Иванова Анна Пустоварова Мария д.б.н. В.В.Алёшин К.В.Михайлов

Московская гимназия на Юго-Западе №1543
Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского
Лаборатория геносистематики
Иванова Анна
Пустоварова Мария
Научные руководители:
д.б.н. В.В.Алёшин
К.В.Михайлов
Москва, 2011
Введение
• На сегодняшний день систематику эукариот
нельзя считать сложившейся.
• Наиболее распространена классификация
Кавалье-Смита, согласно которой все эукариоты
делятся на одножгутиковых и двужгутиковых.
• Изучаемый нами объект принадлежит кладе
Heterokonta (разножгутиковые) (рис.1)
Рисунок 1. Филогенетическое положение клады Heterokonta.
Введение
•Объект нашего изучения- представитель
ещё не описанного вида.
• Его наиболее близкий родственник-
Developayella elegans (см рис.)
• D. elegans- одноклеточный организм,
питающийся бактериями и
передвигающийся с помощью одного из
своих жгутиков. (рис.2)
• Возможно, D. Elegans - близкий
родственник оомицетов.
Рисунок 2. Developayella elegans
Цель работы
 Целью нашей работы было более точное определение
филогенетического положения Colp-4a.
 Для этого необходимо было определить нуклеотидную
последовательность некоторых генов и сравнить их с
соответствующими генами других гетероконт.
 В нашей работе проанализированы последовательности 18S и 28S
рРНК нашего объекта.
 Несколько генов берутся для более достоверного определения
филогенетического положения.
Материалы и методы
Для получения необходимого участка ДНК в ходе нашей работы
были использованы следующие методы молекулярной биологии:
 Выделение из организма тотальной ДНК
 Амплификация нужного фрагмента методом ПЦР
 Электрофорез для выявления результатов ПЦР
 Отделение требуемых фрагментов ДНК от побочных продуктов
ПЦР
 Молекулярное клонирование
 Выделение плазмид, содержащих разные типы вставок
 Секвенирование
Материалы и методы
 Выделение культуры Colp-4a
Данная культура была выделена из морского осадка, привезённого с
Красного моря.
 Выделение геномной ДНК
Для изучения данного объекта было необходимо выделить его ДНК.
Этапы выделения ДНК:
1.
2.
3.
Лизис клеток и денатурация белков
Удаление мембран и клеточных органелл
Экстрагирование ДНК из раствора
Материалы и методы
 ПЦР (полимеразная цепная реакция)
Данный метод позволяет многократно увеличить число определённых
фрагментов ДНК в пробе.
Необходимые компоненты реакции:
1.
2.
3.
4.
5.
ДНК-матрица
Прямые и обратные праймеры
ДНК-полимераза
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP)
Буферный раствор
Ход реакции:
1.
2.
3.
Денатурация (цепи ДНК расходятся)
Отжиг (связывание праймеров с одноцепочечной ДНК)
Элонгация (репликация матричной цепи ДНК-полимеразой)
Материалы и методы
 Гель-электрофорез
Данный метод демонстрирует концентрацию молекул ДНК в анализируемом
образце, а также их длины.
 Элюция ДНК
Данный метод используется для выделения нужной ДНК из полоски
геля.
Ход реакции:
1.
2.
3.
Растапливание полоски геля и помещение её в пробирку с фильтром
Осаждение ДНК на фильтре, удаление остальных веществ из раствора
Отсоединение ДНК от фильтра
Материалы и методы
 Молекулярное клонирование
Мы использовали данный метод для выявления и разделения разных типов
фрагментов ДНК одинаковой длины, полученных в ходе ПЦР и
последующей элюции.
1.
2.
Ход работы:
Выделение нужного фрагмента ДНК
Встраивание нужного гена в вектор (плазмиду, которая
разрезается рестриктазой, а к липким концам присоединяется
нужная нам последовательность) (рис.3)
Материалы и методы
Рисунок 3. Плазмидный вектор
Материалы и методы
3.
4.


