Молекулярная биология для биоинформатиков • Академический университет • Ефимова Ольга Алексеевна Интерференция РНК и регуляция экспрессии генов Нобелевская премия по физиологии и медицине 2006 год "RNA interference – gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. Fire Craig C. Mello Предположение Fire & Mello: Двуцепочечные РНК (dsRNA) – запускающий механизм (триггер) системы интерференции РНК. Интерференция РНК – это замолкание (сайленсинг) генов, обеспечиваемое двуцепочечными молекулами РНК (dsРНК). Явление интерференции РНК открыто в 1998 г. у Nematoda (Fire et al., 1998) Инъекция в C.elegans РНК мышечного белка dsРНК в 10-100 раз более эффективно активируют систему интерференции РНК, по сравнению с ssРНК. Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806–811 (1998). Эффект генетического сайленсинга посредством интерференции РНК: распространяется в тканях организма (!) наследуется (!!!) Механизм интерференции РНК • при исследовании интерференции РНК у растений обнаружены короткие молекулы РНК, маркирующие ген, подверженный сайленсингу; • в условиях in vitro воспроизведены биохимические реакции интерференции РНК. Малые интерферирующие РНК (siRNAs – short interfering RNAs) – класс 21-22 нуклеотидных двуцепочечных РНК, образующихся из более длинных двуцепочечных РНК. Общая схема регуляции генетической экспрессии за счет интерференции РНК (по Novina, Sharp, 2004) Функции siРНК 1. Сайленсинг мобильных генетических элементов; 2. Сайленсинг гетерохроматиновых повторов; 3. Сайленсинг генетического материала вирусного происхождения; 4. Ограничение степени экспрессии гена в определенных тканях. При выделение фракций коротких РНК (19-25 нуклеотидов) из различных организмов обнаружен еще один класс малых РНК – микроРНК. МикроРНК (miRNAs - micro RNAs) – класс 19-25 нуклеотидных одноцепочечных РНК, закодированных в уникальных генах геномов многоклеточных организмов. Схема образования miРНК (по Novina, Sharp, 2004) Функция miРНК Обеспечивают сайленсинг различных генов, обычно, за счет частично комплементарного связывания с мРНК, в результате которого блокируется ее трансляция. • один тип miРНК может регулировать трансляцию мРНК более 100 различных генов; • степень ингибирования зависит от количества связывающихся miРНК (в 3’UTR мРНК содержится несколько сайтов связывания). Отличия miРНК и siРНК miРНК siРНК • Продукт dsРНК, закодированных в уникальных генах геномов многоклеточных организмов (>1% от всех генов у человека); • Продукт dsРНК, образующихся в результате транскрипции транспозонов, гетерохроматиновых повторов или генетического материала вирусного происхождения ; • мРНК может не разрушаться; • Один тип miРНК регулирует разные гены. • мРНК разрушается; • Один тип siРНК обычно регулирует только один тип мРНК. • созданы библиотеки коротких РНК и ДНК- векторов, кодирующих короткие РНК, мишенями которых является около 8000 генов генома человека; • внедряется в практику терапевтическое применение синтетических коротких РНК для целенаправленного подавления генетической экспрессии при некоторых заболеваниях. Основы генетики и медицинской генетики Введение в генетику • Что такое гены? - физические и функциональные детерминанты признаков, которые передаются от одного поколения к другому • Гены были открыты в 1860 годах словацким монахом Грегором Менделем. Он пытался ответить на след. вопрос: передаются ли признаки от одного из родителей или от обоих? Эксперименты с растениями гороха • Мендель открыл, что гены могут быть переданы в одной из 2 форм (аллелей)– доминантной или рецессивной • Доминантная форма будет проявляться в фенотипе ДНК – физический носитель генетической информации • ДНК была открыта в 20 веке • ДНК содержит те самые физические гены, открытые Менделем • У каждого организма – 1 аллель наследуется от отца и 1 - от матери • Гомозигота – АА или аа • Гетерозигота – Аа Мутации • ДНК – это последовательность нуклеотидов • Что происходит