Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня

Проблемы пострадиационного
восстановления:
вчера и сегодня
В 1958 г. Владимир Иванович Корогодин
обнаружил явление пострадиационного
восстановления клеток дрожжей в
непитательной среде. Такое восстановление
осуществляется медленно (в течении 24-48
час) и зависит от плоидности клеток
(проявляется у диплоидных и отсутствует у
G1-гаплоидных клеток), что указывает на
участие в этом процессе гомологичной
рекомбинации.
• Система пострадиационного
восстановления в непитательно среде
представляет уникальные возможности для
молекулярно генетического анализа
рекомбинационных процессов в их кинетике
без вмешательства репликации ДНК.
•
Профили седиментации ДНК из клеток Saccharomyces cerevisiae в
градиенте концентраций нейтральной15-30% сахарозы
(Luchnik, Glaser and Shestakov, 1977)
Необлученный контроль
Облучение в дозе 1000 Gy
Облучение в дозе + выдерживание в непитательной среде, 48
часов.
Выживаемость облученных рентгеновскими лучами
клеток диплоидного и гаплоидного штаммов S. cerevisiae
до и после выдерживания в непитательной среде
Штамм
Облучение (Gy)
Выдерживание в
непитательной
среде, ч
Диплоид
0
0
1000
1000
0
48
0
48
100
103,6
6,0
27,5
Гаплоид
0
0
1000
1000
0
48
0
48
100
96,1
0,03
0,01
Выживаемость,
%
Схема репарации двунитевых разрывов ДНК
по механизму «разрыв и копирование»
(break-induced replication, BIR)
(Luchnik, Glaser, Shestakov, 1977; Voelkel-Meiman
and Roeder, 1990; Malkova, Ivanov and Haber, 1996;
Morrow, Connelly and Hieter, 1997)
• Два пути репарации ДНР ДНК
в условиях инкубации в
непитательной среде:
быстрая и медленная.
Профили седиментации ДНК из клеток Saccharomyces cerevisiae в градиенте
концентрации нейтральной 15-30% сахарозы.
Протопласты получали стандартным методом (А) и в присутствии 10 % KCl (В)
(Glasunov, Glaser and Kapultsevich, 1989)
ДНК из необлученных клеток
Облучение в дозе 570 Gy, лизис клеток сразу после облучения
Облучение в дозе 570 Gy, лизис клеток после выдерживания в
непитательной среде при 280С в течение 1 ч.
Рекомбинантные структруры ДНК, выделенные из Х-облученных
диплоидных G1-клеток Saccharomyces сerevisiae.
Клетки инкубировали в непитательной среде в течении 2-4 часов
(Глазер, Самадашвили и Гаузе, 1982)
Белки, кодируемые генами эпистатической
группы RAD52, и их основные функции.
• Rad50, Mre11, Xrs2 – формирование и процессинг ДНР ДНК.
• Rad51 – ключевой белок рекомбинации, осуществляет
формирование нуклеопротеинового филамента, синапсис и обмен
цепями между рекомбинирующими ДНК.
• Rad52 – связывается с однонитевой ДНК и обеспечивает
формирование Rad51-ДНК-филамента.
• Rad53 – белок check-point контроля клеточного цикла, осуществляет
задержку клеточного цикла в случае повреждения ДНК и
обеспечивает время необходимое для репарации ДНР до
вступления в следующую фазу цикла ДНК.
• Rad54 и его паралог Rdh 54 – участвуют в изменении структуры
хроматина, стимулируют обмен цепями, осуществляемый Rad51.
• Rad55, Rad57 – паралоги Rad51, функционируют в виде
гетеродимера, стабилизируют Rad51-ДНК-филамент.
• Rad59 – связывается с однонитевой ДНК, функционально
перекрывается с Rad52.
Модель рекомбинации на основе
репарации двунитевых разрывов ДНК
(Szostak, Orr-Weaver, Rothstein and Stahl, 1983)
Схема репарации двунитевых разрывов путем
зависимого от репликации отжига цепей ДНК
(synthesis-dependent strand annealing, SDSA)
(Nassif, Penney, Pal, Engels and Gloor, 1994; Ferguson
and Holloman, 1996; Paques and Haber, 1999)
Схема репарации двунитевых разрывов
путём отжига комплементарных цепей ДНК
(single-strand DNA annealing, SSA)
(Lin, Sperle and Sternberg, 1984, 1985; Fishman-Lobell, Rudin and Haber, 1992)
Деградация 5’-концов ДНК
3’
5’
5’
3’
Rad52, RPA, Rad59
Rad1/Rad10
Отжиг комплементарных
участков
делеция участка
между повторами
Exo1, ДНК-лигаза
Репарация дуплекса
Повторяющаяся последовательность
Репарация двунитевых разрывов (ДНР) ДНК путем
non-homologous end-joining (NHEJ)
ДНР
Соединение
концов
Процессинг
концов
Лигирование
•
DNA-PKCS
Гетеродимер
KU80/KU70
NBS1
MRE11
RAD50
ДНК-лигаза IV
XRCC4
DNA-PKCS – каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы;NBS1 –
Nijmegen breakage syndrome I;MRE11 – meiotic recombination 11;XRCC4 – X-ray-repaircross-complementing defective repair in Chinese hamster mutant 4.ДНК-лигаза IV
XRCC4ЛигированиеRAD50MRE11NBS1Процессинг концовDNA-PKCSГетеродимер
KU80/KU70Репарация двунитевых разрывов (ДНР) ДНК путем
non-homologous end-joining (NHEJ)
Порядок сборки пресинаптического
комплекса у дрожжей
5’
3’
3’
Процессированная онДНК
с выступающим 3’-OHконцом
RPA
5’
3’
3’
RPA-онДНК-комплекс
Rad52
5’
3’
3’
Rad52 связывается с SSBонДНК-комплексом
Rad51
5’
3’
3’
5’
3’
3’
Rad52 “загружает” Rad51
Rad51 полностью покрывает
онДНК, в результате
образуется пресинаптический
филамент
Белок RPA
Белок Rad52
Белок Rad51
New et al., 1998. Nature, 391, 407-410
Kowalczykowski, 2000. Nature Struct. Biol., 7, 1087-1089