Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток Науки о жизни Получатель субсидии:

Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Науки о жизни
Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток
СОГЛАШЕНИЕ № 14.607.21.0045 от 22.08.2014 на период 2014-2016 гг.
Получатель субсидии: МГУ имени М.В. Ломоносова
Индустриальный партнер: ООО «Генная и клеточная терапия»
 Факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова (декан, научный руководитель проекта – академик РАН, проф. Ткачук В.А.)
 Медицинский научно-образовательный центр МГУ имени М.В. Ломоносова (директор – член-корр. РАН, проф. Камалов А.А.)
Результаты исследовательской работы,
полученные в 2015 году
Актуальность
В настоящее время активно разрабатываются подходы регенеративной медицины, направленные как
на создание замещающих поврежденные ткани конструкций ex vivo, так и на стимуляцию эндогенных
процессов репарации и регенерации. Современное развитие биомедицинских технологий и методов
культивирования клеток с получением продуктов их секреции, включая различные биологически активные
факторы, позволяют создавать биоинженерные композиции, включающие в себя как каркасную основу (из
биоматериалов или синтетическую), так и клеточный компонент, что позволяет более полно имитировать
замещаемую стенку органа и стимулировать процесс регенерации тканей.
В организме человека физиологическое обновление и регенерация тканей происходят в течение
всей жизни благодаря стволовым и прогениторным клеткам. К ним относятся мультипотентные
мезенхимные стромальные клетки (МСК), которые могут быть легко выделены в достаточном количестве,
например, из жировой ткани. Значительное число данных свидетельствует, что МСК жировой ткани
человека секретируют в культуральную среду многочисленные биологически активные факторы, которые
играют первостепенную роль в процессах регенерации и репарации тканей. В организме многие
регуляторные факторы, секретируемые в межклеточное пространство, связываются с белками
внеклеточного матриксом, что обеспечивает их правильную пространственную локализацию и продлевает
время действия.
Кондиционированная среда
МСК жировой ткани (МСК-ЖТ)
Белки внеклеточного
матрикса
и металлопротеиназы
Секретируемые факторы
роста, цитокины, хемокины
Микровезикулы
Биологически активный
комплекс
экстрацеллюлярных
продуктов секреции МСК
человека



 Формирование стромы
 Активация




тканеспецифических
резидентных стволовых
клеток
Пролиферация и подавление
апоптоза
дифференцированных клеток
Рост и стабилизация сосудов
Рост нервов
Модулирование иммунных и
воспалительных реакций

Получены научно-технические результаты, касающиеся разработки и оценки свойств отдельных
компонентов материала на основе продуктов секреции МСК человека и коллагена.
В течение всего времени выполнения проекта проводится сбор биологического материала,
выделение, наращивание, иммунофенотипирование и контроль контаминации МСК жировой ткани
человека, согласно разработанным стандартным операционным процедура, для формирования
охарактеризованной коллекции МСК жировой ткани человека и получения субстанции,
содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.
Разработаны методы контроля качества субстанции, содержащей продукты секреции МСК
жировой ткани человека, в первую очередь, по группам показателей «Биобезопасность»,
«Подлинность» и «Специфическая активность» и проведен анализ наработанных образцов от
разных доноров по выбранным показателям качества с целью стандартизации субстанции.
На основании полученных данных были уточнены и оптимизированы некоторые этапы
технологического процесса производства субстанции на основе биологически активных факторов,
секретируемых МСК жировой ткани человека при кондиционировании в различных
бессывороточных средах (DMEM с низким содержанием глюкозы (DMEM-LG), HyClone, США и
специфическая среда для поддержания роста МСК человека MSC NutriStem® XF Basal Medium,
Biological Industries, Израиль), стандартизованы показатели контроля ее качества, выдвинуты
предпосылки для возможной замены биологических методов оценки специфической активности
субстанции инструментальными методами.
Протестированы различные типы коллагеновой матрицы (гель, мембрана, губка) разного
происхождения (бычий, свиной, человеческий) на моделях in vivo с целью выбора оптимальных
типов коллагена для каждой модели. Были подобраны типы коллагеновых матриц, условия их
применения и проведена оценка иммунологической реакции тканей на ксеногенный коллаген на
моделях кожной раны (мыши), дефекта стенки мочевого пузыря (кролики) и при введении под
белочную оболочку яичка (крысы). Выбраны типы коллагеновых матриц для использования в
дальнейших исследованиях.
