифид» представлены также в табл. 3, из которой видно, что у ПЗЛ исходно Норма До лечения После лечения 108– <108 у 5 человек N у 9 человек 1010 105–107 <105 у 3 человек N у 10 человек >10% у 1 до 10% > 10% – нет человек Лактобактерии Кишечные палочки неполноценные Кишечные палочки 0 гемолизирующие Условно-патогенные До 104 энтеробактерии Стрептококки До 104 Золотистый 0 стафилококк Клостридии 0–103 Грибы рода Кандида 0–103 >104 – нет >104 – нет >104 – нет >104 – нет >104 – нет >104 – нет Нет Нет 3 >103 нет > 103 – нет >10 нет >103 нет Таблица 2. Распределение ПЗЛ по степени выраженности дисбактериоза толстой кишки до и после лечения БАД «Стимбифид» Степени тяжести дисбактериоза до лечения после лечения 0 1-я 2-я 3-я 4-я 0 1-я 2-я 3-я 4-я 5 (50%) 5 (50%) – – – 9 (90%) 1 (10%) – – – наблюдается незначительное снижение относительного количества уксусной кислоты по сравнению с нормативными показателями (также за счет лиц с дефицитом бифидо- и лактобактерий). АИ были незначительно отклонены в область отрицательных значений. Изменения данных параметров связаны со снижением численности и активности облигатной флоры (в частности, бифидо- и лактобактерий) [5] и незначительным изменением состояния внутрипросветной кишечной среды. После приема БАД «Стимбифид» происходит нормализация указанных показателей, свидетельствующих о росте представителей облигатной флоры (эти данные совпали с результатами бактериологического исследования) и восстановлении среды обитания микрофлоры. Таким образом, можно констатировать высокую эффективность БАД «Стимбифид» в качестве стимулятора роста бифидобактерий у практически здоровых лиц. Для решения задач второй части исследования изучено 25 пациентов с заболеваниями легких (ЗЛ), которые были разделены на 2 подгруппы (2А и 2Б) в зависимости от варианта лечения: подгруппу 2А составили 15 человек, которые на фоне АБТ получали БАД «Стимбифид»; подгруппу сравнения (2Б) – 10 пациентов, которые получали только антибактериальные (АБ) препараты. Как было указано выше, всем пациентам с заболеваниями легких проводилась АБТ с использованием антибиотиков широкого и избирательного спектра действия. Основу схем в обеих группах (100 и 90% соответственно) составили антибактериальные средства, обладающие широким спектром действия в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов (полусинтетические пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды). У 86,7 и 90% больных с ЗЛ (2А и 2Б группы соответственно) исходно были выявлены симптомы кишечной Уксусная кислота Пропионовая кислота Масляная кислота АИ Норма 10,51±2,25 0,634±0,004 0,189±0,003 0,176±0,004 –0,576 ±0,012 0,059±0,011 ПЗЛ (до) ПЗЛ (после) 8,96±2,11 10,37±2,16 0,624±0,006 0,643±0,006* 0,195±0,006 0,184±0,006 0,181±0,005 0,173±0,005 –0,602±0,011 –0,555±0,011* 0,054±0,009 0,055±0,010 EiCn Примечание. M±m, для p<0,05. * - р<0,05 при сравнении показателей до и после лечения. диспепсии, в основном связанные с предшествующим приемом антибиотиков, сопутствующей патологией и т.д. (см. табл. 4). У пациентов 2А группы (АБТ+«Стимбифид») на фоне 10-дневного курса лечения, кроме эффекта по поводу основного заболевания, отмечены положительные сдвиги в клинической симптоматике: боли купированы у 2 человек (13,3%) (исходно были у 4; 26,7%), урчание – у 5 человек (33,3%) (исходно – у 6; 40%), метеоризм – у 4 человек (26,7%) (исходно – у 6; 40%). На фоне терапии БАДом «Стимбифид» нормализовалась консистенция стула и частота дефекаций у 7 пациентов (46,7% ) (исходно была изменена у 10 человек – 67,7%), периодическое послабление сохранилось после лечения у 2 пациентов (13,3%), у 1 пациента (6,7%) к окончанию лечения сохранялись запоры. У 1 пациента исчезла слизь в кале. Увеличилось время транзита карболена по пищеварительному тракту («карболеновая проба») с 14,5±4,5 до 19,3±3,7 ч. Таким образом, в основной группе после лечения уменьшились и/или полностью купировались явления кишечной диспепсии, нормализовался стул, исчезли патологические примеси в кале. В группе сравнения – 2Б отмечалось нарастание симптомов кишечной диспепсии после проведения АБТ: боли констатированы у 3 человек (30%) (исходно были у 2 пациентов – 20%), урчание – у 7 человек (исходно – у 4 человек – 40%), метеоризм – у 6 человек (исходно – у 4 – 40%). Кашицеобразный стул и увеличение частоты дефекаций зафиксированы у 8 больных (80%) (исходно – у 6 пациентов Таблица 4. Динамика симптомов кишечной диспепсии у больных до и после проведения АБТ Симптомы Вздутие Урчание Изменение характера стула: периодическое послабление запоры чередование запоров и поносов Патологические примеси в кале Боль в животе Симптомы отсутствуют Группа 2А (АБТ+«Стимбифид») (n=15) абс. % 6/2 40/13,3 6/1 40/6,6 Группа сравнения (2Б) (n=10) абс. % 4/6 40/60 4/7 40/70 6/2 40/13,3 6/8 60/80 3/1 1/0 20/6,7 6,7/0 0/0 3/1 0/0 30/10 1/0 6,7/0 2/4 20/40 4/2 26,7/13,3 2/3 20/30 2/4 13,3/26,7 0/1 0/10 Примечание. В числителе указано абсолютное значение и процент встречаемости симптома до проведения АБТ, в знаменателе – после проведения АБТ. – 60%). Патологические примеси в кале (слизь) выявлены у 4 пациентов (40%) (исходно – у 2 человек – 20%). Время транзита карболена по пищеварительному тракту («карболеновая проба») с 14,9±4,6 до 15,1±3,9 ч сохранилось на исходном уровне. У пациентов обеих групп исходно выявлены изменения в составе главной, факультативной и остаточной микрофлоры толстой кишки: бактериологически фиксировалось снижение количества бифидо- и лактобактерий (100% в обеих подгруппах), преобладала кишечная палочка с измененными свойствами (лактозонегативная, гемолитическая) – у 6 пациентов (40%) основной подгруппы и у 7 пациентов (70%) подгруппы сравнения, выявлялись факультативные и условно-патогенные энтерококки – у 8 пациентов (53,3%) основной подгруппы и у 6 пациентов (60%) подгруппы сравнения, золотистый стафилококк (у 2 пациентов из каждой подгруппы), повышение количества клостридиальной флоры – у 5 больных (33,3%) и у 4 пациентов (40%) соответственно и грибов рода кандида – у 6 пациентов (40%) основной группы и у 7 пациентов (70%) группы сравнения. После лечения у пациентов основной (2А) группы (АБТ+«Стимбифид») отмечены увеличение количества облигатной флоры (бифидобактерий, лактобактерий) у 7 пациентов (46,7%), нормализация у 2 пациентов (13,3%), уменьшение выявления неполноценной и гемолизирующей кишечной палочки у 3 пациентов (20%), клостридий у 3 пациентов (20%). Уменьшилось также количество условно-патогенных энтеробактерий у 4 пациентов (26,7%) и грибов рода Кандида у 4 пациентов (40%). После лечения у пациентов группы сравнения (АБТ) – 2Б – микробиологический статус сохранился или имел тенденцию к усугублению показателей: отмечалось дальнейшее снижение количества облигатной молочнокислой флоры (бифидобактерий, лактобактерий), сохранилась (или увеличилась у 3 пациентов – 30%) частота выявления неполноценной и гемолизирующей кишечной палочки, клостридий, условно-патогенных энтеробактерий, грибов рода Кандида. Вышеуказанное сказалось на изменении степени выраженности дисбактериоза (по В.Н. Красноголовец). Результаты представлены в табл. 5, из которой видно, что в основной группе после комплексного лечения отмечается снижение степени выраженности дисбактериоза: 1-я степень установлена у 5 больных (33,3%), 2-я – у 8 больных (53,3%), 3-я – у 2 пациентов (13,4%). В группе сравнения (2Б) после проведения АБТ (табл. 5) отмечено нарастание степени выраженности микроэкологических нарушений: 1-я степень установлена у 1 больного (10%), 2-я – у 5 больных (50%), 3-я – у 4 пациентов (40 %). Методом газожидкостного хроматографического анализа были исследованы КЖК в кале больных исследуемых подгрупп до и после курсов лечения и у практически здоровых лиц. Результаты изучения абсолютного содержания КЖК (С2–С6) в кале у больных с заболеваниями легких на фоне Глава II ПРЕБИОТИКИ 兺 (С2–С6) Группа сборник научных статей Результаты изучения абсолютного содержания КЖК (в мг/г), профилей КЖК С2–С4, значений анаэробных индексов, отношение суммарного содержания отдельных изокислот (изоСп) к кислотам (Сп) (в ед.) в кале у ПЗЛ до и после приема БАД «Стимбифид» 87 Таблица 3. Глава II ПРЕБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 88 Таблица 5. Распределение больных с заболеваниями легких по степени выраженности дисбактериоза на фоне лечения Группа Основная (2А) группа (n=15) (до лечения) Основная группа (после лечения) Группа (2Б) сравнения(n=10) (до лечения) Группа сравнения (после лечения) 0 степень абс. % 0 0 0 0 0 0 0 0 1-я степень абс. % 1 6,7 5 33,3 1 10 1 10 лечения представлены в табл. 6, из которой видно, что исходно у больных обеих групп наблюдается резкое снижение – в 2,5–3 раза абсолютной концентрации КЖК по сравнению с нормой; в профиле С2–С4 кислот снижена доля уксусной и масляной кислот и повышена доля пропионовой кислоты. АИ у больных с ЗЛ в обеих группах исходно отклонены в область резко отрицательных значений (–0,681 и –0,644 ед. соответственно). Как указывалось выше, снижение абсолютного содержания КЖК свидетельствует о снижении активности и численности индигенной толстокишечной микрофлоры. Снижение уровня уксусной кислоты при данных значениях АИ также связано со снижением количества облигатной флоры, в том числе молочнокислой (бифидои лактобактерий), что соотносится с результатами бактериологического исследования кала. Повышение уровня пропионовой кислоты свидетельствует об увеличении численности и активности анаэробной микрофлоры, представленной в основном популяциями микроорганизмов родов Bacteroides, пропионибактерий и др. (в основном их факультативных и остаточных штаммов) [5]. Таким образом, исходно (еще до проведения АБТ) у больных с заболеваниями легких констатируются выраженные изменения микробиоценоза толстой кишки. Данный феномен может быть объяснен косвенным воздействием на микрофлору, обусловленным легочной патологией (гипоксия и изменение циркуляции водорода) [1]. Неполное высвобождение Н2 в легких, обусловленное наличием патологии, приводит к возврату и накоплению его в полости кишечника. Это, в свою очередь, вызывает смещение окислительно-восстановительного потенциала внутрипросветной среды в сторону резко отрицательных значений, при которых блокируются железосодержащие ферменты, обеспечивающие жизнедеятельность облигатных анаэробов. На этом фоне начинают активно размножаться условно-патогенные анаэробы (штаммы условнопатогенных бактероидов), что было указано выше. На фоне проводимой комплексной терапии (АБТ+«Стимбифид») у больных основной группы (2А) отмечается тенденция к повышению абсолютной кон- 2-я степень абс. % 11 73,3 8 53,3 7 70 5 50 3-я степень абс. % 3 20 2 13,4 2 20 4 40 4-я степень абс. % 0 0 0 0 0 0 0 0 центрации КЖК. В группе сравнения (2Б ) концентрации КЖК в кале практически не изменяется. Данный факт свидетельствует о тенденции к восстановлению микробиоценоза кишечника в основной подгруппе. После проведения антибактериальной терапии в основной (2А) группе пациентов (АБТ+«Стимбифид») формируется нормальный профиль кислот: отмечается достоверное повышение долей уксусной и масляной кислот при снижении доли пропионовой кислоты, что отражается на изменении АИ, которые после лечения смещаются в сторону нормальных значений. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что у больных, получавших БАД «Стимбифид», наблюдалась тенденция к восстановлению (в ряде случаев – нормализации) качественного состава микроорганизмов и нормализации внутрипросветной кишечной среды, способствующей этому восстановлению. В группе больных, получавших только АБТ (2Б), после лечения происходило дальнейшее ухудшение состояния микрофлоры толстой кишки, выражающееся в нарастании отклонений не только доли пропионовой, но и масляной кислоты, что свидетельствует об активизации не только вышеуказанной остаточной анаэробной микрофлоры (рода Bacteroides), но и условно-патогенных штаммов микроорганизмов рода Clostridium [5]. АИ после лечения отклоняются в область более отрицательных значений, что свидетельствует об усугублении среды обитания микроорганизмов, нарастании дисбаланса между а/анаэробными популяциями микроорганизмов. Таким образом, можно констатировать высокую эффективность БАД «Стимбифид» в качестве средства профилактики нарушений микробиоценоза при проведении АБТ. Была также оценена эффективность БАД «Стимбифид» в коррекции микроэкологических нарушений, возникших вследствие АБТ. Исследования были выполнены у 25 пациентов с заболеваниями легких (ЗЛ), которые были разделены также на 2 подгруппы (3А и 3Б): основную группу (3А) составили 15 человек, которые после проведенной АБТ получали БАД «Стимбифид», подгруппу сравнения (3Б) – 10 паци- Таблица 6. Результаты исследования суммарного содержания КЖК (фракции С2–С6 с изомерами), профилей С2–С4 и значений анаэробных индексов у групп больных с заболеваниями легких на фоне лечения 10,51±2,5 Уксусная кислота 0,634±0,004 Пропионовая кислота 0,189±0,01 Масляная кислота 0,176±0,004 –0,576 (±0,012) 3,89±1,59 0,595±0,008 0,252±0,007 0,153±0,008 –0,681 (±0,012) –0,104 5,95±1,94* 0,620±0,009* 0,202±0,009* 0,178±0,008* –0,612 (±0,013)* –0,036* 3,99±0,95 0,608±0,009 0,241±0,007 0,151±0,009 –0,644 (±0,011) –0,069 4,05±0,51 0,563±0,011* 0,248±0,008 0,189±0,009* –0,776 (±0,014) –0,200* Группа Сумма Норма Основная (2А) группа (до лечения) Основная группа (после лечения) Группа (2Б) сравнения (до лечения) Группа сравнения (после лечения) АИ Примечание. M±m, для p<0,05. * – при сравнении показателей до и после лечения. ДАИ (N) ДАИ леч 0,067* –0,132* Вздутие Урчание Изменение характера стула: периодическое послабление запоры чередование запоров и поносов Патологические примеси в кале Боль в животе Симптомы отсутствуют Группа 2А (АБТ+«Стимбифид») (n=15) абс. % 9/3 66/20 10/4 66,7/26,7 Группа сравнения (2Б) (n=10) абс. % 6/4 60/40 7/4 70/40 12/4 0/0 0/0 80/26,7 0/0 0/0 8/5 0/0 1/0 80/50 0/0 10/0 5/1 33,3/6,7 4/1 40/10 5/1 33,3/6,7 3/1 30/10 2/5 13,3/33,3 1/2 10/20 Примечание. В числителе указано абсолютное значение и процент встречаемости симптома до проведения АБТ, в знаменателе – после проведения АБТ. ентов, которым не проводилась коррекция нарушений микробиоценоза после АБТ. Основу схем в обеих группах (100 и 90% соответственно) составили антибактериальные средства, обладающие широким спектром действия (полусинтетические пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды). У 86,7 и 90% больных с ЗЛ (подгруппы 3А и 3Б соответственно) после лечения АБ-препаратами были выявлены симптомы кишечной диспепсии (см. табл. 7). У пациентов основной группы (3А), получавших «Стимбифид», на фоне 18-дневного курса приема отмечены положительные сдвиги в клинической симптоматике: боли купированы у 4 человек (26,7%), исходно наблюдались у 5 (33%), урчание – у 6 человек (40%), исходно имелись у 10 (66,7%), метеоризм – у 6 человек (40%), исходно наблюдался у 9 (66%). Нормализовалась консистенция стула и частота дефекаций у 8 пациентов (53,3%) (исходно – у 12 человек – 80%). У 4 пациентов (26,7) отмечено исчезновение слизи в кале, исходно имелась у 5 (33,3%). Увеличилось время транзита карболена по пищеварительному тракту («карболеновая проба») с 15,3±3,7 до 20,1±3,1 часа. Таким образом, в основной группе после лечения уменьшились и/или полностью купировались явления кишечной диспепсии, нормализовалась консистенция стула, отмечено снижение частоты патологических примесей в кале. В группе сравнения (3Б) через 18 дней после окончания лечения АБ-препаратами также отмечалось снижение частоты симптомов кишечной диспепсии после проведения АБТ (однако менее выраженное по сравнению с основной группой): боли исчезли у 1 человека (10%), исходно наблюдались у 3 пациентов (30%), урча- Таблица 8. Распределение больных с заболеваниями легких по степени выраженности дисбактериоза после проведения АБТ Группа Основная (3А) группа (n=15) (до лечения) Основная группа (после лечения) Группа (3Б) сравнения(n=10) (до лечения) Группа сравнения (после лечения) 0 степень абс. % 0 0 1 6,7 0 0 0 0 1-я степень абс. % 2 13,3 7 46,7 1 10 2 20 2-я степень абс. % 7 46,7 6 40 5 50 6 60 3-я степень абс. % 6 40 1 6,7 4 40 2 20 4-я степень абс. % 0 0 0 0 0 0 0 0 Глава II ПРЕБИОТИКИ Симптомы сборник научных статей Динамика симптомов кишечной диспепсии у больных после проведения АБТ ние – у 3 человек, исходно наблюдалось у 7 чел (70%), метеоризм – у 2 человек, исходно имелся у 6 (60%). После лечения кашицеобразный стул выявлен у 5 больных (50%), исходно – у 8 пациентов (80%). Патологические примеси в кале (слизь) выявлены у 1 пациента (10%), исходно – у 4 человек (40%). Незначительно увеличилось время транзита карболена по пищеварительному тракту («карболеновая проба») с 15,2±3,7 до 18,1±3,4 ч. У пациентов обеих групп (3А и 3Б) после проведения АБТ выявлены изменения в составе главной, факультативной и остаточной микрофлоры толстой кишки при бактериологическом исследовании кала, заключающиеся в снижении количества бифидо- и лактобактерий (100% в обеих группах), появлении кишечной палочки с измененными свойствами (лактозонегативной, гемолитической) – у 9 пациентов (60%) основной группы и у 5 пациентов группы сравнения (50%), выявлении факультативных и условнопатогенных энтерококков у 7 пациентов (46,7%) основной группы и у 5 пациентов (50%) группы сравнения, золотистого стафилококка у 3 (20%) и у 2 (20%) пациентов соответственно, повышенного количества клостридиальной флоры у 9 (60%) и 5 (50%) пациентов соответственно и грибов рода кандида у 7 пациентов (46,7%) основной группы и у 5 пациентов (50%) группы сравнения. После приема БАД «Стимбифид» в основной группе (3А) увеличение количества облигатной флоры (бифидобактерий, лактобактерий) отмечено у 6 пациентов (40%), нормализация – у 3 пациентов (20%), уменьшение выявления неполноценной и гемолизирующей кишечной палочки – у 6 пациентов (40%), клостридий – у 7 пациентов (46,7%). Уменьшилось также количество условнопатогенных энтеробактерий у 4 пациентов (26,7%), однако продолжали выявляться грибы рода Кандида у 3 пациентов (20%). Через 18 дней после окончания лечения АБ-препаратами у пациентов группы сравнения (3Б) в микробиологическом статусе произошли также незначительные положительные изменения: повысилось количество облигатной молочнокислой флоры (бифидобактерий, лактобактерий) у 2 пациентов (20%), снизилась частота выявления неполноценной и гемолизирующей кишечной палочки у 2 пациентов (20%), клостридий у 2 пациентов (20%), условно-патогенных энтеробактерий у 1 пациента (10%), грибов рода Кандида у 2 пациентов (20%). Динамика степени выраженности дисбактериоза (по В.Н. Красноголовец) представлена в табл. 8, из которой видно, что после приема БАД «Стимбифид» отмечается снижение степени выраженности дисбактериоза: 0 степень установлена у 1 пациента (6,7%), 1-я степень – у 7 больных (46,7%), 2-я – у 6 больных (40%), 3-я – у 1 пациента (6,7%). В группе сравнения (3Б) через 18 дней наблюдения отмечено незначительное снижение степени выраженности дисбактериоза: 1-я степень установлена у 2 больных (20%), 2-я – у 6 больных (60%), 3-я – у 2 пациентов (20 %). Методом газожидкостного хроматографического анализа были исследованы КЖК в кале больных исследуемых групп. 89 Таблица 7. Глава II ПРЕБИОТИКИ Таблица 9. Результаты исследования суммарного содержания КЖК (фракции С2–С6 с изомерами), профилей С2–С4 и значений анаэробных индексов у больных с заболеваниями легких после АБТ 10,51±2,5 Уксусная кислота 0,634±0,004 Пропионовая кислота 0,189±0,01 Масляная кислота 0,176±0,004 –0,576 (±0,012) 4,15±1,35 0,562±0,008 0,247±0,007 0,191±0,008 –0,779 (±0,012) –0,203 6,95±1,06* 0,619±0,009* 0,200±0,009* 0,181±0,008 –0,615 (±0,013)* –0,039* 4,05±1,01 0,563±0,007 0,248±0,007 0,189±0,009 –0,776 (±0,011) –0,200 5,20±0,95 0,580±0,011 0,236±0,008 0,184±0,009 –0,724 (±0,013) –0,248 Группа Сумма Норма Основная (3А) группа (до лечения) Основная группа (после лечения) Группа (3Б) сравнения (до лечения) Группа сравнения (после лечения) АИ ДАИ (N) ДАИ леч 0,164* –0,052 90 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Примечание. M±m, для p<0,05, * – при сравнении показателей до и после лечения. Результаты изучения абсолютного содержания КЖК (С2–С6) в кале у больных исследуемых групп на фоне лечения представлены в табл. 9, из которой видно, что после курса приема БАДа «Стимбифид» в основной группе (3А) пациентов фиксируется тенденция к формированию нормального профиля кислот: отмечается достоверное повышение доли уксусной кислоты и снижение доли пропионовой кислоты, что отражается на изменении АИ, которые после лечения смещаются в сторону нормальных значений. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о тенденции к восстановлению (в ряде случаев – нормализации) качественного состава микроорганизмов, восстановлению баланса а/анаэробных популяций микрофлоры и нормализации окислительно-восстановительного потенциала внутрипросветной кишечной среды, и можно констатировать высокую эффективность БАД «Стимбифид» в качестве средства коррекции нарушений микробиоценоза при проведении АБТ. В группе сравнения (3Б) через 18 дней после проведения АБТ также отмечается незначительное увеличение доли уксусной кислоты и снижение уровня пропионовой кислоты. Значения АИ имеют тенденцию к нормализации, что свидетельствует также о восстановлении среды обитания микроорганизмов (однако менее выраженном, чем в основной группе). Это связано с возможностью самовосстановления микрофлоры после устранения повреждающего фактора. В целом побочных эффектов и аллергических реакций не выявлено. У 1 человека из группы ПЗЛ после 1-го дня приема «Стимбифида» появился кашицеобразный стул, который нормализовался при снижении дозы до 3 таблеток в сутки в течение 3 дней. В дальнейшем доза была увеличена до рекомендуемой, при этом послабления стула не отмечалось. Некоторые пациенты в связи с выраженным эффектом продолжили прием «Стимбифида». Выводы 1. БАД «Стимбифид» обладает высокой эффективностью в качестве стимулятора роста бифидобактерий у практически здоровых лиц, как с измененным составом кишечной микрофлоры, так и без него. 2. БАД «Стимбифид» можно назначать как профилактическое и корригирующее дисбиотические нарушения средство как во время проведения антибактериальной терапии, так и после нее. 3. Препарат устраняет явления кишечной диспепсии (урчание, метеоризм), опосредованно приводит к устранению болевого синдрома и восстановлению двигательной активности кишечника. 4. БАД «Стимбифид» характеризуется хорошей переносимостью и отсутствием побочных эффектов. Это позволяет рекомендовать использовать БАД «Стимбифид» с целью стимуляции роста бифидобактерий у практически здоровых лиц, а также для профилактики и устранения нарушений микробиоценоза, связанных с проведением АБТ. Литература 1. Ардатская М.Д. Дисбактериоз кишечника: понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции. //Consilium medicum. – 2008. – Т. 10, № 8. – С. 86–92. 2. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Прихно Н.И., Дубинин А.В. Летучие жирные кислоты и их диагностическое и прогностическое значение в гастроэнтерологической клинике. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. – 2000. – Т. 10, № 5. – С. 63–70. 3. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В., Кондракова О.А. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры, Росс. хим. журн. (ЖРХО им. Менделеева). – 1994. – Т. 38, № 6. – С. 66—78. 4. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., МацулевичТ.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. KMK Scientific Press. Москва. 2003. – 220С. 5. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. Перевод с английского, Москва, «МИР», 1982. 6. Елизаветина Г.А., Ардатская М.Д., Минушкин О.Н. Хронические заболевания кишечника. Современный взгляд на этиологию, патогенез, диагностику и лечение (обзор). Клинический Вестник N2. – 1998. – С. 22–25. 7. Минушкин О.Н. Функциональные расстройства желудочнокишечного тракта. // Consilium medicum. – 2004 . –Т. 6, № 6. – С. 376–381. 8. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. Дисбактериоз кишечника. //Российский Медицинский журнал. – 1999, №3. – С. 40–45. 9. Парфенов А.И. Клинические проблемы дисбактериоза.// Рос. Гастроэнтерологический журнал. – 1999, N4. – С. 49–55. 10. Ардатская М.Д., Иконников Н.С., Минушкин О.Н. Способ разделения смеси жирных кислот фракции С2–С6 с изомерами методом газожидкостной хроматографии. Патент РФ на изобретение № 2220755, 2002. 11. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. В 3-х томах.– М. – Грантъ –1998. 12. Gibson G.R., Macfarlane G.T. (edit.) Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology and pathology.// CRC Press. 1995, pp. 1–18. 13. Hentges D.J. Human intestinal microflora in health and disease.// New York: Academic Press, 1983. 14. Macfarlane G.T., Macfarlane S. Human colonic microbiota: ecology, physiology and metabolic potential of intestinal bacteria.// Scand. J. Gastroenterol. – 1997. – Vol. 32 (Suppl. 222). – P. 3–9. 15. Salminen S., Isolauri E., Onela T. Gut flora in normal and disordered states.// Chemotherapy. – 1995. – Vol. 41 (Suppl 1). – P. 5–15. 16. Short Chain Fatty Acids. Congress Short Report Falk Symposium, comp. by Scheppach W., Strasbourg. – 1993. – Vol. 50 p. 17. Tannock G.W. Normal microflora.// London: Chapman & Hall. 1995. Чичерин И.Ю.1, Дармов И.В.2, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2 1 Глава II ПРЕБИОТИКИ МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА БЕЛЫХ МЫШЕЙ И МОРСКИХ СВИНОК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АНТИБИОТИКОАССОЦИИРОВАННОМ ДИСБАКТЕРИОЗЕ И ВОЗМОЖНОСТЬ ЕЕ КОРРЕКЦИИ ПРЕБИОТИКОМ СТИМБИФИД* ООО «МедСтар», 2 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии INTESTINAL MICROFLORA OF WHITE MICE AND GUINEA PIGS IN EXPERIMENTAL ANTIBIOTIC-ASSOCIATED DYSBACTERIOSIS AND THE POSSIBILITY OF ITS CORRECTION WHITH PREBIOTIC STIMBIFID I.Yu. Chicherin1, I.V. Darmov2, I.P. Pogorelsky2, I.A. Lundovskikh2 РЕЗЮМЕ SUMMARY Цель исследования. Изучение состава микрофлоры кишечника белых мышей и морских свинок при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе и оценка возможности ее коррекции пребиотиком Стимбифид. Материалы и методы. В экспериментах использовали белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Оценивали восстановление собственной микрофлоры кишечника лабораторных животных при пероральном введении пребиотика Стимбифид. Результаты. Установлено положительное влияние пребиотика Стимбифид на восстановление собственной кишечной микрофлоры белых мышей и морских свинок, в том числе бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Заключение. Пребиотик Стимбифид является эффективным средством коррекции нарушений микрофлоры кишечника у лабораторных животных с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Ключевые слова: экспериментальный дисбактериоз, лабораторные животные, кишечная микрофлора, коррекция микрофлоры, пребиотик Стимбифид. Purpose of the study. Analysis of the composition of intestinal microflora of white mice and guinea pigs in an experimental antibiotic-associated dysbacteriosis and assessment of the possibility of its correction with prebiotic Stimbifid. Materials and methods. White mice and guinea pigs in an experimental antibiotic-associated dysbacteriosis were used in the experiments. The recovery of their own intestinal microflora of laboratory animals was evaluated after prebiotic Stimbifid oral administration. Results. The positive effect of prebiotic Stimbifid has been found to restore their own intestinal microflora of white mice and guinea pigs, including Bifidobacteria, Lactobacillus and Escherichia. Conclusion. Prebiotic Stimbifid has been shown to be useful for the correction of the intestinal microflora of laboratory animals in an experimental antibiotic-associated dysbacteriosis. Key words: experimental dysbacteriosis, laboratory animals, intestinal microflora, microflora correction, prebiotic Stimbifid. ВВЕДЕНИЕ В последующем появляются энтеробактерии (преимущественно кишечные палочки), лактобактерии и бифидобактерии. Фекальная микрофлора взрослых животных и людей характеризуется выраженным разнообразием. За исключением микроорганизмов, по которым имеются неполные данные, нормальная микрофлора мышей представлена 13 биологическими видами (общее количество микроорганизмов – 5,0·1010 КОЕ·г-1), морских свинок – также 13 биологическими видами (общее количество микро- Человек и животные рождаются стерильными, но уже в первые часы и дни после рождения их кожа и слизистые заселяются микроорганизмами, количество и видовой состав которых определяются условиями прохождения родов, состоянием внешней среды и типом вскармливания [1-4]. В начале формирования микробиоценоза кишечника у новорожденных преимущественно встречаются микрококки, стафилококки, энтерококки и клостридии [2; 5; 6]. * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Микрофлора кишечника белых мышей и морских свинок при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе и возможность ее коррекции пребиотиком Стимбифид. Журнал инфектологии.- Т.4.- 2012.- №1.- С. 75-80. сборник научных статей LLC «MedStar», 2 Vyatka State University 91 1 Глава II ПРЕБИОТИКИ организмов – 3,6·109 КОЕ·г-1), у взрослых людей – 11-12 биологическими видами при общем количестве микроорганизмов 1,2·109 КОЕ·г-1 [2; 3; 5; 6]. И если у мышей общее количество микроорганизмов примерно на порядок выше, чем у морских свинок и людей, то по группам микроорганизмов, входящих в состав фекальной микрофлоры, животные и люди различаются иногда незначительно, а иногда на несколько порядков. Кишечная микрофлора, наряду с другими микроорганизмами различных биотопов организма человека, считается главным биогенным фактором, определяющим здоровье или развитие заболевания [7]. Нормальная микрофлора кишечника является весьма чувствительной микроэкологической системой организма [8; 9]. Количественные и качественные ее изменения относят к дисбактериозам [10], при которых происходит снижение не только общего числа кишечной микрофлоры, но и отдельных ее представителей: бифидобактерий (до 107-108 КОЕ·г-1), лактобактерий (до 105-106 КОЕ·г-1), эшерихий (до 106-108 КОЕ·г-1) [11]. Клинико-лабораторные исследования явились основой формирования концепции, согласно которой микробный консорциум в кишечнике человека имеет четко выраженную индивидуальность, что в конечном итоге предполагает индивидуализацию создания пробиотиков из аутоштаммов и симбиотических микроорганизмов [7; 11]. Апробация таких пробиотиков, а также внедряемых в клиническую практику пребиотиков, может быть осуществлена на лабораторных животных с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Как показали клинические наблюдения, его формированию как у детей [12], так и у взрослых [13] способствует длительное и бесконтрольное применение антибиотиков и химиотерапевтических препаратов. Цель настоящего исследования – изучение состава микрофлоры кишечника белых мышей и морских свинок при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе и оценка возможности ее коррекции пребиотиком Стимбифид. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В экспериментах использовали пребиотический препарат Стимбифид (серия 030910, произведен ООО «В-МИН»/ООО «МедСтар», Россия). Препарат создан на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов, содержит премикс витаминно-минеральный «Immunity» и вспомогательные вещества (натрия бикарбонат, лактоза, кальция стеарат). Эффективность пребиотика Стимбифид подтверждена клиническими исследованиями [11]. Гентамицин для парентерального введения произведен фирмой-изготовителем KRKA, Словения [14]. Выращивание бифидобактерий и лактобактерий, выделяемых из состава кишечной микрофлоры, проводили на плотных питательных средах рекомендованного состава [15; 16] в микроаэрофильных условиях с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III-LE 003 (Hi Media Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Выращивание эшерихий проводили на агаре Хоттингера и агаре Эндо. Количество жизнеспособных микроорганизмов в пересчете на 1 г фекалий (КОЕ·г-1) определяли высевом соответствующих десятикратных разведений суспензий биоматериала на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчетом выросших колоний бактерий по истечении времени инкубирования при температуре 37°С. В работе использовали прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18-20 г и морских свинок массой 250-300 г, беспородных, обоего пола. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [17]. 92 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Таблица 1. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей при пероральном – введении гентамицина (Х±I 95, n=5) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 начало эксперимента 1 2 3 4 5 6 7 (6,2±0,6)·109 (3,4±0,4)·107 (1,7±0,6)·107 (2,3±0,4)·106 (2,4±0,3)·106 (2,2±0,6)·106 (8,8±0,7)·105 (2,2±0,6)·105 (6,1±0,6)·106 н (2,1±0,6)·104 н н (1,2±0,6)·103 н (1,6±0,7)·102 (1,8±0,8)·108 н (1,2±0,4)·106 н н (1,4±0,7)·105 н (1,2±0,6)·104 (1,5±0,6)·104 н (2,4±0,6)·103 н н (1,2±0,8)·102 н (1,0±0,5)·101 Примечание – Здесь и в таблицах 2-6 «н» - определение не проводили Таблица 2 Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок при пероральном – введении гентамицина (Х±I 95, n=5) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 начало эксперимента 1 2 3 4 5 6 7 (7,8±0,5)·108 (2,1±0,4)·108 (2,5±0,3)·108 (3,1±0,6)·107 (2,4±0,5)·106 (1,3±0,5)·106 (2,4±0,4)·105 (3,3±0,5)·103 (1,2±0,3)·107 н (1,4±0,5)·106 н н (9,1±0,4)·104 н (1,2±0,4)·102 (8,9±0,6)·106 н (3,3±0,5)·105 н н (6,2±0,6)·104 н (6,3±0,5)·101 (1,3±0,6)·106 н (1,4±0,4)·104 н н (1,3±0,6)·102 н (1,3±0,5)·101 Глава II ПРЕБИОТИКИ Непосредственно в день начала введения пребиотика Стимбифид у животных опытных и контрольных групп отбирали фекалии для бактериологического исследования и определения общего количества фекальной микрофлоры в 1 г экскрементов и таких ее представителей, как бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии. По численности и времени появления в фекалиях животных определяемых видов микроорганизмов судили об эффективности пребиотика Стимбифид [7; 11]. Результаты определений представлены в таблицах 3-6. Из приведенных результатов следует, что исходное общее содержание фекальной микрофлоры составило: у белых мышей – 8,2·104 КОЕ·г-1, у морских свинок – 5,5·103 КОЕ·г-1. Однако уже через сутки после начала перорального введения препарата Стимбифид животным опытных групп общее содержание фекальной микрофлоры как у белых мышей, так и у морских свинок превысило почти в 1000 раз аналогичный показатель у животных контрольных групп, не получавших пребиотик Стимбифид. Определение количества жизнеспособных бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий на 2 сутки экспериментов, как и общего количества микроорганизмов, содержащихся в фекалиях животных опытных групп, свидетельствует о преобладающем их увеличении в сравнении с увеличением микроорганизмов в фекалиях животных контрольных групп. В дальнейшем вплоть до 7 суток наблюдений отмечается положительное влияние пребиотика Стимбифид на количественное содержание кишечной микробиоты таких контролируемых видов микроорганизмов, как бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии. У животных контрольных групп, получавших только пищевой рацион, восстановление нарушений кишечного микробиоценоза значительно отстает от животных экспериментальной группы, получавших пребиотик Стимбифид (рисунки 1–3). ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Определение пребиотикам, данное М.В. Roberfroid [18], относится к избирательно ферментируемым ингредиентам пищи, которые специфически меняют состав и (или) активность микрофлоры желудочно-кишечного тракта, что сопровождается улучшением самочувствия и здоровья человека. Пребиотический эффект созданного в России препарата Стимбифид, содержащего фруктоолиго- и фруктополисахариды и премикс витаминно-минеральный, был зафиксирован в экспериментах in vitro и на людях разных возрастных категорий, о чем свидетельствуют клинические отчеты, в частности отчет о клинико-лабораторном исследовании современных про- и пребиотических препаратов, проведенном в ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» [11]. На фоне лечения пребиотиком Стимбифид у больных отмечалась нормализация диспептических явлений со стороны желудочно-кишечного тракта, а также отчетливая тенденция к закреплению стула и исчезновение побочных эффектов – «вздутия живота» и повышенной перистальтики кишечника. Важно подчеркнуть, что пребиотик Стимбифид, как это указано в отчете [11], в равной степени эффективно корригирует различные типы нарушений состава микроорганизмов кишечника. В этой связи представлялось целесообразным в экспериментах на лабораторных животных определить эффективность пребиотика Стимбифид при восстановлении нарушенного микробиоценоза кишечника белых мышей и морских свинок, вызванного пероральным введением антибиотика гентамицин. сборник научных статей Представленные в работе Б.