BAC-FISH

FISH
FISH – fluorescence in situ hybridization –
цитогенетический метод, используемый для детекции и локализации
специфических последовательностей ДНК на хромосомах, мРНК и др. В основе
методики лежит гибридизация флюоресцентно меченого ДНК/РНК зонда с
комплементарной последовательностью ДНК/РНК. Выявление метки
происходит с помощью флюоресцентного микроскопа.
Метод FISH был введен более 30 лет назад (в 1980-х гг.). Он широко распространился как
метод физического картирования генов на хромосомах.
Позднее он стал применяться в других областях исследований (в областях клинической
генетики, нейронауки, репродуктивной медицины, токсикологии, микробной экологии,
эволюционной биологии, сравнительной геномики, клеточной геномики и хромосомной
биологии).
На данный момент FISH преимущественно используется для построения физических и
генетических карт хромосом, для выявления структурных перестроек, транслокаций,
микроделеций, генных амплификаций в интерфазных и метафазных хромосомах.
В результате развития науки (лучшего понимания химических и физических свойств
нуклеиновых кислот и хроматина), а также развития флюоресцентной микроскопии и
цифровой визуализации, метод постоянно совершенствовался (произведено улучшение
чувствительности, специфичности, разрешения), и было разработано много вариаций
данного метода.
1) Cells are dropped on
to a glass slide causing
chromosomes to
spread
4) Chromosomes are
counter stained
using DAPI
2) Fluorescently labeled
probe is placed on
chromosomes and sealed.
3) The probe and
chromosomes are
denatured, hybridised
then washed
5) Slide is viewed
under a fluorescent
microscope
Зонды: одноцепочечные/двуцепочечные ДНК/РНК первично/вторично меченые зонды.
Зонды метятся:
1)
2)
напрямую: путем вставки нуклетидов, к которым прикреплен флюорохром (ПЦР или nick
translation)
через репортерную молекулу (пр: digoxigenin, biotin) к которой крепятся флюоресцентно меченые
антитела. Для усиления сигнала можно использовать вторичные, третичные и т.д. антитела,
меченые флюоресцентной меткой.
DNase nicks DNA
Nick
Translation
DNA polymerase I adds new
nucleotides to the 3’
hydroxyl
DNA polymerase I removes
individual bases from the 5’ end

Визуализация хромосом:
c помощью DAPI (2mg/ml).
4’,6-diamidino-2-phenylindole; сильное
связывание с A-T богатыми
участками ДНК; возбуждение UV
светом; эмиссия 461nm (blue).
Вариации FISH
1) Q-FISH – quantitative FISH:
•Разработан Lansdorp et al: U.M. Martens, J.M. Zijlmans, S.S. Poon, W. Dragowska, J. Yui,
E.A. Chavez, R.K. Ward, and P.M. Lansdorp. 1998. Short telomeres on human chromosome
17p. Nat. Genet. 18:76-80.
•Количественный метод.
•Разработан для работы с проточной цитометрией.
•Изначально применялся для измерения длины хромосом (разрешение: 200 bp) путем
подсчета числа теломерных повторов.
•Используются PNA-конъюгированные зонды.
•Изначально исследовали метофазные хромосомы (собственно Q-FISH), теперь данный
метод применим и для интерфазных хромосом (IQ-FISH).
•Q-FISH проводится на культуре клеток, срезах тканей (оба на стеклах).
•На данный момент Q-FISH является важным инструментом в изучении роли теломеров
в процессах старения и ракообразования.
2) PNA-FISH – Peptide nucleic acids FISH:
•Пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs) – синтетические аналоги ДНК, в котором сахарный остов
фосфата дезоксирибозы, поддерживающий азотистое основание, заменен на незаряженный
пептидный остов.
•В результате такой структуры: при гибридизации PNA-олигомерного зонда с комплементарной
ДНК/ РНК не происходит электростатического отталкивания.
•PNA-DNA (PNA-RNA) дуплексы гораздо стабильнее натуральных гомо-/гетеродуплексов.
•Высокая специфичность связывания PNA-DNA: PNA-DNA гибридизация намного чувствительнее в
отношении несоответствия пар оснований, чем DNA-DNA гибридизация. Так, с помощью PNAзонда можно различить два центромерных повтора, различающиеся всего по одной паре
оснований.
