Определение Бета-блокаторов методом ВЭЖХ/МСВР с

Определение бета-блокаторов в допинговом
контроле методом ВЭЖХ/МСВР с
электрораспылительной и химической
ионизацией при атмосферном давлении
Вирюс Э. Д., Семенистая Е. Н., Родченков Г. М.
План доклада
1. Проблемы и задачи антидопингового контроля
2. ВЭЖХ/МС высокого разрешения (Orbitrap): использование в рутинных анализах.
Выбор способа ионизации и хроматографической системы для рутинных анализов
3. Определения бета-блокаторов в моче.
Современные проблемы допингового контроля:
Необходимость осуществлять анализ большого числа биологических проб сложного
состава за короткое время (за 14 дней Олимпийских игр анализируются до 2500
проб)
Необходимость определять большое число соединений при низких концентрациях.
Некоторые определяемые соединения имеют эндогенное происхождение (половые
гормоны, глюкокортикостероиды) или близки по структуре к эндогенным
соединениям (анаболические стероиды)
Рост числа запрещенных препаратов
Требования к аналитическим методам:
Высокая чувствительность ( нг/мл)
Высокая селективность
Универсальность (определение разных классов веществ за один анализ)
Возможность проведения ретроспективного анализа
Список запрещенных ВАДА препаратов/методов(2009)
Запрещенные классы/методы
Предел обнаружения методами
ВЭЖХ/ГХ - масс-спектрометрии,
нг/мл
Вещества, запрещенные в соревновательный и внесоревновательный
периоды
Анаболические агенты
Гормоны и относящиеся к ним соединения
2-10
Бета-агонисты
Анти-эстрогены
Диуретики и другие маскирующие агенты
100
50
250
Химические и физические манипуляции
Усилители кислородного переноса (кровяной
допинг)
Генный допинг
Вещества, запрещенные в соревновательный период (дополнительно к
перечисленным выше)
Стимуляторы
200-500
Наркотики
10-200
Каннабиноиды
15
Глюкокортикостероиды
30
Вещества, запрещенные в отдельных видах спорта (дополнительно к
перечисленным выше)
Алкоголь
Бета-блокаторы
500
Выбор источника ионизации и хроматографической системы
Способ ионизации
ESI
Скорость потока распыляющего газа
(N2), отн.ед.
30
Скорость потока
газа (N2), отн.ед.
5
вспомогательного
Подвижная фаза
А: 5 мМ ацетата аммония в
0.01% растворе муравьиной
кислоты (рН 3)
В: метанол
Условия градиентного элюирования
0 мин – 30 % B; 10 мин – 95 % B;
15 мин – 95 % B; 17 мин – 30 %
B; 22 мин – 30 % B
Скорость потока, мкл/мин
Хроматографическая колонка
Предколонка
Объем вводимой пробы, μл
Рабочее давление на колонке, бар
250
Restek Ultra C18 , 100x2.1 мм I.D.,
3 к
Restek Ultra C18 ,
10x2.1 мм I.D., 5 к
5
170
Схема пробоподготовки
Фосфатный
буфер, рН
6.4, 1 мл
ITSD
Моча,
3 мл
Глюкуронидаза,
30 мкл (140
Ед./мг)
Карбонатный
буффер, рН 910
ЭФИР, 5 мл
Моча после
гидролиза
Гидролиз 1 час при
57 оС
Экстракция (10 мин на
встряхивателе) и
центрифугирование
100
мкл
МеОН/
Н2О
Упаривание орг.