А. Шендерова [5] данные свидетельствуют о том, что при пероральном введении канамицина, стрептомицина и других аминогликозидов их концентрация в 1 г фекалий людей может достигать 20000-24000 мкг, что значительно превышает минимальную подавляющую концентрацию для большинства бактерий фекальной микрофлоры. Гентамицин в отличие от других аминогликозидов при приеме внутрь практически не всасывается в желудочно-кишечном тракте и оказывает местное действие [14]. Вызывая микроэкологические нарушения в кишечнике, гентамицин может инициировать развитие дисбактериоза кишечника у подопытных лабораторных животных при пероральном введении. С учетом представленных в работе [5] данных, а также среднесуточных доз препарата для людей, гентамицин вводили белым мышам и морским свинкам per os туберкулиновым шприцем посредством иглы с оливой на конце в дозах 2,9 и 30 мг соответственно 2 раза в сутки в пересчете на единицу поверхности тела. Начиная с первого дня введения антибиотика, у животных отбирали фекалии для определения общего количества фекальной микрофлоры. Кроме того, на 1, 2, 5 и 7 сутки экспериментов определяли содержание бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Результаты экспериментов представлены в таблицах 1 и 2. Из представленных результатов видно, что уже через сутки после начала введения гентамицина животным отмечается снижение общего количества фекальной микрофлоры, причем оно более выражено у морских свинок. У белых мышей такого резкого понижения общего содержания фекальной микрофлоры под влиянием гентамицина не происходит: на 7 сутки эксперимента общее содержание кишечной микрофлоры составило 2,2·105 КОЕ·г-1 по сравнению с исходным количеством 6,2·109 КОЕ·г-1. Наряду со снижением общего количества фекальной микрофлоры, как это следует из представленных в таблицах 1 и 2 результатов, у белых мышей и морских свинок под влиянием гентамицина происходит снижение количества бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Даже после прекращения перорального введения животным гентамицина в течение последующих 2 суток происходит дальнейшее понижение количества указанных представителей фекальной микрофлоры. Наблюдение за животными показало, что если в начале экспериментов фекалии как биоматериал для исследования получали непосредственно от животных, то уже на 3 сутки у белых мышей и на 4 сутки у морских свинок испражнения на исследование отбирали из подстилки в индивидуальных кюветах для содержания животных. Нарушение эвакуаторной функции кишечника у подопытных животных не сопровождалось отказом от приема пищи и проходило без вмешательства извне на 3-4 сутки после прекращения введения гентамицина. На 4 сутки после прекращения перорального введения гентамицина белые мыши и морские свинки с выраженными дисбиотическими изменениями фекальной микрофлоры были разделены на две группы. Одной группе животных вводили пребиотик Стимбифид. Вторая группа животных была контрольной: белые мыши и морские свинки в этих группах не получали пребиотик Стимбифид. Согласно инструкции по применению пребиотика Стимбифид, препарат вводили per os в суточных дозах с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела, которые составили для белых мышей 13 мг, а для морских свинок 131 мг. 93 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава II ПРЕБИОТИКИ А. Б. КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Рисунок 1 – Динамика концентрации бифидобактерий в кишечном содержимом белых мышей (А) и морских свинок (Б) на фоне введения гентамицина (1), пребиотика Стимбифид (2) и при самовосстановлении кишечной микрофлоры (3) А. Рисунок 1 – Динамика концентрации бифидобактерий в кишечном содержимом белых мышей (А) и морских свинок (Б) на фоне введения гентамицина (1), пребиотика Стимбифид (2) и при самовосстановлении кишечной микрофлоры (3) А. 94 Б. Б. Рисунок 1 – Динамика концентрации бифидобактерий в кишечном содержимом белых мышей (А) и морских свинок (Б) на фоне введения гентамицина (1), пребиотика Стимбифид (2) и при самовосстановлении кишечной микрофлоры (3) Глава II ПРЕБИОТИКИ ментально: у лабораторных животных с антибиотикоассоциированным дисбактериозом после прекращения перорального введения антибактериального препарата происходит постепенное восстановление естественной кишечной микрофлоры, но этот процесс затянут по времени. Таким образом, «скорость восстановления» нормальной микрофлоры кишечника у лабораторных животных, содержащихся на обычном пищевом рационе, невелика и может пройти 18-20 дней до того момента, когда численные значения таких представителей нормальной микро- Результаты проведенных бактериологических исследований фекалий белых мышей и морских свинок показали, что у лабораторных животных на фоне перорального введения гентамицина был выявлен дисбактериоз кишечника, сопровождавшийся «вздутием живота» и нарушением перистальтики кишечника. При этом кишечная микрофлора у лабораторных животных фактически являлась критическим звеном нарушенной регуляции, требующим определенного воздействия для самовосстановления. Следует подчеркнуть, что факт самовосстановления кишечной микрофлоры зафиксирован экспери- Таблица 3 Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей опытной группы при – антибиотико-ассоциированном дисбактериозе на фоне введения пребиотика Стимбифид (Х±I 95, n=5) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 начало эксперимента 1 2 3 4 (8,2±0,5)·104 (2,2±0,4)·107 (1,5±0,2)·108 (8,2±0,4)·109 (3,5±0,4)·109 (1,6±0,5)·102 н (2,4±0,3)·105 н н (2,1±0,5)·107 н (3,2±0,3)·107 (1,4±0,3)·104 н (4,2±0,4)·106 н н (2,4±0,5)·108 н (5,4±0,4)·108 (1,3±0,3)·101 н (3,1±0,3)·102 н н (3,2±0,3)·103 н (3,4±0,3)·104 5 6 7 (8,6±0,4)·109 (2,4±0,4)·1010 (3,2±0,3)·1010 Таблица 4. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей контрольной груп– пы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе (Х±I 95, n=5) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 начало эксперимента 1 2 3 4 5 6 7 (8,2±0,5)·104 (3,2±0,6)·104 (4,2±0,4)·104 (8,6±0,4)·105 (8,2±0,4)·105 (7,5±0,2)·105 (4,5±0,4)·106 (2,1±0,4)·106 (1,6±0,4)·102 н (3,2±0,4)·102 н н (2,4±0,3)·103 н (4,5±0,3)·104 (1,0±0,4)·103 н (2,5±0,4)·103 н н (1,2±0,5)·104 н (3,5±0,4)·105 (1,2±0,3)·101 н (2,2±0,3)·101 н н (2,1±0,4)·102 н (1,6±0,4)·103 Таблица 5 Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок опытной группы – при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе на фоне введения пребиотика Стимбифид (Х±I 95, n=5) начало эксперимента 1 2 3 4 5 6 7 (5,5±0,6)·103 (2,5±0,4)·106 (6,5±0,4)·106 (8,8±0,5)·109 (4,4±0,6)·109 (4,6±0,5)·109 (4,4±0,5)·109 (5,4±0,4)·109 (1,5±0,4)·102 н (3,4±0,5)·104 н н (1,5±0,6)·106 н (2,1±0,5)·107 (5,5±0,4)·101 н (3,6±0,4)·104 н н (2,5±0,3)·105 н (3,4±0,4)·106 (1,3±0,3)·101 н (1,7±0,3)·102 н н (3,6±0,4)·104 н (2,4±0,5)·105 Таблица 6 Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок контрольной – группы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе (Х±I 95, n=5) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 начало эксперимента 1 2 3 4 5 6 7 (5,5±0,7)·103 (3,2±0,5)·103 (4,2±0,6)·103 (1,4±0,5)·104 (2,6±0,8)·104 (4,6±0,7)·105 (4,8±0,8)·105 (6,8±0,7)·106 (1,4±0,6)·102 н (1,8±0,6)·102 н н (1,8±0,6)·103 н (1,6±0,5)·104 (4,8±0,5)·101 н (6,4±0,7)·101 н н (2,5±0,5)·103 н (4,5±0,6)·104 (2,1±0,6)·101 н (6,8±0,5)·101 н н (1,2±0,4)·102 н (2,8±0,7)·103 сборник научных статей Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 95 Микроорганизмы Глава II ПРЕБИОТИКИ флоры, как бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии будут соответствовать физиологической норме. Восстановлению собственной микрофлоры кишечника у лабораторных животных способствуют такие компоненты продуктов питания, входящих в пищевой рацион, как пищевые волокна трав, злаковых и фруктов, полисахариды и другие соединения, обладающие пребиотическим эффектом. Пероральное введение лабораторным животным с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом пребиотика Стимбифид в соответствующих дозировках способствовало увеличению как общего содержания фекальной микрофлоры, так и бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. При этом четко прослеживается тенденция ускоренного восстановления собственной кишечной микрофлоры у животных опытных групп, получавших пребиотик Стимбифид (рисунки 1-3). На 7 сутки экспериментов (таблицы 3-6) результаты бактериологического исследования фекалий животных опытных и контрольных групп наглядно свидетельствуют о значительном отставании «скорости восстановления» собственной микрофлоры кишечника у животных контрольных групп в сравнении с аналогичным процессом у животных опытных групп. Таким образом, полученные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что под влиянием пребиотика Стимбифид, перорально вводимого белым мышам и морским свинкам, наблюдается положительная динамика восстановления собственной кишечной микрофлоры у животных. Кроме того, полученные результаты с позиции экспериментальной бактериологии подтверждают данные клинико-лабораторных исследований [7; 11; 13] об эффективности современных препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта, в частности путем восстановления собственной микрофлоры кишечника, а не вынужденного заселения его чужеродными штаммами микроорганизмов [7]. 96 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ ЛИТЕРАТУРА 1. Покровский В.И. Человек и микроорганизмы. Здоровье и болезнь // Вестник РАМН. – 2000. – № 11. – С. 3-6. 2. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрокт. – 1998. – № 1. – С. 61-65. 3. Van der Guchte M., Serror P., Chervanx С. et al. Stress responses in lactic acid bacteria // Antonie van Leenwenhoek. – 2002. – Vol. 82, № 2. – P. 187-216. 4. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro // Журн. микробиол. – 2005. – № 2. – С. 56-61. 5. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. – М.: Издательство ГРАНТЪ, 1998. – 288 с. 6. Бочков И.А., Семеена Н.А., Кайтмазов А.К. и др. Микробная колонизация и сукцессия в толстой кишке у новорожденных детей при совместном с матерью пребыванием в родильном доме // Антибиот. и химиотер. – 1991. – Т. 36, № 12. – С. 24-26. 7. Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза // Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. – 2011. – № 3. – С. 77–84. 8. Justensen J., Haagen N.O. Jacobsen J.E. The normal cultivable microflora in upper jejunal fluid in healthy adults // Scand. J. Gastroenterol. – 1984. – Vol. 19, № 2. – P. 279-282. 9. Шендров Б.А. Нормальная микрофлора и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии // Антибиот. и мед. биотехнол. – 1987. – Т.32, № 2. – С. 18-24. 10. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. – 1997. – № 3. – С. 4-7. 11. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про– и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. – М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010. 12. Бельмер С.В. Дисбактериоз кишечника как осложнение антибактериальной терапии // Детские инфекции. – 2007. – Т. 6, № 2. – С. 44-48. 13. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю. Фруктоолиго- и фруктополисахариды в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника у больных бронхолегочной патологией, получающих антибактериальную терапию // Эксп. и клин. гастроэнтерол.. – 2011. – № 3. – С. 79-89. 14. Гентамицин-К. Инструкция, применение, описание лекарственного действия, синонимы, аналоги и цена препарата Гентамицина – К (международное название Гентамицин) – http://www. ros-med.info. 15. Иванов В.П. Бойцов А.Г., Коваленко А.Д. и др. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. – Спб.: Центр госсанэпиднадзора, 2002. 16. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus // Журн. микробиол. – 1992. – № 9-10. – С. 74-78. 17. Ашмарин И.П. Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. – Л.: Медгиз, 1962. 18. Roberfroid M.B. Prеbiotics: the concept revisited // J. Nutr. – 2007. – Vol. 137, № 3. – P. 830S-837S. Чичерин И.Ю.1, Дармов И.В.2, Лундовских И.А.2, Погорельский И.П.2, Маракулин И.В.2 1 Глава II ПРЕБИОТИКИ ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕБИОТИКА СТИМБИФИД, ПРЕДОТВРАЩАЮЩАЯ РАЗВИТИЕ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ НА ФОНЕ АНТИБИОТИКОТЕРАПИИ* ООО «МедСтар», 2 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии PREBIOTIC STIMBIFID PROTECTIVE ACTIVITY PREVENTS THE DEVELOPMENT OF INTESTINAL MICROBIOCENOSIS DISORDERS IN EXPERIMENTAL ANIMALS AGAINST THE BACKGROUND OF ANTIBIOTIC THERAPY I.Yu. Chicherin1, I.V. Darmov2, I.A. Lundovskikh2, I.P. Pogorelsky2, I.V. Marakulin2 РЕЗЮМЕ SUMMARY Цель исследования. Оценка эффективности применения пребиотика Стимбифид для коррекции нарушений микробиоценоза кишечника экспериментальных животных на фоне антибиотикотерапии гентамицином. Материалы и методы. В экспериментах использовали отечественный пребиотический препарат Стимбифид. Нарушение микробиоценоза кишечника у белых мышей и морских свинок инициировали пероральным введением гентамицина. Оценку эффективности применения пребиотика Стимбифид на экспериментальных животных проводили на фоне антибиотикотерапии. Результаты. Установлено значительное снижение общего количества микроорганизмов, а также бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий у животных контрольных групп, получавших антибиотик гентамицин per os. Самовосстановление кишечной микрофлоры у животных контрольных групп носит затяжной характер. У животных опытных групп, получавших пребиотик Стимбифид, практически не отмечено существенного изменения количественного состава кишечной микрофлоры. Заключение. Пребиотик Стимбифид характеризуется хорошей переносимостью экспериментальными животными и отсутствием побочных эффектов, обеспечивает сохранение оптимального состава кишечной микрофлоры на фоне перорального введения гентамицина. Ключевые слова: микрофлора, пробиотик, пребиотик, гентамицин, дисбактериоз, коррекция микрофлоры кишечника. Purpose of the study. Evaluation of the efficiency of prebiotic Stimbifid for the correction of intestinal microbiocenosis of experimental animals against the background of antibiotic gentamicin therapy. Materials and methods. Domestic prebiotic preparation Stimbifid was used in the experiments. Disorders of intestinal microbiocenosis in white mice and guinea pigs were initiated by oral administration of gentamicin. Evaluation of the efficiency of prebiotic Stimbifid on experimental animals was carried out against the background of antibiotic therapy. Results. Significant reduction in the total number of microorganisms, as well as Bifidobacterium, Lactobacillus and Escherichia, is established experimentally in control groups of animals treated with antibiotic gentamicin per os. Self-recovery of the intestinal microflora in animals of control groups is protracted. In animals of experimental groups treated with prebiotic Stimbifid significant change in the quantitative composition of intestinal microflora practically is not found. Conclusion. Prebiotic Stimbifid is characterized by good tolerability of experimental animals and no side effect, ensures the conservation of optimal composition of intestinal microflora after oral administration of gentamicin. Key words: microflora, probiotic, prebiotic, gentamicin, correction of intestinal microflora. ВВЕДЕНИЕ И.В. Андреева, отвечая на вопрос о целесообразности и сроках начала применения пробиотиков, считает необходимым учитывать данные о чувствительности основных пробиотиков (в частности на основе лакто- и бифидобактерий) к антимикробным препаратам и клинические В научной литературе достаточно подробно освещены вопросы влияния антибиотиков на кишечную микрофлору, а также вопросы регуляции микрофлоры кишечника, в том числе с использованием пробиотиков [1-8]. * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Лундовских И.А., Погорельский И.П., Маракулин И.В. Протективная активность пребиотика Стимбифид, предотвращающая развитие нарушений микробиоценоза кишечника экспериментальных животных на фоне антибиотикотерапии. Журнал Международной Медицины.- 2012.- №1(1).- С.105-110. сборник научных статей LLC «MedStar», 2 Vyatka State University 97 1 Глава II ПРЕБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 98 данные об эффективности применения пробиотиков на фоне антибактериальной терапии [9]. В этой связи следует сказать, что сам по себе прием антибактериальных препаратов приводит к нарушению микробиоценоза кишечника [7; 10; 11]. Концентрация антибиотиков в фекалиях после орального применения терапевтических доз лекарственных препаратов, по данным Б.А. Шендерова [12], может значительно превышать их минимальную подавляющую концентрацию для большинства микроорганизмов, в том числе пробиотических. С другой стороны, опубликованные результаты клинических наблюдений свидетельствуют о том, что применение пробиотиков не влияет на риск развития диареи [13; 14]. Одной из причин этого, по всей вероятности, является выраженная чувствительность пробиотических микроорганизмов, входящих в состав коммерческих препаратов, ко многим антибактериальным препаратам. Так, по нашим данным, результаты которых опубликованы в работе [15], пробиотические микроорганизмы 23 изученных коммерческих пробиотических препаратов в основной массе чувствительны к представителям основных классов антимикробных препаратов в опытах in vitro в концентрациях в плотных питательных средах, соответствующих максимальным концентрациям препаратов в крови. Лишь некоторые пробиотические микроорганизмы устойчивы к 1-4 антибактериальным препаратам: микроорганизмы пробиотиков Бификол и Линекс – к одному (рифампицину, ампициллину соответственно); пробиотиков Бактисубтил, Колибактерин и Лактобактерин – к двум (хлорамфениколу и бисептолу, рифампицину и бисептолу, доксициклину и налидиксовой кислоте (неграму) соответственно); пробиотиков Примадофилус Бифидус – к трем (ампициллину, доксициклину и налидиксовой кислоте); пробиотика Бифиформ – к четырем препаратам (гентамицину, рифампицину, бисептолу, налидиксовой кислоте). Несмотря на данные in vitro о чувствительности пробиотических микроорганизмов к многим антимикробным препаратам, результаты клинических исследований демонстрируют эффективность пробиотиков совместно с антибиотиками при профилактике возникновения нежелательных лекарственных реакций (в первую очередь, со стороны желудочно-кишечного тракта) [9]. Указанную эффективность можно, по-видимому, объяснить тем, что продукты распада микробных клеток и их метаболиты, не являясь пребиотиками, дают определенные преимущества полезной микрофлоре при минимуме их утилизации [16]. Согласно современной концепции пребиотикотерапии [16; 17], при лечении дисбактериозов во главу угла поставлено стимулирующее воздействие на популяции бифидобактерий и лактобактерий. В этой связи представляется целесообразным провести экспериментальное изучение влияния современного препарата Стимбифид на восстановление нормальной кишечной микрофлоры у морских свинок и белых мышей с микроэкологическими нарушениями кишечника под влиянием перорального введения антибиотика. Целью настоящего исследования является оценка эффективности применения пребиотика Стимбифид для коррекции нарушений микробиоценоза кишечника экспериментальных животных на фоне антибиотикотерапии гентамицином. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для выделения из фекалий экспериментальных животных бифидобактерий и лактобактерий использовали плотные питательные среды рекомендованного соста- ва [18; 19]. Выращивание микроорганизмов в микроаэрофильных условиях осуществляли при температуре 37 °С с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Marc III – LE003 (Hi Media Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Выращивание эшерихий проводили на агаре Хоттингера и агаре Эндо. Нарушение микробиоценоза кишечника у белых мышей и морских свинок инициировали пероральным введением гентамицина [20]. Пребиотический препарат Стимбифид (серия 030910 ООО «В-МИН»/ ООО «МедСтар», Россия) содержит инулин, олигофруктозу, витамины (С, В1, В6, В12, Е, РР, фолиевую кислоту, пантотеновую кислоту, биотин) и микроэлементы (цинк, селен). Гентамицин для парентерального введения произведен ОАО «Биохимик», Россия. Количество жизнеспособных микроорганизмов в пересчете на 1 г фекалий (КОЕ•г-1) определяли высевом соответствующих десятикратных разведений суспензий биоматериала на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчета выросших колоний бактерий по истечении времени инкубирования при температуре 37 °С. В работе использовали прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18-20 г и морских свинок массой 25-300 г, беспородных, обоего пола. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [21]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В экспериментах использовали 20 белых мышей и 20 морских свинок. В соответствии с данными, представленными в работе [20], развитие нарушений микробиоценоза у животных инициировали введением гентамицина per os туберкулиновым шприцем посредством иглы с оливой на конце в дозах 2,9 мг и 30 мг соответственно белым мышам и морским свинкам 2 раза в сутки в пересчете на единицу поверхности тела, исходя из среднесуточных доз антибиотика для людей. Белых мышей и морских свинок, получавших per os гентамицин, разделили на две группы по 10 особей: одна группа животных являлась опытной, в которой после перорального введения гентамицина животным вводили пребиотик Стимбифид в суточных дозах с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела – белым мышам 13 мг, морским свинкам 131 мг; животные второй (контрольной) группы получали только антибиотик гентамицин. Продолжительность введения гентамицина белым мышам и морским свинкам с целью инициации и развития дисбиотических изменений в кишечнике животных – 7 суток. Пребиотик Стимбифид вводили белым мышам и морским свинкам опытных групп с первого по последний день проведения экспериментов. Начиная с первого дня введения антибиотика, у животных отбирали фекалии для определения общего количества микрофлоры. Кроме того, в начале экспериментов, на 2, 5 и 7 сутки в фекалиях животных определяли содержание бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Результаты экспериментов представлены в таблице 1. Из представленных в таблице 1 результатов видно, что уже на 2 сутки после начала введения гентамицина животным контрольных групп отмечается снижение общего количества фекальной микрофлоры. Одновременно происходит значительное снижение содержания бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. К 7 суткам введения Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом при пероральном введении – пребиотика Стимбифид (Х±I 95, n=10) Группа животных Микроорганизмы Общее количество Белые мыши, получавшие Бифидобактерии гентамицин и пребиотик Лактобактерии Стимбифид Эширихии Общее количество Белые мыши, получавшие Бифидобактерии гентамицин (контроль) Лактобактерии Эширихии Общее количество Морские свинки, полуБифидобактерии чавшие гентамицин и Лактобактерии пребиотик Стимбифид Эширихии Общее количество Морские свинки, поБифидобактерии лучавшие гентамицин Лактобактерии (контроль) Эширихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало 2 5 7 эксперимента 9 9 9 (7,1±0,8)•10 (5,6±0,6)•10 (3,1±0,6)•10 (1,8±0,7)•109 6 6 6 (5,6±0,5)•10 (2,4±0,7)•10 (2,2±0,5)•10 (2,1±0,6)•106 8 8 8 (2,5±0,6)•10 (2,6±0,6)•10 (2,0±0,7)•10 (1,6±0,7)•108 4 4 3 (1,6±0,5)•10 (1,8±0,6)•10 (5,6±0,5)•10 (1,5±0,5)•103 9 7 6 (6,8±0,6)•10 (1,7±0,6)•10 (2,1±0,6)•10 (1,2±0,6)•105 6 4 3 (5,7±0,7)•10 (3,6±0,8)•10 (1,5±0,7)•10 (1,4±0,7)•102 8 6 5 (2,4±0,6)•10 (4,2±0,6)•10 (1,2±0,7)•10 (1,5±0,6)•104 4 3 2 (1,9±0,8)•10 (3,2±0,7)•10 (1,9±0,8)•10 (1,2±0,7)•101 8 8 8 (8,2±0,6)•10 (7,6±0,6)•10 (5,6±0,7)•10 (3,9±0,5)•108 7 7 7 (1,5±0,8)•10 (1,6±0,8)•10 (1,2±0,6)•10 (1,1±0,7)•107 6 6 6 (8,1±0,6)•10 (6,5±0,7)•10 (5,3±0,6)•10 (5,0±0,8)•106 6 6 6 (1,2±0,5)•10 (1,1±0,7)•10 (1,1±0,8)•10 (1,0±0,8)•106 8 7 6 (2,3±0,6)•10 (1,4±0,6)•10 (4,1±0,8)•103 (8,1±0,7)•10 7 6 4 (1,4±0,5)•10 (1,3±0,6)•10 (6,4±0,7)•10 (1,4±0,5)•102 6 5 4 (8,6±0,7)•10 (3,0±0,5)•10 (4,5±0,7)•10 (6,2±0,7)•101 6 4 2 (1,3±0,4)•10 (1,6±0,6)•10 (1,6±0,8)•10 (2,0±0,6)•101 животным гентамицина общее содержание кишечной микрофлоры у белых мышей контрольной группы снизилось на 4 порядка, у морских свинок контрольной группы – на 5 порядков. Скорость снижения общего содержания кишечной микрофлоры у животных контрольных групп, определяемая как частное от деления разницы значений концентрации микроорганизмов в начале и после окончания введения гентамицина на 7 (продолжительность введения гентамицина в днях), составила для белых мышей 9,7•108 КОЕ•г-1•сут-1, для морских свинок – 1,6•108 КОЕ•г- 1•сут-1. При этом отмечалось снижение числен- Глава II ПРЕБИОТИКИ Таблица 1. ности бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий в фекалиях как у белых мышей, так и у морских свинок. Отмеченные выраженные дисбиотические изменения кишечной микрофлоры сопровождались явными нарушениями общего состояния животных, заключающимися во внешней неопрятности, снижении активности, плохом поедании корма, неоформленности фекалий. Животные опытных групп являли собой полную противоположность: получая антибиотик гентамицин и пребиотик Стимбифид, животные оставались активными, подвижными, опрятными, хорошо поедали корм. Бактериологическое исследование фекалий свидетельствовало Таблица 2. Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Белые мыши, получавшие пребиотик Стимбифид Лактобактерии Эширихии Общее количество Белые мыши: самовосБифидобактерии становление кишечной Лактобактерии микрофлоры (контроль) Эширихии Общее количество Морские свинки, Бифидобактерии получавшие пребиотик Лактобактерии Стимбифид Эширихии Общее количество Морские свинки: самоБифидобактерии восстановление кишечной Лактобактерии микрофлоры (контроль) Эширихии 99 Группа животных Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало 2 5 7 эксперимента (1,9±0,6)•109 (2,5±0,6)•109 (3,1±0,8)•109 (2,1±0,4)•1010 (2,2±0,5)•106 (2,4±0,7)•106 (2,7±0,7)•107 (3,5±0,6)•107 (1,6±0,6)•108 (3,1±0,8)•108 (2,9±0,8)•108 (2,4±0,8)•108 (1,8±0,6)•103 (2,1±0,6)•104 (3,4±0,7)•103 (3,1±0,6)•104 (1,3±0,5)•105 (4,3±0,5)•105 (7,6±0,7)•105 (2,4±0,5)•106 (1,4±0,5)•102 (3,0±0,6)•102 (2,5±0,5)•103 (3,9±0,6)•104 (1,6±0,7)•104 (2,1±0,7)•103 (1,8±0,7)•104 (3,6±0,5)•105 (1,3±0,8)•101 (2,5±0,5)•101 (2,0±0,6)•102 (2,1±0,6)•103 (3,1±0,6)•108 (4,2±0,7)•108 (7,6±0,8)•108 (4,1±0,7)•109 (1,6±0,5)•107 (2,4±0,6)•107 (2,1±0,8)•107 (2,4±0,6)•107 (4,1±0,6)•106 (4,8±0,7)•106 (4,5±0,6)•106 (4,6±0,7)•106 (1,5±0,8)•106 (1,6±0,5)•106 (2,1±0,5)•106 (2,9±0,6)•106 (4,6±0,7)•103 (4,7±0,5)•103 (5,5±0,6)•105 (4,2±0,7)•106 (1,6±0,6)•102 (2,1±0,6)•102 (2,0±0,7)•103 (1,8±0,6)•104 (5,0±0,8)•101 (5,9±0,7)•101 (6,9±0,7)•103 (2,5±0,8)•104 (1,9±0,6)•101 (7,1±0,7)•101 (2,4±0,6)•102 (1,2±0,6)•103 сборник научных статей Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом при пероральном введении – пребиотика Стимбифид (Х±I 95, n=10) Глава II ПРЕБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 100 о том, что как общее содержание кишечной микрофлоры, так и содержание ее отдельных представителей не претерпели существенных изменений, из чего можно заключить о благоприятном влиянии на кишечную микрофлору и самочувствие животных опытных групп пребиотика Стимбифид. По окончании введения животным опытных и контрольных групп антибиотика гентамицина, но продолжении введения животным опытных групп пребиотика Стимбифид, фекалии вновь подвергались бактериологическому исследованию на содержание общей микрофлоры и отдельных ее представителей. Бактериологическому изучению фекалии экспериментальных животных подвергались также на 2, 7 и 14 сутки. Результаты исследований приведены в таблице 2 и рисунке 1. Из приведенных данных следует, что у белых мышей и морских свинок в контрольных группах после прекращения перорального введения гентамицина в течение 2 дней изменение численности микрофлоры кишечника и отдельных ее представителей практически не отмечалось. Некоторые изменения численности кишечной микрофлоры у белых мышей и морских свинок в контрольных группах выявились на 2 сутки наблюдения, а уже на 7 сутки прослеживается отчетливая тенденция самовосстановления кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей. К 14 суткам наблюдения продолжался процесс самовосстановления кишечной микрофлоры. В то же время скорость самовосстановления общего содержания микрофлоры, составившая для белых мышей 1,6•105 КОЕ•г-1•сут-1, а для морских свинок – 2,9•105 КОЕ•г-1•сут-1, свидетельствует о том, что нормализация кишечной микрофлоры у животных, находящихся на обычном пищевом рационе, происходит довольно медленно. Состояние микрофлоры кишечника белых мышей и морских свинок опытных групп, в течение всего срока наблюдения получавших пребиотик Стимбифид, можно охарактеризовать как довольно стабильное с тенденцией к увеличению численности. У белых мышей и морских свинок опытных групп на фоне приема пребиотика Стимбифид никаких побочных эффектов не было выявлено. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ А.А. Воробьев с соавторами [22], рассматривая дисбактериозы как актуальную проблему медицины, еще в 1997 г. сформулировали основные направления и задачи, стоящие перед здравоохранением по указанной проблеме. К ним авторы [22] отнесли задачи, имеющие микробиологическую направленность, в частности дальнейшее изучение видового состава нормофлоры человека и ее функций; оценку влияния на видовой состав нормофлоры ряда биотических и абиотических факторов; совершенствование диагностики дисбактериозов при различных патологических состояниях с использованием микробиологических, биохимических, клинических и других простых, экспрессных, экономичных и унифицированных методов. За прошедшие годы знания о роли нормальной микрофлоры и ее функциях постоянно обновлялись. Были установлены наиболее значимые факторы, приводящие к нарушению микробиоценоза кишечника. Достигнуты впечатляющие результаты в плане диагностики, профилактики и лечения дисбактериозов. В арсенале средств коррекции нарушений микробиоценоза кишечника появились современные про- и пребиотические препараты [8]. Эти две большие группы препаратов обоснованно Рисунок 1 – Динамика общего содержания микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей и морских свинок с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом опытных и контрольных групп на фоне введения пребиотика Стимбифид 1 – белые мыши, получавшие пребиотик Стимбифид; 2 – белые мыши (контроль) – самовосстановление микрофлоры; 3 – морские свинки, получавшие пребиотик Стимбифид; 4 – морские свинки (контроль) – самовосстановление микрофлоры включены в качестве необходимого компонента лечения при проведении антибактериальной терапии и связанных с этим коррекцией и профилактикой нарушений микробиоценоза. Следует, однако, отметить неоднозначную оценку эффективности использования пробиотиков с целью предотвращения возникновения нежелательных лекарственных реакций: от недоказанной роли пробиотиков в лечении антибиотико-ассоциированной диареи [13] и отсутствия влияния применения пробиотиков на развитие микроэкологических изменений в кишечнике [14] до подтверждения рандомизированными контролируемыми исследованиями и метаанализами эффективности профилактического применения пробиотиков на фоне антибактериальной терапии [23; 24]. В то же время пребиотики, относящиеся к классу низкомолекулярных углеводов, поли- и дисахариды, олигосахариды, которые широко распространены в природе [8], лишены отдельных недостатков, присущих пробиотикам. Очевидно, по этой причине основной целью включения в терапию пребиотиков является профилактика побочных эффектов фармакотерапии за счет создания оптимальной среды обитания микроорганизмов, препятствующей росту условно-патогенных микроорганизмов, и стимуляции роста индигенной микрофлоры, необходимой для организма хозяина в функциональном отношении [8]. Опубликованные результаты клинико-лабораторного исследования эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта [8; 25; 26], в числе которых фигурирует пребиотик Стимбифид, дают основание говорить о высокой эффективности данного пребиотического препарата в купировании и/или уменьшении выраженности болевого и диспепсического симптомокомплекса, развившегося на фоне антибактериальной терапии [8; 26]. Клиницисты объясняют это положительным воздействием на микробиоценоз кишечника пребиотического препарата Стимбифид, в состав которого входят следующие основные действующие вещества: фруктополисахариды – инулин (РафтилинТМ, Бельгия); фруктоолигосахариды – олигофруктоза (РафтилозаТМ, Бельгия); премикс витаминно-минеральный Immuniti (продукция DSM Nutritional Products Europe Ltd., Швейцария) и вспомогательные вещества – натрия бикарбонат, лактоза, кальция стеарат [8; 25]. 1. Навашин С.М. Некоторые экологические аспекты современной химиотерапии / С.М. Навашин // Антибиот. и химиотер. – 1989. – Т. 34, № 6. – С. 405-406. 2. Тамм А.О. Влияние антибиотиков на кишечную микрофлору и продукцию метаболитов / А.О. Тамм, У.Х. Сийгур, М.Э. Микельсаар // Антибиот. и химиотер. – 1989. – Т. 34, № 6. – С. 409-414. 3. Микельсаар М.Э. Микроэкологические аспекты изучения воздействия антибактериальных препаратов на микрофлору кишечника / М.Э. Микельсаар, У.Х. Сийгур, А.О. Тамм // Антибиот. и химиотер. – 1989. – Т. 34, № 6. – С. 420-425. 4. Ануфриева Р.Г. Изменение микробной экологии и морфологии биопленки толстой кишки белых крыс под влиянием рифампицина / Р.Г. Ануфриева, П.Л. Заславская, Б.А. Шендеров // Антибиот. и химиотер. – 1989. – Т. 34, № 6. – С. 457-462. 5. Гончарова Г.И. Микробная экология кишечника в норме и при патологии // Г.И. Гончарова, В.Г. Дорофейчук, А.З. Смолянская и др. // Антибиот. и химиотер. – 1989. – Т. 34, № 6. – С. 462-466. 6. Коршунов В.М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника / В.М. Коршунов // Журн. микробиол. – 1955. – № 3. – С. 48-55. Глава II ПРЕБИОТИКИ сборник научных статей ЛИТЕРАТУРА 7. Шевяков М.А. Антибиотик-ассоциированная диарея и кандидоз кишечника: возможности лечения и профилактики / М.А. Шевяков // Антибиот. и химиотер. – 2011. – Т. 13, № 3. – С. 279-282. 8. Минушкин О.Н. Фруктоолиго- и фруктополисахариды в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника у больных бронхолегочной патологией, получающих антибактериальную терапию / О.Н. Минушкин, М.Д. Ардатская, И.Ю. Чичерин // Эксп. клин. гастроэнтерол. – 2011. – № 3. – С. 79-87. 9. Андреева И.В. Когда следует назначать пробиотики? / И.В. Андреева // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2011. – Т. 13, № 3. – С. 279-282. 10. Парфенов А.И. Клинические проблемы дисбактериоза / А.И. Парфенов // Рос. гастроэнтерол. журн. – 1999. – № 4. – С. 49-55. 11. Бондаренко В.М. Дисбактериозы кишечника у взрослых / В.М. Бондаренко, Н.М. Грачева, Т.В. Мацулевич // М., КМК Scientific Press. – 2003. – 220 с. 12. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. – М.: Изд-во ГРАНТЪ, 1998. – 288 с. 13. D’Souza A.L. Probiotics in prevention of antibiotic associated diarrhea: meta-analysis / A.L. D’Souza, C. Rajkumar, J. Cooke et al. // BMJ. – 2002. – V. 324 (7350). – P. 1361-1367. 14. Lonnermark E. Intake of Lactobacillus plantarum reduced certain gastrointestinal symptoms during treatment with antibiotics / E. Lonnermark, V. Friman, G. Lappas et al // J. Clin. Gastroenterol. – 2010. – V. 44. – № 2. – P. 106-112. 15. Дармов И.В. Экспериментальное изучение чувствительности микроорганизмов пробиотиков к антибактериальным препаратам / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. – 2011. – № 9. – С. 102-107. 16. Захаренко С.М. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром / С.М. Захаренко, Ю.А. Фоминых, С.Н. Мехтиев // Эффективн. фармакотер. Гастроэнтерол. – 2011. – № 3. – С. 14-20. 17. Roberfrоid M.B. Prebiotics: the concept revisited / M.B. Roberfrоid // J. Nutr. – 2007. – V. 137. – № 3. – P. 830-837. 18. Иванов В.П. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо / В.П. Иванов, А.Г. Бойцов, А.Д. Коваленко и др. – СПб.: Центр госсанэпиднадзора. – 2002. – 31 с. 19. Лихачева А.Ю. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus / А.Ю. Лихачева, В.М. Бондаренко, К.Я. Соколова // Журн. микробиол. – 1992. – № 9-10. – С. 74-78. 20. Заявка на выдачу патента РФ. Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, А.С. Ердякова и др.; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет». № 2011149501/17 (074291): заявл. 15.12.2011. 21. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. – Л.: Медгиз, 1962. – 280 с. 22. Воробьев А.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины / А.А. Воробьев, Н.А. Абрамов, В.М. Бондаренко и др. // Вестн. РАМН. – 1977. – № 3. – С. 77-84. 23. Tong J.L. Meta-analysis: the effect of supplementation with probiotics on eradication rates and adverse events during Helicobacter pylori eradication therapy / J.L. Tong, Z.H. Ran, J. Shen et al. // Aliment. Pharmacol. Ther. – 2007. – V. 25 (2). – P.155-168. 24. Горелов А.В. Профилактика антибиотико-ассоциированной диареи у детей, больных острыми респираторными заболеваниями / А.В. Горелов, Д.В. Усенко, И.Ш. Трефилова // Инф. болезни. – 2008. – № 6 (1). – С. 69-72. 25. Грачева Н.М. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании / Н.М. Грачева, М.Д. Ардатская, А.А. Аваков и др. – М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010. – 23 с. 26. Ардатская М.Д. Эффективность фруктоолиго- и фруктополисахаридов в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника / М.Д. Ардатская, И.Ю. Чичерин, С.