Стехиометрия процессов культивирования микроорганизмов Цель: научится составлять уравнение материального баланса процессов биосинтеза План 1. Основные принципы стехиометрии 2. Вывод «формулы» биомассы микроорганизмов 3. Расчет выхода биомассы на углеродный субстрат 4. Определение стехиометрических соотношений в реальных процессах ферментации (на примере биосинтеза лимонной кислоты) 1 Основные принципы стехиометрии 1. В химических процессах: nAA + nBB = nCC + nDD Подбор стехиометрических коэффициентов в уравнении (nA, nB, nC, nD) осуществляем на основании закона сохранения материи 2 Основные принципы стехиометрии 1. В биохимических процессах: Общее количество элементов, включенное в структуры клетки, равно количеству, взятому клеткой из питательной среды 3 Основные принципы стехиометрии 1. В биохимических процессах: Субстраты nС [углеродный субстрат] nN [азотный субстрат] nP [фосфорный субстрат] nO2 [О2] .... nX [биомасса] Продукты n [биомасса] nP [продукт метаболизма] nCO2 [CO2] nH2O [H2O] ... (nX+1)X = 4 Основные принципы стехиометрии 1. В биохимических процессах: Субстраты nС [углеродный субстрат] nN [азотный субстрат] nP [фосфорный субстрат] nO2 [О2] .... Продукты = nX [биомасса] nP [продукт метаболизма] nCO2 [CO2] nH2O [H2O] ... 5 2. Вывод «формулы» биомассы Каков элементный состав биомассы? Таблица 1 – Элементный состав биомассы микроорганизмов (по данным элементного анализа) Тип микроорганизмов Элементный состав, % С Н О N P S Зола Дрожжи 47,0 6,5 30,0 7,5 1,5 1,0 6,5 Бактерии 53,0 7,0 20,0 12,0 3,0 1,0 4,0 50,0 8,0 20,0 14,0 3,0 1,0 4,0 «Усредненный» Лесина Ю.А. 6 2. Вывод «формулы» биомассы Таблица 2 – Расчет числа грамм-атомов элементов в 100 г сухой биомассы Тип микроорганизмов Элементный состав, % С/12 Н/1 О/16 N/14 P/31 S/32 Дрожжи 3,92 6,5 1,88 0,54 0,05 0,03 Бактерии 4,42 7,0 1,25 0,86 0,1 0,03 «Усредненный» 4,17 8,0 1,25 1,0 0,1 0,03 «Формула» дрожжи бактерии «усредненная» биомасса С3,92 Н6,5 O1,88 N0,54 P0,05 S0,03 С4,42 Н7,0 O1,25 N0,86 P0,1 S0,03 С4,17 Н8,0 O1,25 N1,0 P0,1 S0,03 7 2. Вывод «формулы» биомассы С-моль - условный моль, приведенный к одному атому углерода «Формула» дрожжи С3,92 Н6,5 O1,88 N0,54 P0,05 S0,03 бактерии С4,42 Н7,0 O1,25 N0,86 P0,1 S0,03 «усредненная» С4,17 Н8,0 O1,25 N1,0 P0,1 S0,03 С-моль СН1,66 O0,48 N0,14 СН1,58 O0,28 N0,19 СН1,92 O0,3 N0,24 биомасса Формула Стоутхаммера С-моля биомассы СН1,8 O0,5 N0,2 Молекулярная масса С-моля: Мr = 1•12 + 1,8•1 + 0,5•16 + 0,2•14 = 24,6 С этого момента забудем о существующих мелких различиях в составах биомассы микроорганизмов! 8 Расчет выхода биомассы на углеродный субстрат 3. Таблица 2 – Расчет стехиометрического выхода биомассы для различных субстратов Субстрат Химическая формула Молекулярная масса субстрата Молекулярная масса С-моля субстрата Стехиометрический выход биомассы Фактически измеренный выход биомассы, г/г Глюкоза С6Н12О6 (С6Н12О6)n (С6Н12О6)n C2H5OH CH3OH (CH2)nH2 180 180n 180n 46 32 14n + 2 30 30 30 23 32 ~14 0,82 0,82 0,82 1,07 0.77 ~1,76 0,5 0,5 0,5 0,75 0,5 1,0 CH4 16 16 1,54 0,62 Крахмал Целлюлоза Этанол Метанол Парафины (н-алканы) Метан 9 Определение стехиометрических соотношений в реальных процессах ферментации 4. Проблемы расчета реальных процессов ферментации: затраты субстратов на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов (непроизводительные затраты) фактический выход сильно зависит от условий и скорости роста биомассы одновременно протекающие процессы катаболизма и анаболизма Стехиометрические коэффициенты определяются