когда эта последовательность изменяется • Мутация • Это и приводит к образованию различных аллелей Хорошие, плохие и молчащие • Мутации могут быть нескольких видов • Хорошие: Мутации могут улучшить выживаемость организма. Например мутации в гене серповидно-клеточной анемии приводят к устойчивости к малярии. • Плохие:Мутации приводят к значительному вреду или даже гибели организма Например, гемофилия • Нейтральные: Мутации не оказывают никакого влияния Campbell, Biology, 5th edition, p. 255 Классификация мутаций I. ГЕНОМНЫЕ • Диплоидный набор 2n=46 • Гаплоидный 1n=23 • Полиплоидия (триплоидия 3n=69; тетраплоидия 4n=92) • Анеуплоидия (трисомия 2n=47; моносомия 2n=45 II. ХРОМОСОМНЫЕ (делеции, дупликации, инсерции инверсии, транслокации) III ГЕННЫЕ • Точечные (сайтовые) мутации (нейтральные –SNP,нонсенс, миссенс • Внутригенные перестройки (делеции, дупликации, инверсии, инсерции) • Динамические мутации • Перемещение мобильных элементов(Alu -300-500по х100 000 Line( 6 500по х 50 000 Гены организованы в хромосомы • Хромосомы – нитеподобные структуры, находящиеся в ядре клетки и содержащие 1 молекулу ДНК. Разные организмы могут иметь разное количество хромосом (парное (2n) – у организмов с половым размножением). • Томас Морган (1920) – Нашел косвенное доказательство существования хромосом путем экспериментов с дрозофилой Сцепленные гены и последовательность генов. • Различные признаки (гены) могут быть сцеплены, т.е. расположены на одной хромосоме. • Морган предположил, что чем ближе гены были расположены на одной хромосоме, тем более часто они наследовались совместно Порядок генов на хромосоме? Mutant b, mutant vg X Normal fly Mutant b, mutant cn X Normal fly Mutant vg, mutant cn X Normal fly 17% progeny have only one mutation The genes vg and b are farthest apart from each other. 9% progeny have only one mutation 8% progeny have only one mutation The gene cn is close to both vg and b. Порядок генов на хромосоме? b cn vg Основы медицинской генетики XXI век- век генетики Внешняя среда Геном Генетика - наука о наследственности и изменчивости Медицинская генетика (МГ) - наука о роли наследственности в патологии человека, закономерностях передачи наследственных болезней, их диагностике, лечении, профилактике. Клиническая генетика - прикладная МГ, направленная на применение достижений генетики и МГ для решения клинических проблем пациентов и их семей. Генеалогический анализ –метод родословных • Установление наследственного характера признака • Выяснение типа передачи НБ • Анализ пенетрантности и экспрессивности признака • Сцепление признака с генетическими и молекулярными маркерами • Медико-генетическое консультирование Пробанд – больной или его родственник, с которого начинается составление родословной. Cимволы, используемые в МГ при составлении родословных Аутосомно-доминантный (ахондроплазия, синдром Марфана, нейрофиброматоз, миотоническая дистрофия, хорея Гентингтона) – популяционная частота - 0,5-1,0% • Прослеживается в родословных только по вертикали • Соотношение больных и здоровых детей 1:1 • Здоровые дети от больных родителей имеют здоровое потомство • Соотношение больных мальчиков и девочек одинаково • Пациенты независимо от пола одинаково часто передают болезнь • У гомозигот болезнь нередко летальна • Болезнь - часто результат спонтанных мутаций Другие типы наследования Аутосомно-рецессивный (муковисцидоз, ФКУ, СМА, АГС, мукополисахаридозы) - популяционная частота - 0,25% • Родители клинически здоровы • Соотношение больных и здоровых детей 1:3 • Если больны оба супруга – дети всегда больные • Оба пола поражаются одинаково часто • Не исключено кровное родство супругов • В браке больного и носителя рождается 50% больных, больного и здорового –рождаются только здоровые Х-сцепленные заболевания - популяционная частота 0,25% Доминантное наследование (витамин D резистентный рахит) • Поражаются мальчики в 2 раза чаще, чем девочки • Женщины болеют менее