В. Стражев и др. // Кремлевская медицина. – 2011. – № 3. – С. 59-66 101 Подтверждением позитивного влияния пребиотика Стимбифид на микробиоценоз кишечника экспериментальных животных – белых мышей и морских свинок являются результаты настоящего исследования. Так, под влиянием перорального введения животным контрольных групп антибиотика гентамицина у них развились выраженные изменения микробиоценоза кишечника. У животных опытных групп, получавших наряду с антибиотиком гентамицином пребиотик Стимбифид, практически не было выявлено существенных изменений кишечной микрофлоры, что благоприятно сказалось на внешнем облике экспериментальных животных и их активности. Анализ динамики самовосстановления кишечной микрофлоры у белых мышей и морских свинок контрольных групп после прекращения перорального введения им антибиотика гентамицина свидетельствует о том, что этот процесс затянут во времени. При этом скорость самовосстановления кишечной микрофлоры у белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом отставала от скорости убыли кишечной микрофлоры в 6,1•103 раз, а у морских свинок – в 5,5•102 раз. К этому следует добавить, что в процессе самовосстановления кишечной микрофлоры общее содержание микроорганизмов в 1 г фекалий белых мышей контрольной группы к 14 дню эксперимента уступало аналогичному показателю у животных опытной группы в 8,7•103 раз, а у морских свинок – в 9,7•102 раз. Таким образом, в контрольных группах животных, где коррекция пребиотиком Стимбифид не проводилась, также отмечалась положительная тенденция, хотя и менее выраженная по сравнению с опытной группой животных, к нормализации биоценоза кишечника после снятия негативно действующего фактора, в частности отмены перорального введения антибиотика гентамицина. В заключение следует отметить, что пребиотический препарат Стимбифид, судя по результатам его испытания на экспериментальных животных с дисбиотическими изменениями кишечной микрофлоры, характеризуется хорошей переносимостью и является высокоэффективным средством профилактики и коррекции дисбиотических нарушений как во время введения животным антибиотика гентамицина, так и после его отмены. Глава II ПРЕБИОТИКИ МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КИШЕЧНИКЕ ПРИ ДИСБАКТЕРИОЗЕ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ПРЕБИОТИКОМ СТИМБИФИД Бредихин В.Н.1, Чичерин И.Ю.2, Погорельский И.П.3, Лундовских И.А.3, Лещенко А.А.3, Лазыкин А.Г. 3 1 ФГУЗ «Противочумный центр» Роспотребнадзора, 2 Научное общество «Микробиота», 3 Вятский государственный университет, кафедра микробиологии MICROECOLOGICAL CHANGES IN THE INTESTINE DURING DYSBACTERIOSIS: EXPERIMENTAL SUBSTANTIATION THE POSSIBILITY OF CORRECTION DYSBIOTIC CHANGES WITH PREBIOTIC STIMBIFID V.N. Bredikhin1, I.Yu. Chicherin2, I.P. Pogorelsky3, I.A. Lundovskikh3, A.A. Leshchenko3, A.G. Lazykin3 102 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 1 FGUZ «Anti-Plague Center» Rospotrebnadzor, 2 Scientific society «Microbiota», 3 Vyatka State University, Department of Microbiology РЕЗЮМЕ SUMMARY Изучен состав кишечной микрофлоры у белых мышей и морских свинок в норме и при антибиотикоассоциированном дисбактериозе. Показано положительное влияние пребиотика Стимбифид на полное восстановление общего количества кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей (бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий) у экспериментальных животных. Ключевые слова: экспериментальный дисбактериоз, лабораторные животные, кишечная микрофлора, коррекция микрофлоры, пребиотик Стимбифид. The composition of the intestinal microflora of white mice and guinea pigs in norm and in an antibiotic-associated dysbacteriosis was studied. The positive effect of the prebiotic Stimbifid has been shown for full recovery of the total amount of the intestinal microflora and its individual representatives (bifidobacteria, lactobacilli and escherichia) in experimental animals. Key words: experimental dysbacteriosis, laboratory animals, intestinal microflora, microflora correction, prebiotic Stimbifid. . ВВЕДЕНИЕ дами при общем количестве микроорганизмов 1,2·109 КОЕ·г-1 [5]. Но если у мышей общее количество микроорганизмов примерно на порядок выше, чем у морских свинок и людей, то по группам микроорганизмов, входящих в состав фекальной микрофлоры, животные и люди различаются иногда незначительно, а иногда на несколько порядков. Кишечная микрофлора, наряду с другими микроорганизмами различных биотопов организма человека, считается главным биогенным фактором, определяющим здоровье или развитие заболевания. Однако при дисбактериозах происходит снижение не только общего числа кишечной микрофлоры, но и отдельных ее представителей: бифидобактерий (до 107-108 КОЕ·г-1), лактобактерий (до 105-106 КОЕ·г-1), эшерихий (до 106-108 КОЕ·г-1) [5]. Клинико-лабораторные исследования, связанные с изучением различных аспектов дисбиотических изменений в желудочно-кишечном тракте людей, явились основой формирования концепции, согласно которой Дисбактериозы отнесены А.А. Воробьевым с соавторами [2] к актуальной проблеме медицины. Авторы цитируемой работы указывают, что дисбактериозом следует называть любое количественное или качественное изменение типичного для данного биотопа состава нормальной микрофлоры человека или животного, возникающее в результате воздействия на макроорганизм или микроорганизмы различных факторов экзогенного и эндогенного характера и влекущие за собой выраженные клинические проявления со стороны макроорганизма либо являющиеся следствием каких-то патологических процессов в нем. Нормальная микрофлора кишечника взрослых животных и людей характеризуется выраженным разнообразием. Так, у мышей она представлена 13 биологическими видами (общее количество микроорганизмов – 5,0·1010 КОЕ·г-1), у морских свинок – также 13 биологическими видами (общее количество микроорганизмов – 3,6·109 КОЕ·г-1), у взрослых людей – 11-12 биологическими ви- В экспериментах использовали пребиотический препарат Стимбифид (серия 030910, произведен ООО «В-МИН»/ООО «МедСтар», Россия). Препарат создан на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов, содержит премикс витаминно-минеральный «Immunity» и вспомогательные вещества (натрия бикарбонат, лактоза, кальция стеарат). Эффективность пребиотика Стимбифид подтверждена клиническими исследованиями [3]. Гентамицин для парентерального введения произведен фирмой-изготовителем KRKA, Словения. Выращивание бифидобактерий и лактобактерий, выделяемых из состава кишечной микрофлоры, проводили на селективных плотных питательных средах в микроаэрофильных условиях при температуре 370С с использованием системы для анаэробного культивирования. Выращивание эшерихий проводили на агаре Хоттингера и агаре Эндо. Общее количество микробных клеток в 1 грамме фекалий экспериментальных животных определяли подсчетом в камере Горяева. Количество жизнеспособных микроорганизмов в пересчете на 1 г фекалий (КОЕ·г-1) определяли высевом соответствующих десятикратных разведений суспензий биоматериала на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчета выросших колоний бактерий по истечении времени инкубирования при температуре 37°С. В работе использовали прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18-20 г и морских свинок массой 250-300 г, беспородных, обоего пола. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [1]. Результаты и обсуждение. Представленные в работе Б.А. Шендерова [5] данные свидетельствуют о том, что при пероральном введении ряда аминогликозидов концентрация последних в 1 г фекалий людей может достигать 20000-24000 мкг, что значительно превышает минимальную подавляющую концентрацию для большинства бактерий фекальной микрофлоры. Гентамицин в отличие от других аминогликозидов при приеме внутрь практически не всасывается в желудочно-кишечном тракте и оказывает местное действие. Вызывая микроэкологические нарушения в кишечнике, гентамицин инициирует развитие дисбактериоза кишечника у подопытных лабораторных животных при пероральном введении. С учетом представленных в работе [5] данных, а также среднесуточных доз препарата для людей, с целью Глава II ПРЕБИОТИКИ сборник научных статей Материалы и методы исследования. инициации дисбактериоза гентамицин вводили белым мышам и морским свинкам per os в дозах 2,9 и 30 мг, соответственно, 2 раза в сутки в пересчете на единицу поверхности тела. Начиная с первого дня введения антибиотика, у животных отбирали фекалии для определения общего количества фекальной микрофлоры. Кроме того, на 1, 2, 5 и 7 сутки экспериментов определяли содержание бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Было установлено, что к 7 суткам эксперимента общее содержание микроорганизмов кишечной микрофлоры в 1 г фекалий белых мышей снизилось по сравнению с исходным количеством в 2,8•104 раз, а морских свинок – в 2,3•105 раз. Наряду со снижением общего количества фекальной микрофлоры у белых мышей и морских свинок под влиянием гентамицина отмечалось снижение количества бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Даже после прекращения перорального введения животным гентамицина в течение последующих 4 суток происходит дальнейшее понижение количества указанных представителей фекальной микрофлоры. На 5 сутки после прекращения перорального введения гентамицина белые мыши и морские свинки с выраженными дисбиотическими изменениями фекальной микрофлоры были разделены на две группы. Опытным группам животных вводили пребиотик Стимбифид. Контрольные группы животных не получали пребиотик Стимбифид. Согласно инструкции по применению пребиотика Стимбифид, препарат вводили per os в суточных дозах с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела, которые составили для белых мышей 13 мг, а для морских свинок 131 мг. Непосредственно в день начала введения пребиотика Стимбифид у животных опытных и контрольных групп отбирали фекалии для бактериологического исследования. По результатам бактериологического исследования фекалий животных судили об эффективности пребиотика Стимбифид. Результаты определений представлены в таблицах 1-3. Из приведенных результатов следует, что исходное общее содержание фекальной микрофлоры составило: у белых мышей – 8,2·104 КОЕ·г-1, у морских свинок – 5,5·103 КОЕ·г-1. Однако уже через сутки после начала перорального введения препарата Стимбифид животным опытных групп общее содержание фекальной микрофлоры как у белых мышей, так и у морских свинок, превысило почти в 1000 раз аналогичный показатель у животных контрольных групп, не получавших пребиотик Стимбифид. Определение количества жизнеспособных бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий на 2 сутки экспериментов, как и общего количества микроорганизмов, содержащихся в фекалиях животных опытных групп, свидетельствует о преобладающем их увеличении в сравнении с увеличением микроорганизмов в фекалиях животных контрольных групп. В дальнейшем, вплоть до 7 суток наблюдений, отмечается положительное влияние пребиотика Стимбифид на количественное содержание кишечной микробиоты таких контролируемых видов микроорганизмов, как бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии. У животных контрольных групп, получавших только пищевой рацион, восстановление нарушений кишечного микробиоценоза значительно отстает от животных экспериментальных групп, получавших пребиотик Стимбифид. Определение пребиотикам, данное М.В. Roberfroid [6], относится к избирательно ферментируемым ингредиентам пищи, которые специфически меняют состав и (или) активность микрофлоры желудочно-кишечного 103 микробное сообщество в кишечнике человека имеет четко выраженную индивидуальность, что в конечном итоге предопределяет индивидуализацию создания пробиотиков из аутоштаммов и симбиотических микроорганизмов. Апробация таких пробиотиков, а также внедряемых в клиническую практику пребиотиков, может проводиться на лабораторных животных с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Как показали клинические наблюдения, его формированию как у детей, так и у взрослых способствует длительное и бесконтрольное применение антибиотиков и химиотерапевтических препаратов. Цель настоящего исследования – экспериментальная оценка возможности коррекции дисбиотических изменений микрофлоры кишечника у белых мышей и морских свинок пребиотиком Стимбифид. Глава II ПРЕБИОТИКИ Таблица 1. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей опытной группы при – антибиотико-ассоциированном дисбактериозе на фоне введения пребиотика Стимбифид (Х±I95, n=5) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 Микроорганизмы начало эксперимента 4 1 2 7 3 8 Общее количество (8,2±0,5)·10 (2,2±0,4)·10 (1,5±0,2)·10 Бифидобактерии (1,6±0,5)·102 4 9 5 9 6 7 (8,6±0,4)·10 (2,4±0,4)·10 (3,2±0,3)·1010 н (2,1±0,5)·107 н (3,2±0,3)·107 8 (8,2±0,4)·10 (3,5±0,4)·10 н 9 10 н (2,4±0,3)·105 Лактобактерии (1,4±0,3)·10 4 н 6 (4,2±0,4)·10 н н (2,4±0,5)·10 н (5,4±0,4)·108 Эшерихии (1,3±0,3)·101 н (3,1±0,3)·102 н н (3,2±0,3)·103 н (3,4±0,3)·104 Таблица 2. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей контрольной – группы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе (Х±I 95, n=5) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 Микроорганизмы начало эксперимента 4 1 2 4 3 Общее количество (8,2±0,5)·10 (3,2±0,6)·10 (4,2±0,4)·10 Бифидобактерии (1,6±0,4)·102 4 4 5 5 5 6 5 7 6 (2,1±0,4)·106 (8,6±0,4)·10 (8,2±0,4)·10 (7,5±0,2)·10 (4,5±0,4)·10 н н (2,4±0,3)·103 н (4,5±0,3)·104 4 н (3,2±0,4)·102 Лактобактерии 3 (1,0±0,4)·10 н (2,5±0,4)·10 3 н н (1,2±0,5)·10 н (3,5±0,4)·105 Эшерихии (1,2±0,3)·101 н (2,2±0,3)·101 н н (2,1±0,4)·102 н (1,6±0,4)·103 Таблица 3. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок опытной группы при – антибиотико-ассоциированном дисбактериозе на фоне введения пребиотика Стимбифид (Х±I95, n=5) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ·г-1 104 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Микроорганизмы начало эксперимента 3 Общее количество (5,5±0,6)·10 Бифидобактерии (1,5±0,4)·102 1 2 6 3 6 4 9 5 9 6 9 (4,4±0,5)·10 7 9 (5,4±0,4)·109 (2,5±0,4)·10 (6,5±0,4)·10 (8,8±0,5)·10 (4,4±0,6)·10 (4,6±0,5)·10 н н (1,5±0,6)·106 н (2,1±0,5)·107 5 н (3,4±0,5)·104 Лактобактерии 1 (5,5±0,4)·10 н 4 (3,6±0,4)·10 н н (2,5±0,3)·10 н (3,4±0,4)·106 Эшерихии (1,3±0,3)·101 н (1,7±0,3)·102 н н (3,6±0,4)·104 н (2,4±0,5)·105 тракта, что сопровождается улучшением самочувствия и здоровья человека. Пребиотический эффект созданного в России препарата Стимбифид, содержащего фруктоолиго- и фруктополисахариды и премикс витаминно-минеральный, был зафиксирован в экспериментах in vitro и на людях разных возрастных категорий, о чем свидетельствуют клинические отчеты, в частности отчет о клинико-лабораторном исследовании современных про- и пребиотических препаратов, проведенном в ФГУН «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» [3]. На фоне лечения пребиотиком Стимбифид у больных отмечалась нормализация диспептических явлений со стороны желудочно-кишечного тракта, а также отчетливая тенденция к закреплению стула и исчезновение побочных эффектов – «вздутия живота» и повышенной перистальтики кишечника. Важно подчеркнуть, что пребиотик Стимбифид, как это указано в работах [3, 4], в равной степени эффективно корригирует различные типы нарушений состава микроорганизмов кишечника. В этой связи представлялось целесообразным в экспериментах на лабораторных животных определить эффективность пребиотика Стимбифид при восстановлении нарушенного микробиоценоза кишечника белых мышей и морских свинок, вызванного пероральным введением антибиотика гентамицин. Результаты проведенных бактериологических исследований фекалий белых мышей и морских свинок показали, что у лабораторных животных на фоне перорального введения гентамицина развился дисбактериоз кишечника, сопровождавшийся «вздутием живота» и нарушением перистальтики кишечника. При этом кишечная микрофлора у лабораторных животных фактически являлась критическим звеном нарушенной регуляции, требующим определенного воздействия для восстановления. Пероральное введение лабораторным животным с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом пребиотика Стимбифид в соответствующих дозировках способствовало увеличению как общего содержания фекальной микрофлоры, так и бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. При этом четко прослеживается тенденция ускоренного восстановления собственной кишечной микрофлоры у животных опытных групп, получавших пребиотик Стимбифид. Следует подчеркнуть, что экспериментально зафиксирован факт самовосстановления кишечной микрофлоры у лабораторных животных контрольных групп с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом: после прекращения перорального введения антибактериального препарата происходит постепенное самовосстановление естественной кишечной микрофлоры, но этот процесс затянут по времени. Самовосстановлению собственной микрофлоры кишечника у лабораторных животных способствуют такие 1. Ашмарин И.П. Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. – Л.: Медгиз, 1962. – 280 с. 2. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. – 1997. – № 3. – С. 4-7. 3. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про– и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. – М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010. – 23 с. 4. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю. Фруктоолиго – и фруктополисахариды в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника у больных бронхолегочной патологии, получающих антибактериальную терапию // Эксп. и клин. гастроэнтерол.. – 2011. – № 3. – С. 79-87. 5. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. – М.: Издательство ГРАНТЪ, 1998. – 288 с. 6. Roberfroid M.B. Prеbiotics: the concept revisited // J. Nutr. – 2007. – Vol. 137, № 3. – P. 830S-837S. Глава II ПРЕБИОТИКИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ сборник научных статей нарушений желудочно-кишечного тракта, в частности путем восстановления собственной микрофлоры кишечника. 105 компоненты продуктов питания, входящих в пищевой рацион, как пищевые волокна трав, злаковых и фруктов, полисахариды и другие соединения, обладающие пребиотическим эффектом. На 7 сутки экспериментов (таблицы 1-3) результаты бактериологического исследования фекалий животных опытных и контрольных групп наглядно свидетельствуют о значительном отставании «скорости восстановления» собственной микрофлоры кишечника у животных контрольных групп в сравнении с аналогичным процессом у животных опытных групп. Резюмируя полученные результаты экспериментальных исследований, можно отметить, что пребиотик Стимбифид характеризуется хорошей переносимостью животными и отсутствием побочных эффектов. При пероральном введении пребиотика Стимбифид у белых мышей и морских свинок отмечается выраженная положительная динамика восстановления общего содержания кишечной микрофлоры, а также отдельных ее представителей – бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Полученные результаты с позиции экспериментальной бактериологии подтверждают данные клиниколабораторных исследований [3, 4] об эффективности пребиотика Стимбифид в коррекции дисбиотических Глава II ПРЕБИОТИКИ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ ПИЩЕВЫХ ВЕЩЕСТВ С ПРЕБИОТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ И ПРЕБИОТИКА СТИМБИФИД К ВОССТАНОВЛЕНИЮ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ У КОНВЕНЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛЫХ МЫШЕЙ С АНТИБИОТИКОАССОЦИИРОВАННЫМ ДИСБАКТЕРИОЗОМ* Чичерин И.Ю.1, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2, Дармов И.В.2, Маракулин И.В.2 1 Научное общество «Микробиота», Сергиев Посад, Россия (141306, Сергиев Посад-6 МО, ул. Октябрьская,19-3), e-mail: rpatron@mail.ru 2 ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru COMPARATIVE EVALUATION OF THE ABILITY OF NUTRIENTS WITH PREBIOTIC EFFECT AND PREBIOTIC STIMBIFID TO RECOVERY INTESTINAL MICROFLORA OF CONVENTIONAL WHITE MICE WITH ANTIBIOTIC-ASSOCIATED DYSBACTERIOSIS Chicherin I.Yu.1, Pogorelsky I.P.2, Lundovskikh I.A.2, Darmov I.A.2, Marakulin I.V.2 106 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 1 Scientific society «Microbiota», Sergiev Posad, Russia (Oktyabrskaya st., 19-3, Sergiev Posad-6, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru, 2 Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Представлены результаты сравнительного изучения эффективности пребиотика Стимбифид и веществ пищевого назначения с пребиотическим действием (Лактит МС, Лайтесс и Лайтесс ультра) в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Восстановление собственной микрофлоры кишечника у животных оценивали при пероральном введении сравниваемых веществ. Установлено, что пребиотик Стимбифид оказывает наиболее выраженное влияние на восстановление нормальной кишечной микрофлоры у подопытных животных. Под влиянием пищевых веществ Лайтесс и Лайтесс ультра скорость восстановления нормальной микрофлоры кишечника приближается к скорости восстановления кишечной микрофлоры под влиянием пребиотика Стимбифид. Лактит МС в меньшей степени, чем Лайтесс и Лайтесс ультра, стимулирует процесс восстановления кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей. Ключевые слова: кишечная микрофлора, лабораторные животные, экспериментальный дисбактериоз, коррекция микрофлоры, пребиотик, пребиотическое действие. The results are presented of comparative evaluation of the efficiency of prebiotic Stimbifid and nutrients with prebiotic effect (Lactitol MS, Litesse and Litesse ultra) in the correction of intestinal microbiocenosis of conventional white mice with antibiotic-associated dysbacteriosis. The recovery of their own intestinal microflora of laboratory animals was evaluated after oral administration of compared substances. Results showed that prebiotic Stimbifid has the most pronounced effect on the recovery of the normal intestinal microflora of experimental animals. Under the influence of the nutrients Litesse and Litesse ultra the recovery rate of the normal intestinal microflora is closed to the recovery rate of the intestinal microflora influenced by prebiotic Stimbifid. Lactitol MS stimulates the recovery of the intestinal microflora and its individual representatives less than Litesse and Litesse ultra. Key words: intestinal microflora, laboratory animals, experimental dysbacteriosis, microflora correction, prebiotic, prebiotic effect. ВВЕДЕНИЕ ляет желать лучшего [1, 2]. Это стало одной из причин использования в клинической практике для профилактики и лечения дисбактериозов кишечника пребиотических препаратов [3, 4]. М.В. Roberfroid [5] определил пребио- Несмотря на то, что на протяжении многих лет было предложено и испытано большое количество пробиотиков, их лечебно-профилактическая эффективность остав- * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дармов И.В., Маракулин И.В. Сравнительная оценка способности пищевых веществ с пребиотическим действием и пребиотика Стимбифид к восстановлению кишечной микрофлоры у конвенциональных белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Медицинский Советник Поволжья.- 2012.№4(4).- С.61-64. В экспериментах использовали пребиотический препарат Стимбифид (серия 030910 ТУ 9330-002-50168265-05 с изм. № 1, произведен ООО «В-МИН»/ООО «МедСтар», Россия). Препарат создан на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов, содержит премикс витаминноминеральный «Immunity» и вспомогательные вещества (натрия бикарбонат, лактоза, кальция стеарат). Эффективность пребиотика Стимбифид подтверждена клиническими испытаниями [6]. Лактит МС – синтетический углеводородный спирт, произведенный из молочного сахара, полученного из молочной сыворотки (продукт изготовлен фирмой «DАNISCO USА Inс», США). Применяется как низкокалорийный подсластитель в выпечке и кондитерской продукции. Включен в список пищевых добавок, не оказывающих вредного воздействия на здоровье человека при использовании для изготовления пищевых продуктов (Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 14.10.2001 г. № 36; СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности продуктов») в качестве текстуратора и подсластителя. Белый кристаллический порошок без запаха с умеренно сладким вкусом, растворим в воде (1,7 г•мл-1 при температуре 25 °С). Таблица 1. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей при пероральном – введении гентамицина (Х±I 95, n=50) Микроорганизмы Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 3 4 7 Общее количество (7,2±0,3)•109 (1,8±0,4)•108 (6,5±0,5)•106 (1,3±0,5)•106 (4,1±0,5)•103 Бифидобактерии (6,2±0,5)•106 (4,1±0,4)•105 (3,2±0,4)•104 (1,5±0,4)•104 (2,1±0,5)•102 Лактобактерии (2,6±0,5)•108 (1,5±0,6)•107 (2,4±0,5)•105 (4,6±0,5)•103 (2,6±0,6)•102 3 3 3 2 (1,8±0,6)•101 Эшерихии (9,0±0,5)•10 (9,0±0,5)•10 (1,6±0,5)•10 (2,3±0,7)•10 Глава II ПРЕБИОТИКИ сборник научных статей Материалы и методы исследования Лайтесс – полисахарид, состоящий из остатков глюкозы (продукт изготовлен фирмой «DАNISCO USА Inс», США). Используется как пищевая добавка и как источник растворимых пищевых волокон при производстве низкожирных и обезжиренных продуктов в качестве органического имитатора жира (СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности продуктов»). Порошок без запаха, очень хорошо растворим в воде (80 г в 100 мл воды при температуре 20 °С); переносимость 90 г в сутки; энергетическая ценность 1 ккал•г-1. Лайтесс ультра – порошкообразная усовершенствованная полидекстроза, представляет собой полимер соединенных остатков глюкозы с остатками сорбита (продукт изготовлен фирмой «DАNISCO Sweeteners Ltd», США). Используется как пищевая добавка в пищевой промышленности. Продукт включен в реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию (СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности продуктов», СанПиН 2.3.2.1293-03 «Гигиенические требования по применению пищевых добавок»). Тонкий белый порошок, вкус слегка сладкий, запах практически отсутствует, очень хорошо растворим в воде (80 г в 100 мл воды при температуре 20 °С). Гентамицин для парентерального применения произведен фирмой-изготовителем КRКА, Словения [8]. Выращивание бифидобактерий и лактобактерий, выделенных из кишечного содержимого лабораторных животных, проводили на плотных питательных средах рекомендованного состава [9, 10] в микроаэрофильных условиях с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark IIILE003 (HiMedia Laboratories Pvt. LTD, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными HiAnaero Gas Pacet. Выращивание эшерихий проводили на агаре Хоттингера и агаре Эндо. Общее количество микробных клеток в пересчете на 1 г фекалий лабораторных животных определяли путем подсчета в камере Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец», Россия). Количество живых микроорганизмов (КОЕ) в суспензиях фекалий лабораторных животных определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений на плотные питательные среды и подсчетом выросших колоний по истечении времени инкубирования при температуре 37 °С. Антибиотико-ассоциированный дисбактериоз кишечника у конвенциональных белых мышей, обоего пола, массой 18-20 г, воспроизводили путем перорального введения гентамицина [11]. Всего в опыте было использовано 50 животных. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [12]. 107 тики как избирательно ферментируемые ингредиенты пищи, специфически влияющие на состав, численность и активность кишечной микрофлоры. Несколько иное определение пребиотикам дано в учебно-методическом пособии [3], согласно которому пребиотики – это препараты или биологически активные добавки немикробного происхождения, не перевариваемые в кишечнике, способные оказывать позитивный эффект на организм через стимуляцию роста и/или метаболической активности нормальной кишечной микрофлоры. На основании сравнительной оценки клиниколабораторной эффективности современных пробиотических и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта, проведенной специалистами ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского», было признано целесообразным использование пребиотиков в постоянном режиме, а также сочетанного курсового приема с пробиотиками для достижения максимального эффекта лечения и профилактики нарушений микробиоценоза кишечника [6]. Цель работы состоит в сравнительном изучении эффективности пребиотика Стимбифид и веществ с пребиотическим действием Лактита МС (входит в состав пробиотика [7]), Лайтесса и Лайтесса ультра в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Глава II ПРЕБИОТИКИ Таблица 2. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей с антибиотикоассоциированным дисбактериозом на фоне энтерального введения пребиотика Стимбифид и – препаратов Лактит МС, Лайтесс и Лайтесс ультра (Х±I 95, n=10) Группа животных Вводимые препараты 1 Пребиотик Стимбифид 2 Лактит МС 3 Лайтесс 4 Лайтесс ультра 5 Препараты не вводили (контроль) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки Скорость восстановэксперимента, КОЕ•г-1 ления индигенных микроорганизмов, начало 2 7 14 КОЕ•г-1•сут-1 эксперимента 3 6 9 10 2,3•109 (4,8±0,6)•10 (2,5±0,5)•10 (9,6±0,8)•10 (1,6±0,5)•10 2 5 7 7 (2,8±0,5)•10 (2,4±0,4)•10 (6,9±0,7)•10 (9,8±0,6)•10 1,4•107 2 5 8 8 (2,9±0,7)•10 (4,8±0,6)•10 (2,6±0,5)•10 (5,6±0,6)•10 8,0•107 1 2 4 4 (2,0±0,6)•10 (3,0±0,4)•10 (1,8±0,4)•10 (2,0±0,5)•10 2,8•103 3 4 7 8 (4,2±0,5)•10 (4,5±0,6)•10 (2,4±0,5)•10 (1,6±0,6)•10 2,3•107 2 3 5 6 (2,1±0,6)•10 (3,1±0,5)•10 (2,8±0,6)•10 (6,5±0,5)•10 9,3•105 2 3 5 7 (2,2±0,5)•10 (4,9±0,6)•10 (2,4±0,5)•10 (5,6±0,6)•10 8,0•106 1 2 3 4 (2,1±0,6)•10 (1,8±0,4)•10 (6,7±0,6)•10 (1,5±0,4)•10 2,1•103 3 5 8 9 (2,9±0,5)•10 (1,6±0,5)•10 (1,3±0,4)•10 (1,5±0,6)•10 2,1•108 2 4 7 7 (2,5±0,6)•10 (4,5±0,6)•10 (1,6±0,6)•10 (2,8±0,6)•10 1,7•107 2 4 6 7 (2,4±0,5)•10 (4,6±0,5)•10 (7,5±0,7)•10 (1,2±0,6)•10 1,7•106 1 2 4 4 (2,3±0,6)•10 (1,9±0,7)•10 (1,2±0,5)•10 (1,5±0,7)•10 2,1•103 3 5 8 9 (4,0±0,6)•10 (1,8±0,6)•10 (2,4±0,6)•10 (1,6±0,7)•10 2,3•108 2 4 7 7 (2,4±0,5)•10 (6,5±0,6)•10 (8,8±0,5)•10 (8,6±0,5)•10 1,3•107 2 4 6 7 (2,8±0,6)•10 (7,2±0,4)•10 (8,1±0,6)•10 (5,9±0,7)•10 8,4•106 1 2 4 4 (2,6±0,7)•10 (3,5±0,6)•10 (1,3±0,5)•10 (2,3±0,6)•10 1,4•103 3 4 5 6 2,6•105 (4,1±0,5)•10 (3,2±0,5)•10 (2,6±0,6)•10 (1,8±0,7)•10 2 2 4 4 (2,9±0,6)•10 (3,0±0,4)•10 (3,5±0,5)•10 (9,1±0,5)•10 1,3•104 2 2 4 4 (2,8±0,7)•10 (2,5±0,5)•10 (3,8±0,6)•10 (8,9±0,7)•10 1,3•104 1 1 2 3 (2,1±0,5)•10 (1,7±0,4)•10 (1,6±0,5)•10 (1,2±0,5)•10 1,7•102 108 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Результаты исследования С учетом представленных в работе Б.А. Шендерова [13] данных, а также среднесуточных доз препаратов для людей, гентамицин вводили белым мышам реr оs туберкулиновым шприцем с иглой и оливой на конце в дозе 2,9 мг два раза в сутки (в пересчете на единицу поверхности тела). Начиная с первого дня введения антибиотика, у животных отбирали фекалии для определения общего количества фекальной микрофлоры, а также бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Результаты бактериологического исследования фекалий подопытных животных в обобщенном виде представлены в таблице 1. Представленные в таблице 1 результаты со всей очевидностью свидетельствуют о глубоких дисбиотических изменениях в составе кишечной микрофлоры у подопытных животных под воздействием перорального введения гентамицина. При этом чисто визуально дисбиотические изменения у животных проявлялись гипокинезией, внешней неопрятностью, выделением жидких фекалий светло-желтого цвета. Таким образом, результаты бактериологического исследования фекалий подопытных белых мышей, а также внешний вид животных однозначно говорят о нарушении состава кишечной микрофлоры у подопытных животных. На 5 сутки после прекращения перорального введения гентамицина белые мыши с выраженными дисбиотическими изменениями фекальной микрофлоры были разделены на 5 групп по 10 особей в каждой. Одной группе животных перорально вводили пребиотик Стимбифид, второй группе животных – Лактит МС, животным третьей группы – полидекстрозу Лайтесс, животным четвертой группы – полидекстрозу Лайтесс ультра. Пятая группа животных была контрольной: белые мыши кроме корма и воды не получали указанных выше веществ. В начале введения животным пребиотика Стимбифид и веществ с пребиотическим действием, а также на вторые, седьмые и четырнадцатые сутки, у животных в каждой из групп отбирали фекалии для бактериологического исследования. Результаты выполненного исследования представлены в таблице 2. Из представленных в таблице 2 данных следует, что наиболее благоприятное влияние на микрофлору кишечника белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом оказывает пребиотик Стимбифид: начиная со 2 дня введения животным данного препарата происходит нарастание численности как общего количества кишечной микрофлоры, так и бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. При этом на 14 сутки экспериментов отмечается значительное увеличение количества перечисленных микроорганизмов в пересчете на 1 г фекалий, что в принципе соответствует физиологическим параметрам. Определение скорости восстановления индигенных микроорганизмов в кишечном содержимом этой группы животных, которое было введено впервые нами в научный оборот [11], свидетельствует о больших потенциальных возможностях пребиотика Стимбифид в коррекции дисбиотических изменений микрофлоры кишечника у экспериментальных животных. Пищевые вещества Лайтесс и Лайтесс ультра (3 и 4 группа подопытных животных соответственно) в значительной степени приближаются к пребиотику Стимбифид как по восстановлению общего количества кишечной микрофлоры, так и отдельных ее представителей – бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. По скорости восстановления общего количества кишечной микрофлоры пищевое вещество Лайтесс уступал пребиотику Стимбифид в 10,9 раз, а пищевое вещество Лайтесс ультра – в 10,0 раз. Лактит МС при пероральном введении белым мышам с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом в меньшей степени, чем Лайтесс и Лайтесс ультра, стиму- В выполненных нами ранее исследованиях по изучению состава микрофлоры белых мышей в норме и при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе и оценке возможности коррекции дисбиотических изменений пребиотиком Стимбифид было установлено положительное влияние пребиотика на восстановление собственной кишечной микрофлоры у подопытных животных, в частности бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий [14]. Полученные данные вполне согласуются с результатами исследования клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочнокишечного тракта [3-6, 15]. Логичным продолжением выполненных исследований стала настоящая работа по сравнительной оценке эффективности многокомпонентного пребиотического препарата Стимбифид и обладающих пребиотическими свойствами химических веществ (Лактит МС, Лайтесс и Лайтесс ультра), разрешенных для применения в пищевой промышленности, в восстановлении кишечной микрофлоры у белых мышей с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Таким образом, вполне оправданы выполненные исследования, в которых в сравнительном плане в опытах in vivo на модели экспериментального антибиотикоассоциированного дисбактериоза изучена пребиотическая эффективность прошедшего клинические испытания пребиотика Стимбифид и разрешенных к применению в пищевой промышленности таких веществ, как Лактит МС, Лайтесс и Лайтесс ультра, обладающих пребиотическим действием. Известно, что в качестве веществ, обладающих пребиотической активностью, рассматриваются глюкоолигосахариды, изомальтоолигосахариды, лактосахароза, полидекстроза, олигодекстраны, гентиоолигосахариды и др. [4]. Эти вещества, как и полноценные пребиотики, стимулируют жизнедеятельность и активность собствен- Глава II ПРЕБИОТИКИ Выводы 1. В опытах на конвенциональных белых мышах с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом в сравнительном плане изучено влияние на восстановление нормальной кишечной микрофлоры веществ, обладающих пребиотическим действием синтетического углеводородного спирта Лактит МС, полисахарида Лайтесс, полидекстрозы Лайтесс ультра, а также поликомпонентного пребиотического препарата Стимбифид. 2. Наиболее выраженный стимулирующий эффект восстановления нормальной кишечной микрофлоры у подопытных животных оказывает пребиотик Стимбифид: под влиянием препарата скорость восстановления общего количества индигенных микроорганизмов составляет 2,3·109 КОЕ·г-1·сут.