•PNA обладает относительной
гидрофобностью (по
сравнению с DNA), вследствие
чего PNA лучше диффундирует
сквозь клеточные стенки =>
широкое применение в
микробиологии.
•На основании высокой
специфичности связывания:
считается, что PNA технология
в скором времени станет
основой для создания аллельспецифичных зондов для in
situ гибридизации.
•Применяется в генетике,
цитогенетике, эпигенетике,
микробиологии и др.
3) Flow-FISH – FISH for flow cytometry:
•Предложен в 1998 г.: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P.M. Telomere
length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nature Biotechnol.
16, 743–747 (1998).
•Комбинация Q-FISH и проточной цитометрии, позволяющая анализировать (измерять) сигнал и
сортировать.
•Для flow-FISH используется клеточная суспензия (для измерение длины теломеров хромосом),
хромосомные спреды и выделенные хромосомы (для дальнейшего картирования).
•Как и в Q-FISH, используются PNA-меченые теломерные зонды (например, для визуализации и
измерения длины теломерных
повторов)
• Главное преимущество –
более быстрый метод
(анализ/сортировка
большого количества
клеток/хромосом).
•Широко применяется для
исследования разных
проблем: старения,
сохранение теломер,
исследование суспензий
гемотопоетических
стволовых клеток ex vivo,
исследование бактерий.
Multiparametric analysis allows for differentiation of cell types within one
sample, allowing for internal control, and analysis of leukocyte subtypes.
Преимущества flow-FISH:
•Легко воспроизводимый результат
•Возможность анализировать подгруппы клеток в популяции, используя физические и
иммунофлюоресцентные маркеры
•Лучшая производительность, чем в Q-FISH
•Возможность получать количественные данные по флюоресценции тысяч клеток
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ХРОМОСОМ
с помощью методов проточной цитометрии
1. Сортировка хромосом с помощью проточной цитометрии
- Кариотипирование с помощью проточной цитометрии используется для дальнейшего
картирования генов и построения хромосомных библиотек.
- Идентификация и локализация генов на сортированных хромосомах производится с
последующим применением мотодов FISH/ метода PRINS (primed in situ labeling) или его
вариаций и хромосом-специфической ПЦР.
- К 2011г. успешно сортированы пока только хромосомы 17 видов культивированных
растений.
- Сортировка метафазных или пахитенных хромосом с высоким индексом деления.
Флюоресцентная метка:
- Хромосомы метятся флюорохромами, специфичными к нуклеиновым кислотам.
- Флюорохромы выбираются в соответствии 1) со специфичностью к азотистыми
основаниями, 2) с условиями эксперимента (в том числе учитывая длины волн имеющихся
лазеров).
1. Для моновариантного анализа используют краски, не специфичные к A-T или G-C парам:
• propidium iodide (пик возбуждения: 535 нм, эмиссии: 617нм, требуемый лазер: 488нмаргоновый лазер или лампа + long-pass filter)
• ethidium bromide (пики возбуждения: 300 и 520нм, эмиссии: 600 нм, требуемый лазер:
488нм-аргоновый лазер или лампа + long-pass filter)
Данные метки красят ДНК не зависимо от содержания A, G, T или C-азотистых оснований.
2. Для бивариантного анализа используют:
• chromomycin A3 (специфичен для G-C пар оснований), пик возбуждения: 458нм, эмиссии
580 нм. Лазер:, 458нм минимум 400 мВ мощность.
• Hoechst 33258 (специфичен для A-T пар оснований), возбуждение: 351-364нм, эмиссия:
470нм. Лазер: 351-364нм (мощный).
Лазеры должны быть разделены во времени и пространстве из-за частичного перекрытия
спектров флюорохромов.
2. Исследование хромосом/ нуклеотидных последовательностей после
сортировки (для построения физических и генетических карт и т.п.)
•FISH
•BAC-FISH
•PRINS
•C-PRINS
• Исследование больших
геномов с длинными
хромосомами.
• Картирование
последовательностей с большим
количеством повторов (пр:
теломерных и центромерных
участков).
• Использование коротких
зондов.