Динамика изменения концентраций ключевых активных факторов при
кондиционировании МСК-ЖТ в бессывороточной среде DMEM-LG
Цели и задачи проекта
Целью проекта является создание технологии производства стимулирующего регенерацию материала на
основе композиции продуктов секреции стволовых клеток и коллагена в качестве матрицы.
Задачи:
1) Разработать технологию производства и провести стандартизацию субстанции, получаемой из среды
культивирования мультипотентных мезенхимных стволовых/стромальных клеток (МСК) жировой ткани
человека и обогащенной продуктами секреции этих клеток, на основании анализа физико-химических,
молекулярно-биологических и регенеративных свойств субстанции, полученной с использованием
биоматериала от нескольких десятков доноров.
2) Подобрать оптимальные протоколы очистки и стабилизации субстанции, содержащей продукты
секреции МСК жировой ткани человека.
3) Подобрать оптимальные виды и формы коллагеновой матрицы в зависимости от планируемого
применения разрабатываемого материала.
4) Отработать эффективную технологию соединения отдельных компонентов разрабатываемого
материала – коллагеновой матрицы, несущей продукты секреции МСК человека.
5) Разработать нормативно-техническую документацию для стандартизации ключевых процедур
технологического процесса получения компонентов материала и контроля его качества.
6) Провести апробацию разработанного стимулирующего регенерацию материала на экспериментальных
животных моделях повреждения различных тканей.
VEGF – фактор роста эндотелия сосудов, HGF – фактор роста гепатоцитов,
FGF2 – основный фактор роста фибробластов, Angpt1 – ангиопоэтин 1 типа
Специфическая активность образцов
субстанции на основе продуктов секреции
Специфическая активность образцов субстанции МСК-ЖТ (7 дней кондиционирования) на
модели миграции эндотелиальных клеток
на основе продуктов секреции МСК-ЖТ (7 дней
кондиционирования) на модели миграции
фибробластов в клеточную рану
Перспективы практического использования
DMEM-LG
NutriStem
* - p<0,05, ** - p<0,01
Сравнительный анализ образцов субстанции от 30 доноров МСК-ЖТ
Фактор
VEGF, пг/мл
HGF, пг/мл
FGF2, пг/мл
Angpt-1, пг/мл
PEDF, пг/мл
Среднее±SD
390,0±268,9
801,9±788,4
3,54±5,74
342,2±36,6
3067,4±2999,1
Медиана
283,6 (227,9; 431,5) 697,2 (207,4; 970,4) 1,78 (0,53; 4,16)
Предлагаемое в данной разработке комбинированное изделие соединяет в себе преимущества двух
материалов, а именно: уникальные свойства коллагена как эффективного матрикса для регенерации клеток
и одновременно как средства депонирования и доставки биологически активных веществ с одной стороны, а
также терапевтический потенциал сбалансированного коктейля продуктов секреции МСК человека,
ответственных за регенерацию и репарацию тканей и органов в норме и при патологии, с другой стороны.
Новый материал, полученный в результате реализации проекта, будет уникальным для рынка
регенеративной медицины и может быть использован для эффективного решения широкого круга
клинических ситуаций. В рамках проекта планируется апробация разрабатываемого материала на
экспериментальных моделях повреждения кожи, стенки мочевого пузыря и нарушения сперматогенеза.
Применение нового материала для покрытия и заживления раневых поверхностей поможет обеспечить
ускоренное заживление кожных повреждений, улучшение клинической эффективности лечения пациентов с
острыми и хроническими ранами, ожогами, трофическими повреждениями и значительное сокращение
сроков реабилитации таких больных. Это позволит перевести значительную часть больных на амбулаторное
лечение, что приведет к выраженному экономическому эффекту. Использование материала в
реконструктивной урологии для пластики мочевого пузыря и мочеточников позволит значительно улучшить
результаты хирургического лечения таких пациентов, снизить частоту их инвалидизации и улучшить
отдаленные результаты лечения. Предполагается использование нового материала для лечения мужского
бесплодия, что позволит с высокой эффективностью
восстанавливать фертильность, обеспечить
пролонгированное сохранение репродуктивной функции пациентов и повысить качество их жизни.