-1 3. Пребиотический эффект восстановления индигенной микрофлоры у подопытных животных при пероральном введении полисахарида Лайтесс, полидекстрозы Лайтесс ультра менее выражен в сравнении с аналогичным эффектом пребиотика Стимбифид: скорость восстановления общего количества кишечной микрофлоры меньше в 10,9 и 10,0 раз соответственно. сборник научных статей Обсуждение результатов ной индигенной микрофлоры и восстанавливают моторику кишечника. Документально зафиксированные пребиотические эффекты самих пребиотических препаратов и веществ, обладающих пребиотической активностью, вне зависимости от терминологии, важны как для экспериментатора, так и клинициста. В этой связи полученные нами результаты, характеризующие влияние пребиотика Стимбифид и веществ, обладающих пребиотической активностью, на восстановление дисбаланса кишечной микрофлоры у экспериментальных животных, имеют научное и практическое значение. При этом каждое из сравниваемых с пребиотиком Стимбифид вещество по-своему влияет на восстановление общего количества микрофлоры в кишечнике белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, а также отдельных ее представителей – бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Поликомпонентный пребиотический препарат Стимбифид оказывает наиболее выраженное стимулирующее влияние на восстановление кишечной микрофлоры у подопытных животных. На фоне перорального введения животным полисахарида Лайтесс и усовершенствованной полидекстрозы Лайтесс ультра также выявлены положительные сдвиги со стороны кишечной микрофлоры, однако их выраженность примерно на порядок меньше в случае подсчета общего количества микроорганизмов в 1 г фекалий. Синтетический углеводородный спирт Лактит МС можно охарактеризовать как вещество, обладающее пребиотической эффективностью, особенно если сравнение проводить с контрольной группой животных, когда происходит самовосстановление кишечной микрофлоры. Таким образом, изученные пищевые вещества с пребиотическим действием и особенно специально созданный пребиотик Стимбифид оказывают безопасное и эффективное положительное воздействие на нормальную микрофлору желудочно-кишечного тракта экспериментальных животных с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом кишечника. Наиболее выраженной эффективностью обладает пребиотик Стимбифид на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов. 109 лируют процесс восстановления кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей и значительно уступает пребиотику Стимбифид. Так, скорость восстановления общего количества кишечной микрофлоры под влиянием пищевого вещества Лактит МС ниже скорости восстановления кишечной микрофлоры под влиянием пребиотика Стимбифид в 100,0 раз, под влиянием пищевого вещества Лайтесс – в 9,1 раза, а пищевого вещества Лайтесс ультра – в 10,0 раз. У животных контрольной группы, как это следует из представленных в таблице 2 данных, происходит самовосстановление кишечной микрофлоры, но скорость этого процесса невелика. Об этом говорят результаты сравнения, например, скорость восстановления кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей под влиянием пребиотика Стимбифид выше по сравнению с контролем (самовосстановлением) в 8846,1 раза по восстановлению общего количества микроорганизмов в 1 г фекалий, в 1076,9 раза – бифидобактерий, в 6153,8 раза – лактобактерий и в 16,5 раза – эшерихий. Таким образом, полученные экспериментальные данные о коррекции дисбиотических нарушений в составе микрофлоры кишечника у подопытных белых мышей свидетельствуют о потенциальной возможности использования пищевых веществ, обладающих пребиотической эффективностью, в лечении и профилактике дисбактериозов, а также подтвердили высокую лечебную эффективность пребиотика Стимбифид. Глава II ПРЕБИОТИКИ 4. Синтетический углеводородный спирт Лактит МС характеризуется наименьшей пребиотической эффективностью и по скорости восстановления общего количества кишечной микрофлоры уступает пребиотику Стимбифид в 100 раз, а пищевые вещества Лайтесс и Лайтесс ультра в 9,1 и 10,0 раз соответственно. 5. Пребиотик Стимбифид и вещества с пребиотическим действием Лактит МС, Лайтесс и Лайтесс ультра характеризуются хорошей переносимостью подопытными животными и отсутствием побочных эффектов. ЛИТЕРАТУРА 110 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 1. Lebenthal E., Lebenthal Y. Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего признания. Журн. микробиол. 2003; (4): 88-90. 2. Глушанова Н.А. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: дис… д-ра мед. наук: защищена в 2006 г. – М., 2006; 260 с. 3. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. М., ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации; 2010; 50 с. 4. Захаренко С.М., Фоминых Ю.А., Мехтиев С.Н. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром. Эффективная фармакотерапия и гастроэнтерология. 2011; (3): 14-20. 5. Roberfrоid M.B. Prebiotics: The Concept Revisited. J. Nutur. 2007; 137 (3): – 830 S-837 S. 6. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. – М., Московский НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского; 2010; 23 с. 7. Инструкция по применению биокомплекса «Нормофлорин-Б1». Свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.4.413.1.10 от 28.01.2010. Сертификат соответствия клинической эффективности № СДС.Б00022 от 12.07.2007 г. ТУ 9229-001-18840 410-05 от 06.10.2005. Занесение в Государственный реестр 05.10.2005 г. 8. Гентамицин К. Инструкция, применение, описание лекарственного действия, синонимы, аналоги и цена препарата Гентамицина-К (международное название Гентамицин) – http: // www.rоs-med.info. 9. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Г., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо, СПб: Центр госсанэпиднадзора 2002; 31 с. 10. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн. микробиол. 1992; (9-10): 74-78. 11. Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Пробиотики: вектор развития. Практическая медицина. 2012; 3 (58): 180-188. 12. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 13. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. – М.: Изд-во ГРАНТЪ, 1998. – 288 с. 14. Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А. Микрофлора кишечника белых мышей и морских свинок при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбактериозе и возможность ее коррекции пребиотиком Стимбифид. Журн. инфектологии 2012; 4(1): 75-80. 15. Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю., Стражев С.В., Минушкин О.Н. Эффективность фруктоолиго- и фруктополисахаридов в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника. Кремлевская медицина 2011; (3): 59-66. Чичерин И.Ю.1, Погорельский И.П.2, Дармов И.В.2, Лундовских И.А.2, Кулемин Л.М.3, Гаврилов К.Е.2, Дурнев Е.А.2 1 ООО «МедCтар», Сергиев Посад, Россия (141300, Сергиев Посад, ул. Вознесенская, 55), e-mail: rpatron@mail.ru ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru; 3 ЗАО «Ягодное», Киров, Россия (610051, Киров, Ленинский р-н, дер. Югрино), e-mail: zao@yagodnoe.kirov.ru 2 Глава II ПРЕБИОТИКИ ФЕРМЕНТИРОВАННЫЕ ПИЩЕВЫЕ ВОЛОКНА ПРЕПАРАТА РЕКИЦЕН-РД: ПРЕБИОТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ В УСЛОВИЯХ IN VITRO* FERMENTED DIETARY FIBERS OF THE REKICEN-RD PREPARATION: PREBIOTIC EFFECT UNDER THE IN VITRO CONDITIONS I.Yu. Chicherin1, I.P. Pogorelsky2, I.V. Darmov2, I.A. Lundovskikh2, L.M. Kulemin3, K.E. Gavrilov2, E.A. Durnev2 1 LLC «MedStar», Sergiev Posad, Russia (Voznesenskaya st., 55, Sergiev Posad, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru, Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru 3 LLС «Yagodnoe» Kirov, Russia (610051, Kirov- Yugrino), e-mail: zao@yagodnoe.kirov.ru) SUMMARY Представлены результаты изучения влияния ферментированных пищевых волокон препарата Рекицен-РД на колонизацию и размножение лактобактерий и бифидобактерий, входящих в состав сертифицированных пробиотических препаратов Лактобактерин и Бифидумбактерин. В экспериментах использовали регидратированные культуры лактобактерий и бифидобактерий. Инокуляцию пробиотических микроорганизмов проводили в стерильные препараты Рекицена-РД и пшеничных отрубей (препарат сравнения), помещенные в чашки Петри. После инкубирования препаратов с пробиотическими микроорганизмами в оптимальных условиях определяли количество жизнеспособных микроорганизмов, а также изучали их морфологию с использованием электронной микроскопии. Результаты экспериментов свидетельствуют о сохранении нативной структуры лактобактерий и бифидобактерий, использующих ферментированные пищевые волокна препарата Рекицен-РД для роста и размножения в созданных микроаэрофильных условиях. Сохранение жизнеспособности лактобактериями и бифидобактериями, колонизирующими ферментированные пищевые волокна Рекицена-РД, при пониженной температуре в течение 14 суток еще раз подтверждает важность и необходимость для организма ферментированных пищевых волокон, обеспечивающих пробиотические микроорганизмы селективным питанием и энергией. Ключевые слова: пробиотики, бифидобактерии, лактобактерии, пищевые волокна, Рекицен-РД, пшеничные отруби. The results of studies of the effect of fermented dietary fiber preparation Rekicen-RD on the colonization and multiplication of lactobacilli and bifidobacteria, which are comprised in the formulation of the certified probiotic preparations Lactobacterin and Bifidumbacterin, are presented. Rehydrated cultures of lactobacilli and bifidobacteria were used in the experiments. Inoculation with probiotic microorganisms was carried out in sterile preparation Rekicen-RD and wheat bran (reference preparation), placed in Petri dishes. After incubation of preparations with probiotic microorganisms under optimal conditions the numbers of viable microorganisms were determined and their morphology was studied using electron microscopy. The experimental results show the preservation of the native structure of lactobacilli and bifidobacteria that use the fermented dietary fiber preparation Rekicen-RD for the growth and multiplication under microaerophilic conditions created. Preserving the viability of lactobacilli and bifidobacteria, colonizing dietary fiber preparation Rekicen-RD, at low temperature for 14 days once again confirms the importance and necessity for the organisms fermented dietary fi-bers, providing probiotic microorganisms with selective nutrition and energy. Key words: probiotic, bifidobacteria, lactobacilli, dietary fiber, Rekicen-RD, wheat bran. ВВЕДЕНИЕ ника людей. Для того, чтобы бактерии были включены в группу пробиотических микроорганизмов они должны соответствовать определенным критериям: 1) выживать при пассаже через желудочно-кишечный тракт; 2) ад- Пробиотики – широко распространенные препараты, созданные на основе штаммов бактерий, многие из которых выделены из нормальной микрофлоры кишеч- * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Кулемин Л.М., Гаврилов К.Е., Дурнев Е.А. Ферментированные пищевые волокна препарата Рекицен-РД: пребиотический эффект в условиях in vitro. Медицинский Советник Поволжья.- 2012.- №4(4).- С.67-71. 111 РЕЗЮМЕ сборник научных статей 2 Глава II ПРЕБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 112 гезироваться на эпителиальных клетках кишечника с последующей колонизацией; 3) стабилизировать кишечную микрофлору; 4) не иметь признаков патогенности; 5) быть экологически безопасными; 6) сохранять жизнеспособность в пищевых продуктах и в процессе получения фармакопейных лиофилизированных препаратов; 7) быстро размножаться, колонизируя желудочно-кишечный тракт; 8) персистировать с проявлением родовых свойств [1]. Перечисленным критериям в наибольшей степени соответствует нормальная микрофлора кишечника, включая таких постоянных ее представителей, как лакто- и бифидобактерии, кишечная палочка [2, 3]. Несомненно, пробиотики создают эффект, но не всегда и не такой, как предполагалось [4]. Именно поэтому для восстановления количественного и качественного состава кишечной микрофлоры всё шире стали применять пребиотики, обеспечивающие безопасное и эффективное прямое положительное воздействие на нормальную микрофлору желудочно-кишечного тракта и каскад вторичных благоприятных для человека эффектов [5]. Многочисленными исследованиями установлено, что пребиотическим эффектом обладает большое число соединений, в том числе полисахариды (пектины, декстрин, инулин и др.), пищевые волокна трав, злаковых (отруби, Рекицен-РД и др.), фруктов и т.д. [6]. Термин «пищевые (диетические) волокна» был введен в научный оборот E.H. Hipsley еще в 1953 году [7]. В соответствии с концепцией здорового (функционального) питания, утвердившейся в начале в Японии, а затем в странах Европы и США, пищевые волокна относятся к группе физиологически функциональных ингредиентов [8]. Суточный уровень потребления пищевых волокон для людей составляет 20-40 г в сутки [9]. В связи с тем, что пищевые волокна проявляют ряд положительных физиологических эффектов, в частности стимулируют моторную деятельность кишечника, оказывают благоприятное воздействие на некоторые метаболические реакции организма человека, представляется актуальным изучение взаимоотношения сертифицированных пробиотических микроорганизмов лактобактерий и бифидобактерий с ферментированными пищевыми волокнами биодобавки Рекицен-РД, а также влияния указанных пищевых волокон на выживаемость и размножение лактобактерий и бифидобактерий в условиях in vitro. Препарат Рекицен-РД кроме указанных эффектов обладает пребиотическим действием. Связано это с тем, что ферментированные пищевые волокна являются селективным стимулятором роста представителей нормальной микрофлоры кишечника, а содержащиеся в препарате короткоцепочечные жирные кислоты обеспечивают энергией рост и размножение нормальной микрофлоры [10]. Цель исследования – изучение пребиотического эффекта в условиях in vitro ферментированных пищевых волокон препарата Рекицен-РД в отношении лактобактерий и бифидобактерий. Материалы и методы В работе использовали ферментированные пищевые волокна препарата Рекицен-РД (ЗАО «Ягодное», г. Киров-Югрино, Россия), в качестве препарата сравнения – пищевые волокна пшеничных отрубей. При проведении экспериментов применяли коммерческие препараты Лактобактерин (серии 15/6) и Бифидобактерин (серии 315-6), произведенные ФГУП «НПО «Микроген», Россия. Согласно инструкции по медицинскому применению, препарат Лактобактерин сухой создан на основе лактобактерий L. plantarum 8Р-А3, а препарат Бифидумбактерин сухой – на основе B. bifidum № 1. В одной дозе лиофилизата препарата Лактобактерин содержится не менее 2•109 живых лактобактерий, а в одной дозе лиофилизата препарата Бифидумбактерин – не менее 1•107 живых бифидобактерий. Выращивание лактобактерий и бифидобактерий, инокулированных в стерильный субстрат (отруби, РекиценРД) в чашках Петри, проводили в микроаэрофильных условиях при температуре 37 °С с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III-LE003 (Hi Media Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Образцы препарата Рекицен-РД и пшеничных отрубей подвергали стерилизации кипячением в течение 30 минут. Количество жизнеспособных пробиотических микроорганизмов (КОЕ•мл-1) после инокуляции в субстраты и в процессе выращивания определяли высевом соответствующих десятикратных разведений суспензий биоматериала на плотные питательные среды рекомендованного состава [11, 12] в чашках Петри и подсчета выросших колоний бактерий по истечении времени инкубирования при температуре 37 °С. Изучение ультраструктуры лактобактерий и бифидобактерий проводили с использованием электронных микроскопов: сканирующего – JEOL JSM-6510LV (Япония) и просвечивающего – JEOL JEM-1200EX (Япония). Для сканирующей электронной микроскопии готовили препараты на покровном стекле, подсушивали на воздухе, фиксировали в этиловом спирте, после чего проводили платиновое напыление; микроскопию осуществляли при следующих контролируемых параметрах: ускоряющее напряжение – 15 кВ, рабочее расстояние – 18 мм, размер фокусного пятна – 30 %, режим вакуума – глубокий вакуум. Для просвечивающей электронной микроскопии суспензии бактерий после пробоподготовки наносили на медную подложку на 200 Mesh, обрабатывали Таблица 1. Колонизация и размножение пробиотических микроорганизмов, инокулированных в пшеничные отруби и Рекицен-РД Название препарата, штамм микроорганизма Лактобактерин, L. plantarum 8Р-А3 Бифидумбактерин, B. bifidum № 1 Содержание жизнеспособных бактерий, инокулированных в субстрат …, на … час эксперимента, КОЕ•мл-1 (Х±I95) пшеничные отруби Рекицен-РД 0 24 0 24 (1,1±0,4)•108 (1,8±0,6)•109 (1,0±0,3)•108 (7,8±0,6)•109 (1,0±0,3)•106 (2,6±0,7)•109 (1,0±0,3)•106 (9,6±0,8)•109 уранилацетатом и просматривали при ускоряющем напряжении 72 кВ. Статистическую обработку результатов исследований проводили согласно рекомендациям работы [13]. Результаты исследования 113 Простерилизованные кипячением пшеничные отруби и препарат Рекицен-РД в качестве субстрата в асептических условиях выкладывали в чашки Петри с крышками. Регидратированные пробиотики Лактобактерин и Бифидумбактерин инокулировали в чашки Петри с субстратом. Конечная концентрация лактобактерий составила 1•108 КОЕ•мл-1, а бифидобактерий – 1•106 КОЕ•мл-1. Закрытые крышками чашки Петри с субстратом и инокулированными пробиотическими бактериями инкубировали в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов при температуре 37 °С. По завершении времени инкубирования определяли количество жизнеспособных лакто- и бифидобактерий. Результаты экспериментов приведены в таблице 1 и на рисунке 1. Представленные на рисунке 1 и в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что и пшеничные отруби и Рекицен-РД являются не только субстратом для колонизации лактобактерий и бифидобактерий, но и стимулятором роста и размножения пробиотических микроорганизмов. Добавление к субстрату (отрубям и Рекицену-РД) лактобактерий и бифидобактерий в созданных оптимальных условиях роста ведет к колонизации и обрастанию субстрата. Это можно рассматривать с экологической точки зрения как своеобразную «первичную сукцессию», т.е. развитие и размножение биологического вида на незаселенной ранее территории. Глава II ПРЕБИОТИКИ Рисунок 1 – Размножение лактобактерий и бифидобактерий на пшеничных отрубях (верхний ряд) и Рекицене-РД (нижний ряд) сборник научных статей В чашках Петри: 1 – отруби; 2 – отруби с лактобактериями; 3 – отруби с бифидобактериями; 4 – Рекицен-РД; 5 – Рекицен-РД с лактобактериями; 6 – Рекицен-РД с бифидобактериями Рисунок 2 –Рост бифидобактерий на пшеничных отрубях (1) и Рекицене-РД (2) Глава II ПРЕБИОТИКИ 1 (⫻500) 2 (⫻1100) 3 (⫻3000) 4 (⫻550) 5 (⫻7500) 6 (⫻4500) 1 – пшеничные отруби; 2 – лактобактерии и пшеничные отруби; 3 – бифидобактерии и пшеничные отруби; 4 – Рекицен-РД; 5 – лактобактерии и Рекицен-РД; 6 – бифидобактерии и Рекицен-РД 114 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Рисунок 3 – Электронно-микроскопическая картина пищевых волокон пшеничных отрубей, Рекицена-РД и растущих пробиотических микроорганизмов (сканирующая электронная микроскопия, платиновое напыление) В чашках Петри: 1 – отруби; 2 – отруби с лактобактериями; 3 – отруби с бифидобактериями; 4 – Рекицен-РД; 5 – Рекицен-РД с лактобактериями; 6 – Рекицен-РД с бифидобактериями Рисунок 4 – Лактобактерии и бифидобактерии на пшеничных отрубях (верхний ряд) и Рекицене-РД (нижний ряд) после хранения в течение 14 суток Из данных таблицы 1 следует, что ферментированные пищевые волокна Рекицена-РД являются более предпочтительными для роста и размножения лактобактерий и бифидобактерий в сравнении с пшеничными отрубями (рисунок 2). И второе, на что обращают внимание данные таблицы, это более интенсивный рост бактерий на ферментированных пищевых волокнах Рекицена-РД, чем на пищевых волокнах пшеничных отрубей: лактобактерий в 4,9 раз, бифидобактерий – в 3,7 раз. Электронно-микроскопическое изучение субстратов и микробных клеток, выросших на пшеничных отрубях и Рекицене-РД, с использованием сканирующей электронной микроскопии с платиновым напылением свидетельствует, во-первых, о различии структуры отрубей и ферментированных пищевых волокон Рекицена-РД, а во-вторых, о сохранении морфологии бактериями: лактобактерии – ровные прямые палочки; бифидобактерии – полиморфные палочки; размеры клеток укладываются в размеры, приведенные в руководстве Берджи [14]. Обращает на себя внимание тот факт, что пробиотические микроорганизмы (в большей степени бифидобактерии) окружены значительным количеством глобулярных структур (рисунок 3), хорошо видных на электронных микрофотографиях. Выживаемость лактобактерий и бифидобактерий при хранении на пшеничных отрубях и Рекицене-РД (1,9±0,6)•109 (1,7±0,8)•109 (7,5±0,5)•109 (7,1±0,8)•109 (2,5±0,7)•109 (2,0±0,8)•109 (9,1±0,7)•109 (8,9±0,7)•109 Очевидно, что их образование – результат метаболической активности растущих микроорганизмов. Продукты метаболизма лактобактерий и бифидобактерий формируют вместе с пищевыми волокнами матрикс, внутри которого находятся бактерии. Именно поэтому при сканирующей электронной микроскопии с платиновым напылением видны поверхностно расположенные микробные клетки, в то время как находящиеся в полужидкой структуре матрикса бактерии не просматриваются. Следующим этапом работы стало изучение жизнеспособности выросших пробиотических микроорганизмов на ростовых субстратах при хранении чашек Петри в течение 14 суток при температуре (5±2) °С. Высев на плотные питательные среды суспензии желеподобного матрикса и подсчет выросших колоний (таблица 2) показали наличие примерно того же количества жизнеспособных лактобактерий и бифидобактерий, которое представлено на 24-ый час роста в таблице 1. Естественно, что при температуре (5±2) °С размножения и роста пробиотических микроорганизмов не происходило. В то же время сохранение числа жизнеспособных бактерий, находившихся весь период хранения в матриксе, состоящем из пшеничных отрубей и Рекицена-РД, жид- 1 (⫻5000) 2 (⫻8000) 3 (⫻8000) 4 (⫻5000) 5 (⫻5000) 6 (⫻5000) 1 – пшеничные отруби; 2 – лактобактерии и пшеничные отруби; 3 – бифидобактерии и пшеничные отруби; 4 – Рекицен-РД; 5 – лактобактерии и Рекицен-РД; 6 – бифидобактерии и Рекицен-РД Рисунок 5 – Электронно-микроскопическая картина пищевых волокон пшеничных отрубей и Рекицена-РД и пробиотических микроорганизмов, хранившихся в течение 14 дней (просвечивающая электронная микроскопия) сборник научных статей Лактобактерин, L. plantarum 8Р-А3 Бифидумбактерин, B. bifidum № 1 Содержание жизнеспособных бактерий в субстрате … на …сутки эксперимента, КОЕ•мл-1 (Х±I95) пшеничные отруби Рекицен-РД 0 14 0 14 115 Название препарата, штамм микроорганизма Глава II ПРЕБИОТИКИ Таблица 2. Глава II ПРЕБИОТИКИ кости и продуктов метаболизма бактерий, свидетельствует о формировании определенных условий, поддерживающих на минимальном уровне метаболические процессы у микроорганизмов. Как следует из представленных на рисунке 4 фотографий, колонизация пробиотических микроорганизмов, в частности бифидобактерий, на субстратах (пшеничных отрубях и Рекицене-РД) стала еще более выраженной, что говорит в пользу сохранения жизнеспособности лактобактерий и бифидобактерий в процессе хранения. Электронная микроскопия (рисунок 5) является важным дополнением в характеристике хранившихся на субстратах пробиотических микроорганизмов. Так, морфологическая однородность микробных клеток и выраженная фрагментация как пшеничных отрубей, так и ферментированных пищевых волокон Рекицена-РД, свидетельствуют в пользу того, что этот процесс происходил вследствие жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов, инокулированных в субстрат. При этом морфология и размер микробных клеток соответствуют таковым, приведенным в руководстве Берджи [14]. Далее, в поле зрения, особенно в случае бифидобактерий, просматриваются округлые элементы (глобулы или круглые образования с отчетливой сердцевиной), которые со всей очевидностью следует отнести к продуктам жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов. Таким образом, полученные экспериментальные данные дают основание полагать существование значительного потенциала у исследуемых пищевых волокон, используемого лактобактериями и бифидобактериями для роста и размножения. 116 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Обобщение и оценка результатов исследования Пробиотики в свое время вполне обоснованно были включены в схемы профилактики и лечения дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника. Однако, несмотря на довольно многочисленный рынок пробиотиков, предлагаемых для внедрения в клиническую практику, все еще не удается с их помощью решить проблему дисбактериозов. При этом прослеживается явное несоответствие между сложившимся представлением о высокой эффективности пробиотиков и растущим распространением дисбактериозов [4]. Более того, есть данные о том, что применение коммерческих пробиотиков может быть результативным в одних случаях [15], а в других – безрезультатным или вызвать ухудшение микроэкологического статуса [16]. Возможные причины недостаточной эффективности пробиотической коррекции дисбиозов рассмотрены и проанализированы в диссертационной работе Н.А. Глушановой [17]. В последующем лабораторно-клинические исследования позволили сформулировать важнейшее положение о необходимости восстановления собственной микрофлоры кишечника с использованием пребиотиков. Доказана эффективность сочетанного курсового приема пробиотиков с пребиотиками [18], к которым относятся пищевые волокна пшеничных отрубей и ферментированные пищевые волокна Рекицена-РД. Начиная с 1995 г., препарат Рекицен-РД применяется более чем в 20 лечебных учреждениях России для нормализации пищеварения, метаболизма и глубокой очистки организма от шлаков, является селективным питанием, стимулирующим рост собственной нормальной микрофлоры кишечника. Настоящие исследования предприняты с целью более глубокого понимания стимулирующего влияния Рекицена-РД на рост и размножение лактобактерий и бифи- добактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры кишечника человека. Указанные пробиотические микроорганизмы, на основе которых созданы сертифицированные препараты Лактобактерин и Бифидобактерин, были использованы в экспериментах in vitro для оценки их колонизирующей способности и ростовых свойств при инокуляции в простерилизованный препарат Рекицен-РД и, взятые в качестве контроля, простерилизованные пшеничные отруби. Эксперименты показали, что при создании оптимальных микроаэрофильных условий лактобактерии и бифидобактерии колонизируют пищевые волокна пшеничных отрубей и Рекицена-РД, используют их в качестве субстрата для роста и размножения. И в последующем, при хранении выросших культур лактобактерий и бифидобактерий вместе с субстратами при температуре (5±2) °С в течение 14 дней, жизнеспособность пробиотических микроорганизмов сохранилась практически на том же уровне, что и до хранения. Следует подчеркнуть, что бифидобактерии размножаются более интенсивно на пшеничных отрубях и Рекицене-РД, о чем свидетельствуют результаты бактериологического определения количества жизнеспособных бактерий (КОЕ•мл-1). Это во-первых, а, во-вторых, ферментированные пищевые волокна препарата Рекицена-РД являются более предпочтительными в сравнении с пшеничными отрубями для колонизации, роста и размножения как лактобактерий, так и бифидобактерий. При этом, как следует из анализа изображений субстратов и микроорганизмов пребиотиков, сделанных с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, происходят изменения структуры пищевых волокон, на которых размножаются лактобактерии и бифидобактерии. Естественно, что эти изменения являются следствием жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов, как и те глобулярные или округлые образования, видимые при электронной микроскопии субстратов с размножающимися пробиотическими микроорганизмами. Вполне вероятно, что это продукты жизнедеятельности лактобактерий и бифидобактерий, которые сродни описанным в работе В.М. Бондаренко [19] антибиотикоподобным или бактериоциноподобным веществам. Полученные в настоящем исследовании результаты о стимулирующем влиянии пищевых волокон пшеничных отрубей и препарата Рекицен-РД в экспериментах in vitro на рост и размножение лактобактерий и бифидобактерий вполне сопоставимы с результатами клинических исследований, в которых препарат Рекицен-РД прекрасно зарекомендовал себя при лечении дисбактериозов кишечника в качестве эффективного стимулятора роста нормальной микрофлоры, в частности лактобактерий и бифидобактерий, а также препарата, обладающего выраженной антитоксической активностью. В этой связи представляется целесообразным проведение исследований по изучению пребиотического эффекта препарата Рекицен-РД в опытах in vivo по коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника экспериментальных животных с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Выводы 1. Показана эффективность использования ферментированных пищевых волокон препарата Рекицен-РД для колонизации и размножения пробиотических микроорганизмов лактобактерий и бифидобактерий в условиях in vitro. 1. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность. Химич. и биол. безопасность 2007; (2-3): 20-41. 2. Fuller R., Gibson G.R. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health. Clin Microbiol and Infect 1998; 4: 477-480. 3. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microflora: introducing the concept of prebiotics. J Nutr 1995; 125: 1401-1412. 4. Малахов Ю.А. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Материалы Всероссийской конференции с международным участием; 21-23 апреля 1999 г; М: 1999; с. 110. 5. Захаренко С.М., Фоминых А.Ю., Мехтиев С.Н. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром. Эффективная фармакотерапия Гастроэнтерология 2011; (3): 14-20. Глава II ПРЕБИОТИКИ сборник научных статей ЛИТЕРАТУРА 6. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. М: ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации; 2010; 50 с. 7. Hipsley E.H. Dietary «fibre» and pregnancy toxaemia. Brit Med J 1953; 2: 420-422. 8. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. 1998; (1): 61-65. 9. Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. Рациональное питание. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации МР 2.3.1.19150-04. Утв. 02.07.2004. 9 с. 10. Рекицен-РД (цитировано 12.03.12). Адрес доступа: http://www. rekicen.ru/ 11. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. СПб: Центр госсанэпиднадзора, 2002; 31 с. 12. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн микробиол 1992; (9-10): 74-78. 13. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 14. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. Т. 2. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита. Пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. М: Мир, 1997; 368 с. 15. Субботин В.В. Биотехнология пробиотического препарата лактобифадиола. Его эффективность. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Материалы Всероссийской конференции с международным участием; 21-23 апреля 1999 г; М: 1999; с. 121-122. 16. Зинченко Е.В., Груздев К.Н. Одно из направлений создания пробиотических препаратов. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Материалы Всероссийской конференции с международным участием; 21-23 апреля 1999 г; М: 1999; с. 109-110. 17. Глушанова Н.А. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: дис. д-ра мед. наук: защищена в 2006 г. М: 2006; 260 с. 18. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. М: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010; 23 с. 19. Бондаренко В.М. Прикладные аспекты молекулярной биологии бифидобактерий и лактобацилл. Журн микробиол 2006; (7): 89-97. 117 2. Ферментированные пищевые волокна на основе пшеничных отрубей (Рекицен-РД) являются более предпочтительным субстратом, на котором количество жизнеспособных лактобактерий выше в 4,9 раз по сравнению с аналогичным показателем, определенным для неферментированных пшеничных отрубей, а количество жизнеспособных бифидобактерий выше, соответственно, в 3,7 раз. 3. По данным электронной микроскопии, выросшие на ферментированных пищевых волокнах препарата Рекицен-РД и пшеничных отрубях (препарат сравнения) пробиотические лактобактерии и бифидобактерии сохраняют нативную структуру и по морфологическим параметрам соответствуют размерам микробных клеток эталонных штаммов пробиотических микроорганизмов. 4. Ферментированные пищевые волокна препарата Рекицен-РД, использованные пробиотическими лактобактериями и бифидобактериями в качестве субстрата, обеспечивают не только колонизацию, рост и размножение микроорганизмов, но и сохранение их жизнеспособности в процессе хранения в течение 14 дней при температуре (5±2) °С. 5. Выявленные с помощью электронной микроскопии изменения структуры ферментированных пищевых волокон препарата Рекицен-РД и пшеничных отрубей как препарата сравнения, а также появление глобулярных структур, в большом количестве окружающих микробные клетки, свидетельствуют о проявлении ферментированными пищевыми волокнами пребиотического эффекта in vitro в отношении пробиотических лактобактерий и бифидобактерий. Глава II ПРЕБИОТИКИ РЕКИЦЕН-РД В КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА У БЕЛЫХ МЫШЕЙ И МОРСКИХ СВИНОК С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ АНТИБИОТИКО-АССОЦИИРОВАННЫМ ДИСБАКТЕРИОЗОМ* Чичерин И.Ю., Кулемин Л.М., Дармов И.В., Лундовских И.А., Погорельский И.П. REKICEN-RD IN THE CORRECTION OF INTESTINAL MICROBIOCENOSIS IN WHITE MICE AND GUINEA PIGS WITH EXPERIMENTAL ANTIBIOTIC-ASSOCIATED DYSBACTERIOSIS 118 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ I.Yu. Chicherin, L.M. Kulemin, I.V. Darmov, I.A. Lundovskikh, I.P. Pogorelsky РЕЗЮМЕ SUMMARY Представлены результаты изучения влияния ферментированных пищевых волокон Рекицена-РД на восстановление нормальной микрофлоры в кишечнике белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, вызванным пероральным введением гентамицина. Добавленный к суточному пищевому рациону подопытных животных, Рекицен-РД эффективно стимулирует восстановление нормальной кишечной микрофлоры, в том числе бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Рекицен-РД характеризуется хорошей переносимостью белыми мышами и морскими свинками и отсутствием побочных эффектов. Ключевые слова: ферментированные пищевые волокна, Рекицен-РД, экспериментальный дисбактериоз, кишечная микрофлора, коррекция нарушений микробиоценоза. The results are presented of studying the influence of fermented dietary fiber preparation Rekicen-RD on the restoration of normal intestinal microflora of white mice and guinea pigs with experimental antibiotic-associated dysbacteriosis caused by oral administration of gentamicin. Added to the daily nutrition diet of experimental animals, Rekicen-RD efficiently stimulates the restoration of normal intestinal microflora, including bifidobacteria, lactobacilli and Escherichia. Rekicen-RD is well tolerated by white mice and guinea pigs and is characterized by the absence of side effects. Key words: fermented dietary fiber, Rekicen-RD, experimental dysbacteriosis, intestinal microflora, correction of microbiocenosis. ВВЕДЕНИЕ би и др.), бифидобактерии (бифидосодержащие кефир, ряженка, йогурт), олигосахариды растений, молочных продуктов и синтетического происхождения. Пищевые волокна выполняют весьма важную патогенетическую роль, являясь не только пищевым субстратом для сахаролитических анаэробов, но и стимулятором моторики кишечника [10]. Термин «пищевые (диетические) волокна» был введен в научный оборот Е.Н. Нipsley в 1953 г. [11]. В соответствии с концепцией здорового (функционального) питания, пищевые волокна относятся к группе физиологически функциональных ингредиентов [12]. Суточный уровень потребления пищевых волокон для людей составляет не более 20-40 г [13]. Передозировка пищевых волокон, тем не менее, может вызвать ухудшение состояния пациента (усиление метеоризма, болевого синдрома и т.п.). Производимый в ЗАО «Ягодное», начиная с 1995 г., коммерческий препарат Рекицен-РД, содержащий ферментированные пищевые волокна, короткоцепочечные жирные кислоты, витамины, органически связанный йод, минеральные вещества, применяется более чем в 100 ле- Многочисленные внутренние и внешние факторы вызывают нарушения микробиоценоза различных биотопов организма людей, в частности в тонкой и толстой кишке, способствуя возникновению и развитию различных патологических состояний, а также являются основой их осложнений [1, 2]. Современные подходы к лечебной коррекции дисбиотических изменений в кишечнике при дисбактериозах и синдроме избыточного бактериального роста в тонкой кишке [1-4] включают ряд важных мероприятий, в том числе направленных на восстановление нормальной кишечной микрофлоры [5, 6]. Диетическая коррекция является одним из подходов лечебно-профилактических мероприятий и заключается в использовании питательных веществ естественного происхождения, которые при систематическом применении оказывают биокорректирующее действие [2, 4]. Основными элементами такого лечебного и функционального питания [7-9] являются продукты, в состав которых входят пищевые волокна (пищевые отру- * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Кулемин Л.М., Дармов И.В., Лундовских И.А., Погорельский И.П. Рекицен-РД в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника у белых мышей и морских свинок с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Медицинский Советник Поволжья.- 2013.- №1.- C.77-82. Материалы и методы В работе использовали ферментированные пищевые волокна препарата Рекицен-РД (ЗАО «Ягодное», г. Киров – Югрино, Россия), в качестве препарата сравне- ния – пищевые волокна пшеничных отрубей. Препарат Рекицен-РД и пшеничные отруби скармливали экспериментальным животным, добавляя их к суточному кормовому рациону для белых мышей и морских свинок соответственно 80 и 795 мг на одно животное [15, 16]. Общее количество микробных клеток в пересчете на 1 г фекалий животных определяли подсчетом в камере Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец», Россия). Количество жизнеспособных микроорганизмов (КОЕ•г-1) определяли высевом соответствующих десятикратных разведений суспензий биоматериала на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчета выросших колоний по истечении времени инкубирования при температуре 37 °С [17, 18]. Выращивание эшерихий и подсчет выросших колоний проводили на агаре Эндо. Выращивание бифидобактерий и лактобактерий, выделенных из фекалий белых мышей и морских свинок, проводили в микроаэрофильных условиях с использованием системы для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark III-LE003 (Hi Media Laboratories Pvt. LTD, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Антибиотико-ассоциированный дисбактериоз у лабораторных животных воспроизводили путем перорального введения гентамицина (продукция ОАО «Биохимик», Россия) [19]. В работе использовали прошедших акклиматизацию в виварии белых мышей, беспородных, обоего пола, массой 18-20 г, морских свинок, беспородных, обоего пола, массой 250-300 г. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [20]. Глава II ПРЕБИОТИКИ чебных учреждениях России для нормализации пищеварения, метаболизма и глубокой очистки организма от шлаков [14]. Установлено, что Рекицен-РД выполняет функцию селективного питательного вещества, стимулирующего рост собственной нормальной микрофлоры кишечника. В проведенных предварительных исследованиях, предпринятых для более глубокого понимания стимулирующего влияния Рекицена-РД на рост и размножение лактобактерий и бифидобактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры человека, было показано, что при создании оптимальных микроаэрофильных условий указанные пробиотические микроорганизмы колонизируют ферментированные пищевые волокна Рекицена-РД и пшеничные отруби (препарат сравнения), используя их в качестве субстрата для роста и размножения. В последующем, при хранении выросших культур лактобактерий и бифидобактерий вместе с субстратами при температуре (5±2) °С в течение 14 дней, жизнеспособность пробиотических микроорганизмов сохранилась практически на том же уровне, что и до хранения. Важно при этом подчеркнуть, что, по данным электронной микроскопии, выросшие на ферментированных пищевых волокнах препарата Рекицен-РД и пшеничных отрубях лактобактерии и бифидобактерии сохраняют свою нативную структуру и по морфологическим параметрам соответствуют размерам клеток типовых видов пробиотических микроорганизмов [14]. С учетом полученных in vitrо экспериментальных данных, представляется целесообразным проведение исследований по изучению влияния ферментированных пищевых волокон препарата Рекицен-РД в опытах in vivо на восстановление нормальной микрофлоры у экспериментальных животных с дисбиотическими изменениями в кишечнике. Цель исследования – изучение влияния ферментированных пищевых волокон препарата Рекицен-РД на восстановление нормальной микрофлоры в кишечнике белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Результаты исследования Для инициации антибиотико-ассоциированного дисбактериоза кишечника белым мышам и морским свинкам вводили перорально дважды в сутки гентамицин по 3 и 30 мг соответственно. До введения антибиотика, на второй и седьмой день введения у животных отбирали фекалии для бактериологического изучения и определения содержания микроорганизмов фекальной микрофлоры в пересчете на 1 г фекалий (КОЕ•г-1). Результаты экспериментов представлены в таблицах 1 и 2. Таблица 1. Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 7 (6,8±0,6)•109 (7,7±0,6)•105 (2,2±0,6)•104 (6,6±0,8)•106 (2,1±0,6)•104 (1,6±0,7)•102 8 6 (2,1±0,6)•10 (1,2±0,4)•10 (1,2±0,6)•103 4 3 (1,9±0,6)•10 (2,3±0,6)•10 (1,9±0,6)•101 Примечание – здесь и в таблицах 2-6 «n» –количество повторных определений Таблица 2. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок при пероральном – введении гентамицина (Х±I 95, n=7) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 7 (8,0±0,6)•108 (2,4±0,4)•108 (2,5±0,4)•103 (6,8±0,5)•107 (1,2±0,5)•106 (1,4±0,5)•102 (5,1±0,6)•106 (3,1±0,6)•105 (3,6±0,7)•101 (1,3±0,5)•106 (1,7±0,6)•104 (1,4±0,7)•101 119 Микроорганизмы сборник научных статей Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей при пероральном – введении гентамицина (Х±I 95, n=7) Глава II ПРЕБИОТИКИ Таблица 3. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей при антибиотикоассоциированном дисбактериозе на фоне добавления в пищевой рацион Рекицена-РД и пшеничных – отрубей (Х±I 95, n=7) Компонент пищевого рациона Рекицен-РД Пшеничные отруби Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 7 14 (3,8±0,6)•104 (5,6±0,5)•105 (4,7±0,7)•107 (1,4±0,6)•109 (1,8±0,5)•102 (3,1±0,6)•103 (4,6±0,7)•105 (1,2±0,5)•107 (1,6±0,7)•103 (1,5±0,7)•103 (1,7±0,6)•104 (1,8±0,7)•106 (1,9±0,7)•101 (3,2±0,5)•101 (1,6±0,5)•102 (2,1±0,5)•104 (1,2±0,6)•105 (6,8±0,7)•106 (8,6±0,7)•108 (3,5±0,6)•104 (2,1±0,7)•102 (2,1±0,5)•103 (5,6±0,5)•104 (6,6±0,5)•106 (2,0±0,5)•103 (1,6±0,6)•103 (2,1±0,6)•104 (5,8±0,7)•105 (2,0±0,6)•101 (1,8±0,5)•101 (5,6±0,8)•102 (1,0±0,6)•104 Таблица 4. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе на фоне добавления в пищевой рацион Рекицена-РД и пшеничных отрубей Компонент пищевого рациона Рекицен-РД 120 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Пшеничные отруби Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 7 14 (2,5±0,6)•103 (3,3±0,6)•105 (5,2±0,6)•108 (1,2±0,6)•109 (1,6±0,5)•102 (2,5±0,7)•104 (3,4±0,7)•107 (1,4±0,7)•108 (3,4±0,7)•101 (1,8±0,6)•102 (1,2±0,6)•106 (1,4±0,6)•107 (1,2±0,7)•101 (1,6±0,5)•102 (3,5±0,7)•104 (2,5±0,7)•106 (1,8±0,6)•104 (1,8±0,5)•106 (4,6±0,7)•107 (2,4±0,8)•103 (1,9±0,6)•102 (1,1±0,7)•103 (1,2±0,6)•105 (3,2±0,4)•106 (3,2±0,6)•101 (1,6±0,6)•102 (3,1±0,7)•104 (1,9±0,7)•105 (1,3±0,6)•101 (1,7±0,6)•102 (2,6±0,6)•104 (2,6±0,6)•105 Из представленных в таблицах 1 и 2 данных следует, что уже на 2 сутки введения животным гентамицина отмечается снижение числа жизнеспособных бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий в пересчете на 1 г фекалий. В дальнейшем происходит прогрессирующее снижение как общего количества фекальной микрофлоры, так и отдельных ее представителей. К 7 суткам эксперимента численность отдельных представителей фекальной микрофлоры понижается до нескольких тысяч и даже меньше. Для проведения последующих экспериментов все животные с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом были разделены на группы по 6 особей в каждой. Через 5 дней, в течение которых животным не вводили перорально гентамицин для снижения его концентрации в кишечном содержимом, с целью стимуляции восстановления кишечной микрофлоры в суточный пищевой рацион животных стали добавлять расчетные количества Рекицена-РД и пшеничных отрубей (в качестве контроля). Животные хорошо поедали корм, оставались в течение всего периода активными и ухоженными. Ежедневно, на протяжении 14 дней наблюдения, в кюветах для содержания животных меняли подстилку и отбирали фекалии в начале экспериментов по восстановлению кишечной микрофлоры, на вторые, седьмые и четырнадцатые сутки для бактериологического исследования. Результаты экспериментов представлены в таблицах 3, 4. Из представленных результатов следует, что скармливание белым мышам и морским свинкам с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом Рекицена-РД и пшеничных отрубей приводит к увеличению как общего содержания микроорганизмов кишечной микрофлоры, так и отдельных ее представителей. При этом следует отметить, что введение в пищевой рацион препарата Рекицен-РД как белым мышам, так и морским свинкам, оказывает благоприятное стимулирующее влияние на восстановление кишечной микрофлоры. Однако, при прочих равных условиях, ферментированные пищевые волокна препарата Рекицен-РД более эффективно стимулируют рост кишечной микрофлоры, в том числе бифидобактерий, в сравнении с пшеничными отрубями. Животные контрольных групп находились на обычном пищевом рационе и не получали в виде добавки ни Рекицен-РД, ни пшеничные отруби. Результаты бактериологического исследования фекалий животных контрольных групп в процессе самовосстановления кишечной микрофлоры представлены в таблицах 5 и 6. Представленные в таблицах 5 и 6 данные однозначно свидетельствуют о процессе восстановления кишечной микрофлоры как у белых мышей, так и у морских свинок с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом: после прекращения перорального введения животным гентамицина происходит постепенная нормализация естественной кишечной микрофлоры, очевидно, под влиянием таких компонентов продуктов питания, входящих в пищевой рацион, как пищевые волокна трав, злаков и фруктов, полисахариды и другие соединения, обладающие пребиотическим эффектом. На основании результатов, которые представлены в таблицах 3-6, были определены скорости восстановления кишечной микрофлоры у белых мышей и морских свинок с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом [19] под влиянием Рекицена-РД, пшеничных отрубей в сравнении с аналогичными показателями у животных контрольных групп, получающих ежедневно обычный пищевой рацион. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей контрольной – группы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе (Х±I 95, n=7) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 7 14 (3,0±0,7)•104 (3,5±0,6)•104 (1,8±0,8)•105 (1,8±0,6)•106 (1,5±0,6)•102 (1,7±0,8)•102 (2,6±0,7)•103 (6,8±0,75)•105 3 3 3 (1,5±0,6)•10 (1,6±0,7)•10 (1,8±0,8)•10 (4,3±0,8)•104 1 1 2 (1,4±0,5)•10 (1,8±0,7)•10 (2,1±0,6)•10 (3,5±0,7)•103 Таблица 6. Глава II ПРЕБИОТИКИ Таблица 5. Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок контрольной – группы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе (Х±I 95, n=7) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало эксперимента 2 7 14 (2,6±0,6)•103 (4,5±0,6)•103 (6,8±0,7)•105 (1,7±0,6)•106 (1,3±0,7)•102 (1,8±0,8)•102 (1,7±0,6)•103 (2,1±0,6)•104 1 1 3 (3,8±0,6)•10 (4,1±0,7)•10 (1,9±0,8)•10 (4,8±0,6)•104 1 1 2 (2,0±0,6)•10 (5,3±0,7)•10 (1,7±0,6)•10 (3,1±0,7)•103 Обобщенные данные приведены в таблице 7, из которых следует, что Рекицен-РД наиболее выраженно влияет как на скорость восстановления общего количества кишечной микрофлоры, так и отдельных ее представителей у белых мышей и у морских свинок. Особо следует отметить влияние Рекицена-РД на скорость восстановления кишечной микрофлоры и, в частности, бифидобактерий у морских свинок. Так, кратность скорости восстановления общего количества микрофлоры в сравнении с контролем (контрольной группой животных, находящихся на обычном пищевом рационе) составляет 717, бифидобактерий – 6600, лактобактерий – 291, эшерихий – 818. Рекицен-РД стимулирует также восстановление кишечной микрофлоры белых мышей с антибиотикоассоциированным дисбактериозом. Однако, судя по представленным в таблице 7 результатам, несмотря на довольно высокую скорость восстановления общей численности кишечной микрофлоры (кратность к контролю составляет 761) скорость восстановления бифидобактерий, лактобактерий и особенно эшерихий у белых мышей существенно меньше, чем у морских свинок. Возможно, это связано с особенностями пищеваре- ния у этого вида животных или особенностями функционирования индивидуального микробно-тканевого комплекса кишечника. Ведь если проследить влияние пшеничных отрубей на скорость восстановления кишечной микрофлоры у белых мышей и морских свинок с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, то получается картина несколько иная: у белых мышей в большей степени пшеничные отруби стимулируют восстановление общей кишечной микрофлоры, а у морских свинок – в основном бифидобактерии и эшерихии. Таким образом, представленные в таблицах 3-7 данные свидетельствуют о том, что ферментированные пищевые волокна Рекицена-РД можно отнести к физиологически функциональным ингредиентам, которые в составе пищевого рациона оказывают выраженное стимулирующее влияние на коррекцию микробиоценоза кишечника у белых мышей и морских свинок с антибиотикоассоциированным дисбактериозом. Особенно наглядно это прослеживается при сравнении с восстановлением кишечной микрофлоры у животных контрольных групп, у которых процесс восстановления микробиоценоза кишечника под влиянием компонентов обычного пищевого рациона происходит довольно медленно. Таблица 7. Рекицен-РД Пшеничные отруби Обычный пищевой рацион (контроль) Микроорганизмы Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Скорость восстановления кишечной микрофлоры у подопытных животных белые мыши морские свинки кратность к кратность к -1 -1 -1 КОЕ•г сут КОЕ•г сут-1 контролю контролю 9,9•107 761 8,6•107 717 8,6•105 18 9,9•106 6600 1,3•105 45 9,9•105 291 1,1•103 4,4 1,8•105 818 6,1•107 469 3,3•106 28 3,1•104 0,6 2,3•105 153 4,1•104 14,1 1,4•104 4,1 2,8 1,8•104 82 7,1•102 1,3•105 1 1,2•105 1 4,8•104 1 1,5•103 1 1 3,4•103 1 2,9•103 2,5•102 1 2,2•102 1 121 Компонент пищевого рациона сборник научных статей Влияние препарата Рекицен-РД на скорость восстановления кишечной микрофлоры у белых мышей и морских свинок с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом Глава II ПРЕБИОТИКИ КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 122 Обсуждение полученных результатов В последние годы накопилось много результатов экспериментальных исследований, а также клинических наблюдений, согласно которым пища является важным, а в ряде случаев и ведущим лечебно-профилактическим средством при многих хронических заболеваниях [8]. Сложилась стройная концепция здорового (функционального) питания [8, 9], согласно которой одним из важных компонентов пищи являются пищевые волокна. Последние входят в состав пищевых продуктов животного растительного и минерального происхождения. К ним относят и живые микроорганизмы, оказывающие благоприятное влияние на обменные процессы в организме человека при систематическом употреблении в оптимальных суточных дозах [11, 12]. Однако в продуктах питания современного человека пищевых волокон содержится меньше 30 % от рекомендуемой нормы [13]. Дефицит пищевых волокон является существенным фактором риска формирования интоксикации, нарушений функций иммунной системы, дисбактериозов, воспалительных и онкологических заболеваний толстого кишечника, нарушений углеводного и липидного обмена, гормональных расстройств и других патологических состояний [14]. Для устранения дефицита пищевых волокон наиболее оптимально использовать комплексы уже ферментированных пищевых волокон и короткоцепочечных жирных кислот, содержащихся в Рекицене-РД. Препарат Рекицен-РД изготовлен по оригинальной технологии и его прием наиболее целесообразен людьми с дисбактериозами, у которых нарушен процесс ферментации пищевых волокон. Как показано нами в экспериментах in vitrо с использованием пробиотических бифидобактерий и лактобактерий, инокулированных в стерильный препарат Рекицен-РД и пшеничные отруби (препарат сравнения), наблюдаются выраженные структурные изменения пищевых волокон, на которых размножаются пробиотические микроорганизмы. По данным электронной микроскопии, эти структурные изменения сопровождаются появлением глобулярных образований, окружающих в большом количестве микробные клетки и пищевые волокна. Учитывая результаты экспериментов in vitrо, были выполнены исследования, связанные с оценкой влияния ферментированных пищевых волокон препарата Рекицен-РД на восстановление микробиоценоза кишечника белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, вызванным пероральным введением гентамицина [19]. Дисбиотические изменения в кишечнике подопытных животных были подтверждены бактериологическим исследованием фекалий по окончании введения животным антибиотика. Суточную дозу Рекицена-РД, а также дозу пшеничных отрубей, как препарата сравнения, рассчитывали, исходя из суточной нормы для людей [13] с учетом переводного коэффициента на единицу поверхности тела. Препарат Рекицен-РД и пшеничные отруби скармливали белым мышам и морским свинкам с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, добавляя в рассчитанной дозе к ежедневному пищевому рациону. Эффект воздействия Рекицена-РД и пшеничных отрубей прослеживали на протяжении 14 суток, отмечая общее состояние животных и подвергая бактериологическому исследованию фекалии животных. Можно констатировать, что скармливание белым мышам и морским свинкам с антибиотико-ассоциированным дисбактери- озом Рекицена-РД и пшеничных отрубей благоприятно сказывается на росте общего содержания микроорганизмов кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей. В то же время необходимо подчеркнуть, что ферментированные пищевые волокна Рекицена-РД значительно эффективнее стимулируют рост кишечной микрофлоры, в частности бифидобактерий, по сравнению с пшеничными отрубями. В отличие от животных опытных групп, белые мыши и морские свинки с антибиотико-ассоциированным дисбактериозом, не получавшие добавки Рекицена-РД и пшеничных отрубей к пищевому рациону, были менее подвижными, а предложенный корм съедали не до конца. У животных контрольных групп отмечалось постепенное нарастание общего числа нормальной микрофлоры и отдельных ее представителей, растянутое во времени. Интегративным показателем эффективности коррекции кишечной микрофлоры у белых мышей и морских свинок с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом является скорость восстановления общего содержания микрофлоры и отдельных ее представителей [19]. Она выше для Рекицена-РД в сравнении с пшеничными отрубями и особенно с аналогичными показателями, определенными для кишечной микрофлоры животных контрольных групп. Так, скорость восстановления общего количества кишечной микрофлоры у белых мышей превышал контрольный показатель в 761 раз, а у морских свинок – в 717 раз. Отдельно нужно отметить выраженное стимулирующее влияние Рекицена-РД на бифидобактерии морских свинок: скорость восстановления бифидобактерии превышает контрольный показатель в 6600 раз. В целом, Рекицен-РД весьма существенно стимулирует восстановление лактобактерий и эшерихий у морских свинок и в меньшей степени у белых мышей. Разработчики Рекицена-РД связывают стимулирующее влияние препарата на кишечную микрофлору с пребиотическим действием [14], поскольку, с одной стороны, ферментированные пищевые волокна Рекицена-РД являются селективным питанием для бифидо- и лактофлоры кишечника, а с другой стороны, - содержащиеся в нем короткоцепочечные жирные кислоты, образовавшиеся в результате биотехнологической ферментации пищевых волокон, необходимы для обеспечения энергией роста и размножения микрофлоры кишечника. Вполне вероятно, что продукты жизнедеятельности бифидобактерий и лактобактерий, которые мы наблюдали при электронной микроскопии процесса размножения этих бактерий на пищевых волокнах как субстрате для роста и размножения, могут быть теми антибиотикоподобными или бактериоциноподобными веществами, которые описаны В.М.Бондаренко [21] и которые сообщают микроорганизмам, их продуцирующим, определенное экологическое преимущество. Выявленные в опытах на животных положительные свойства Рекицена-РД могут служить экспериментальным подтверждением важности разработки на его основе новых комплексов, обогащенных фруктоолигосахаридами и экстрактами лекарственных трав [14], усиливающих целебные свойства Рекицена-РД при сохранении его профилактического действия. Выводы 1. Изучено влияние ферментативных пищевых волокон Рекицена-РД на восстановление нормальной микрофлоры в кишечнике белых мышей и морских свинок 1. Парфенов А.И. Клинические проблемы дисбактериоза. Рос. гастроэнтерол. журн. 1999; (4): 49-55. 2. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Зверков И.В., Чичерин И.Ю. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии: учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей. М: ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации; 2010; 50 с. 3. Tillman R., King C., Toskes P. Continued experience with the xylose breath test: Evidence that the small bowel culture as a gold standard for bacterial overgrowth may be tarnished. Gastroenterology 1981; 80: 1304. 4. Маев И.В., Самсонов А.А. Терапевтическая тактика при синдроме избыточного бактериального роста в тонкой кишке. Consilium medicum 2008; 9 (7): 44-50. 5. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. М: Московский НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 2010; 23 с. 6. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю. Фруктоолиго – и фруктополисахариды в коррекции и профилактике нару- Глава II ПРЕБИОТИКИ сборник научных статей ЛИТЕРАТУРА шений микробиоценоза кишечника у больных бронхолегочной патологии, получающих антибактериальную терапию. Эксперимент клин гастроэнтерол 2011; (3): 79-87. 7. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 3: Пробиотики и функциональное питание. М: Издательство ГРАНТЪ, 2001; 289 с. 8. Шендеров Б.А. Функциональное и персональное питание. Современное состояние и перспективы. Журн ГАСТРОэнтерология Санкт-Петербурга 2010; (2-3): 2-5. 9. Shenderov B.A. Probiotics and functional foods in Food Engineering, [Eds. UNESCO-EOLSS Joint Committee], in Encyclopedia of Life Support Systems (EOLSS) Developed under the Auspices of the UNESCO, Eolss Publishers, Oxford, UK [http://www.eolss.net]. 10. Рудой Б.А. Пищевые волокна и их использование для профилактики неблагоприятных воздействий химических загрязняющих веществ. Теоретич и прикладн экология 2008; (1): 74-79. 11. Hipsley E.H. Dietary «fibre» and pregnancy toxaemia. Brit Med J 1953; 2: 420-422. 12. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. Рос жур. гастроэнтерол гепатол колопрокт 1988; (1): 61-65. 13. Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. Рациональное питание. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации МР 2.3.1.19150-04. Утв. 02.07.2004. 9 с. 14. Рекицен-РД (цитировано 12.03.12). Адрес доступа: http://www. rekicen.ru/ 15. Kimura Y., Nagata Y., Bryant C.W., Buddington R.K. Nondigestible oligosaccharides do not increase accumulation of lipid soluble environmental contaminants by mice. J Nutr 2002; 132: 80-87. 16. Fernandez M.L., Vergara-Jimenez M., Romero A.L., Erickson S.K., McNamara D.J. Gender differences in response to dietary soluble biber in guinea pigs: effects of pectin, guar gum and psyllium. J Lipid Res 1995; 36(10): 2191-2002. 17. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Д., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо. СПб.: Центр госсанэпиднадзора, 2002; 31 с. 18. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн микробиол 1992; (9-10): 74-78. 19. Заявка на выдачу патента РФ. Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных. И.В.Дармов, И.Ю.Чичерин, И.П.Погорельский, И.А.Лундовских; заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», № 2011149501/171074291; заявл. 15.12.2011. 20. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 21. Бондаренко В.М. Прикладные аспекты молекулярной биологии бифидобактерий и лактобактерий. Журн микробиол 2006; (7): 89-97. 123 с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. 2. Установлено, что при скармливании Рекицена-РД, добавленного к суточному пищевому рациону, отмечается существенное положительное влияние ферментированных пищевых волокон и других входящих в состав препарата ингредиентов на восстановление нормальной кишечной микрофлоры подопытных животных с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. 3. Скорость восстановления общего содержания кишечной микрофлоры относительно контроля возрастает у белых мышей в 761 раз, а у морских свинок – в 717 раз при одновременном возрастании у морских свинок бифидобактерий в 6600 раз. Аналогичный стимулирующий эффект Рекицена-РД установлен в отношении других представителей кишечной микрофлоры белых мышей и морских свинок. 4. Добавление Рекицена-РД в пищевой рацион белым мышам и морским свинкам с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом характеризуется хорошей переносимостью подопытными животными и отсутствием побочных эффектов. Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков Глава III ПРОТИВОИНФЕКЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕБИОТИКОВ И МЕТАБОЛИТНЫХ ПРОБИОТИКОВ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗ: ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ И КОРРЕКЦИИ ДИСБИОТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ* Чичерин И.Ю.1, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2, Дармов И.В.2, Маракулин И.В.2 1 2 EXPERIMENTAL PSEUDOTUBERCULOSIS: ASSESSING THE POSSIBILITY OF PREVENTION, TREATMENT AND CORRECTION OF THE INTESTINAL MICROFLORA DYSBIOTIC DISORDERS Chicherin I.Yu.1, Pogorelsky I.P.2, Lundovskikh I.A.2, Darmov I.A.2, Marakulin I.V.2 1 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 2 124 Научное общество «Микробиота», Сергиев Посад, Россия (141306, Сергиев Посад-6 МО, ул. Октябрьская,19-3), e-mail: rpatron@mail.ru ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru Scientific society «Microbiota», Sergiev Posad, Russia (Oktyabrskaya st., 19-3, Sergiev Posad-6, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru, Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Изучена возможность предотвращения развития псевдотуберкулеза и коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры у конвенциональных белых мышей пребиотиком Стимбифид и экзометаболитами надосадочной жидкости нативных культур пробиотических бифидобактерий и лактобактерий, обладающих пребиотическим действием. Конвенциональных белых мышей инфицировали перорально культурой псевдотуберкулезного микроба и оценивали развитие инфекционного процесса. Пребиотик Стимбифид и надосадочная жидкость нативной культуры лактобактерий, введенные животным перорально, как и введенный внутримышечно гентамицин, полностью купировали развитие инфекционного процесса. В отличие от антибиотика гентамицина пребиотик Стимбифид и надосадочная жидкость нативной культуры лактобактерий, введенные перорально, предотвратили развитие дисбактериоза кишечника у животных. Ключевые слова: псевдотуберкулез, белые мыши, дисбактериоз, пребиотик, пробиотик, экзометаболиты. Resume. The possibility was studied of preventing the development of pseudotuberculosis and correcting the dysbiotic disorders of the intestinal microflora in conventional white mice with prebiotic Stimbifid and exometabolites in supernatant fluids of native cultures of probiotic bifidobacteria and lactobacilli, which have prebiotic effect. Conventional white mice were infected orally with pseudotuberculosis microbe culture and the development of infection was evaluated. Prebiotic Stimbifid and supernatant fluid of lactobacilli native culture, administered to animals orally, as injected intramuscular gentamicin, completely stopped the infection development. In contrast to the antibiotic gentamicin prebiotic Stimbifid and supernatant fluid of lactobacilli native culture, administered orally, prevented the development of the intestinal dysbiosis in animals. Key words: pseudotuberculosis, white mice, dysbacteriosis, prebiotic, probiotic, exometabolites. * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дармов И.В., Маракулин И.В. Экспериментальный псевдотуберкулез: оценка возможности профилактики, лечения и коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры. Журнал инфектологии.- Т.4.- 2012.- №4.- С.71-79. Материалы и методы исследования В экспериментах по моделированию псевдотуберкулезной инфекции на конвенциональных белых мышах использовали кальцийзависимый штамм 147 Yersinia pseudotuberculosis I серотипа, содержащий плазмиду с молекулярной массой 47 МД. Штамм выделен от больного с выраженными симптомами острого инфекционного заболевания. Величина LD50 для белых мышей при пероральном способе введения составляет 8,5•104 живых микробов [11]. В работе использовали: пребиотический препарат Стимбифид (серия 030910 ТУ 9330-002-50168265-05 с изм. № 1, произведен ООО «В-МИН» (ООО «МедСтар», Россия). Препарат создан на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов, содержит премикс витаминно-минеральный «Immunity» и вспомогательные вещества (натрия бикарбонат, лактоза, Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков сборник научных статей Клинические наблюдения и экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что у многих жителей России, в том числе и у детей, имеет место выраженный дисбаланс нормальной микрофлоры кишечника [1-3]. Транзиторные нарушения микробиоценоза кишечника относят к дисбактериальным реакциям, а выраженные и стойкие изменения количественного и качественного состава микроорганизмов – к дисбактериозам [1-5]. Дисбактериоз кишечника сопровождает различные заболевания, в том числе и инфекционные, и характеризуется изменением состава нормальной микрофлоры, транслокацией ее различных видов в другие биотопы организма и их избыточным ростом [6, 7]. К числу инфекционных заболеваний, при которых возникают выраженные дисбиотические изменения в кишечной микрофлоре, относится псевдотуберкулез – острая зоонозная бактериальная инфекционная болезнь, вызываемая микроорганизмами Yersinia pseudotuberculosis [8-10]. Для болезни характерны фекально-оральный механизм передачи возбудителя, полиморфизм клинических проявлений, поражения желудочно-кишечного тракта и суставов, кожные высыпания, интоксикация, лихорадка, склонность к рецидивам, обострениям, хронизации [8-10]. Летальность при септической форме псевдотуберкулеза может достигать 25-50 %. Основным резервуаром и источником возбудителя являются мышевидные грызуны, как дикие, так и обитающие вблизи человека (синантропные). Факторами передачи являются овощи, корнеплоды, которые могут быть обсеменены иерсиниями уже на полях, при хранении в овощехранилищах обсемененность иерсиниями резко возрастает. Неудивительно, что вспышки псевдотуберкулеза чаще всего бывают связаны с употреблением салатов из сырой капусты или моркови. Проблема псевдотуберкулеза привлекает уже на протяжении многих лет пристальное внимание специалистов в области инфектологии, а также клиницистов, что связано, в первую очередь, с разработкой средств экстренной и специфической профилактики и лечения заболевания [11-13]. Внедрение в клиническую практику новых антибактериальных препаратов и разработка эффективной вакцины потребовали проведения исследований с использованием экспериментальных моделей псевдотуберкулезной инфекции. Это позволило проследить судьбу возбудителя Y. pseudotuberculosis при энтеральном пути поступления в чувствительный организм. В частности, была охарактеризована в опытах на белых мышах и морских свинках инвазия иерсиний и связанная с ней генерализация псевдотуберкулезной инфекции [10]. Весь период от адгезии иерсиний к отдельным эпителиоцитам, в основном над куполами пейеровых бляшек, до начала диссеминации возбудителя соответствует инкубационному периоду, продолжительность которого варьирует в пределах 3-21 дней [10, 14]. С использованием экспериментальной модели псевдотуберкулезной инфекции у обезьян Рарio hamadrgas изучены клинические проявления и ряд микробиологических и иммунологических аспектов псевдотуберкулеза, вызванного пероральным заражением животных, определены величины среднелетальных доз для них, а также для белых мышей и морских свинок [11]. Важно отметить, что из крови и легких погибших обезьян иерсинии не были выделены ни в одном случае. В то же время из содержимого кишечника, из лимфоузлов илеоценальной области и из печени на среде Серова были выделены бактерии Y. pseudotuberculosis. Рассчитанное значение LD50 возбудителя псевдотуберкулеза для обезьян сопоставимо с величиной минимальной инфици- рующей дозы (0,9•109 микробов), прием которой внутрь вызывал заболевание в известном эксперименте по самозаражению В.А. Знаменского [15]. Данные, полученные с использованием экспериментальных моделей псевдотуберкулезной инфекции, однозначно свидетельствуют о том, что при естественном (энтеральном) пути проникновения иерсиний псевдотуберкулеза в чувствительный организм важнейшим этапом инфекционного процесса является взаимодействие возбудителя со слизистой оболочкой кишечника. Начиная с адгезии иерсиний к отдельным эпителиоцитам в илеоцекальном отделе кишечника с последующей колонизацией поверхности эпителия, происходит вытеснение собственной кишечной микрофлоры у инфицированных животных псевдотуберкулезным микробом, инвазия и размножение в отдельных макрофагах и, наконец, образование сплошных биопленок на поверхностном эпителии и в криптах илеоцекального отдела, а также в начале ободочной кишки [10, 16]. Колонизацию бактерий Y. pseudotuberculosis на слизистой оболочке тонкой кишки рассматривают как первую фазу инфекционного процесса при псевдотуберкулезе. В дальнейшем экспрессия ряда факторов патогенности возбудителя, детерминируемых хромосомными и плазмидными генами, придает псевдотуберкулезному микробу способность проникать в органы и ткани, противостоять факторам неспецифической резистентности, размножаться вплоть до летальных популяций, вызывать гибель клеток чувствительного организма [9-12]. Следовательно, от колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника человека или животного зависит приживление или элиминация возбудителя псевдотуберкулеза. Сама же колонизационная резистентность, в свою очередь, связана с биологическими свойствами иерсиний псевдотуберкулеза и индигенных представителей кишечной микрофлоры, которые определяют характер взаимоотношений между ними, в частности бионесовместимость [10, 17]. Сохранив колонизационную резистентность, создав индигенной микрофлоре с помощью современных препаратов микроэкологическое преимущество, можно будет, по-видимому, еще на ранней стадии псевдотуберкулезной инфекции предотвратить адгезию, инвазию и колонизацию слизистой кишечника возбудителем Y. pseudotuberculosis. Цель работы состоит в изучении возможности предотвращения развития псевдотуберкулезной инфекции и коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры у конвенциональных белых мышей пребиотиком Стимбифид и экзометаболитами бифидобактерий и лактобактерий, обладающими пребиотическим действием. 125 ВВЕДЕНИЕ Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 126 кальция стеарат). Лечебная и профилактическая эффективность пребиотика Стимбифид подтверждена клиническими испытаниями [18]; пробиотик Бифидумбактерин (серия 315/6, произведен ФГУП «НПО «Микроген», Россия); пробиотик Лактобактерин (серия 15/6, произведен ФГУП «НПО «Микроген», Россия). Выращивание штамма Y. pseudotuberculosis 147 с учетом его психрофильности [9, 14] проводили при температуре 4 °С. Результаты исследования В выполненных нами ранее исследованиях, результаты которых представлены в работе [22], было показано, что надосадочная жидкость, освобожденная центрифугированием нативных культур от клеток гомопробиотических лактобактерий и бифидобактерий, оказывает наиболее существенное положительное влияние на восстановление нарушений микробиоценоза кишечника у конвенциональных белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом. Указанные результаты дали основание заключить, что основной вклад в эффективность пробиотических препаратов вносят продукты жизнедеятельности микроорганизмов – экзометаболиты. С учетом полученных результатов, а также клинико-экспериментальных данных об эффективности пребиотика Стимбифид в коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике были поставлены специальные эксперименты по оценке возможности использования пребиотического влияния на микрофлору кишечника конвенциональных белых мышей, противостоящую адгезии, колонизации и инвазии иерсиний псевдотуберкулеза. В этой связи все подопытные животные были разделены на 5 групп по 10 особей в каждой группе. Первая группа являлась контрольной: животные этой группы были инфицированы перорально культурой возбудителя псевдотуберкулеза. Животные опытных второй и третьей групп были инфицированы перорально культурой возбудителя псевдотуберкулеза. На этих группах животных проверяли лечебное действие гентамицина, который вводили внутримышечно по 1 мг в сутки в течение 5 дней: через 2 часа после инфицирования иерсиниями псевдотуберкулеза животных второй группы (профилактический курс) и через 24 часа после инфицирования иерсиниями псевдотуберкулеза животных третьей группы (лечебный курс). Животные четвертой, пятой и шестой групп также являлись опытными. Животным четвертой группы вводили реr оs пребиотик Стимбифид в дозе 13 мг в сутки за 5 дней до инфицирования иерсиниями псевдотуберкулеза и еще в течение 5 дней после инфицирования. Животным пятой и шестой групп пребиотик Стимбифид в той же дозе начинали вводить через 2 часа (пятая группа животных) и через 24 часа (шестая группа животных) после инфицирования культурой возбудителя псевдотуберкулеза в течение 5 дней. Животным двух последних – седьмой и восьмой групп, относящихся также к опытным группам, в течение 5 дней до инфицирования и 5 дней после инфицирования культурой псевдотуберкулезного микроба вводили реr оs по 0,2 мл надосадочной жидкости нативной культуры пробиотических микроорганизмов, соответственно, бифидобактерий и лактобактерий, содержащей микробные экзометаболиты. Сами нативные культуры получали путем культивирования бифидобактерий и лактобактерий, изолированных из коммерческих препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин, в жидких питательных средах при температуре 37 °С в течение 72 часов (концентрация бифидобактерий 8,6·108 КОЕ·мл-1, лактобактерий – 2,8·109 КОЕ·мл-1). Введение надосадочной жидкости животным реr os осуществляли в течение 5 дней до инфицирования и 5 дней после инфицирования иерсиниями псевдотуберкулеза. Заражающая доза возбудителя псевдотуберкулеза для животных всех восьми групп составила 10 LD50 (~850000 КОЕ), что обеспечивало гарантированное развитие инфекционного процесса при пероральном введении бактериальной взвеси [11, 13]. Результаты экспериментов представлены в таблице. Из представленных данных видно, что животные контрольной группы в результате инфицирования возбудителем псевдотуберкулеза погибли в сроки от 5 до 13 суток от начала инфицирования. От всех павших животных была выделена чистая культура иерсиний псевдотуберкулеза, что является свидетельством генерализации инфекционного процесса. Бактериологическое изучение фекалий позволило установить, что на селективной плотной питательной среде был выявлен обильный рост иерсиний псевдотуберкулеза, соответствующий 8,6•107-1,2•108 КОЕ•г-1, при снижении общего количества нормальной кишечной микрофлоры в 3,7•105 раз, бифидобактерий – в 5,9•104 раз, лактобактерий – в 2,2•106 раз, эшерихий – в 1,4•103 раз. Данные бактериологического исследования фекалий павших животных свидетельствуют о преобладании бактерий псевдотуберкулеза в кишечном содержимом при одновременном резком снижении как общего количества собственной кишечной микрофлоры, так и отдельных ее представителей – бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий, что характерно для глубоких дисбиотических изменений в микробном сообществе кишечного содержимого подопытных животных. В седьмой опытной группе также зафиксирована гибель 4 из 10 инфицированных возбудителем псевдотуберкулеза животных на 4-9 сутки от начала инфицирования. От всех четырех павших животных, как и от животных контрольной группы, была выделена чистая культура псевдотуберкулезного микроба. При бактериологическом исследовании фекалий от павших животных выявлены как и в случае павших животных контрольной группы глубокие дисбиотические изменения кишечной микрофлоры. У выживших после инфицирования псевдотуберкулезным микробом животных седьмой опытной группы в фекалиях псевдотуберкулезный микроб выявлен не был, однако были выявлены явные количественные изменения кишечной микрофлоры. Так, общее количество микробов в 1 г фекалий снизилось в 3,8•104 раз, бифидобактерий – в 3,4•102 раз, лактобактерий – в 1,3•104 раз, эшерихий – в 1,2•102 раз. Полученные результаты бактериологического изучения фекалий павших и выживших после инфицирования животных седьмой группы позволяют констатировать наличие определенной протективной эффективности вводимой животным перорально надосадочной жидкости нативной культуры бифидобактерий штамма B. bifidum 1. Внутримышечное введение инфицированным возбудителем псевдотуберкулеза животным гентамицина как при профилактическом, так и лечебном курсе (вторая и третья группа животных), полностью предотвратило развитие инфекционного процесса. При этом в фекалиях выживших животных было выявлено довольно существенное снижение как общего содержания нормальной кишечной микрофлоры (в 3,0•104 и 2,5•103 раз у животных второй и третьей групп, соответственно), так и бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Пребиотик Стимбифид, вводимый перорально в соответствующих дозах как до инфицирования белых мы- Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков По данным Г.