• Благодаря большому
количеству повторов сигнал
сильный.
• Стандартная величина зонда:
15 – 30 нуклеотидов.
FISH
Проблемы FISH:
• Сложно локализовать однолокусные последовательности ДНК (т.е.
неповторяющиеся уникальные последовательности ДНК), т.к. при использовании
стандартных коротких зондов сигнал будет очень слабым.
• Увеличение длины зонда до неск. килобаз для усиления сигнала приведет к
снижению чувствительности и => к неспецифическому связыванию.
• Решение: BAC-FISH.
BAC-FISH
- BAC-FISH – комбинация метода FISH и использования клонов геномной ДНК,
встроенной в бактериальные искусственные хромосомы (BAC), позволяющие встраивать
большие последовательности ДНК.
- Эффективный метод для идентификации и картирования отдельных хромосом
организмов с небольшими геномами.
В качестве зонда используется BAC-зонды, overgos (overlapping oligonucleotides).
Альтернатива FISH:
PRINS
• PRINS (primed in situ labeling) – способ мечения хромосом с помощью отжига
олигонуклеотидного ДНК-праймера с гомологичной последовательностью денатурированной
хромосомной ДНК и последующего энзиматического удлинения праймера in situ мечеными
нуклеотидами.
• Впервые описан Koch et al. в 1989г. (Koch, J. E., Kølvraa, S., Petersen, K. B., Gregersen, N., and
Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming methods for the chromosome-specific labelling of alpha
satellite DNA in situ. Chromosoma 98, 259–265).
• PRINS является альтернативой FISH.
• Применяется для локализации нуклеотидных последовательностей, распознавания и подсчета
метафазных или интерфазных хромосом или хромосомных пар (в т.ч. хромосомной
анеуплоидии).
Праймер:
отжиг немеченого праймера
• фрагмент рестрикции
(праймер – затравка)
• ПЦР-продукт
с исследуемой ДНК
• олигонуклеотид
элонгация затравки с
помощью термостабильной
ДНК-полимеразы и
меченых нуклеотидов
остановка реакции
(присоединение
блокирующей молекулы на
3’-конец)
Мечение нуклеотидов:
- прямое (флюорохромами)
- непрямое (biotin/ dig  флюорохромконъюгированный avidin/ anti-dig)
- В результаты каждой PRINS реакции можно
идентифицировать только одну пару гомологичных
хромосом (одну хромосому). Следующую реакцию
PRINS на том же стекле можно проводить только
после блокировки предыдущей.
- Применяется для последовательностей ДНК с
большим количеством повтором.
Преимущества PRINS:
1.
2.
3.
4.
Требуется минимальная информация о последовательности, требуемая
для синтеза олигонуклеотидного праймера.
Наиболее быстрый и простой метод детекции интересующей нас
последовательности на хромосоме (по сравнению с использованием
тяжелых зондов для FISH, гибридизующихся очень большой промежуток
времени).
Исключение стадии мечения зонда.
Возможность элонгировать праймер мечеными нуклеотидами для усиления
сигнала при детекции коротких уникальных последовательностей.
c-PRINS
Для выявления малокопийных повторов или коротких уникальных
последовательностей применяется более чувствительный метод – cycling
PRINS (c-PRINS).
C-PRINS предложен Gosden et al. в 1991г., улучшенный широко используемый
протокол – Kubaláková et al., 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák
MA, Dole J (2001). Localisation of DNA sequences on plant chromosomes using
PRINS and C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82).
C-PRINS включает в себя серию термальных циклов, аналогичных ПЦР.
Sheath fluid for FISH:
-BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Flow cytometry and
FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376)
-40 mM KCl + 10mM NaCl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J.
Flow sorting of mitotic chromosomes in common wheat (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000;156(4):2033-41)
-MgSo4 buffer without dithiothreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Flow-sorted
chromosomes: a fine material for plant gene physical mapping. Caryologia. 2006, vol.59, №2:99-103)
-autoclaved 0.1% (wt/vol) NaCl
-50 mM NaCl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N
Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome
Analysis. Genetics. 2005, 170(2): 823–829)
-Chromosome-stabilizing polyamine buffer (protein-containing sheath fluid)
(Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic
Press, Inc. 1994)