из экспериментальных данных по потреблению субстрата и образованию продуктов биохимического взаимодействия 10 4. Определение стехиометрических соотношений в реальных процессах ферментации Общее стехиометрическое соотношение для объединенного процесса, включающего катаболизм и анаболизм nS S + nO2 [О2] + nN [NH3] →X + nP [Р] + nCO2 [CO2] + nH2O [H2O] ПРИМЕР: моль С-моль Экспериментально установлено, что в процессе ферментации на 1 кг потребленной сахарозы получается 0,6 кг лимонной кислоты и 0,3 кг сухой биомассы. Составить стехиометрическое уравнение для процесса биосинтеза лимонной кислоты. М (С12Н22О11) = 342 г/моль М (С6Н8О7) = 192 г/моль М (СН1,8О0,5N0,2)= 24,6 г/моль 11 Ответ: nS [C12H22O11] 0,24 + nP 0,26 + 0,66 nO2[О2] + 0,2 nN [NH3] →[CH1,8O0,5N0,2] + [C6H8O7] + n0,32 n1,0 CO2 [CO2] + H2O [H2O] 12 Материальный баланс стадии ферментации mст.ПС + mпос.мат. + mО2потр. ± mвл.возд. + (mдолив.) + mст.пеног. = mк.ж. + mсо + mбрызг.+ (mотлив.) 2 mст.ПС - масса стерильной питательной среды, кг mпос.мат. – масса посевного материала, кг mО2потр. – масса кислорода, потребленного из воздуха в процессе ферментации, кг mвл.возд. – масса влаги, принесенной (унесенной) из ферментатора, кг mдолив./mотлив. – масса доливов (отливов), если предусмотрены технологией, кг mст.пеног. – масса стерильного пеногасителя, кг mк.ж. – масса культуральной жидкости, кг mсо2 – масса СО2, выделившегося в процессе ферментации, кг 13 mбрызг. – масса жидкости, унесенной из ферментатора в виде брызг, кг Тепловой баланс ферментатора (на режиме ГД) Q1 + Q2 + Q3 + Q4 = Q5 + Q6 + Q7 + Q8+ Q9 Q1- тепло, поступающее с исходными компонентами (питательная среда, посевной материал, воздух на стерилизацию), кДж Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q7 Q8 Q9 - тепло, поступающее с теплоносителем, кДж - тепловой эффект биосинтеза, кДж - тепловой эффект перемешивания, кДж - тепло, уходящее с культуральной жидкостью, кДж - тепло, уходящее с отработанным воздухом, кДж - тепло, на нагрев (охлаждение) аппарата, кДж - тепло, затраченное на испарение влаги из воздуха, кДж - потери тепла в окружающую среду, кДж 14 Тепловой эффект биосинтеза (жизнедеятельности микроорганизмов) Q3 = Qж = QM0 + QS – QM – QP QM0 – тепло, вносимое посевным материалом, кДж QS – тепло, вносимое с компонентами питательной среды, кДж QM – тепло, уходящее с мицелием, кДж QP – тепло уходящее с продуктами биосинтеза, кДж Q = mi•qсг.i находим либо считаем 15 Тепловой эффект перемешивания Q4 = N • τпер.• 3600 N – мощность, затрачиваемая на перемешивание (мощность электродвигателя), Вт τ – время перемешивания, ч 16 Задача 1 Определить влияние объема питательной среды и температуры стерилизации на время выдержки. Объемы стерилизуемой среды 5,32, 50 м3. Температуры стерилизации 100, 120, 130 0С. Вероятность выживания N=0,01. Лесина Ю.А. 17 выд. Решение (см.ЛК 9,10) N0 1 ln К N К – удельная скорость гибели микроорганизмов, 1/мин N0 – число микроорганизмов в стерилизуемом объекте N – конечное число микроорганизмов в стерилизуемом объекте. V, м3 Т, 0С К, мин-1 N, м.о. N0, м.о. ln N0/N τвыд., мин τвыд., ч 5 100 0,013 0,01 51012 33,846 2603,5 43,4 5 120 1,48 22,9 0,38 5 130 14,8 2,29 0,038 32 100 0,013 2746,3 45,77 32 120 1,48 24,12 0,4 32 130 14,8 2,41 0,04 50 100 0,013 2780,6 46,34 50 120 1,48 24,42 0,41 50 130 14,8 2,44 0,041 321012 501012 35,702 36,148 18 К - в расчетах используется К Bacillius stearothermothillus шт.1518 в зависимости от температуры (табл. 10.2) Т, Сº 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 К, мин-1 0.013 0.017 0.023 0.03 0.036 0.048 0.062 0.083 0.109 0.135 0.163 Т, Сº 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 К, мин-1 0.193 0.234 0.302 0.412 0.540 0.653 0.081 1.002 1.210 1.480 1.83 Т, Сº 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 К, мин-1 2.44 3.07 3.77 4.57 5.90 7.40 9.35 11.4 14.8 16.6 18.6 N0 = 106м.