П. Сомова и соавторов [9], для манифестной формы псевдотуберкулеза характерно многообразие симптомов, что является свидетельством вовлечения в патологический процесс различных органов и систем уже в первые дни заболевания. Поражения пищеварительного тракта часто являются ведущими признаками болезни, которые отмечаются практически у половины больных [23]. Одним из важнейших этапов псевдотуберкулеза как инфекционного заболевания является колонизация слизистых оболочек [9, 10, 16]. При этом весьма характерно для псевдотуберкулезного микроба то, что его внеорганизменные популяции обладают адгезивными и инвазивными свойствами. Скорость реализации инвазивного потенциала возбудителя псевдотуберкулеза играет определяющую роль при взаимодействии с организмом хозяина, а в дальнейшем – в проникновении через слизистые оболочки во внутреннюю среду чувствительного организма [9, 16]. Таким образом, предотвращение колонизации слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта чувствительного организма бактериями псевдотуберкулезного микроба будет во многом способствовать недопущению быстрого его проникновения в кровяное русло и в последующем диссеминации во внутренние органы. Поэтому исход болезни во многом может зависеть от этой первой стадии инфекционного процесса [9]. При пероральном пути поступления возбудителя, естественном для псевдотуберкулеза, довольно быстро развивается генерализация инфекции, что подтверждено выделением из крови врача В.А.Знаменского культуры псевдотуберкулезного микроба в опыте по самозаражению [15]. Конкуренция возбудителя псевдотуберкулеза с микробами естественной микрофлоры кишечника с неизбежностью приводит к развитию выраженного дисбактериоза. Представленные в таблице результаты это подтверждают: бактериологическое изучение кишечного содержимого белых мышей, погибших в результате перорального инфицирования возбудителем псевдотуберкулеза, выявило обильное накопление бактерий Y. pseudotuberculosis при значительном снижении общего количества кишечной микрофлоры и отдельных ее представителей. Гентамицин, вводимый внутримышечно инфицированным животным второй и третьей групп в режиме профилактического и лечебного курса, полностью купировал развитие псевдотуберкулеза. Тем не менее на 21 сутки эксперимента при бактериологическом изучении фекалий подопытных животных было выявлено значительное снижение общего содержания кишечной микрофлоры и таких сборник научных статей Обсуждение полученных результатов ее представителей, как бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Из фекалий выживших животных ни разу не был выделен псевдотуберкулезный микроб, что свидетельствует в пользу отсутствия генерализации инфекции при лечении инфицированных животных гентамицином. Пребиотик Стимбифид не является антибактериальным препаратом, как гентамицин, но тоже предотвращает генерализацию псевдотуберкулезной инфекции как при профилактическом курсе (четвертая и пятая группы животных), так и при лечебном курсе (шестая группа животных). С учетом различия механизмов антибактериального действия, можно предположить, что в случае пребиотика Стимбифид имеет место многонаправленность действия пребиотика на псевдотуберкулезный микроб [17, 24], в частности, создание приоритетных условий для размножения индигенных бифидобактерий, а также лактобактерий и эшерихий; угнетение роста патогенной микрофлоры и вытеснение ее из организма; повышенная скорость восстановления индивидуальной микрофлоры кишечника; стабилизация барьерных свойств слизистой оболочки кишечника; выраженное влияние на иммунную систему и повышение фагоцитарной активности клеток печени, способствующей защите ее от инфекционного агента [24]. Эти и, возможно, другие составляющие антибактериальной активности пребиотика Стимбифид в отношении возбудителя псевдотуберкулеза повысили колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника подопытных животных и предотвратили адгезию и колонизацию иерсиний псевдотуберкулеза, разрушение барьеров слизистой оболочки кишечника, проникновение в кровяное русло и диссеминацию по всему организму. Важно при этом отметить сохранение микроэкологического статуса собственной кишечной микрофлоры у животных опытных групп, получавших per os пребиотик Стимбифид. Весьма интересен результат, полученный при инфицировании псевдотуберкулезным микробом белых мышей восьмой опытной группы, которым перорально вводили в течение 5 дней до и после инфицирования надосадочную жидкость нативной культуры лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-А3. Как и в случае введения инфицированным животным пребиотика Стимбифид, выявлен защитный эффект от перорального введения надосадочной жидкости нативной культуры лактобактерий: ни одно из инфицированных возбудителем псевдотуберкулеза животных не погибло и, кроме того, у них не развился дисбактериоз кишечника. Несколько иначе развивался инфекционный процесс в седьмой группе животных, инфицированных бактериями Y. pseudotuberculosis 147. Несмотря на пероральное введение животным надосадочной жидкости нативной культуры бифидобактерий штамма B. bifidum 1 до и после заражения возбудителем псевдотуберкулеза, была зафиксирована гибель 4 из 10 подопытных животных, что является свидетельством генерализации у них инфекционного процесса. От погибших животных была выделена чистая культура псевдотуберкулезного микроба при одновременном развитии выраженных дисбиотических изменений в микробном сообществе кишечника. Бактериологическое изучение фекалий 6 выживших животных седьмой опытной группы не выявило бактерий псевдотуберкулеза, однако снижение общего количества кишечной микрофлоры, равно как и бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий, свидетельствует в пользу имевшего место выраженного дисбактериоза кишечника. Впервые выявленный на экспериментальных животных протективный эффект пребиотика Стимбифид, предотвращающий развитие генерализованной псевдотуберкулезной инфекции, а также аналогичные эффекты 127 шей иерсиниями псевдотуберкулеза (четвертая группа животных), так и после инфицирования (пятая и шестая группы животных), с последующим пролонгированием перорального введения пребиотика Стимбифид в течение 5 дней, полностью предотвратил размножение псевдотуберкулезного микроба в организме инфицированных животных и, соответственно, их гибель. Важно при этом отметить, что при бактериологическом исследовании фекалий животных не было обнаружено дисбиотических изменений микрофлоры кишечника, а количество бифидобактерий даже возрастало. Надосадочная жидкость нативной культуры лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-А3, вводимая белым мышам 8 группы реr os за 5 дней до заражения и еще в течение 5 дней после заражения культурой Y. pseudotuberculosis 147, обеспечила купирование инфекционного процесса, предотвращение гибели животных и развитие дисбактериоза кишечника. Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков экзометаболитов надосадочной жидкости нативных культур лактобактерий L. plantarum 8Р-А3 и в меньшей степени бифидобактерий B. bifidum 1, были вполне ожидаемы. В выполненных нами ранее исследованиях [25] с использованием конвенциональных белых мышей с экспериментальным антибиотико-ассоциированным дисбактериозом впервые было установлено, что основной вклад в эффективность пробиотических препаратов вносят продукты жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов – экзометаболиты, а микробные клетки, их продуцирующие, не участвуют в восстановлении микробиоценоза кишечника. Таким образом, представленные экспериментальные данные свидетельствуют о высокой эффективности по- Таблица 1. Протективная эффективность пребиотика Стимбифид и экзометаболитов бифидобактерий и – лактобактерий при пероральном заражении белых мышей возбудителем псевдотуберкулеза (Х±I 95, n=10) Порядковый номер КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Группа животных Заражающая доза, КОЕ Количество животных, особей павших от взятых псевдотув опыт беркулеза 10 10 Сроки гибели, – сутки X (Хmin-Хmax) выделенные микроорганизмы начало экспе- 21 (или в день римента гибели) Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии (6,0±0,7)•109 (6,5±0,6)•106 (2,8±0,6)•108 (1,6±0,5)•104 (6,1±0,6)•109 (6,0±0,4)•106 (1,8±0,5)•108 (1,6±0,4)•104 (6,2±0,5)•109 (6,3±0,7)•106 (1,9±0,6)•108 (1,5±0,5)•104 (6,2±0,6)•109 (6,0±0,5)•106 (2,0±0,6)•108 (1,6±0,6)•104 (1,1±0,4)•102 (1,3±0,5)•102 (1,1±0,3)•101 (2,0±0,7)•106 (7,5±0,6)•104 (8,2±0,6)•104 (1,4±0,5)•103 (2,4±0,6)•106 (6,9±0,5)•104 (7,6±0,7)•104 (1,5±0,6)•103 (8,6±0,5)•109 (6,2±0,6)•107 (4,8±0,7)•108 Эшерихии Контрольная 2 Лечение гентамицином через 2 часа после заражения в течение 5 дней 10 0 - 3 Лечение гентамицином через 24 часа после заражения в течение 5 дней 10 0 - 10 0 - (1,7±0,6)•104 (4,0±0,6)•104 10 0 - Общее количество (6,1±0,8)•109 Бифидобактерии (6,3±0,7)•106 Лактобактерии (2,5±0,7)•108 (5,8±0,6)•109 (5,1±0,7)•107 (4,0±0,5)•108 (1,7±0,6)•104 (3,9±0,7)•104 10 0 - Общее количество (5,6±0,6)•109 Бифидобактерии (6,0±0,5)•106 Лактобактерии (2,6±0,5)•108 (4,0±0,5)•109 (4,3±0,6)•107 (4,1±0,5)•108 (1,9±0,7)•104 (3,2±0,8)•104 10 4 6,3 (4-9) 5 6 7 8 Введение per os пребиотика Стимбифид за 5 дней до заражения и 5 в течение дней после заражения Введение per os пребиотика Стимбифид через 2 часа после заражения в течение 5 дней Введение per os пребиотика Стимбифид через 24 часа после заражения в течение 5 дней Введение per os надосадочной жидкости нативной культуры бифидобактерий за 5 дней до заражения и в течение 5 дней после заражения Введение per os надосадочной жидкости нативной культуры лактобактерий за 5 дней до заражения и в течение 5 дней после заражения 8,8 (5-13) Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 1 4 128 лученных из нативных культур пробиотических микроорганизмов экзометаболитов надосадочной жидкости, обладающих, как и пребиотик Стимбифид, способностью предотвращать развитие инфекционного процесса в кишечнике бактериями псевдотуберкулеза. Общим в их механизме действия является селективная стимуляция роста и функциональной активности индигенной микрофлоры, а в случае использования экзометаболитов – возможное дополнительное наличие в их составе антимикробных веществ (антибиотиков, бактериоцинов и других низкомолекулярных биоактивных субстанций [26]). Следовательно, на сегодняшний день появилось достаточно оснований считать необходимым и возможным развитие уникальных технологий выделения из бескле- 10 LD50 (850000) Эшерихии Эшерихии 10 LD50 (850000) 10 0 - Общее количество (6,1±0,6)•109 Бифидобактерии (6,2±0,7)•106 Лактобактерии (3,0±0,5)•108 Эшерихии (1,9±0,7)•104 (1,6±0,5)•105 (1,3±0,4)•104 (1,8±0,6)•104 (1,2±0,5)•102 (2,3±0,7)•104 (1,1±0,5)•102 (1,6±0,5)•102 (1,0±0,4)•101 Общее количество (6,5±0,5)•109 (8,1±0,6)•109 Бифидобактерии (6,4±0,6)•106 (6,8±0,7)•107 Лактобактерии (2,8±0,7)•108 (5,3±0,6)•108 Эшерихии (2,0±0,5)•104 (1,5±0,5)•104 Примечания: 1. В таблице приведены результаты определения содержания живых бактерий, выделенных из кишечного содержимого погибших животных в группе 1 (контроль); в группе 7 (опыт) в числителе – содержание живых бактерий на 21 сутки эксперимента, в знаменателе – на день гибели. 2. От всех павших в опыте животных из внутренних органов была выделена чистая культура возбудителя псевдотуберкулеза ЛИТЕРАТУРА 1. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы – актуальная проблема медицины. Вестн. РАМН; 1997 (3): 4-7. 2. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В., Воробьев А.А. Микроэкологические изменения кишечника и их коррекция с помощью лечебно-профилактических препаратов. Журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. 2003; (4, приложение 20): 66-76. 3. Воробьев А.А., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А. Микроэкологические нарушения при клинической патологии и их коррекция бифидосодержащими пробиотиками. Вестн. РАМН; 2004 (2): 13-17. Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков 1. В экспериментах на конвенциональных белых мышах изучена возможность предотвращения развития псевдотуберкулеза и дисбиотических изменений в кишечнике при пероральном введении животным бактерий штамма Y. pseudotuberculosis 147, путем повышения колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника. 2. Получены нативные культуры пробиотических бифидобактерий и лактобактерий («жидкие пробиотические комплексы») с концентрацией 8,6•108 КОЕ•мл-1 и 2,8•109 КОЕ•мл-1 соответственно, использованные с пребиотиком Стимбифид для сравнительной оценки антибактериальной активности против псевдотуберкулезного микроба как самих нативных культур, так и надосадочных жидкостей, освобожденных центрифугированием от клеток бифидобактерий и лактобактерий, а также к оценки возможности предотвращения развития дисбактериоза кишечника. 3. Впервые в прямых опытах на конвенциональных белых мышах установлена протективная эффективность пребиотика Стимбифид и надосадочной жидкости нативной культуры пробиотических лактобактерий L. plantarum 8РА3, содержащей микробные экзометаболиты, при пероральном заражении подопытных животных возбудителем псевдотуберкулеза Y. pseudotuberculosis 147 в дозе 10LD50. У выживших животных на 21 сутки эксперимента при бактериологическом изучении фекалий не обнаружено дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта. 4. Повышение колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника конвенциональных белых мышей под влиянием пребиотика Стимбифид и микробных экзометаболитов, содержащихся в надосадочной жидкости нативной культуры пробиотических лактобактерий L. plantarum 8Р-А3, является научной основой нового подхода в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта инфекционной природы, основывающегося на избирательном стимулирующем влиянии на рост и активацию метаболической активности индигенной кишечной микрофлоры. сборник научных статей Выводы 4. Ардатская М.Д. Дисбактериоз кишечника: понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции. Consilium ruedicum 2008; 10 (8): 86-92. 5. Ардатская М.Д., Чичерин И.Ю., Стражев С.В., Минушкин О.Н. Эффективность фруктоолиго- и фруктополисахаридов в коррекции и профилактике нарушений микробиоценоза кишечника. Кремлевская медицина. Клинический вестник 2011; (3): 59-66. 6. Грачева Н.М., Малышев Н.А., Чичерин И.Ю., Аваков А.А., Партин О.С., Щербаков И.Т., Соловьева А.И., Герасимова Н.В. Фруктоолигосахариды и фруктополисахариды в комплексном лечении больных желудочно-кишечными заболеваниями с явлениями дисбактериоза кишечника. Инф. болезни 2010; 8 (1): 107-111. 7. Чичерин И.Ю., Дармов И.В., Богачева Н.В., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Шевцов А.Н. Исследование влияния больших доз пробиотика Бифидумбактерин и микроорганизмов аутофлоры кишечника на организм белых мышей и показатели клеточного иммунитета. - http://gastroportal.ru/files/mikroflora.pdf 8. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. Иерсиниозы. В кн.: Лекции по инфекционным болезням. В 2 томах. Том 1. – 2-е изд. перераб. и доп. М.: ВУНМЦ; 1999; 454 с. 9. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.П., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. – 2-е изд. перераб. и доп. М.: Медицина; 2001; 256 с. 10. Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Кареткина Г.Н., Бродов Л.Е. Иерсиниозы. М.: Медицина; 2003; 208 с. 11. Маракулин И.В., Дармов И.В., Погорельский И.П., Дробков В.И., Паутов В.Н. Экспериментальная модель псевдотуберкулезной инфекции у обезьян. Бюл. эксп. биол. и мед. 1994; 118 (7): 59-62. 12. Дармов И.В., Маракулин И.В., Погорельский И.П., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф. Профилактика экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции с помощью иммунизации порином из Yersinia pseudotuberculosis. Бюл. эксп. биол. и мед. 1999; 127 (2): 221-223. 13. Погорельский И.П., Дробков В.И. Оценка протективной эффективности секреторных антител при экспериментальной иерсиниозной инфекции у морских свинок, иммунизированных поливалентной противоиерсиниозной вакциной. Патол. физиол. и эксп. терапия 2009; (4): 26-29. 14. Сазанов Н.С. Псевдотуберкулез. Киев: Здоров’я; 1984; 120 с. 15. Знаменский В.А., Вишняков А.К. Этиология дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки. Журн. микробиол. 1967; (2): 125-130. 16. Ценева Г.Я., Полоцкий Ю.Е., Дмитриева Г.М., Полоцкий В.Ю. Характеристика инвазивности возбудителя псевдотуберкулеза. Журн. микробиол. 1984 (5): 26-30. 17. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro. Журн. микробиол. 2005 (2): 56-61. 18. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. – М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 2010; 23 с. 19. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн. микробиол. 1992; (9-10): 74-78. 20. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Г., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо, СПб: Центр госсанэпиднадзора 2002; 31 с. 21. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. – Л: Медгиз, 1962; 280 с. 22. Jorgensen J.H., Turnidge J.D. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. Manual of clinical microbiology. 9th-ed ASM Press Press Washington; 2007: 1152-1172. 23. Борисова М.А. Клиника иерсиниозов. Владивосток: Изд-во ДВГУ; 1991; 197 с. 24. Грачева Н.М., Партин О.С., Аваков А.А., Соловьева А.И., Щербаков И.Т. Клиническое изучение БАД Стимбифид: клинический отчет Московского НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Г.Н. Габричевского и инфекционной клинической больницы № 1 г.Москвы. – М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, 2010; 12 с. 25. Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Гаврилов К.Е. Пробиотики: вектор развития. Практическая медицина; 2012; 3 (58): 180-188. 26. Shenderov B.A. Probiotic (symbiotic) languages. Anaerobe 2012; (17): 490-495. 129 точных фильтратов или супернатантов биологически активных экзометаболитов, перспективных для создания на их основе не только высокоэффективных средств коррекции нарушений кишечной микрофлоры, но и, возможно, нового класса лекарственных препаратов, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта инфекционной природы. Становление и развитие данных технологий напрямую будет связано с поиском и выделением штаммовпродуцентов биологически активных экзометаболитов и их всесторонним изучением, конструированием недорогих питательных сред и подбором условий для выращивания штаммов-продуцентов, разработкой высокоэффективных изоляционных методов, позволяющих выделять микробные экзометаболиты в количествах, достаточных для создания на их основе биологически активных химических соединений с целью проведения лабораторных и клинических испытаний. Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 130 КОЛОНИЗАЦИОННАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШЕЧНИКА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИЕРСИНИОЗЕ* Чичерин И.Ю.1, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2, Бессолицына Е.А.2, Дармов И.В.2, Шабалина М.Р.2 1 Научное общество «Микробиота», Сергиев Посад, Россия (141306, Сергиев Посад-6 МО, ул. Октябрьская,19-3), e-mail: rpatron@mail.ru 2 ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru COLONIZATION RESISTANCE OF THE INTESTINAL MUCOSA IN EXPERIMENTAL YERSINIOSIS Chicherin I.Yu.1, Pogorelsky I.P.2, Lundovskikh I.A.2, Bessolitsyna E.A.2, Darmov I.V.2, Shabalina M.R.2 1 Scientific society «Microbiota», Sergiev Posad, Russia (Oktyabrskaya st., 19-3, Sergiev Posad-6, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru, 2 Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru РЕЗЮМЕ SUMMARY Исследовано влияние пребиотика Стимбифид и низкомолекулярных экзометаболитов надосадочной жидкости нативных культур пробиотических бифидобактерий и лактобактерий, обладающих пребиотическим действием, на предотвращение развития кишечного иерсиниоза у конвенциональных белых мышей. Подопытных животных инфицировали перорально культурой возбудителя кишечного иерсиниоза Yersinia enterocolitica, выделенного от больного с манифестной формой инфекционного заболевания. Пребиотик Стимбифид, надосадочная жидкость нативных культур бифидобактерий и лактобактерий, составляющих основу пробиотиков Бифидумбактерин и Лактобактерин, при пероральном введении инфицированным животным полностью купировали развитие кишечного иерсиниоза и предотвращали дисбиотические изменения в составе кишечной микрофлоры. Ключевые слова: кишечный иерсиниоз, белые мыши, дисбактериоз, пребиотик, пробиотик, экзометаболиты. The effect of prebiotic Stimbifid and low-molecular exometabolites in the supernatant fluid of native cultures of prebiotic bifidobacteria and lactobacilli possessing prebiotic effect on the prevention of intestinal yersiniosis in the conventional white mice was investigated. Experimental animals were infected orally with intestinal yersiniosis pathogen Yersinia enterocolitica, isolated from patient with manifested form of infection. Prebiotic Stimbifid, supernatant fluids of native cultures of Bifidobacteria and Lactobacteria, which form the basis of probiotics Bifidumbacterin and Lactobacterin, when administered orally to infected animals completely stopped the development of intestinal yersiniosis and prevented the dysbiotic changes in the intestinal microflora. Key words: intestinal yersiniosis, white mice, dysbacteriosis, prebiotic, probiotic, exometabolites. ВВЕДЕНИЕ стики и лечения данного инфекционного заболевания, летальность при септической форме которого достигает 30-60 % [5, 6]. Основным резервуаром возбудителя в природе являются мелкие грызуны, которые оставляют возбудитель на различных объектах внешней среды, на почве, пищевых продуктах, заносят в воду, способствуя распространению иерсиний среди диких и домашних животных, мелких певчих птиц. Источником инфекции для человека являются в основном домашние животные и мелкие грызуны [1, 2, 6]. Факторами передачи Y. enterocolitica являются контаминированные мясные продукты, молоко, овощи, вода. Иерсинии способны длительно существовать при низких положительных температурах и размножаться в пищевых Кишечный иерсиниоз – острая зоонозная бактериальная инфекция, вызываемая микроорганизмами Yersinia enterocolitica [1, 2]. Для болезни характерны фекальнооральный механизм передачи возбудителя, полиморфизм клинической симптоматики, нередко стертая картина начальных проявлений болезни, сходство клинических проявлений с другими заболеваниями кишечника различной этиологии, вовлечение в патоморфологический процесс ряда органов и систем, преимущественная спорадичность возникновения заболевания, возможность хронизации [1-4]. Эти и другие особенности кишечного иерсиниоза обуславливают известные трудности выявления, диагно- * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Бессолицына Е.А., Дармов И.В., Шабалина М.Р. Колонизационная резистентность слизистой оболочки кишечника при экспериментальном иерсиниозе. Журнал инфектологии.2013.- №1. Материалы и методы В экспериментах по моделированию кишечного иерсиниоза на конвенциональных белых мышах использовали кальцийнезависимый штамм 1407 Yersinia enterocolitica серотипа 0:9, содержащий плазмиду с молекулярной массой 42 МД. Штамм выделен от больного с манифестной формой заболевания, выраженными симптомами гастроэнтероколита и поражения суставов. Титр антител в крови больного против иерсиний 1:12000. Бактерии штамма устойчивы к ампициллину, чувствительны к хлорамфениколу, гентамицину, ципрофлоксацину, цефтриаксону. Величина LD50 для белых мышей при пероральном способе введения составляет ~7,4•107 живых микробов. В работе использовали: пребиотический препарат Стимбифид (серия 030910 ТУ 9330-002-50168265-05 с изм. № 1, произведен ООО «В-МИН» (ООО «МедСтар», Россия). Препарат создан на основе фруктоолиго- и фруктополисахаридов, содержит премикс витаминно-минеральный «Immunity» и вспомогательные вещества (натрия бикарбонат, лактоза, кальция стеарат). Лечебная и профилактическая эффективность пребиотика Стимбифид подтверждена клиническими испытаниями [17]; пробиотик Бифидумбактерин (серия 315/6, произведен ФГУП «НПО «Микроген», Россия); пробиотик Лактобактерин (серия 15/6, произведен ФГУП «НПО «Микроген», Россия). Выращивание штамма Y. enterocolitica 1407 с учетом его психрофильности [2] проводили при температуре 24 °С. Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков зации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами является составной частью защитных механизмов кишечника в норме. Сохранив колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника, обеспечив бионесовместимость по типу «хозяин против патогена» [16], можно купировать развитие патологического процесса на ранней стадии иерсиниозной инфекции, предотвратив адгезию, инвазию и колонизацию слизистой возбудителем Y. enterocolitica. Цель работы состоит в изучении влияния пребиотика Стимбифид и низкомолекулярных микробных экзометаболитов пробиотических микроорганизмов, образующихся в процессе культивирования в жидких питательных средах, на колонизационную резистентность кишечника конвенциональных белых мышей и предотвращение развития кишечного иерсиниоза. На основании данных, представленных J.C. Pepe и V.L. Miller в работе [13], инициация кишечного иерсиниоза при энтеральном поступлении Y. enterocolitica в чувствительный организм выглядит следующим образом: на первой стадии процесса происходит адгезия и инвазия возбудителя с последующей транслокацией через интестинальный эпителий в терминальном отделе подвздошной кишки и размножением в пейеровых бляшках; на второй стадии – диссеминация возбудителя по органам и системам тканей и развитие генерализованной (системной) инфекции. Таким образом, воздействуя на начальной стадии инициации кишечного иерсиниоза при пероральном поступлении возбудителя в организм, можно предупредить его адгезию к эпителиоцитам слизистой оболочки кишечника, колонизацию и инвазию. С этой целью использованные в работе конвенциональные белые мыши были разделены на 6 групп по 10 особей в каждой группе. Первая группа, животных которой инфицировали перо- сборник научных статей Результаты исследования 131 продуктах. Для кишечного иерсиниоза характерен сезонный подъем заболеваемости; в ноябре отмечается пик заражения возбудителем Y. enterocolitica [6]. Серьезность проблемы кишечного иерсиниоза, с которой сталкиваются врачи-инфекционисты, эпидемиологи и микробиологи, связана с тем, что заболевание часто остается нераспознанным и превращается, будучи изначально инфекционным, в терапевтическую и даже хирургическую проблему [4-6]. Важно при этом отметить, что при кишечном иерсиниозе, также как и при псевдотуберкулезе [7], возникают выраженные дисбиотические изменения в составе кишечной микрофлоры. Очень часто с микроэкологическими нарушениями в консорциуме нормальной кишечной микрофлоры ассоциируются возникающие и усугубляющиеся метаболические нарушения, которые провоцируют прогрессирование патологического состояния с быстрым летальным исходом [8]. Как известно, для Y. enterocolitica основным является энтеральный путь инфицирования [2, 6]. Поэтому адекватной моделью, воспроизводящей кишечный иерсиниоз, является энтеральное заражение восприимчивых животных [9, 10]. Комплекс факторов патогенности Y. enterocolitica определяет их способность вызывать заболевание у лабораторных животных и у людей. Процесс первичного взаимодействия патогенных иерсиний с эпителием кишечника при энтеральном поступлении в организм подразделяют на два этапа: адгезию с энтеротоксигенностью различной степени выраженности при слабой или отсутствующей инвазии и пенетрацию бактерий в клетки эпителия при слабой токсинпродукции с последующей генерализацией инфекции [2, 11]. Штаммы Y. enterocolitica серотипа 0:9 (наиболее инвазивные, содержащие плазмиду вирулентности) характеризуются развитием генерализованного процесса с возникновением энтероколита, увеличением лимфатических узлов, печени, селезенки, полнокровием паренхиматозных органов и образованием милиарных абсцессов. Выделение патогенных бактерий отмечается из печени, лимфатических узлов брыжейки, из кишечного содержимого [2]. Установление полидетерминантной природы патогенности возбудителя кишечного иерсиниоза, факторы патогенности которого контролируются как хромосомными, так и плазмидными генами [12], имеет принципиальное значение для понимания начального этапа взаимодействия возбудителя со слизистой оболочкой кишечника. Установлено, в частности, что бесплазмидные штаммы Y. enterocolitica не инициируют инфекционный процесс и иммунную перестройку организма при энтеральном инфицировании. Мутанты по гену inv, не синтезирующие инвазин, не способны проникать внутрь эпителиальных клеток кишечника на начальном этапе развития инфекции [13]. Данные, полученные с использованием экспериментальных моделей иерсиниозной инфекции [14], оказались весьма информативными в плане микробиологоморфологической оценки характера взаимодействия иерсиний с чувствительным организмом [13, 15]. При естественном (энтеральном) пути введения вирулентных штаммов Y. enterocolitica в чувствительный организм, как и при энтеральном введении бактерий близкородственного псевдотуберкулезного микроба (Y. pseudotuberculosis), важнейшим этапом инфекционного процесса является взаимодействие возбудителя со слизистой оболочкой кишечника. Высокая колонизационная резистентность слизистой оболочки кишечника и ее сопротивляемость к колони- Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков рально возбудителем кишечного иерсиниоза, являлась контрольной. Инфицированных перорально возбудителем кишечного иерсиниоза животных второй группы лечили внутримышечным введением гентамицина по 1 мг в сутки в течение 6 дней, начиная со вторых суток после инфицирования. Животные третьей и четвертой групп являлись опытными. Животным третьей группы вводили перорально пребиотик Стимбифид в дозе 13 мг в сутки за 3 дня до инфицирования культурой Y. enterocolitica и еще в течение 6 дней после инфицирования. Животным четвертой группы пребиотик Стимбифид начинали вводить реr оs в той же дозе через 24 часа после инфицирования в течение 7 дней. Пятая и шестая группы животных также являлись опытными. Животным пятой группы вводили по 0,2 мл перорально надосадочную жидкость нативной культуры бифидобактерий за 3 дня до заражения возбудителем Y. enterocolitica, а также в течение 6 дней после заражения. Животным шестой группы за 3 дня до заражения, как и животным пятой группы, вводили по 0,2 мл перорально надосадочную жидкость нативной культуры лактобактерий, а также в течение 6 дней после заражения. Нативные культуры пробиотических бифидобактерий и лактобактерий, в которых накапливались низкомолекулярные микробные экзометаболиты, получали путем культивирования выделенных из коммерческих препаратов Бифидумбактерин и Лактобактерин микроорганиз- мов в жидких питательных средах при температуре 37°С в течение 72 часов до концентрации бифидобактерий 8,8•108 КОЕ•мл-1 и лактобактерий 3,0•109 КОЕ•мл-1. Заражающая доза возбудителя кишечного иерсиниоза для животных всех 6 групп составила 10 LD50 (~7,4•108 КОЕ) при пероральном введении бактериальной взвеси, что гарантировало развитие манифестной формы заболевания. Результаты экспериментов представлены в таблице. Как следует из представленных в таблице данных, животные контрольной группы, инфицированные энтерально возбудителем кишечного иерсиниоза, погибли в сроки от 8 до 15 суток со дня инфицирования. О развитии системной инфекции свидетельствует выделение чистой культуры иерсиний от павших животных. При бактериологическом изучении фекалий погибших животных на селективной плотной питательной среде выявлен рост колоний иерсиний, соответствующий их количеству в 1 г фекалий, равному 6,8•105 КОЕ•г-1. Одновременно отмечалось снижение общего количества нормальной кишечной микрофлоры в 3,5•105 раз, бифидобактерий – в 4,7•104 раз, лактобактерий – 2,1•106 раз, эшерихий – в 1,6•103 раз. Данные бактериологического исследования фекалий белых мышей контрольной группы свидетельствуют о развитии дисбиотических изменений в микробном сообществе с уменьшением бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий и довольно значительном содержании бактерий кишечного иерсиниоза. Таблица. Протективная эффективность пребиотика Стимбифид и низкомолекулярных экзометаболитов бифидобактерий и лактобактерий при пероральном заражении конвенциональных белых мышей – возбудителем кишечного иерсиниоза (Х±I 95, n=10) № п/п Группа животных Количество животЗараСроки ных, особей … жающая гибели, – павших от доза, сутки X взятых кишечного КОЕ (Хmin-Хmax) в опыт иерсиниоза 132 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ Контрольная 1 2 3 4 5 6 Лечение гентамицином через 24 часа после заражения в течение 5 дней Введение реr оs пребиотика Стимбифид за 3 дня до заражения и в течение 6 дней после заражения 10 LD50 (7,4•108) Введение реr оs пребиотика Стимбифид через 24 часа после заражения в течение 7 дней Введение реr оs надосадочной жидкости нативной культуры бифидобактерий за 3 дня до заражения и в течение 6 дней после заражения Введение реr оs надосадочной жидкости нативной 10 LD50 культуры лактобактерий за 3 (7,4•108) дня до заражения и в течение 6 дней после заражения 10 10 11,0 (8-15) 10 0 - 10 0 - 10 0 - 10 0 - 10 0 - Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … сутки эксперимента, КОЕ•г-1 начало выделенные 25 (или в экспемикроорганизмы день гибели) римента Общее количество (6,4±0,5)•109 (1,8±0,5)•104 Бифидобактерии (6,6±0,6)•106 (1,4±0,6)•102 Лактобактерии (2,5±0,7)•108 (1,2±0,5)•102 Эшерихии (1,8±0,5)•104 (1,1±0,5)•101 Общее количество (6,8±0,6)•109 (2,0±0,6)•106 Бифидобактерии (6,5±0,8)•106 (6,5±0,5)•104 Лактобактерии (2,0±0,6)•108 (7,0±0,5)•104 Эшерихии (1,7±0,7)•104 (1,2±0,6)•103 Общее количество (6,2±0,6)•109 (8,0±0,5)•109 Бифидобактерии (6,2±0,5)•106 (5,2±0,6)•107 Лактобактерии (2,0±0,5)•108 (4,2±0,5)•108 Эшерихии (1,8±0,6)•104 (3,9±0,6)•104 Общее количество (5,9±0,6)•109 (4,1±0,6)•109 Бифидобактерии (6,2±0,5)•106 (5,8±0,6)•107 Лактобактерии (2,5±0,5)•108 (4,4±0,6)•108 Эшерихии (1,7±0,5)•104 (3,0±0,8)•104 Общее количество (6,0±0,6)•109 (2,6±0,5)•109 Бифидобактерии (6,3±0,5)•106 (5,8±0,6)•106 Лактобактерии (3,0±0,5)•108 (2,3±0,5)•108 Эшерихии (1,5±0,7)•104 (1,6±0,5)•104 Общее количество Бифидобактерии Лактобактерии (6,0±0,5)•109 (8,2±0,5)•109 (6,4±0,7)•106 (6,8±0,6)•107 (2,3±0,6)•108 (5,8±0,6)•108 Эшерихии (2,0±0,6)•104 (1,7±0,5)•104 Примечание – В таблице приведены результаты определения содержания бактерий, выделенных из кишечного содержимого погибших животных в группе 1 (контроль); в группах 2-6 (опыт) на 25 сутки эксперимента Несмотря на то, что возбудитель кишечного иерсиниоза Y. enterocolitica менее патогенный, чем близкородственные возбудители чумы Y. pestis и псевдотуберкулеза Y. pseudotuberculosis, однако вызываемое им заболевание представляет довольно серьезную проблему для врачей как в плане диагностики, так и лечения [5, 6]. Особенностью возбудителя Y. enterocolitica, как это отмечено в работе [13], является не его вирулентность, а наличие детерминируемого соответствующим геном биосинтеза инвазина, определяющего проникновение бактерий внутрь эпителиальных клеток в период начальной стадии инфекции. В последующих стадиях кишечного иерсиниоза роль инвазина второстепенная, поскольку как исходный штамм, так и его inv -мутант вызывают системную летальную инфекцию у мышей [2, 13]. Как следует из результатов исследований А.