В дальнейшем в зависимости от клинической задачи стволовые/прогениторные клетки могут быть
модифицированы с целью направленного изменения их секретома. Формы выпуска медицинских изделий на
основе разрабатываемого материала могут варьировать в зависимости от назначения (гели различной
плотности, жгуты, гранулы, мембраны, порошки, преднаполненные шприцы), что позволит расширять
область применения. Широкие возможности модификации компонентов разрабатываемого материала
создают предпосылки для дальнейших исследований и разработок в этой области.
(1131;
2893,3)
Histogram: Var2
K-S d=,20786, p<,15 ; Lilliefors p<,01
Shapiro-Wilk W=,75959, p=,00001
Histogram: Var1
K-S d=,21494, p<,15 ; Lilliefors p<,01
Shapiro-Wilk W=,77496, p=,00002
18
Histogram: Var3
K-S d=,27468, p<,05 ; Lilliefors p<,01
Shapiro-Wilk W=,55684, p=,00000
14
30
12
Histogram: Var5
K-S d=,28695, p<,05 ; Lilliefors p<,01
Shapiro-Wilk W=,75485, p=,00001
Histogram: Var4
K-S d=,25091, p<,05 ; Lilliefors p<,01
Shapiro-Wilk W=,76648, p=,00002
16
25
16
16
14
14
12
12
10
10
14
10
12
6
6
15
10
No. of obs.
8
No. of obs.
8
No. of obs.
No. of obs.
20
10
8
8
6
6
4
4
4
4
5
2
2
0
0
Ожидаемые результаты проекта
223,3 (107,9; 458,8) 2128,6
(25%, 75%)
No. of obs.
1) Общая хирургия (острые и хронические раны различного происхождения и тяжести, диабетическая
стопа, трофические язвы, пролежни, свищи, послеоперационные спайки, грыжи, ожоговые поражения
различного генеза и тяжести, лечение гипертрофических рубцов и др.)
2) Урология (пластика мочевого пузыря и мочеточников, пластика уретры, восстановление фертильности,
слинговые операции для коррекции недержания мочи у женщин, лечение везико-уретрального рефлюкса у
детей, свищи, нервосберегающая простатэктомия)
Возможные дополнительные области:
1) Гинекология (пузырно-влагалищные-прямокищечные свищи, эрозии шейки матки, пролапс органов
малого таза, микрохирургическая коллагенопластика маточных труб)
2) Нейрохирургия (направленная регенерация диастаза периферических нервов после рассечения и
других травм)
3) Офтальмология (хирургическое лечение прогрессирующей миопии, лечение отслойки сетчатки,
частичное помутнение роговой оболочки, травмы всех сегментов глазного яблока)
4) Стоматология (пародонтология – пародонтиты, рекоструктивная пародонтология, рецессия десны)
5) Косметология и пластическая хирургия
6) Аутоиммунные заболевания (для улучшения трофики кожи и ускорения заживления)
7) Профилактика и лечение лучевых поражений кожи (для уменьшения площади и тяжести поражения
кожи и ускорения заживления).
200
400
600
800
1000
1200
X <= Category Boundary
2
0
0
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
X <= Category Boundary
4000
-5
0
5
10
15
20
25
30
X <= Category Boundary
35
2
0
0
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
X <= Category Boundary
X <= Category Boundary
Выбор оптимальных типов коллагеновых матриц на моделях in vivo
Модель кожной раны у мышей
Повязка на основе
свиного коллагена
Повязка на основе
коллагена человека
Моделирование
инфертильности на
крысах
Модель дефекта стенки
мочевого пузыря на
кроликах
Мембрана из
свиного коллагена
7 сутки
3 сутки
Мембрана из
бычьего коллагена
7 сутки
7 сутки
14 сутки
Лучшие результаты получены при
использовании человеческого коллагена
14 сутки
Иммунопривилегированная
зона обуславливает инертность
иммунного ответа на свиной и
бычий коллагеновый гель
14 сутки
Лучшие результаты получены
при использовании свиного
коллагена
Выполнение запланированных индикаторов: по результатам проекта в 2015 г. опубликовано и
принято в печать 4 статьи, 1 статья находится на рецензировании, подготовлена 1 патентная
заявка. Полученные результаты соответствуют плану-графику работ по проекту и техническому
заданию.