тяжело, передают болезнь 50% сыновьям и 50% дочерям • Больные мужчины передают болезнь всем дочерям Х-сцепленные заболевания - популяционная частота 0,25% Рецессивное наследование (миодистрофия Дюшенна, гемофилии, синдромы Мартина-Белла, Леш-Нихана, Хантера) • Болеют только мальчики, • 2/3 случаев наследуются от матерей-носительниц, 1/3 спонтанных • Сестры больных братьев в 50% - носители мутации • Здоровые мужчины не передают заболевание Другие типы наследования Y-сцепленные (нарушения сперматогенеза, рост тела, конечностей, зубов) Митохондриальные болезни (атрофия зрительного нерва Лебера, кардиомиопатии, миоклоническая эпилепсия, митохондриальная миопатия, прогрессирующая офтальмоплегия) • Болезнь передается только по материнской линии • Болеют мальчики и девочки • Больные мужчины не передают болезнь потомству Пренатальная диагностика (дородовая) «Совокупность всех методов диагностики состояния плода, которая направлена на выявление врожденных дефектов и любых аномалий, диагностируемых при рождении» ВОЗ, Европейская Ассоциация перинатальной медицины Пренатальная диагностика научно-практическое направление медицинской генетики Задачи пренатальной диагностики Практические эффективная диагностика, профилактика и лечение наследственных и врожденных болезней Научные познание механизмов биологии раннего развития человека, включая гаметогенез, эмбриогенез и фетальный период Методы оценки состояния плода ПРЯМЫЕ НЕПРЯМЫЕ (обследование плода) (обследование беременной) 1. Клиническое (акушерско-гинекологическое) ИНВАЗИВНЫЕ НЕИНВАЗИВНЫЕ 2. Бактерио- и серологическое 3. Медико-генетическое · генеалогическое · цитогенетическое · молекулярно-биологическое 4. Анализ эмбрионспецифических белков · · · · ПОЛУЧЕНИЕ ПЛОДНОГО МАТЕРИАЛА 1. Ультразвуковое сканирование 2. Электрокардиография 3. Рентгенография a -фетопротеин хорионический гонадотропин эстриол другие 1. Хорионбиопсия (I триместр) 2. Плацентобиопсия (II триместр) 3. Амниоцентез · ранний (13-14 н.б.) · обычный (15-22 н.б.) 4. Кордоцентез (II-III триместр) 5. Фетоскопия (II-III триместр) ЛАБОРАТОРНЫЕ 1. 2. 3. 4. Цитогенетические Молекулярно-генетические Биохимические Иммуноцитохимические 6. Биопсия тканей плода (кожа, мышцы,печень, селезенка и пр.) (II-III триместр) Инвазивные методы пренатальной диагностики Доимплантационный период Методы ЭКО Преконцепционная диагностика (полярные тельца) Доимплантационная диагностика (бластомеры или трофобласт) I триместр беременности (период органогенеза) Хорионбиопсия Трансцервикальный способ (7-12 недели) Трансабдоминальный способ (с 9/10 недели) II триместр беременности (плодный период) Плацентобиопсия (14-26 недели) Амниоцентез (с 14 недели) Кордоцентез (с 20 недели) Составляющие ПД 1.Медико-генетическое консультирование 2.УЗ-скрининг 3.Биохимический скрининг 4.Получение плодного материала 5.Лабораторная диагностика цитогенетическая молекулярная биохимическая 6.Рекомендации по результатам ПД ДОЛЯ МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ НИИАГ им. Д.О.Отта, Санкт-Петербург ПД генных болезней 14% ПД хромомсомных болезней 86% Синдром ломкой Болезнь Хантера 1% Х-хромосомы Гемофилия В 1% 1% Гемофилия А 10% Болезнь Верднига Гоффмана 0,1% Талассемия 0,3% Хорея Гентингтона 0,1% Миодистрофия Дюшенна/ Беккера 10% Фенилкетонурия 11% Муковисцидоз 66% ПРЕДИКТИВНАЯ МЕДИЦИНА (ПМ) 1.Раздел молекулярной медицины, направленный на досимптоматическое выявление лиц с высокой наследственной предрасположенностью к МФЗ c целью своевременной (упреждающей) профилактики заболеваний 2. Отличительные особенности ПМ: - индивидуальный характер - профилактическая направленность 3. Методическая основа ПМ – тестирование генов-маркеров, ассоциированных с МФЗ, т.н. генов «предрасположенности» 4.Генетический паспорт - индивидуальная база ДНКданных, отражающая уникальные генетические особенности каждого человека, его наследственную предрасположенность к тем или иным наследственным и МФЗ