В. Цинзерлинга, внедрение и размножение Y. enterocolitica происходит в собственной мембране слизистой оболочки тонкой кишки, преимущественно в области илеоцекального угла и червеобразного отростка [18]. Начиная Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков сборник научных статей Обсуждение полученных результатов со 2 суток иерсинии размножаются на поверхности эпителия (колонизация), что проявляется цитотоксическим повреждением апикальной цитоплазмы и инвазии в некоторые эпителиоциты [19]. Через 3 суток колонизация иерсиний приводит к образованию биопленок, в том числе и сплошных, на покровном эпителии и в криптах илеоцекального угла и подвздошной кишки. В дальнейшем происходит инвазия бактерий в эпителиоциты, размножение и транслокация за пределы кишечника с генерализацией заболевания. Именно в таком направлении прошла генерализация кишечного иерсиниоза у подопытных животных первой контрольной группы, которых заразили культурой иерсиний штамма Y. enterocolitica 1407. Все 10 инфицированных животных погибли от кишечного иерсиниоза в сроки от 8 до 15 суток. Специфика поражения была подтверждена выделением культуры иерсиний из внутренних органов и кишечного содержимого, где выявлено существенное снижение как общего количества кишечной микрофлоры, так и отдельных ее представителей (бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий). Гентамицин, введенный внутримышечно в соответствующей дозе инфицированным белым мышам, предотвратил развитие инфекционного процесса. У излеченных животных в фекалиях не были обнаружены бактерии кишечного иерсиниоза, но в то же время выявлены дисбиотические изменения в микробном сообществе кишечника. Введение инфицированным животным третьей и четвертой групп перорально пребиотика Стимбифид в соответствующей дозировке предотвратило, согласно патоморфологическим исследованиям, описанным в работах [18, 19], адгезию и колонизацию иерсиний с последующим формированием обширных участков биопленки на покровном эпителии и в криптах кишечника и, тем самым, был ликвидирован первичный патоморфологический субстрат кишечного иерсиниоза у белых мышей. Аналогичным эффекту от введения инфицированным животным пребиотика Стимбифид оказался эффект от перорального введения подопытным инфицированным мышам надосадочной жидкости нативных культур бифидобактерий В. bifidum 1 и лактобактерий L. plantarum 8P-A3 (соответственно 5 и 6 группы животных). Выявленный протективный эффект можно напрямую связать с микробными экзометаболитами В. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3, положительно влияющими на колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника подопытных животных и ингибирующими адгезию патогенных иерсиний, а в последующем их ускоренную элиминацию из кишечника. Как известно, основным механизмом колонизационной резистентности является активация иммунной системы [20]. В то же время состояние колонизационной резистентности напрямую зависит от биологических свойств микроорганизмов всего сообщества кишечной микрофлоры, а также условно-патогенных (патогенных) и пробиотических микроорганизмов, назначаемых с профилактической или лечебной целью. Взаимоотношения между указанными группами микроорганизмов могут носить антагонистический, синергидный или индифферентный характер, что проявляется в виде конкурентности либо совместимости. Очевидно, что перорально введенные пребиотик Стимбифид, а также надосадочные жидкости нативных культур бифидобактерий В. bifidum 1 и лактобактерий L. plantarum 8P-A3, содержащие микробные экзометаболиты, обеспечивают оптимальный качественный и 133 Лечение инфицированных животных второй группы гентамицином, начатое через 24 часа после перорального введения животным суспензии бактерий Y. enterocolitica 1407, полностью купировало развитие инфекционного процесса. При этом в фекалиях выживших животных было выявлено существенное снижение как общего содержания нормальной кишечной микрофлоры (в 3,4•103 раз), так и бифидобактерий (в 100 раз), лактобактерий (в 2,9•103 раз) и эшерихий (в 14,2 раза). Вводимый перорально инфицированным животным пребиотик Стимбифид в соответствующих дозах полностью предотвратил колонизацию и размножение бактерий кишечного иерсиниоза и генерализацию инфекционного процесса. Бактериологическое исследование фекалий этой группы животных свидетельствует о том, что в них не было выявлено дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры, а количество бифидобактерий даже возросло. Важно подчеркнуть, что протективный эффект пребиотика Стимбифид в отношении патогенных иерсиний Y. enterocolitica 1407 проявляется как на фоне его профилактического введения (т.е. за 3 дня до заражения животных третьей группы), так и через 24 часа после заражения животных (четвертая группа). Животным пятой и шестой опытных групп вводили за 3 дня до заражения возбудителем Y. enterocolitica 1407 надосадочную жидкость нативных культур соответственно бифидобактерий (штамм В. bifidum 1) и лактобактерий (штамм L. plantarum 8P-A3), а также еще в течение 6 дней после заражения. В обеих группах не было зафиксировано гибели ни одного подопытного животного. При этом бактериологическое изучение фекалий подопытных животных на 25 сутки эксперимента не выявило дисбиотических изменений в сообществе микроорганизмов кишечной микрофлоры, а в содержимом кишечника животных шестой группы содержание бифидобактерий даже возросло. Представленные в таблице результаты свидетельствуют о действительном влиянии пребиотика Стимбифид и низкомолекулярных микробных экзометаболитов, содержащихся в надосадочной жидкости нативных культур В. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3, на начальный этап инфекционного процесса и предотвращение его генерализации. Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 134 количественный состав нормальной кишечной микрофлоры и, вследствие этого, микроэкологическое преимущество перед попадающими в организм с пищей и водой патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Являясь экологически и функционально маргинальными, они с неизбежностью, в соответствии с общесистемным законом Г.Ф. Хильми [21, 22], потеряют свою индивидуальность и структуру, будут подвергнуты рестрикции и исчезнут из биотопа. Полученные нами результаты в определенной мере согласуются с результатами В.М. Добрынина с соавторами [23], изучавшими перспективы использования пробиотических препаратов в качестве средств патогенетической профилактики и терапии сибирской язвы. Авторами доказана перспективность использования доксициклина в комбинации с бактистатином при заражении беспородных белых мышей возбудителем сибирской язвы в дозе 10 LD50, при которой выживаемость инфицированных животных составила 100 %. В качестве одного из вероятных механизмов положительного воздействия комбинации антибиотика и пробиотика на доброкачественное течение сибиреязвенной инфекции авторы указывают на возможное стимулирующее влияние бактистатина на систему неспецифической иммунологической резистентности. К такому заключению они пришли, исходя из результатов исследований, в которых выявлена способность бактистатина повышать функциональную активность клеток фагоцитарной системы крови и активировать процессы, ответственные за синтез и секрецию в кровь лизоцима и миелопероксидазы, – ферментов, обладающих как иммунорегулирующим действием, так и бактерицидной активностью [23]. Еще одно обстоятельство, на которое обратили внимание В.М. Добрынин с соавторами [23], касается состояния аутомикрофлоры при опасных инфекционных заболеваниях. Несмотря на недостаток информации, авторы убеждены, что с учетом патогенного действия возбудителей опасных инфекционных заболеваний на макроорганизм должны быть изменения со стороны нормофлоры, проявляющиеся развитием дисбиозов, которые способствуют прогрессированию основного заболевания. Настоящими исследованиями впервые показано, что при генерализации иерсиниозной инфекции, сопровождающейся увеличением возбудителя в чувствительном организме до летальной популяции, отмечается действительное снижение в кишечном содержимом подопытных животных как общего количества микроорганизмов, а также таких значимых представителей, как бифидобактерии, лактобактерии и эшерихии. Выживаемость инфицированных животных при пероральном введении пребиотика Стимбифид и микробных экзометаболитов в составе надосадочных жидкостей нативных культур бифидобактерий и лактобактерий является интегральным показателем эффективности пребиотического действия на кишечную микрофлору, при котором происходит ингибирование роста, размножения и колонизации патогенных микроорганизмов, оптимизация микроэкологических условий для функционирования кишечного нормобиоценоза и, по-видимому, иммуномодуляция. Весьма показательно, что при септической форме кишечного иерсиниоза, вторичных очагах инфекции, а также кишечной форме заболевания, протекающего на фоне ослабленного иммунитета, в состав средств лечения включают «при необходимости» пробиотики [6]. Как показывает опыт инфекционистов, такая необходимость возникает, когда кишечный иерсиниоз развивается на фоне хронических заболеваний печени, злокачественных новообразований, сахарного диабета, иммуносупрессивной терапии, алкоголизма, истощения, гемолитической анемии, а также у пожилых людей. Именно в этих случаях целесообразно использовать зарекомендовавший себя с положительной стороны пребиотик Стимбифид [17] и, как показано в наших исследованиях, микробные экзометаболиты, которые могут стать основой нового класса лечебных препаратов [24]. Выводы 1. В экспериментах на конвенциональных белых мышах изучено влияние пребиотика Стимбифид и низкомолекулярных микробных экзометаболитов, образующихся в процессе культивирования в жидких питательных средах бифидобактерий В. bifidum 1 и лактобактерий L. plantarum 8P-A3, на колонизационную резистентность кишечника и предотвращение развития кишечного иерсиниоза при пероральном введении животным бактерий штамма Y. enterocolitica 1407. 2. Получены нативные культуры пробиотических бактерий В. bifidum и L. plantarum 8P-A3 с концентрацией соответственно 8,8•108 КОЕ•мл-1 и 3,0•109 КОЕ•мл-1. Надосадочная жидкость нативных культур, освобожденная центрифугированием от микробных клеток В. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3, и пребиотик Стимбифид, введенные перорально инфицированным возбудителем кишечного иерсиниоза конвенциональным белым мышам, характеризуются хорошей переносимостью и отсутствием побочных эффектов. 3. Установлена протективная эффективность пребиотика Стимбифид и надосадочной жидкости нативных культур пробиотических бактерий В. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3 при пероральном введении конвенциональным белым мышам, зараженным при естественном пути поступления в организм возбудителем кишечного иерсиниоза Y. enterocolitica 1407 в дозе 10 LD50. 4. При бактериологическом изучении фекалий выживших в опыте перорального инфицирования возбудителем кишечного иерсиниоза конвенциональных белых мышей не выявлено дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры на фоне перорального введения пребиотика Стимбифид и надосадочной жидкости нативных культур пробиотических бактерий В. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3 в отличие от выраженности дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры у погибших в результате развития экспериментального кишечного иерсиниоза подопытных животных. ЛИТЕРАТУРА 1. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. Иерсиниозы. В кн.: Лекции по инфекционным болезням. В 2 томах. Том 1. – 2-е изд. перераб. и доп. М.: ВУНМЦ; 1999; 454 с. 2. Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Кареткина Г.Н., Бродов Л.Е. Иерсиниозы. М.: Медицина; 2003; 208 с. 3. Ющук Н.Д., Кареткина Г.Н. Иерсиниоз как хирургическая проблема. Хирургия 1999; (12): 50-52. 4. Седельникова С.М., Ющенко Т.В., Асеева Э.И. Иерсиниозы как терапевтическая проблема. Терапевт. архив 2000; (11): 27-30. 5. Ющук Н.Д., Кареткина Г.Н. Клиника, диагностика и лечение иерсиниоза. М.: Медицина; 1987; 24 с. 6. Звягинцева Т.Д., Мирзоева Л.А. Кишечный иерсиниоз: особенности течения, диагностика, принципы лечения. Здоровье Украины 2008; (6/1): 72-73. 7. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.П., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. – 2-е изд. перераб. и доп. М.: Медицина; 2001; 256 с. 8. Захаренко С.М., Фоминых Ю.А., Мехтиев С.Н. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология 2012; 3: 14-20. Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков сборник научных статей 18. Цинзерлинг А.В., Цинзерлинг В.А. Современные инфекции: патологическая анатомия и вопросы патогенеза. – СПб.; 2002; 376 с. 19. Авцын А.П., Исачкова Л.М., Жаворонков А.А., Сомов Г.П., Махнев М.В. Основные черты патогенеза псевдотуберкулеза (иерсиниоза). Арх. патол. 1990; (5): 3-7. 20. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. М.: ГРАНТЪ; 1998; 288 с. 21. Погорельский И.П., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А. Экологическая и функциональная маргинальность пробиотических микроорганизмов. Общество, наука, инновации (НТК-2012): ежегод. открыт. всерос. науч.-техн. конф. 16-27 апреля 2012 г.: сб.материалов Вят. гос. ун-т; отв. ред. С.Г.Литвинец. Киров; 2012. 1 электрон. опт. диск (СД-RОМ) (Биологический факультет. Секция «Микробиология»). 22. Хильми Г.Ф. Основы биофизики биосферы. Л.: Гидрометеоиздат; 1966; 272 с. 23. Добрынин В.П., Степанов А.В., Захарченко М.М. Перспективы использования пробиотических препаратов в качестве средств патогенетической профилактики и терапии опасных инфекционных заболеваний. Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Матер. Всерос. науч. конф., посвящ. 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». Киров; 2008; с. 69-71. 24. Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Лахтин М.В., Алёшкин В.А., Несвижский Ю.В., Поспелов В.В. Нанотехнологии и перспективы их использования в медицине и биотехнологии. Вестник РАМН 2008; (4): 50-55. 135 9. Carter P.D. Pathogenicity of Yersinia enterocolitica for mice. Infect. and Immun. 1975; 11(5): 164-170. 10. Дайтер А.Б., Полоцкий Ю.Е., Ценева Г.Я. Патогенные свойства иерсиний и их роль в патологии иерсиниозов. Журн. микробиол. 1987; (5): 108-115. 11. Ценева Г.Я., Бондаренко В.М., Полоцкий Ю.А. Инвазивность и цитотоксичность как критерии оценки аттенуации иерсиний. Журн. микробиол. 1988; (9): 10-16. 12. Darwin A., Miller V.Z. Identification of Yersinia enterocolitica genes affecting survival in an animal host using signature tagget transposon mutagenesis. Mol. Microbiol. 1999; 32: 51-62. 13. Pepe J.C., Miller V.Z. Yersinia enterocolitica invasion: a primary role in the initiation of infection. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1993; 90: 64736477. 14. Ценева Г.Я., Полоцкий Ю.Е., Клеганов В.К., Ефремов В.Е. Выбор моделей для определения патогенных свойств возбудителя псевдотуберкулеза. Журн. микробиол. 1982; (11): 68-71. 15. Ценева Г.Я., Полоцкий Ю.Е., Дмитриева Г.М., Полоцкий В.Ю. Характеристика инвазивности возбудителя псевдотуберкулеза. Журн. микробиол. 1984 (5): 26-30. 16. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro. Журн. микробиол. 2005 (2): 56-61. 17. Грачева Н.М., Ардатская М.Д., Аваков А.А., Соловьева А.И. Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании. – М.: Московский НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 2010; 23 с. Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 136 АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ И СОСТАВ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ НАТИВНОЙ КУЛЬТУРЫ LАCTOBACILLUS PLANTARUM 8Р-А3* Чичерин И.Ю.1, Погорельский И.П.2, Лундовских И.А.2, Дармов И.В.2, Малов А.А.3 1 Научное общество «Микробиота», Сергиев Посад, Россия (141306, Сергиев Посад-6 МО, ул. Октябрьская,19-3), e-mail: rpatron@mail.ru 2 ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет», Киров, Россия (610000, Киров, ул. Московская, 36), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru 3 НИЦ ФБУ «33 ЦНИИИ Министерства обороны Российской Федерации», Киров, Россия (610017, Киров, Октябрьский пр., 121) ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND COMPOSITION OF THE SUPERNATANT FLUID OF NATIVE CULTURE LАCTOBACILLUS PLANTARUM 8Р-А3 Chicherin I.Yu.1, Pogorelsky I.P.2, Lundovskikh I.A.2, Darmov I.V.2, Malov A.A.3 1 Scientific society «Microbiota», Sergiev Posad, Russia (Oktyabrskaya st., 19-3, Sergiev Posad-6, Russia, 141306), e-mail: rpatron@mail.ru, 2 Vyatka State University, Kirov, Russia (Moskovskaya st., 36, Kirov, Russia, 610000), e-mail: kaf_mb@vyatsu.ru 3 RC FSE «Russian Federation Ministry of Defense 33 Central Research and Development Testing Institute», Kirov, Russia (Oktyabrsky pr., 121, Kirov, Russia, 610017) РЕЗЮМЕ SUMMARY Объектом изучения является надосадочная жидкость нативной культуры лактобацилл Lаctobacillus plantarum 8Р-А3 коммерческого пробиотического препарата Лактобактерин, выращенной в микроаэрофильных условиях в жидкой питательной среде при температуре 37 °С. Определен состав надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл и изучена ее антибактериальная активность в опытах in vitro и in vivo на инфицированных возбудителями псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза конвенциональных белых мышах. Антибактериальная активность надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 обусловлена содержащимися в ней молочной кислотой, длинноцепочечными жирными кислотами и некоторыми другими бактериальными экзометаболитами. Ключевые слова: пробиотик Лактобактерин, лактобациллы, экзометаболиты, антибактериальная активность, белые мыши, псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз. The object of study is the supernatant fluid of native culture Lаctobacillus plantarum 8Р-А3 of commercial probiotic preparation Lactobacterin grown under microaerophilic conditions in a liquid nutrient medium at a temperature of 37 °С. The composition of the supernatant fluid of lactobacilli native culture was characterized and its antibacterial activity was studied in vitro and in vivo on conventional white mice infected with pathogens of pseudotuberculosis and intestinal yersiniosis. The antibacterial activity of the supernatant fluid of native culture L. plantarum 8Р-А3 is due to lactic acid, long-chain fatty acids and some other bacterial exometabolites contained therein. Key words: probiotic Lactobacterin, Lactobacteria, exometabolites, antibacterial activity, white mice, pseudotuberculosis, intestinal yersiniosis. ВВЕДЕНИЕ скими проявлениями. К числу заболеваний, при которых объективно выявляются выраженные дисбиотические изменения в составе нормальной кишечной микрофлоры, относятся псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз – острые зоонозные бактериальные инфекции, вызываемые близкородственными возбудителями Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica [2]. Особенности клинического течения заболеваний обуславливают известные трудности выявления возбудите- Согласно Отраслевому стандарту «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» [1], дисбактериоз кишечника рассматривается как клинико-лабораторный синдром, возникающий при ряде заболеваний и клинических ситуаций, характеризующийся изменением качественного и/или количественного состава нормальной микрофлоры, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися у части больных клиниче- * Ссылка для цитирования: Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дармов И.В., Малов А.А. Антибактериальная активность и состав надосадочной жидкости нативной культуры Lactobacillus plantarum 8P-A3. Журнал Международной Медицины.2013.- №1(2).- C.131-139. В экспериментах по моделированию псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза на конвенциональных белых мышах использовали кальцийзависимый штамм 147 Y. pseudotuberculosis I серотипа, содержащий плазмиду с молекулярной массой 47 МДа, а также кальцийнезависимый штамм 1407 Yersinia enterocolitica серотипа 0:9, содержащий плазмиду с молекулярной массой 42 МДа. Оба штамма выделены от больных с манифестными проявлениями псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Определенные в экспериментах на конвенциональных белых мышах значения среднесмертельных доз (LD50) при пероральном введении суспензий бактерий составляют: для штамма Y. pseudotuberculosis 147 – 8,5•104 КОЕ, для штамма Y. enterocolitica – 7,4•107 КОЕ. Бактерии штамма лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 были выделены из лиофилизированного пробиотического коммерческого препарата Лактобактерин (серия 15/6, производство ФГУП «НПО «Микроген», Россия). Выращивание лактобацилл и бифидобактерий, выделенных из фекалий подопытных животных, проводили на плотной питательной среде рекомендованного состава [16, 17], эшерихий – на среде Эндо. Иерсинии псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза выращивали на агаре Хоттингера. Для выращивания представителей нормальной микрофлоры фекалий конвенциональных белых мышей при температуре 37 °С использовали систему для анаэробного культивирования (анаэростат) Anaerobic system Mark IIILE003 (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия) с пакетами газогенераторными Hi Anaero Gas Pacet. Выращивание иерсиний псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза с учетом их психрофильности [2, 3] проводили на агаре Хоттингера при пониженной температуре (8 °С и 24 °С соответственно). Для получения нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 использовали жидкую питательную среду, содержащую пептон, дрожжевой экстракт, витамины (В1, В5), глюкозу, стимуляторы роста (гемин и сульфит натрия), соль (хлорид натрия), твин-80. Выращивание лактобацилл в жидкой питательной среде проводили при температуре 37 °С в системе для анаэробного культивирования в течение 72 часов. Общее количество микробных клеток в пересчете на 1 г фекалий подопытных животных определяли подсчетом в камере Горяева (модель 851, ЛПО «Красногвардеец», Россия). Количество живых микроорганизмов (КОЕ) в суспензиях определяли высевом соответствующих десятикратных серийных разведений исследуемых суспензий Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков Материалы и методы исследований сборник научных статей кислот, микробного лизоцима, перекиси водорода и различных антибиотиков. Они также синтезируют различные ферменты и витамины, принимающие участие в процессе пищеварения, обладают иммуномодулирующим действием, важным для восстановления естественных иммунных факторов защиты организма. В связи с вышеизложенным, представляется целесообразным продолжить исследования, связанные с изучением протективной эффективности надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 при пероральном заражении конвенциональных белых мышей бактериями псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Цель работы состоит в изучении антибактериальной активности и состава надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 в экспериментах in vitro и in vivo с использованием инфицированных возбудителями псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза конвенциональных белых мышей. 137 лей, диагностики и лечения заболеваний. Летальность при септической форме псевдотуберкулеза может достигать 25-50 %, а при кишечном иерсиниозе – 30-60 % [3, 4]. При псевдотуберкулезе, как и при кишечном иерсиниозе, очень часто на фоне микроэкологических нарушений в консорциуме нормальной кишечной микрофлоры возникают и прогрессируют метаболические нарушения, которые провоцируют ускоренное течение патологического процесса с быстрым летальным исходом [5]. Благодаря разработке экспериментальных моделей псевдотуберкулезной и иерсиниозной инфекций [6-8] было доказано, что при естественном (энтеральном) пути внедрения патогенных бактерий Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica важнейшим этапом инфекционного процесса является взаимодействие возбудителя со слизистой оболочкой кишечника. Комплекс факторов патогенности возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, детерминируемых соответствующими генами хромосомной и плазмидной локализации [2, 3, 9, 10], обеспечивают определенное экологическое преимущество патогенным иерсиниям именно на начальном этапе их взаимодействия со слизистой оболочкой кишечника. Классический путь инфицирования патогенными иерсиниями чувствительного организма животного начинается с адгезии иерсиний к отдельным эпителиоцитам в основном над куполами пейеровых бляшек в илеоцекальном отделе кишечника с последующей колонизацией поверхности эпителия. В дальнейшем происходит вытеснение (замещение) собственной кишечной микрофлоры у инфицированных животных, инвазия и размножение патогенных иерсиний в отдельных макрофагах и, наконец, образование сплошных биопленок на поверхностном эпителии и в криптах илеоцекального отдела, а также в начале ободочной кишки [2, 7]. В экспериментах на конвенциональных белых мышах нами была изучена возможность предотвращения развития псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, а также дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры, при пероральном введении животным бактериальных суспензий Y. pseudotuberculosis 147 и Y. enterocolitica 1407 [11]. Было установлено, что пребиотик Стимбифид, а также надосадочная жидкость нативной культуры пробиотических лактобацилл L. plantarum 8Р-А3, содержащая микробные экзометаболиты, полностью предотвращали генерализацию псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза у инфицированных животных, а также развитие дисбиотических нарушений в консорциуме кишечной микрофлоры. Протективная эффективность пребиотика Стимбифид и надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3, выделенных из коммерческого препарата Лактобактерин, послужила основанием для формулировки предположения о том, что содержащиеся в нативной культуре лактобацилл микробные экзометаболиты, как и пребиотик Стимбифид, оказывают положительное влияние на колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника конвенциональных белых мышей, препятствуя адгезии патогенных иерсиний к соответствующим рецепторам на слизистые оболочки кишечника, а в последующем – обеспечивая ускоренную элиминацию патогенных иерсиний из кишечника. Действительно, как свидетельствуют опубликованные данные клинико-лабораторных исследований [1215], живые лактобациллы, входящие в состав нормальной кишечной микрофлоры, обладают широкой антагонистической активностью за счет продукции органических Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 138 А Б Рисунок 1 – Зоны ингибирования микробного роста штамма Y. pseudotuberculosis 147 (А) и Y. enterocolitica 1407 (Б): 1 – гентамицин; 2 – надосадочная жидкость, полученная центрифугированием нативной культуры лактобацилл; 3 – надосадочная жидкость, полученная после естественной седиментации лактобацилл. на плотные питательные среды в чашках Петри и подсчетом выросших колоний по истечении времени инкубирования. Надосадочную жидкость для исследования получали путем центрифугирования нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 при 3000 g в течение 15 мин. Антибактериальную активность надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 определяли по методу J.H. Jorgensen и J.D. Turnide [18]. Компонентный состав надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 (в том числе жирнокислотный состав) определяли методом газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием с использованием капиллярных колонок СВ-WAX58 и EquityTM-5 30,0 м x 0,32 мм x 0,32 мкм на приборе Shimadzu-QP2010 Plus. Экстракцию компонентов надосадочной жидкости проводили с использованием ацетонитрила. В экспериментах использовали конвенциональных белых мышей обоего пола массой 18-20 г. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [19]. Результаты исследования Нативную культуру лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 получали, выращивая выделенные из коммерческого пробиотического препарата Лактобактерин бактерии в микроаэрофильных условиях при температуре 37 °С в жидкой питательной среде в течение 72 часов. Концентрация лактобацилл по окончании культивирования составила 3,2•109 КОЕ•мл-1. Надосадочную жидкость получали центрифугированием нативной культуры лактобацилл и путем самопроизвольного осаждения нативной культуры в статических условиях при температуре 5 °С. В обоих случаях надосадочная жидкость имела одинаковое значение рН, равное 5,4. Опыты in vitro, в которых определялись зоны задержки роста бактерий Y. pseudotuberculosis 147 и Y. enterocolitica 1407 (рисунок 1) под влиянием надосадочной жидкости лактобацилл L. plantarum 8Р-А3, свидетельствуют о том, что вокруг тест-объектов, пропитанных раствором ген- Рисунок 2 – Зоны ингибирования микробного роста L. plantarum 8Р-А3: 1 – гентамицин; 2 – надосадочная жидкость, полученная центрифугированием нативной культуры лактобацилл; 3 – надосадочная жидкость, полученная после естественной седиментации лактобацилл. тамицина (продукция ОАО «Биохимик», Россия) в концентрации 1 мкг•мл-1 и надосадочной жидкостью, полученной после центрифугирования нативной культуры лактобацилл, формируются выраженные зоны ингибирования роста иерсиний псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, имеющие практически одинаковый диаметр. Вокруг тест-объекта, пропитанного надосадочной жидкостью, полученной в процессе естественной седиментации, диаметр зон задержки роста иерсиний существенно меньше, что, по-видимому, связано с пониженной диффузией надосадочной жидкости в агаре вследствие присутствия определенного количества лактобацилл во взвешенном состоянии, препятствующих процессу диффузии. На рисунке 2 представлены результаты определения зон задержки роста бактерий L. plantarum 8Р-А3 под влиянием надосадочной жидкости, полученной после осаждения лактобацилл нативной культуры того же штамма. Протективная эффективность надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8P-A3 при пероральном заражении белых мышей возбудителями псевдотуберкулеза и кишечного – иерсиниоза (Х±I 95, n=10) № п/п Группа животных 1 Контрольная 2 Лечение гентамицином через 24 часа после заражения в течение 6 дней 3 Введение per os надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл за 5 дней до заражения и в течение 6 дней после заражения 4 Контрольная 5 Лечение гентамицином через 24 часа после заражения в течение 6 дней 6 Введение реr оs надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл за 5 дней до заражения и в течение 6 дней после заражения Содержание живых бактерий в 1 г фекалий на … Микро- Количество животСроки ных, особей… сутки эксперимента, КОЕ•г-1 организм, гибели, заражаюпавших по- сутки – X выделенные начало экс25 (или в щая доза, взятых сле инфи(Хmin-Хmax) микроорганизмы в опыт перимента день гибели) (КОЕ) цирования Общее количество (6,0±0,7)•109 (1,6±0,6)•104 Бифидобактерии (6,5±0,6)•106 (1,1±0,4)•102 10 10 8,8 (5-13) Лактобациллы (2,8±0,6)•108 (1,3±0,5)•102 Эшерихии (1,6±0,5)•104 (1,1±0,3)•101 Общее количество (6,2±0,5)•109 (2,5±0,6)•106 Y. pseudotubercuБифидобактерии (6,3±0,7)•106 (6,8±0,5)•104 10 0 losis 147, Лактобациллы (1,9±0,6)•108 (7,7±0,7)•104 10 LD50 4 5 Эшерихии (1,5±0,5)•10 (1,6±0,6)•103 (8,5•10 ) Общее количество (6,5±0,5)•109 (8,4±0,6)•109 Бифидобактерии (6,4±0,6)•106 (6,9±0,7)•107 10 0 Лактобациллы (2,8±0,7)•108 (5,5±0,6)•108 Y. enterocolitica 1407, 10 LD50 (7,4•108) 10 10 11,0 (8-15) 10 0 - 10 0 - Эшерихии (2,0±0,5)•104 (1,6±0,5)•104 Общее количество Бифидобактерии Лактобациллы Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобациллы Эшерихии Общее количество Бифидобактерии Лактобациллы (6,4±0,5)•109 (6,6±0,6)•106 (2,5±0,7)•108 (1,8±0,5)•104 (6,8±0,6)•109 (6,5±0,8)•106 (2,0±0,6)•108 (1,7±0,7)•104 (6,0±0,5)•109 (6,4±0,7)•106 (2,3±0,6)•108 Эшерихии (2,0±0,6)•104 (1,7±0,5)•104 (1,8±0,5)•104 (1,4±0,6)•102 (1,2±0,5)•102 (1,1±0,5)•101 (2,0±0,6)•106 (6,5±0,5)•104 (7,0±0,5)•104 (1,2±0,6)•103 (8,2±0,5)•109 (6,8±0,6)•107 (5,8±0,6)•108 Примечание – В таблице приведены результаты определения содержания бактерий, выделенных из кишечного содержимого погибших животных в группах 1 и 4 (контроль); в группах 2, 3, 5, 6 (опыт) на 25 сутки эксперимента Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков Таблица. сборник научных статей микроорганизмов кишечной микрофлоры, отдельных ее представителей, а также содержание патогенных иерсиний. Результаты определений представлены в таблице. Из представленных данных видно, что животные 1 и 4 контрольных групп в результате перорального инфицирования возбудителями псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза погибли в сроки, характерные для этих инфекций. Выделенные чистые культуры иерсиний от погибших животных свидетельствуют о развитии генерализованной инфекции. При этом на селективной плотной питательной среде из фекалий обеих групп животных были выделены культуры иерсиний псевдотуберкулеза (6,8•107 КОЕ•г-1) и бактерий кишечного иерсиниоза (5,8•105 КОЕ•г-1). Данные бактериологического исследования фекалий животных обеих контрольных групп свидетельствуют о глубоких дисбиотических изменениях в составе кишечной микрофлоры, соответствующих 3 степени нарушения по классификации И.К. Максимова [20]. Лечение гентамицином инфицированных животных 2 и 5 групп, начатое через 24 часа после перорального введения суспензий патогенных иерсиний, полностью прервало развитие псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, хотя избежать дисбиотических изменений в составе кишечной микрофлоры не удалось: дисбиотические нарушения соответствуют 2 степени по классификации И.К. Максимова [20]. Надосадочная жидкость нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3, вводимая животным 3 и 6 групп до и после их инфицирования патогенными иерсиниями, 139 Из рисунка 2 следует, что надосадочная жидкость, полученная центрифугированием (и в меньшей степени седиментацией) нативной культуры L. plantarum 8Р-А3, ингибирует рост лактобацилл того же штамма, клетки которого не обладают иммунностью против своих же экзометаболитов, образующихся в процессе роста в жидкой питательной среде. С учетом полученных результатов in vitro, были поставлены эксперименты in vivo по оценке протективной активности полученной центрифугированием нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 надосадочной жидкости при пероральном заражении конвенциональных белых мышей суспензиями иерсиний псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Животных 1 и 4 контрольных групп инфицировали перорально бактериями Y. pseudotuberculosis 147 и Y. enterocolitica 1407 соответственно в дозе, равной 10 LD50. Животных 2 и 5 групп после инфицирования лечили внутримышечным введением гентамицина по 1 мг в сутки в течение 6 дней, начиная со вторых суток после перорального введения суспензий бактерий псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Животные третьей и шестой групп являлись опытными. Им вводили за 5 дней до инфицирования суспензиями бактерий псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза по 0,2 мл перорально надосадочную жидкость нативной культуры L. plantarum 8Р-А3, а также в течение 6 дней после инфицирования. В начале экспериментов и на 25 сутки (или в день гибели) в фекалиях животных определяли общее количество Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 140 Рисунок 3 – Анализ компонентов надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 методом газожидкостной хроматографии (1- молочная кислота, 2 - 1,2а-пиперазин-1,4-дион) обеспечила купирование инфекционного процесса, предотвращение гибели животных и развитие дисбактериоза кишечника. Результаты экспериментов in vitro и in vivo подтвердили существование антагонистической активности у лактобацилл [21, 22] и предопределили изучение состава надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3, обладающей антибактериальной активностью (рисунок 3). Исходя из приведенной на рисунке 3 хроматограммы определения состава надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3, можно с уверенностью утверждать, что основным ее компонентом является молочная кислота, а также гексагидропиррол [1,2а-пиперазин-1,4-дион], входивший в состав питательной среды. Среди менее значимых компонентов надосадочной жидкости следует назвать дипептиды, азотистые соединения, аминокислоты (в частности, пролин), а также длинноцепочечные жирные кислоты, например октаде- кановая (стеариновая) жирная кислота, которые в сумме составляют не более 15 % всего пула компонентов надосадочной жидкости. Прецизионное определение жирнокислотного состава надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 (рисунок 4) позволило установить, что из всего спектра жирных кислот в наибольшем количестве (площадь, %) определяются такие жирные кислоты, как олеиновая [цис-9-октадеценовая] кислота (48,7744 %), эруковая [одноосновная карбоновая] кислота (9,0494 %), пальмитиновая [гексадекановая] кислота (5,0898 %), трикозановая [одноосновная карбоновая] кислота алифатического ряда (4,5723 %), стеариновая [октадекановая] кислота (4,0357 %). В меньших количествах определяются и другие жирные кислоты: пальмитолеиновая [мононенасыщенная] кислота (2,9828 %), миристиновая [тетрадекановая] кислота (1,9703 %), линоленовая [одноосновная карбоновая] кислота (1,9171 %), а также неидентифицированные жирные кислоты (4,0336 %, 3,7655 %, 1,9818 %) и другие. Рисунок 4 – Анализ метиловых эфиров жирных кислот надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 методом газожидкостной хроматографии Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков Анализируя биологические свойства лактобацилл, Н.А. Глушанова [22] констатирует, что одним из наиболее известных биологических свойств является выраженная способность к продукции молочной кислоты. При этом указывается, что антагонизм молочнокислых бактерий в отношении других микроорганизмов обусловлен образованием не только молочной кислоты, но и продукцией ряда антимикробных и антибиотикоподобных соединений: лизоцима, перекиси водорода, бактериоцинов (лактацинов), короткоцепочечых жирных кислот, диацетила, а также гистамина и других аминов [24]. Спектр угнетающей активности продуктов метаболизма молочнокислых бактерий включает сальмонеллы, шигеллы, клостридии, псевдомонады, стафилококки, стрептококки, листерии, некоторые виды грибов [21, 22]. Наиболее выражена эта активность, по данным М.В.