Гибридный белок: люцифераза Luciola mingrelica – биотин-

Гибридный белок: люцифераза Luciola mingrelica – биотинсвязывающий домен. Получение, свойства, применение
С.8.15.
Смирнова Д.В., Кокшаров М.И., Угарова Н.Н.
Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
1. Введение
В настоящее время актуальной задачей является
создание
новых
биоаналитических
высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов для
определения нано количеств различных физиологически
активных веществ и патогенных микроорганизмов.
Одним из широко развиваемых путей получения таких
систем является использование гибридных белков,
совмещающих в себе высокую чувствительность белкадетектора с высокой селективностью белка, способного
связываться с изучаемой мишенью. В результате чего
происходит фиксация белка-детектора на поверхности
мишени.
В качестве белка детектора могут выступать различные
люциферазы, в частности люцифераза светляков,
обладающая высокой чувствительностью вследствие
высокого квантового выхода биолюминесцентной
реакции, низким фоновым сигналом, который
определяется стабильностью субстрата, а так же
простой процедурой наработки и выделения белка в
необходимых количествах. В качестве селективного
компонента могут быть использованы
.
стрептавидин
или биотин-связывающий
домен,
имеющие высокую константу связывания.
Биотинилирование
люциферазы
возможно
при
гибридизации фермента с биотин связывающими
доменами. Биотин связывающие домены содержатся в
таких
белках,
как
ацетилкокарбоксилаза
и
пируваткарбоксилаза, имеющих в активном центре
остаток лизина, способный образовывать амидную связь
с биотином при помощи биотин-лигазы [1]. Таким
образом, биотинилирование белков, коньюгированных с
биотин-связывающими
доменами
происходит
непосредственно при синтезе гибридных белков, in vivo.
В литературе подобные белки описаны для люцифераз
светляков Photinus pyralis [2-3] и Luciola lateralis [4-5].
Для люциферазы светляков Luciola mingrelica таких
конструкций не описано.
2. Плазмида для экспрессии
гибридного белка
T7 promoter
ROP
Таблица 1 Физико-химические свойства мутанта 4TS люциферазы
cветляков Luciola mingrelica и гибридного белка: люцифераза (4TS)биотин связывающий белок (bccp).
luc
ori
Apa I
bccp87
Pst I
Фермент
term
f1 ori
pr
Время
полуинактивации при 47о,
мин
C-his-tag
Для получения плазмиды, кодирующей гибридный
белок , были использованы три фрагмента ДНК:
• экспрессионный вектор pET23b, кодирующий
дополнительную шестигистидиновую последовательность ;
• ген термостабильного мутанта люциферазы 4TS,
выделенный из плазмиды методом рестрикции;
• фрагмент
ДНК,
кодирующий
биотинсвязывающий домен (87 С-концевых
аминоксилотных остатков bccp), выделенный из
генома клеток E. coli и модифицированный
сайтами рестрикции Sal I и Apa I при помощи
ПЦР.
Полученные в результате лигирования клоны были
проверены на содержание необходимых фрагментов
с использованием метода PCR , рестрикционного
анализа и секвенирования, которые подтвердили
отсутствие мутаций в гене, кодирующем гибридный
белок. Полученная плазмида была наработана в
клетках E. coli XL1blue.
LH2
АТФ
pH 7.8
4TS
60 ± 5
41 ± 8
573
15 ± 2
4TS-bccp
66 ± 6
41 ± 7
569
15 ± 2
4. Использование гибридного
белка в качестве метки в ИФА
для определения количества
клеток Salmonella typhimurium
В предварительно оптимизированных условиях был
проведен гетерогенный сэндвич анализ для
определения термически инактивированных клеток
сальмонеллы (рис 2.). Иммобилизацию препарата
инактивированных
клеток
проводили
на
активированный
моноклональными
небиотинилированными
антителами
полистирольный планшет.
1800
1500
1200
900
600
300
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
lg(КОЕ/мл.)
Рис. 4. Градуировочная зависимость биолюминесцентного сигнала от логарифма концентрации клеток
Salmonella typhimurium в анализируемом образце,
полученная
с использованием схемы детекции,
показанной на рис.2.
3. Исследование свойств lucbccp
Экспрессией белка в клетках E. coli BL21(DE3)
получен и выделен с использованием метода металохелатной хроматографии гибридный белок (4TSbccp) , причем 60% гибридного белка находится в
биотинилированной форме. Изучены каталитические
свойства,
термостабильность
и
спектры
биолюминесценции гибридного белка и показано,
что они близки к свойствам исходной люциферазы
(Таблица 1).
 Получение и изучение свойств гибридного белка
люцифераза- биотин связывающий домен для
люциферазы Luciola mingrelica.
 Исследование возможности его применения для
специфического определения содержания клеток
Salmonella typhimurium.
А, ед.
bla
Km, мкМ
Максимум спектра
биолюминесценции, нм
Целями работы были:
Рис. 2. Схема образования детектируемого комплекса.
4. Выводы
Ссылки
1. Сконструирована плазмида, кодирующая гибридный белок «люцифераза» -«биотин-связывающий домен» (4TSbccp87) с использованием гена термостабильного мутанта 4TS люциферазы светляков Luciola mingrelica.
2. Проведена наработка, выделение и очистка гибридного белка luc-bccp87. Показано, что степень
биотинилирования гибридного белка составляет 60%.
3. Показано, что присоединение биотин-связывающего домена не оказывает cущественного влияния на константы
Михаэлиса, термостабильность и спектры биолюминесценции люциферазы светляков L. mingrelica.
4. Оптимизированы условия получения комплекса гибридный белок-стрептавидин для проведения
иммуноферментного анализа. Показано, что стрептавидин и используемые антитела не оказывают влияния на
биолюминесцентную активность гибридного белка.
5. Показана возможность детекции инактивированных клеток Salmonella typhimurium с использованием
моноклональных антител и комплекса гибридный белок-стрептавидин в интервале 104-107 КОЕ/мл.
1. Chapman-Smith A., Cronan J. E. // Journal of Nutrition.
1999. 129. P. 477-484.
2. Karp M., Oker-Blom C. // Biomolecular Engineering.
1999. 16. P. 101-104.
3. Wang C.-Y., Sam Hitz, Andrade J. D., Stewart R. J. //
Anal. Biochem. 1997. 246. P. 133-139.
4. Ohkuma H., Abeb K., Kosakab Y., Maedaa M. // Analytica
Chimica Acta. 1999. 395. P. 265-272
5. Tatsumi H., Fukuda S., Kikuchi M., Koyama Y. // Anal.
Biochem. 1996. 243. P. 176-180.
Дополнительная информация
e-mail: mkoksharov@enz.chem.msu.r
Работа выполнена при поддержке
РФФИ (проект № 08-04-00624а).