5.
Трансформация (введение плазмидного вектора в
бактериальную клетку)
Отбор клеток, в которые вошла чужеродная ДНК (не все
бактерии трансформируются; не все плазмиды несут вставку).
Используются плазмиды, обладающие двумя свойствами:
Устойчивость к ампициллину, который содержится в среде
(рис.3)
Вставка инактивирует ген фермента LacZ в плазмиде =>
колонии не окрашиваются в синий цвет.
Анализ колоний (случайный выбор колоний и амплификация их
плазмид) (рис.4)
Рисунок 4. Анализ колоний
(на рисунке – амплифицированные вставки).
Материалы и методы
Молекулярное
клонирование
Рестрикция вставок
(различаются ли
вставки по
нуклеотидной
последовательности?)
(рис.5)
6.
Рисунок 5. Пример рестрикции . Стрелочками отмечены разные
типы вставок.
Материалы и методы
 Выделение плазмид
Выделение плазмид, несущих интересующую нас вставку, и их
секвенирование для определения нужной вставки.

Построение филогенетического дерева
Сравнение полученной нами последовательности с уже
секвенированными генами других гетероконт для создания
выравнивания. На основе выравниваний генов 18S и 28S рРНК были
построены
филогенетические деревья.
Результаты
 В ходе работы нами были выделены и секвенированы гены 18S и 28S рРНК
 Были составлены три выравнивания (первое содержало лишь 18S рРНК,
второе – 28S рРНК, третье - и то, и другое)
 На основе каждого из них построены деревья
 Подтвердилось, что ближайшим родственником Colp-4a является
Developayella elegans.
 Филогенетическое дерево 18S рРНК демонстрирует родство D. elegans и
оомицетов. Но, судя по дереву, построенному на основе выравнивания 28S
рРНК, ни D.elegans, ни Colp-4a не входят в состав Pseudofungi.
(Pseudofungi = оомицеты + близкие к ним виды)
Результаты
А) Дерево на основе
выравнивания гена
18S рРНК
АВТОТРОФНЫЕ
HETEROKONTA
Сolp-4a + D. elegans
ООМИЦЕТЫ
ВНЕШНЯЯ ГРУППА
Результаты
Б) Дерево на основе
выравнивания гена
28S рРНК
АВТОТРОФНЫЕ
HETEROKONTA
Сolp-4a + D. elegans
ООМИЦЕТЫ
ВНЕШНЯЯ ГРУППА
Обсуждение
 Подтверждено родство Colp-4a и Developayella elegans. Следовательно, их
признаки должны быть схожими.
 Однако длина ветвей после их общего узла показывает, что уже должны
были появиться различия между этими организмами.
 Принадлежность таксона, содержащего D. Elegans, к Pseudofungi требует
дополнительной проверки.
 Определение филогении Colp-4a и Developayella elegans позволит уточнить
признаки, характерные для группы Pseudofungi.
Выводы

За время работы мы освоили многие методы молекулярной
биологии.

Были выделены и секвенированы гены 18S и 28S рРНК
простейшего Colp-4a.

Оба филогенетических дерева, построенных на основе
полученных последовательностей, показывают, что Colp-4a и
Developayella elegans - близкородственные виды.