Тюрина и соавторов [21], у таких видов, как L. acidophilus, L. plantarum, L. fеrmentii, L. casei, L. buchneri. Как показано в наших экспериментах, продукты метаболизма лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 проявили антибактериальную активность в отношении патогенных иерсиний псевдотуберкулёза (Y. pseudotuberculosis 147) и кишечного иерсиниоза (Y. enterocolitica 1407) как в опытах in vitro, так и in vivo. Надосадочная жидкость, содержащая продукты метаболизма L. plantarum 8Р-А3, получена центрифугированием нативной культуры лактобацилл, выращенной в микроаэрофильных условиях при температуре 37 °С. Именно состав питательной среды и условия культивирования, согласно опубликованным данным [22, 25], определили антибактериальную активность, в том числе активность кислотообразования. Анализ состава надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 позволил установить, что основным её компонентом является молочная кислота. Кроме того, в состав надосадочной жидкости входят также такие жирные кислоты, как олеиновая, эруковая, пальмитиновая, трикозановая, стеариновая, пальмитолеиновая, миристиновая, линоленовая и другие, в том числе неидентифицированные. Перекись водорода в надосадочной жидкости не выявлена. Очевидно, что выраженная антибактериальная активность надосадочной жидкости обусловлена сочетанным действием молочной кислоты и перечисленных жирных кислот. Весьма интересно то, что в составе идентифицированных жирных кислот нет короткоцепочечных жирных кислот, которые образуются в кишечнике под влиянием индигенной микрофлоры, в том числе и лактобацилл. Интересно и другое: надосадочная жидкость нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 подавляет рост не только бактерий псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, что наглядно продемонстрировано образованием зон ингибирования роста соответствующей культуры (рисунок 1), но и рост своих собственных лактобацилл (рисунок 2). сборник научных статей Обсуждение полученных результатов Таким образом, у лактобацилл нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 методом газожидкостной хроматографии 8Р-А3 отсутствует «иммунность» к собственным продуктам метаболизма в нативной культуре. Не исключено, что и в кишечнике пробиотические лактобациллы, поступающие в составе пробиотика Лактбактерин, могут испытывать негативное влияние на рост и физиологические функции со стороны своих собственных экзометаболитов. В отличие от лактобацилл, бактерии, к примеру, чумного микроба, продуцирующие in vivo и in vitro бактериоцин пестицин, являются иммунными к нему вследствие генетической обусловленности этого состояния наличием гена иммунности в составе плазмиды pPst [26]. Сам же пестицин обеспечивает определенное экологическое преимущество внеорганизменным популяциям Yersinia pestis. Опыты in vitro наталкивают на мысль о возможном участии экзогенных метаболитов лактобацилл в формировании и поддержании колонизационной резистентности слизистой кишечника [27, 28]. Продемонстрированная в наших экспериментах протективная эффективность надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8РА3, введенной per os конвенциональным белым мышам, инфицированным возбудителями псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, со всей очевидностью доказала вероятность блокирования рецепторов эпителиальных клеток слизистых оболочек кишечника, предотвращения адгезии патогенных иерсиний и начального этапа инфекционного процесса [29]. Именно этим обстоятельством можно объяснить факт выживания подопытных животных и отсутствие диcбиотических нарушений в составе их кишечной микрофлоры. Действительно, входящая в состав надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3 молочная кислота оказывает в организме антимикробный эффект, регулирует уровень кислотности в пищеварительном тракте, выполняет роль «эндогенного слабительного», регулирует моторную и секреторную активность кишечника [22, 27, 29]. В совокупности с другими компонентами, входящими в состав надосадочной жидкоcти и являющимися метаболитами лактобацилл L. рlantarum 8Р-A3, молочная кислота, как это следует из опубликованных данных [30], препятствует образованию медиаторов воспаления, стимулируемых ферментами патогенных иерсиний, что предупреждает увеличение проницаемости клеточных мембран, гипоксию тканей, нарушение микроциркуляции и свертываемости крови, ведущих к снижению барьерной функции слизистой оболочки кишечника и возможности транслокации патогенных бактерий. В заключение необходимо отметить следующее. Лактобациллы благодаря своим биологическим свойствам представляют значительный научный и практический интерес. Они широко распространены в окружающей среде, являются составной частью нормальной микрофлоры животных и человека. В то же время все дисбиотические нарушения в составе кишечной микрофлоры обязательно сказываются на лактобациллах, и в первую очередь на их численном составе. С другой стороны, лактобациллы нашли широкое применение для профилактики и лечения инфекционновоспалительных заболеваний человека и животных [22]. И как показано настоящими исследованиями, их лечебнопрофилактический потенциал далеко не исчерпан, в том числе в направлении практического использования синтезируемых ими экзометаболитов. 141 Короткоцепочечные жирные кислоты с длиной углеродной цепи от 2 до 6 атомов углерода (уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, капроновая) и их изомеры, представляющие собой конечные продукты метаболизма сахаролитических и протеолитических микроорганизмов кишечника [2, 3] не были обнаружены в надосадочной жидкости. В надосадочной жидкости также не было выявлено перекиси водорода (определение по ОСТ 42-21-2-85 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы»). Глава III Противоинфекционная активность пребиотиков и метаболитных пробиотиков КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 142 Выводы 1. Получена надосадочная жидкость нативной культуры пробиотических лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 с концентрацией бактериальных клеток 3,2•109 КОЕ•мл-1, предназначенная для изучения её состава и оценки антибактериальной активности в опытах in virto и in vivo. 2. Изучен состав надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8P-A3 с использованием газожидкостной хроматографии, в том числе состав жирных кислот. Основным компонентом надосадочной жидкости является молочная кислота, в её составе также присутствуют дипептиды, азотистые соединения и аминокислоты. Спектр жирных кислот представлен олеиновой, эруковой, пальмитиновой, трикозановой, стеариновой, пальмитолеиновой, миристиновой, линоленовой и другими кислотами. 3. В экспериментах, выполненных с использованием дискодиффузионного метода, выявлена антибактериальная активность надосадочной жидкости в отношении бактерий псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Бактериальные клетки L. plantarum 8P-A3 чувствительны к собственным экзометаболитам, входящим в состав надосадочной жидкости нативной культуры, выращенной в микроаэрофильных условиях при температуре 37 °С. 4. Надосадочная жидкость нативной культуры L. plantarum 8Р-А3, освобожденная центрифугированием от лактобацилл, характеризуется хорошей переносимостью и отсутствием побочных эффектов при пероральном введении конвенциональным белым мышам. 5. Установлена протективная эффективность надосадочной жидкости нативной культуры пробиотических лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 при пероральном введении конвенциональным белым мышам, зараженным энтерально суспензями бактерий. Y. pseudotuberculosis 147 и Y. enterocolitica 1407 в дозе 10 LD50. 6. Бактериологическое изучение фекалий выживших в опыте перорального инфицирования суспензиями бактерий Y. pseudotuberculosis 147 и Y. enterocolitica 1407 конвенциональных белых мышей не выявило дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры на фоне перорального введения животным надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8P-A3. ЛИТЕРАТУРА 1. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91599.11.0004-2003), утв. приказом № 231 МЗ РФ от 09.06.2003 г. М., 2003. 2. Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Кареткина Г.Н., Бродов Л.Е. Иерсиниозы. М.: Медицина; 2003; 208 с. 3. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.П., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. – 2-е изд. перераб. и доп. М.: Медицина; 2001; 256 с. 4. Звягинцева Т.Д., Мирзоева Л.А. Кишечный иерсиниоз: особенности течения, диагностика, принципы лечения. Здоровье Украины 2008; (6/1): 72-73. 5. Захаренко С.М., Фоминых Ю.А., Мехтиев С.Н. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром. Эффективная фармтерапия. Гастроэнтерология 2012; 3: 14-20. 6. Ценева Г.Я., Полоцкий Ю.Е., Клеганов В.К., Ефремов В.Е. Выбор моделей для определения патогенных свойств возбудителя псевдотуберкулеза. Журн микробиол 1982; (11): 68-71. 7. Ценева Г.Я., Полоцкий Ю.Е., Дмитриева Г.М., Полоцкий В.Ю. Характеристика инвазивности возбудителя псевдотуберкулеза. Журн микробиол 1984; (5): 26-30. 8. Маракулин И.В., Дармов И.В., Погорельский И.П., Дробков В.И., Паутов В.Н. Экспериментальная модель псевдотуберкулезной инфекции у обезьян. Бюл. эксп. биол. и мед. 1994; 118 (7): 59-62. 9. Pepe J.C., Miller V.Z. Yersinia enterocolitica invasion: a primary role in the initiation of infection. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1993; 90: 64736477. 10. Darwin A., Miller V.Z. Identification of Yersinia enterocolitica genes affecting survival in an animal host using signature tagget transposon mutagenesis. Mol Microbiol 1999; 32: 51-62. 11. Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дармов И.В., Маракулин И.В. Экспериментальный псевдотуберкулез: оценка возможности профилактики, лечения и коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры. Журн инфектологии 2012; (4): 71-79. 12. Бондаренко В.М., Грачева Н.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов. Фарматека 2003; (7): 56-63. 13. Вахитов Т.Я., Момот Т.Н., Шалаева О.Н., Петров Л.Н. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escheriсhia соli М-17. Журн. микробиол. 2003; (6): 20-25. 14. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией. Журн. микробиол. 2004; (1): 84-92. 15. Аджигайтканова С.К. Подходы к медикаментозному лечению дисбактериоза кишечника. http://www.rmj.ru/articles_5634.htm. 16. Иванов В.П., Бойцов А.Г., Коваленко А.Г., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника: информационное письмо, СПб: Центр Госсанэпиднадзора, 2002; 31 с. 17. Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние вопроса таксономии бактерий рода Lactobacillus. Журн микробиол 1992; (9-10): 74-78. 18. Jorgensen J.H., Turnidge J.D. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. Manual of clinical microbiology. 9th-ed ASM Press Press Washington; 2007: 1152-1172. 19. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Медгиз, 1962; 280 с. 20. Максимов И.К. Нарушение микробиоценоза на фоне полихимиотерапии у больных опухолевыми заболеваниями системы крови: новые методы диагностики и коррекции. Фарматека 2004; (13): 79-84. 21. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г., Поспелова В.В., Лагода И.В. К механизму антагонистической активности лактобацилл. Журн. микробиол. 1989; (2): 3-8. 22. Глушанова Н.А. Биологические свойства лактобацилл. Бюл. сибирской медицины 2003; (4): 50-58. 23. Белоусова Е.А., Никитина Н.В., Мишуровская Т.С., Златкина А.Р. Возможности препаратов на основе микробных метаболитов для восстановления кишечной микробиоты Consilium Medicum. Гастроэнтерология 2005; 7 (1): 9-13. 24. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. Том 3: Пробиотики и функциональное питание; М.: ГРАНТЪ, 2001. – 289 с. 25. Baintner F., Schmidt I., Szigeli I., Varga I. Die wirkung von Na- und Caacrylat aux die milchsauregarund von buttermitteln mit unterschiedlicher vergarbarkeit. Wirtschaftseig Futter 1986; 32 (1): 93-99. 26. Мишанькин Б.Н., Гончарова Е.К., Марченков В.И., Кравцов А.Н., Сорокин В.М. Молекулярное клонирование плазмиды Yersinia pestis, детерминирующей синтез пестицина, белка иммунности, фибринолизина и коагулазы. Мол. генет. микробиол. и вирусол. 1984; (10): 12-16. 27. Ленцнер А.А. Лактофлора животного организма и ее защитная функция. Теоретич. и практич. проблемы биологии; М.: Агропромиздат, 1986: 195-200. 28. Freter R., Dе Maclas M.E. Factors affecting the colonization of the gut by lactobacilli and other bacteria. Probiotics: prospects of the use in opportunistic infections. Old Herbarn University Seminar. Monograph. Ind. Microbiol., Pviochem., Herborn-Dill. Germany; 1995: 19-34. 29. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э., Тюри М.Э., Брилене Т.А., Брилене В.И., Левков А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность. Антибиот. и мед. биотехнол. 1987; 32 (3): 173-179. 30. Бондаренко В.М. Метаболитные пробиотики: механизмы терапевтического эффекта при микроэкологических нарушениях Consilium Medicum. Гастроэнтерология 2005; 7 (6): 41-45. СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ О ДИССЕРТАЦИОННЫХ РАБОТАХ РФ за 2000–2012 гг., полностью или частично ПОСВЯЩЕННЫХ ВОПРОСАМ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ. 2000 г. 1.Дарсания Маквала Шотаевна. Микрофлора кишечника обезьян и доклиническое изучение лечебных биопрепаратов: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07.- Москва, 2000.- 109 с.: ил. РГБ ОД, 61 013/373-7. 2.Шилов Сергей Олегович. Иммунный статус, естественный микробиоценоз кишечника птиц и методы их коррекции: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07.- Уфа, 2000.- 191 с.: ил. РГБ ОД, 61 02-3/580-5. Глава IV Справочная информация Глава III 2004 г. 8.Брудастов Юрий Авенирович. Выживание бактерий при взаимодействии с эффекторными механизмами защиты хозяина: диссертация ... доктора медицинских наук: 03.00.07 / Брудастов Юрий Авенирович; [Место защиты: ГОУВПО “Оренбургская государственная медицинская академия”].- Оренбург, 2004.- 310 с.: ил. 9.Попкова София Марковна. Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири: Дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.16, 14.00.07: Иркутск, 2004. - 301 c. РГБ ОД, 71:053/124. 2002 г. 4.Ардатская Мария Дмитриевна. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта: диссертация ... доктора медицинских наук: 14.00.05 / Ардатская Мария Дмитриевна; [Место защиты: Учебно-научный центр Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации].- Москва, 2003.- 299 с.: ил. 5.Бархатова Татьяна Викторовна. Создание технологий синбиотических продуктов на основе растительных олигосахаридов: Дис. ... д-ра техн. наук: 05.18.04, 05.18.07: Ставрополь, 2003 267 c. РГБ ОД, 71:04-5/258. 6.Колганова Татьяна Владимировна. Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе: Дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07, 03.00.15: Москва, 2003; 139 c. РГБ ОД, 61:03-3/1041-0. 7.Тришина Наталия Владимировна. Связь между развитием дисбактериоза кишечника и состоянием антиэндотоксинового иммунитета: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Тришина Наталия Владимировна; [Место защиты: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток РАМН].- Москва, 2003.- 92 с.: ил. 2005 г. 11.Белова Ирина Викторовна. Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактер-ассоциированных заболеваний: Диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07, 2005. – 143 с. 12.Валышева Ирина Викторовна. Антилактоферриновая активность микроорганизмов: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07. - Оренбург, 2005. - 140 с.: ил. РГБ ОД. 13.Голошва Елена Владимировна. Изменение колонизационной резистентности кишечника при дисбактериозах, обусловленных антибиотиками широкого спектра действия: Дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07: Ростов н/Д, 2005, 180 c. РГБ ОД, 61:05-3/828. 14.Ефимов Борис Алексеевич. Микроэкология кишечника человека, коррекция микрофлоры при дисбиотических состояниях: диссертация ... доктора медицинских наук: 03.00.07 / Ефимов Борис Алексеевич; [Место защиты: ФГУН “Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии”].- Москва, 2005.- 277 с.: ил. сборник научных статей 2003 г. 10.Чистохина Лариса Павловна. Иммунобиологическая характеристика препарата “Микростим” на основе метаболитов лактобактерий: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Чистохина Лариса Павловна; [Место защиты: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН].- Пермь, 2004.- 164 с.: ил. 143 3.Чуйкина Оксана Витальевна. Условно-патогенные микроорганизмы в микробиоценозе полости рта при дисбактериозе кишечника, их персистентные свойства: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Чуйкина Оксана Витальевна; [Место защиты: Волгоградская медицинская академия].- Волгоград, 2002.- 163 с.: ил. Глава IV Справочная информация 15.Зорина Виктория Владимировна. Роль лактобактерий в модуляции факторов иммунитета в норме и при экспериментальной шигеллезной инфекции: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07, 14.00.36.Москва, 2005.- 199 с.: ил. РГБ ОД, 61 05-3/1082. 16.Корнеев Михаил Леонидович. Моделирование состояний пристеночной микрофлоры различных отделов желудочно-кишечного тракта на экспериментальных животных: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Корнеев Михаил Леонидович; [Место защиты: ГОУВПО “Московская медицинская академия”].- Москва, 2005.- 167 с.: ил. 17.Шишкина Татьяна Алексеевна. Состояние микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и его коррекция у часто болеющих детей в условиях крупного промышленного города: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Шишкина Татьяна Алексеевна; [Место защиты: ГОУВПО “Московская медицинская академия”]. - Москва, 2005. - 123 с.: 29 ил. РГБ ОД. 2006 г. 18.Вахитов Тимур Яшэрович. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях: диссертация ... доктора биологических наук: 03.00.23.- Санкт-Петербург, 2006.- 561 с.: ил. РГБ ОД, 71 07-3/195. 144 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 19.Глушанова Нина Алексеевна. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: диссертация ... доктора медицинских наук: 03.00.07 / Глушанова Нина Алексеевна; [Место защиты: ФГУН “Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии”].- Москва, 2006.- 260 с.: ил. 20.Железова Людмила Ильинична. Клинико-лабораторные особенности микроэкологических нарушений слизистой толстой кишки при острых кишечных инфекциях у детей: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07 / Железова Людмила Ильинична; [Место защиты: ГОУВПО “Санкт-Петербургская государственная медицинская академия”].- Санкт-Петербург, 2006.149 с.: ил. 21.Калмыкова Анна Ивановна. Системные эффекты действия пробиотиков: Экспериментально-клиническое исследование: диссертация ... доктора биологических наук: 14.00.16. - Новосибирск, 2006. - 248 с.: ил. РГБ ОД. 22.Мартыканова Диляра Сафовна. Изменения микробных сообществ в желудочно-кишечном тракте детей при дисбактериозах кишечника и их коррекция пробиотиками и нитрофуранами: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07, 14.00.25 Казань, 2006. – 216 с. 23.Осипова Ирина Григорьевна. Экспериментальноклиническое изучение споровых пробиотиков: дис. ... дра биол. наук: 03.00.07 Москва, 2006, 283 с. РГБ ОД, 71:063/246. 24.Савостьянова Ольга Вадимовна. Микробиоценоз кишечника и его коррекция у травматолого-ортопедических пациентов с гнойно-септическими осложнениями: Дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07 Москва, 2006. 125 с. РГБ ОД, 61:06-3/1114. 25.Топчий Сергей Николаевич. Роль низкомолекулярных метаболитов кишечной микрофлоры в оценке дисбиоза, прогнозе и лечении больных с хирургическими заболеваниями толстой кишки: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.00.47 / Топчий Сергей Николаевич; [Место защиты: ГОУВПО “Московская медицинская академия”].- Москва, 2006.- 110 с.: ил. 2007 г. 26.Азарова Ева Владимировна. Клинико-микробиологические подходы к прогнозированию характера адаптации новорожденных: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 14.00.09, 03.00.07 / Азарова Ева Владимировна; [Место защиты: Оренбург. гос. мед. акад.].Оренбург, 2007.- 22 с.: ил. РГБ ОД, 9 07-4/1217. 27.Гайдеров Андрей Александрович. Изучение свойств штаммов Escherichia coli M-17 и Bacillus subtilis 1719 на модели экспериментального дисбиоза: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07 / Гайдеров Андрей Александрович; [Место защиты: ГОУВПО “Российский университет дружбы народов”].- Москва, 2007.- 91 с.: ил. 28.Гульнева Марина Юрьевна. Микробиоценоз кишечника у больных системными заболеваниями соединительной ткани и системными васкулитами : диссертация ... кандидата медицинских наук : 14.00.39 / Гульнева Марина Юрьевна; [Место защиты: ГОУВПО “Ярославская государственная медицинская академия”].- Ярославль, 2007.- 182 с.: ил. 29.Лазарева Елена Борисовна. Бактериофаги и пектины в коррекции нарушений микробиоценозов при гнойно-воспалительных процессах: диссертация ... доктора биологических наук: 03.00.07 / Лазарева Елена Борисовна; [Место защиты: ФГУН “Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии”].- Москва, 2007.- 179 с.: ил. 30.Лыкина Елена Владиславовна. Влияние искусственного вскармливания на состояние желудочно-кишечного тракта у детей первого года жизни: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07 / Лыкина Елена Владиславовна; [Место защиты: ГОУВПО “Московская медицинская академия”].- Москва, 2007.- с.: ил. 31.Мустафина Регина Ришатовна. Коррекция пробиотиками микроэкологических нарушений кишечника у пациентов после эрадикационной терапии Helicobacter pylori: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07 / Мустафина Регина Ришатовна; [Место защиты: Центр. науч.-исслед. ин-т эпидемиологии МЗ РФ].- Москва, 2007.- 158 с.: ил. РГБ ОД, 61 07-3/1639. 32.Шевелева Светлана Анатольевна. Анализ микробиологического риска как основа для совершенствования системы оценки безопасности и контроля пищевых продуктов: диссертация ... доктора медицинских наук: 14.00.07 / Шевелева Светлана Анатольевна; [Место защиты: ГУ “Научно-исследовательский институт питания РАМН”].- Москва, 2007.- с.: ил. 35.Иванова Татьяна Николаевна. Микробиологические особенности дисбиоза кишечника у жителей Крайнего Севера: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Иванова Татьяна Николаевна; [Место защиты: ГОУВПО “Военно-медицинская академия”].- СанктПетербург, 2008.- 159 с.: ил. 36.Черныш Анита Юрьевна. Антагонистическое действие пробиотических лактобактерий в отношении патогенных стрептококков различных серологических групп: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Черныш Анита Юрьевна; [Место защиты: С.-Петерб. гос. мед. акад. им. И.И. Мечникова].- Санкт-Петербург, 2008.- 19 с.: ил. РГБ ОД, 9 08-5/421. 37.Шкопоров Андрей Николаевич. Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Шкопоров Андрей Николаевич; [Место защиты: ГОУВПО “Российский университет дружбы народов”].- Москва, 2008.- 86 с.: ил. 2009 г. 42.Иванова Наталия Геннадьевна. Особенности микробиоценоза кишечника у детей с нефротическим синдромом с минимальными изменениями и повышением специфических IgE: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 14.00.09, 14.00.47 / Иванова Наталия Геннадьевна; [Место защиты: С.-Петерб. гос. педиатр. мед. акад.].- Санкт-Петербург, 2009.- 20 с.: ил. РГБ ОД, 9 095/1295. 43.Ипатова Мария Георгиевна. Роль индигенной микрофлоры при воспалительных заболеваниях кишечника у детей: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 14.00.09 / Ипатова Мария Георгиевна; [Место защиты: Федер. науч.-клин. центр дет. гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава].- Москва, 2009.- 32 с.: ил. РГБ ОД, 9 10-2/3632. 44.Кирюхина Наталия Владимировна. Применение пробиотиков в целях коррекции микрофлоры верхних дыхательных путей: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.00.00 / Кирюхина Наталия Владимировна; [Место защиты: ГУЗ “Московский научно-практический центр оториноларингологии”].- Москва, 2009.- 94 с.: ил. 45.Ладыгина Александра Владимировна. Взаимодействие Bifidobacterium bifidum штамм 1 и Escherichia coli штамм М-17 в Бификоле, изготовленном при совместном культивировании производственных штаммов: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07 / Ладыгина Александра Владимировна; [Место защиты: ГОУВПО “Российский университет дружбы народов”].- Москва, 2009.- 142 с.: ил. 38.Амерханова Аделаида Михайловна. Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности: диссертация ... доктора биологических наук: 03.00.07, 03.00.23 / Амерханова Аделаида Михайловна; [Место защиты: Моск. науч.-исслед. ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ].- Москва, 2009.- 280 с.: ил. РГБ ОД, 71 09-3/246. 46.Лутовина Ольга Васильевна. Роль дисбиозов кишечника и ротоглотки в формировании контингента часто и длительно болеющих респираторными заболеваниями детей раннего возраста: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.00.09 / Лутовина Ольга Васильевна; [Место защиты: ГОУВПО “Ростовский государственный медицинский университет”].- Ростов-на-Дону, 2009.- 183 с.: ил. 39.Березина Людмила Витальевна. Клинико-патогенетическое обоснование дифференцированного назначения пробиотиков в терапии острых кишечных инфекций у детей грудного возраста: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.00.09 / Березина Людмила Витальевна; [Место защиты: ГОУДПО “Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования”].Санкт-Петербург, 2009.- 205 с.: ил. 47.Нилова Людмила Юрьевна. Характеристика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Нилова Людмила Юрьевна; [Место защиты: ГОУВПО “СанктПетербургская государственная медицинская академия”].- Санкт-Петербург, 2009.- 129 с.: ил. 40.Евлашкина Вера Францевна. Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07 / Евлашкина Вера Францевна; [Место защиты: Моск. науч.-исслед. ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Глава IV Справочная информация 34.Завьялова Анжелика Витальевна. Микробиоценоз желудка и коррекция его отклонений у детей раннего возраста с функциональными и воспалительными заболеваниями верхних отделов пищеварительного тракта: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.00.09 / Завьялова Анжелика Витальевна; [Место защиты: ГОУВПО “Ивановская государственная медицинская академия”]. - Иваново, 2008. - 171 с.: 11 ил. 41.Ермоленко Елена Игоревна. Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту: диссертация ... доктора медицинских наук: 03.00.07 / Ермоленко Елена Игоревна; [Место защиты: ГУ “Научноисследовательский институт экспериментальной медицины РАМН”].- Санкт-Петербург, 2009.- 205 с.: ил. 48.Семёнов Александр Васильевич. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07 / Семёнов Александр Васильевич; [Место защиты: Оренбург. гос. мед. акад.].- Оренбург, 2009.- 132 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/816. сборник научных статей 33. Горбачева Екатерина Сергеевна. Пробиотические свойства природного микробного симбиоза национального напитка “Айран”: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.07 / Горбачева Екатерина Сергеевна; [Место защиты: Ставроп. гос. ун-т]. - Ставрополь, 2008. - 153 с.: ил. РГБ ОД, 61:08-3/593. Г.Н. Габричевского МЗ РФ].- Москва, 2009.- 198 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/916. 145 2008 г. Глава IV Справочная информация 49.Субботина Марина Евгеньевна. Разработка методики генотипирования бифидобактерий на основе двухлокусного секвенирования с целью видовой идентификации штаммов: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.00.23 / Субботина Марина Евгеньевна; [Место защиты: Всерос. науч.-исслед. ин-т с.-х. биотехнологии РАСХН].Москва, 2009.- 122 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/855. 50.Тонкушина Лилия Владимировна. Аутофлора кишечника у пожилых и людей старческого возраста, проживающих в крупном промышленном городе: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.00.07 / Тонкушина Лилия Владимировна; [Место защиты: ГОУВПО “Волгоградский государственный медицинский университет”].Волгоград, 2009.- 156 с.: ил. 2010 г. 51.Бегиашвили Лариса Васильевна. Клиническая оценка нарушений метаболической активности микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей и методы коррекции: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.01.09 / Бегиашвили Лариса Васильевна; [Место защиты: ГОУДПО “Российская медицинская академия последипломного образования”].- Москва, 2010.118 с.: ил. 146 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ 52.Донских Екатерина Евгеньевна. Молекулярный и микробиологический мониторинг становления микрофлоры кишечника новорожденных: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.02.03 / Донских Екатерина Евгеньевна; [Место защиты: Моск. науч.-исслед. ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ].- Москва, 2010.- 100 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-3/863. 53.Иванова Елена Валерьевна. Биологические особенности бифидобактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.02.03 / Иванова Елена Валерьевна; [Место защиты: ГОУВПО “Оренбургская государственная медицинская академия”].- Оренбург, 2010.- 128 с.: ил. 54.Орлова Надежда Анатольевна. Дисбиоз кишечника у больных воспалительными заболеваниями кишечника с сочетанной патологией и/или внекишечными проявлениями: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.01.04 / Орлова Надежда Анатольевна; [Место защиты: ГОУВПО “Санкт-Петербургская государственная медицинская академия”].- Санкт-Петербург, 2010.- 130 с.: ил. 55.Пенькова Надежда Ивановна. Изучение лактогенных свойств гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах и in vivo: автореферат дис. ... кандидата биологических наук: 03.02.03 / Пенькова Надежда Ивановна; [Место защиты: Ставроп. гос. ун-т].- Ставрополь, 2010.- 20 с.: ил. РГБ ОД, 9 10-7/2322. 56.Шитов Леонид Николаевич. Влияние цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в эксперименте: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.02.03 / Шитов Леонид Николаевич; [Место защиты: Моск. науч.-исслед. ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ].- Москва, 2010.- 166 с.: ил. РГБ ОД, 61 103/1125. 2011 г. 57.Алешкин Андрей Владимирович. Поликомпонентные пробиотические препараты - конструирование, производство и стратегия их продвижения на российском фармацевтическом рынке: диссертация ... доктора биологических наук: 03.01.06 / Алешкин Андрей Владимирович; [Место защиты: Моск. науч.-исслед. ин-т эпидемиологии и микробиологии].- Москва, 2011.- 348 с.: ил. РГБ ОД, 71 11-3/140. 58.Ботина Светлана Геннадиевна. Молекулярнобиологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии: диссертация ... доктора биологических наук: 03.02.03, 03.01.06 / Ботина Светлана Геннадиевна; [Место защиты: Моск. науч.исслед. ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ].- Москва, 2011.- 287 с.: ил. РГБ ОД, 71 12-3/16 59.Бурганова Рамиля Фаритовна. Изменение патогенности Klebsiella pneumoniae при дисбиозе кишечника, вызванного бластоцистной инвазией: диссертация ... кандидата медицинских наук : 03.02.03 / Бурганова Рамиля Фаритовна; [Место защиты: ГОУВПО «Челябинская государственная медицинская академия»].- Челябинск, 2011.- 125 с.: ил. 60.Герасимова Елена Владимировна. Грибы родов Candida и Saccharomyces в фекальном микробиоценозе пациентов с сахарным диабетом: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.02.03 / Герасимова Елена Владимировна; [Место защиты: ГОУВПО “Московская медицинская академия”].- Москва, 2011.- 142 с.: ил. 61.Жиленкова Ольга Геннадьевна. Селекция производственно-перспективных штаммов бифидобактерий, выделенных от детей: автореферат дис. ... кандидата биологических наук: 03.02.03, 03.01.06 / Жиленкова Ольга Геннадьевна; [Место защиты: Моск. науч.-исслед. ин-т эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ].- Москва, 2011.- 29 с.: ил. 62.Журавлёв Алексей Юрьевич. Клиникопатогенетическая значимость дисбиоза кишечника при лептоспирозе: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.01.09 / Журавлёв Алексей Юрьевич; [Место защиты: ГОУВПО “Ростовский государственный медицинский университет”].- Ростов-на-Дону, 2011.- 143 с.: ил. 63.Калинина Светлана Валерьевна. Оценка микробиоценозов и иммунного статуса кормящих женщин: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 03.02.03, 14.03.09 / Калинина Светлана Валерьевна; [Место защиты: Владивосток. гос. мед. ун-т].- Владивосток, 2011.- 24 с.: ил. РГБ ОД, 9 11-3/3847. 64.Мечетина Татьяна Анатольевна. Синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке после холецистэктомии: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.01.28 / Мечетина Татьяна Анатольевна; [Место защиты: Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии].- Москва, 2011.- 107 с.: ил. 65.Михайлова Людмила Викторовна. Биология условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих кишечные инфекции: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.02.03 / Михайлова Людмила Викторовна; 67.Алешукина Анна Валентиновна. Отношения микробхозяин в биотопах толстой кишки при дисбактериозах: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 03.02.03 / Алешукина Анна Валентиновна; [Место защиты: Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора].- Москва, 2012.- 39 с. 68.Аширова Альбина Бариевна. Нарушения микробиоценозов основных биотопов организма у пациентов с рожей, прогнозирование рецидивирующего её течения: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 14.01.09 / Аширова Альбина Бариевна; [Место защиты: Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии].- Москва, 2012.- 21 с. 69.Ильина Лариса Александровна. Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода t-rflp с целью разработки способов ее оптимизации: автореферат дис. ... кандидата биологических наук: 03.01.06 / Ильина Лариса Александровна; [Место защиты: Всероссийский научноисследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии].- Дубровицы, 2012.- 20 с. 70.Ковалева Светлана Валерьевна. Характеристика новых свойств пробиотических препаратов серии «Экофрэнд»: автореферат дис. ... кандидата биологических наук: 03.01.06 / Ковалева Светлана Валерьевна; [Место защиты: Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова].- Саратов, 2012.- 20 с. 71.Иркитова Алёна Николаевна. Эколого-биологическая оценка штаммов Lactobacillus acidophilus, используемых в производстве пробиотических продуктов: автореферат дис. ... кандидата биологических наук: 03.02.03 / Иркитова Алёна Николаевна; [Место защиты: Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН].Пермь, 2012.- 22 с. 72.Медведева Ольга Анатольевна. Состояние микрофлоры толстого кишечника человека и животных при воздействии аномального геомагнитного поля: автореферат дис. ... доктора биологических наук: 03.02.03 / Медведева Ольга Анатольевна; [Место защиты: ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации].- Оренбург, 2012.- 46 с. 73.Прокопенко Кирилл Михайлович. Особенности дисбактериоза кишечника у жителей районов крупного про- 75.Рыбас Яна Александровна. Модуляция адгезивно – активных структур микробного ценоза влагалища селективными модификаторами эстрогеновых рецепторов растительного происхождения: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 03.02.03, 14.01.01 / Рыбас Яна Александровна; [Место защиты: Российский университет дружбы народов].- Москва, 2012.- 22 с. Глава IV Справочная информация 2012 г. 74.Рукосуева Татьяна Владимировна. Особенности микрофлоры при воспалительных процессах желчевыводящих путей у больных желчнокаменной болезнью: автореферат дис. ... кандидата биологических наук: 03.02.03 / Рукосуева Татьяна Владимировна; [Место защиты: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук].- Иркутск, 2012.- 24 с. 76.Червинец Юлия Вячеславовна. Симбиотические взаимоотношения лактобацилл и микроорганизмов желудочно-кишечного тракта: автореферат дис. ... доктора медицинских наук: 03.02.03 / Червинец Юлия Вячеславовна; [Место защиты: ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова].- Москва, 2012.- 25 с. 77.Четвериков Сергей Павлович. Идентификация новых экзометаболитов некоторых штаммов Pseudomonas spp. и технология биопрепаратов на их основе: автореферат дис. ... доктора биологических наук: 03.01.06 / Четвериков Сергей Павлович; [Место защиты: Институт биологии Уфимского научного центра РАН].- Уфа, 2012.- 47 с. 78.Шевчук Евгения Александровна. Закономерности формирования микробоценозов и биологические свойства симбионтов у новорожденных в условиях акушерско-гинекологического стационара: автореферат дис. ... кандидата биологических наук: 03.02.03 / Шевчук Евгения Александровна; [Место защиты: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук].- Иркутск, 2012.- 28 с. сборник научных статей 66.Петров Леонид Николаевич. Микроэкологические и биотехнологические основы создания и эффективного применения новых бактериальных пробиотических препаратов: автореферат дис. ... доктора биологических наук: 03.02.03, 03.01.06 / Петров Леонид Николаевич; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т эксперим. медицины РАМН].- Санкт-Петербург, 2011.- 40 с.: ил. РГБ ОД, 9 112/3863. мышленного города с различным уровнем техногенной нагрузки: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 03.02.03 / Прокопенко Кирилл Михайлович; [Место защиты: Волгоградский государственный медицинский университет].- Волгоград, 2012.- 23 с. 147 [Место защиты: ГОУВПО “Волгоградский государственный медицинский университет”].- Волгоград, 2011.- 137 с.: ил. 148 КИШЕЧНАЯ МИКРОФЛОРА: ВЗГЛЯД ИЗНУТРИ ЗАМЕТКИ