о./мл х 5106мл = 51012 N0 = 106м.о./мл х 32106мл = 321012 N0 = 106м.о./мл х 50106мл = 501012 19 Задача 2 Рассчитать геометрический объем емкостного выдерживателя для стерилизации питательной среды. Исходные данные для расчета. 1. Состав концентрата питательной среды (вес.%) сахароза 7,0 кукурузный экстракт 3,0 сульфат калия 0,15 соевая мука 3,5 мел 0,8 хлорид натрия 0,4 подсолнечное масло 0,6 2. Объем питательной среды, м3 35 3. Температура стерилизации, 0С 127 4. Плотность концентрата питательной среды, кг/м3 1070 5. Объем конденсата, % от объема питательной среды 15 6. Время операции стерилизации , ч 3 Вероятность выживания микроорганизмов при непрерывной стерилизации принять 0,001. Обсемененность минеральных солей принять по обсемененности мела,20 подсолнечного масла – по зеленой патоке. Решение (см. ЛК 9,10) V ПС Vап. Vp стер. N0 1 ln К N VПС – объем стерилизуемой питательной среды с конденсатом, м3; τстерил. – время стерилизации всей среды, ч; φ - коэффициент заполнения выдерживателя, 0,9 Vап. К = 7,4 мин-1, N = 0,001 N0 35 1 35 1 5840,03 ln ln 3 7,4 0,001 3 7,4 0,001 63,59 м3 0,9 0,9 Лесина Ю.А. 21 Расчет No Рассчитаем массу концентрата ПС: Объем конденсата составляет Vконд. = 3515/100 = 5,25 (м3) Объем концентрата ПС Vконц.ПС = 35–5,25 = 29,75 (м3) Масса концентрата ПС m конц.ПС = Vρ = 29,75 1070 = 31832,5 (кг) Лесина Ю.А. 22 Расчет No mконц.ПС•вес.%\100 Компонент 100-(7,0+3,0+,0,15+3,5+0,8+0,4+0,6)=84,55 Рассчитаем обсемененность ПС сахароза K2SO4 соевая мука мел NaCl подсолн. масло вода водопров. 0,15 3,5 0,8 0,4 0,6 84,55 Вес.% 7,0 rукурузный экстракт 3,0 Масса, г 2228,3103 954,96103 47,75103 1114,14103 254,66103 127,33103 191,0103 26914,36103 6102 6106 1102 8,8104 1102 1102 4102 4102 1,337109 5729,76109 0,0048109 98,04109 0,0255109 0,0127109 0,0764109 10,77109 Обсемененность, сп./г Обсемененность, сп. Обсемененность концентр. ПС, сп. (1,337+5729,76+0,0048+98,04+0,0255+0,0127+0,0764+10,77) 109 = 5840,03109 mкомп.ПС(г)•обсемененность, сп./г Лесина Ю.А. 23 Таблица 10.1 – Обсемененность компонентов питательных сред споровыми формами микроорганизмов Компонент среды Число спор в 1 г вещества Глюкоза (3.3-6.0)·104 Сахароза (1.9-6.0)·102 Зеленая патока 4·102 Кукурузный экстракт (3.0-6.0)·106 БВК 0.7·104 Соевая мука (8.2-8.8)·104 Кукурузная мука (2.1-3.0)·106 Мел (0.2-1.0)·102 Вода водопроводная (2-6)·102 Лесина Ю.А. 24 Задача 3 Рассчитать оптимальный трубчатый выдерживатель для стерилизации питательной среды Исходные данные для расчета: 1. Объем среды, м3 50 2. Температура стерилизации, 0С 132 3. Объем конденсата, % от объема стерильной ПС 15 4. Плотность среды, кг/м3 5.Вязкость среды, Пас 6. Время операции стерилизации, ч 1030 2,510-3 5 Вероятность выживания микроорганизмов при непрерывной стерилизации принять 0,001. 25 Решение 4 Vсек . d 0 , 0385 4 Vсек . 1030 d 2500 0 , 0385 2 V р К ср . 0 , 307 2 V р 3,14К ср . Лесина Ю.А. 0 , 307 26 Vсек . VПС стер. 50 10 м3/ч 5 N0 = 106м.о./мл х 50106мл = 501012 N 210-13 N0 К 48 48 / 18,6 2,58 ср . ср . V p Vсек . ср. 10 2,58 25,8 27 4 10 1030 d 2500 0, 0385 2 25,8 3,14 48 0, 307 1,1139 0,7181 0,8 м Vp 25,8 l 41,1м 0,785 d 0,785 0,8 Лесина Ю.А. 28