фазы и
перерастворение в
элюенте
Анализ методом
ВЭЖХ/МСВР
Название
Название
1
2
3
4
5
6
APCI
APCI
t , мин
S/N
ESI R
Бета-блокаторы
S/N
1.32
12088
tR,
S/N
tR,
Ацебуталол
1
мин
мин
Алпренолол
2.88
57977
2
стероиды
НазваниеАнаболические Название
APCI
ESI
APCI
Бетаксолол
1.14
41448
3
3’-гидроксистанозолол
13863 S/N10.65 tR, мин
6.22tR, мин
2963 S/N
tR, мин
S/N
Бисопролол
2.23 tR, мин
73317
4
16’15463
Бета-агонисты
5.99
10.55
5983
Анти-эстрогены
гидроксистанозолол5
Бунолол 3.37
25413
1 фенотерол
12957
5.661.43 33694
оксандролон
6.21 33008
Буфетолол
6
2 тербуталин
0.77
1 фулвестран
эпиоксандролон
7.50 28078
Карведиол
3 бамбутерол 7
2.06
2 17-дигидроэкземестан
флюоксиместерон
4 кленбутерол 8
1.26
6.91 32400
Целипролол
3 экземестан
5 сальбутамол
0.77
тренболон
5.90 20158
Лабеталол
9
10.85
3319
9.61
11.91
8607
6.91
2555
11.44
6.29
7558
10.62
2608
1.03
10.75
6 формотерол
1.21
4 аминоглутетимид
эпитренболон
6.15 71489
10 Левобунолол
7 сальметерол
5.36
8 6-гидрокси1291 37105
11 Метипранолол
5 анастразол
3.66
5.39
9.98
оралтуринабол
12 Метопролол
9 эпиметендиол транс-4-гидрокси-39.73 15903
13.93
6
6.33
13 Окспренолон
10 оралтуринаболметокси-тамоксифен
7.35 16663
11.82
14 Пропранолол
11 гестринон
6.61 50012
11.12
7 4-гидроксициклофенил
4.18
Соталол
15
12 тетрагидрогестринон
7.78 29235
12.22
16 Талинолол
7
4354
1.14 1861
1.20
43075
13.18871
5449
3.47 49400
97884
6.58
30822
11.43
5.22
8733
1.74 7865
15564
58030
10.88
1.18
137
2.24 7975
26731
5.61
5573
3.46
488
1.19 7909
9507
ESI
tR, мин
S/N
1.00
29656
8.26
ESI
2.91
S/N7.34
77137
169892
1.03
114068
84462.19
8.49
11965
1.13
11600
7.19
4637
19755.75
10.20
48018
1.37 8.16
83251 100087.68
25700
4685
1.37
58900
5.57
2397
28034
1.99 10.86
13362 211176.97
6418
2.72
87565
8.04
7755
3386
0.79
4588
1.21
6774
1.14 100184
2.71
64185
134842
75883
24448
42054
185364
35719
42477
136731
3344
135628
17
Тимолол
1.36
46695
5.52
35991
18
Эсмолол
1.65
26394
6.26
61755
Использование
химической ионизации
для создания более
универсальной
скринниговой
процедуры.
Экспрессный
анализ благодаря
высоким скоростям
потока.
Возможность промывки
различными
растворителями
продлевает срок
службы предколонок и
колонок.
Где можно более детально ознакомиться нашей работой
E.D. Virus, T.G. Sobolevsky, G.M. Rodchenkov. Introduction of HPLC/orbitrap mass
spectrometry as screening method for doping control // Journal of mass spectrometry. 2008.
43 (7). Р. 949-957
Э.Д. Вирюс, Г.М. Родченков. Применение метода высокоэффективной жидкостной
хроматографии / масс-спектрометрии высокого разрешения с фотоионизацией при
атмосферном давлении для детектирования ультрамалых количеств анаболических
стероидов // Масс-спектрометрия, 2007, Т. 4, С. 275 – 283
Э.Д.Вирюс, Т.Г.Соболевский, Г.М.Родченков – Обнаружение оксандролона и его метаболита
в моче методом высокоэффективной хроматографии/масс-спектрометрии высокого
разрешения с орбитальной ловушкой с химической ионизацией при атмосферном давлении
после прекращения его приема // Журнал аналитической химии, 2009, 64 (1), С. 38-42
Е. Н. Семенистая, М. А. Дикунец, Э. Д. Вирюс, Г. М. Родченков. Определение экземестана
и 17-гидроксиэкземестана методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в
сочетании с тандемной масс-спектрометрией и масс-спектрометрией высокого разрешения
// Журнал аналитической химии, 2010, 65 (5), С. 513–521