Филогенетическое дерево по гену 18S рРНК даёт высокую
поддержку монофилии группы Pseudofungi, в то время как в
дереве по гену 28S рРНК Colp-4a и Developayella elegans не входят
в их состав.
Благодарности
Мы благодарим:
 Сергея Менделевича Глаголева за организацию
практики.
 Сотрудников отдела эволюционной биохимии НИИ
имени А.Н.Белозерского, которые руководили нашей
работой и помогали нам её выполнять.
 Вахрушеву Ольгу рецензирование нашей работы.
Спасибо за внимание!
d71
Q5
18S
d6
28s
28d5
28d1
r71 Q39
28r2
28r3
28r7
28r12
Карта ДНК в районе 18S и 28S рРНК. Фрагменты слева направо: 18S рРНК, 5S рРНК,
28S рРНК. Стрелочками обозначены различные праймеры к данным генам; сверху
прямые, внизу обратные.
Используемые праймеры
Ген
Прай
-мер
Ориентация
18s
Q51
прямой
18s
Q39
обратный GAATGATCCWTCYGCAGGTTCACCT
AC
28s
28s d1 прямой
28s
28s
d5
28s
28s r7 обратный AGCCAATCCTTWTCCCGAAGTTAC
28s
28s
r12
обратный TTCTGACTTAGAGGCGTTCAG
60-62 °C
28s
28s
r13
обратный MRGGCTKAATCTCARYRGATCG
57-68 °C
прямой
Последовательность
GTATCTTGTTGATCCTGCCAGTAG
Диапазон
устойчивости
(Тпл)
63-64 °C
65-68 °C
GACCCGCTGAAYTTAAGCATAT
60-63 °C
TCCGCTAAGGAGTGTGTAACAAC
63-64 °C
63-65 °C
Laminaria angustata@AB022818.1
82
100
Ectocarpus siliculosus@AY307398.1
54
Phaeophyceae
Fucus distichus@AB011423.1
88
Phaeothamniophyceae
Phaeothamnion confervicola@AF044846.1
Tribonema intermixtum@AF083397.1
87
Xanthophyceae
Chlorellidium tetrabotrys@FJ030892.1
96
Vacuolaria virescens@U41651.1
Raphidophyceae
Chattonella marina@AB217626.1
100
24
Heterosigma akashiwo@DQ191681.1
31
Nannochloropsis gaditana@AF067957.1
100
Eustigmatophyceae
Nannochloropsis salina@AF045048.1
Ochromonas distigma@EF165136.1
42
73
Chrysophyceae
Synura sphagnicola@U73221.1
100
97
Mallomonas tonsurata@FJ030893.1
Pinguiococcus pyrenoidosus@AF438324.1
100
Pinguiophyceae
Glossomastix chrysoplasta@AF438325.1
Phaeodactylum tricornutum@EF140622.1
88
99
Bacillariophyta
Skeletonema pseudocostatum@AJ632209.1
4
Rhizosolenia setigera@M87329.1
92
Pseudochattonella farcimen@AM075624.1
89
100
2
Dictyochophyceae
Dictyocha speculum@U14385.1
Pseudopedinella elastica@U14387.1
Pelagococcus subviridis@U14386.1
36
Pelagophyceae
Pelagomonas calceolata@U14389.1
100
Aureococcus anophagefferens@U40257.1
89
Hyphochytrium catenoides@AF163294.1
99
Developayella elegans@U37107.1
100
86
Colp-4a
Pseudofungi
Achlya bisexualis@M32705.1
76
Oomycetes
Phytophthora infestans@AY742761.1
100
Pythium helicoides@EF418925.1
100
Japonochytrium sp@AB022104.1
100
Thraustochytrium aureum@AB022110.1
Labyrinthulida
Blastocystis hominis@AB023499.1
72
Caecitellus parvulus@AY642126.1
71
Bicosoecida
Nerada mexicana@AY520453.1
83
Pfiesteria piscicida@AF077055.1
100
Akashiwo sanguinea@AY831412.1
100
Theileria parva@AF013418.1
Frenkelia microti@AF009244.1
100
Thaumatomonas seravini@AF411259.1
100
Chlorarachnion CCMP621@AF054832.1
100
Guillardia theta@X57162.1
66
Cryptomonas platyuris@AF508271.1
Pavlova pinguis@AF102373.1
83
Isochrysis galbana@AJ246266.1
100
100
0.02
Prymnesium sp@AB183612.1
Рисунок 6. Филогенетическое дерево на основе последовательностей 18S рРНК
Pseudochattonella farcimen@FJ030886.1
78
100
Dictyochophyceae
Dictyocha speculum@AF289046.1
Apedinella radians@AF289045.1
99
Aureococcus anophagefferens@AF289042.1
19
Pelagophyceae
Pelagococcus subviridis@FJ030889.1
100
100
Pelagomonas calceolata@AF289047.1
Pinguiococcus pyrenoidosa@AF409130.1
100
Pinguiophyceae
Glossomastix chrysoplastos@AF409128.1
Nannochloropsis salina@Y07975.1
40
44
Eustigmatophyceae
Nannochloropsis gaditana@FJ030880.1
100
Mallomonas tonsurata@FJ030885.1
87
100
Chrysophyceae
Synura sphagnicola@DQ980475.1
