Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с
реклама
Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 6. Многосубстратные ферментативные реакции. Уравнения, описывающие эти реакции. Определение параметров в стационарном режиме. Порядок присоединения субстратов. Методы его определения Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами 1. Последовательное связывание субстратов с образованием тройного комплекса: Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами Двусубстратная реакция Односубстратная реакция S1>>S2 Должен быт ь извест ен порядок присоединения субст рат ов Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами Для схемы с последовательным связыванием субстратов уравнение скорости реакции: v=k3[ES1S2] Для нахождения [ES1S2] в систему уравнений добавляется уравнение материального баланса и условия квазистационарности: E0 = [E] + [ES1] + [ES1S2] d[ES 1 ] 0 dt d[ES1S2 ] 0 dt Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами DE = k-1k-2+k2S2k3+k-1k3 DES1 = k1S1k3+k1S1k-2 DES1S2 = k1S1k2S2 ; ; v= k 3E 0 D ES1S2 D E D ES1 D ES1S2 k 3E 0 = k3 (k -2 k 3 ) k -1 (k -2 k 3 ) 1 k 1S1 k 2S2 k 1S1 k 2 S 2 Для определения параметров реакции из экспериментальных данных это уравнение можно линеаризовать : E0 (k -2 k 3 ) k -1 (k -2 k 3 ) 1 1 v k 3 k 1S1 k 3 k 2S2 k 3 k 1S1k 2S2 0 1 S1 2 S2 12 S1S 2 = Определение величин коэффициентов φi Накопление продукта реакции во времени при различных концентрациях S1 и S2=const, или наоборот, при различных концентрациях S2 и S1=const. Определение величин коэффициентов φi a=φ0+φ2/S2 b=φ1+φ12/S2 Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами 2. Произвольный порядок присоединения двух субстратов в процессе образования тройного комплекса: v= k 3E 0 D ES1S 2 D E D ES1 D ES2 D ES1S 2 где DES1S2 – определитель узла графа, в котором происходит образование продуктов реакции. От определения порядка присоединения субстратов зависит, какой присоединения схемой реакций будет описываться Порядок субстратов образование продукта и как будут рассчитываться параметры реакции. Методы определения порядка присоединения субстратов • Гель-фильтрация. • Метод задержки в геле (gel retardation, или electrophoretic mobility shift assay – EMSA). • Тушение флуоресценции. Можно следить за изменением интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Trp) в белковой молекуле фермента, происходящим при комплексообразовании. Интенсивность флуоресценции при образовании комплекса с ферментом может изменяться и для субстрата. В этом случае можно использовать аналог субстрата, имеющий флуоресцентную метку. Использование аналогов субстратов для определения порядка присоединения субстратов • Аналоги субстратов выбираются таким образом, чтобы они продолжали быть субстратами, то есть участвовали в каталитических стадиях ферментативного процесса. • В случае аналога субстрата кинетические характеристики ферментативной реакции (KM, kcat) могут измениться для тех стадий, в которых принимает участие данный субстрат (его аналоги). Определение порядка присоединения субстратов Для исследования порядка присоединения субстратов в реакции аминоацилирования, катализируемой аминоацил-тРНК-синтетазами, были использованы фторированные аналоги аминокислот, например: Фенилаланин Парафтор-фенилаланин Метод конкурентных ингибиторов Реакция аминоацилирования тРНК с образованием фенилаланил-тРНК, катализируемая фенилаланил-тРНКсинтетазой): E + АТР + Phe Е·[Phe~АМР] + ррi Е·[Phe~АМР] + тРНКPhe Е + Phe~тРНКPhe + АМР Метод конкурентных ингибиторов • Аминогруппа – при ее замене сродство субстрата к ферменту резко падает • Фенильная группа участвует в узнавании субстрата. • Фенилаланинол (Phe-ol) – конкурентный ингибитор фенилаланина в реакции аминоацилирования. Kd (Phe)=10-6M Kd (Phe-ol)=10-5M Фенилаланин Фенилаланинол Метод конкурентных ингибиторов 1. Ингибитор образует комплекс с ферментом 2. Ингибитор образует тройной комплекс ES1I Для установления порядка присоединения субстратов нужно решить уравнения для схем 1 и 2, с помощью метода графов. • Показано экспериментально: чаще всего, в т.ч. в реакции аминоацилирования, первым субстратом является специализированный субстрат (кофермент-АТР), хотя комплекс фермента с коферментом ES1 может быть менее прочным, чем комплекс фермента со вторым субстратом ЕS2. • При аминоацилировании тРНКVal на первом этапе происходит активация аминокислоты АТР: Е + АТР + Val Е∙АМР∙Val + ррi • Сначала в активном центре синтетазы от молекулы АТР отщепляются две фосфатные группы, образуя молекулу пирофосфата (ррi), и на их место становится аминокислота. Образованное соединение (аминоациладенилат) состоит из ковалентно связанных высокоэнергетической связью аминокислотного остатка и АМФ. Комплекс фермента с Val прочнее (Kd=10-6M), чем комплекс с АТР (Kd=10-3-10-4M), но фермент при такой последовательности связывания дальнейшие реакции не катализирует.