Ochromonas danica@Y07977.1
Chlorellidium tetrabotrys@FJ030881.1
45
70
100
9
Xanthophyceae
Tribonema aequale@Y07979.1
Phaeothamniophyceae
Phaeobotrys solitaria@FJ030890.1
Fucus vesiculosus@AF331151.1
98
Phaeophyceae
Laminaria digitata@AF331153.1
100
Streblonema maculans@AF331155.1
91
96
Skeletonema pseudocostatum@Y11512.1
Bacillariophyta
Phaeodactylum tricornutum@contig
100
Rhizosolenia setigera@AF289048.1
61
75
Vacuolaria virescens@AF409125.1
Chattonella antiqua@FJ030891.1
79
74
Raphidophyceae
Heterosigma akashiwo@AF409124.1
100
Colp-4a
Developayella elegans@FJ030882.1
98
Hyphochytrium catenoides@X80345.1
28
/ /
16
Blastocystis hominis@contig
Achlya@contig
18
Phytophthora megasperma@X75631.1
100
100
99
Oomycetes
Pythium@contig
Japonochytrium sp@FJ030887.1
Thraustochytrium aureum@FJ030888.1
100
Labyrinthulida
Caecitellus parvulus@FJ030883.1
Nerada mexicana@FJ030884.1
100
100
Bicosoecida
Pfiesteria piscicida@AY112746.1
Akashiwo sanguinea@AY831412.1
100
Theileria parva@AF013419.1
67
100
Frenkelia microti@AF044252.1
Thaumatomonas sp@DQ980477.1
Chlorarachnion CCMP621@AF289036.1
100
100
Guillardia theta@AF289037.1
Cryptomonas paramecium@AY752990.1
Pavlova@contig
96
Isochrysis galbana@contig
100
100
Prymnesium patelliferum@AF289038.1
0.05
Рисунок 7. Филогенетическое дерево на основе последовательностей 28S рРНК
Pseudochattonella farcimen
92
100
Dictyochophyceae
Dictyocha speculum
Pedinellales
99
Aureococcus anophagefferens
47
Pelagophyceae
Pelagococcus subviridis
100
100
Pelagomonas calceolata
Pinguiococcus pyrenoidosa
32
Pinguiophyceae
Glossomastix chrysoplastos
100
Nannochloropsis salina
30
Eustigmatophyceae
Nannochloropsis gaditana
100
Chattonella
83
100
Raphidophyceae
Heterosigma akashiwo
Vacuolaria virescens
96
Laminaria
100
85
90
Phaeophyceae
Ectocarpales
Fucus
Phaeothamniophyceae
Phaeothamniales
100
Chlorellidium tetrabotrys
100
Xanthophyceae
Tribonema
94
98
Ochromonas
Chrysophyceae
Synura sphagnicola
100
Mallomonas tonsurata
98
51
Rhizosolenia setigera
Skeletonema pseudocostatum
90
93
Bacillariophyta
Phaeodactylum tricornutum
100
Developayella elegans
Colp-4a
100
Hyphochytrium catenoides
51
Achlya
87
Oomycetes
Phytophthora
100
26
100
Pythium
/ /
100
Blastocystis hominis
Caecitellus parvulus
Bicosoecida
Nerada mexicana
100
Thraustochytrium aureum
Japonochytrium sp
100
100
Labyrinthulida
Pfiesteria piscicida
Akashiwo sanguinea
100
Theileria parva
59
Frenkelia microti
100
Thaumatomonas
Chlorarachnion CCMP621
100
100
Guillardia theta
Cryptomonas
Pavlova
100
Isochrysis galbana
100
100
Prymnesium
0.02
Рисунок 8. Филогенетическое дерево на основе выравнивания, содержащего гены 18S и 28S рРНК.
Литература
[1] Ingvild Riisberga, Russell J.S. Orrb, Ragnhild Klugeb, Kamran Shalchian-Tabrizid,
Holly A. Bowerse, Vishwanath Patilb, Bente Edvardsena and Kjetill S. Jakobsen. Seven Gene
Phylogeny of Heterokonts. // Protist, Vol.160, 191—204, May 2009.
[2] Mayumi Moriya, Takeshi Nakayama, Isao Inouye. Ultrastructure and 18S rDNA
Sequence Analysis of Wobblia lunata gen. et sp. nov., a New Heterotrophic
Flagellate (Stramenopiles, Incertae Sedis). // Protist, Vol. 151, 41–55, May 2000.
[3] Neil A. Campbell, Jane B. Reece. Biology - 8th ed. Pearson Benjamin Cummings, San
Francisco, 2008.
[4] Cavalier-Smith T. Only six kingdoms of life. Proc R Soc Lond B. 2004;271:1251–1262
[5] Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. // Москва,
изд. Мир, 1984.
[6] Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.
Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
[7] Encyclopedia of life. Description of Developayella elegans. Режим доступа:
http://www.eol.org/pages/2912228