Особенности механизма репликации

Химический состав клетки
Тема:
«Репликация ДНК»
Задачи:
Дать характеристику репликации ДНК
Основные принципы
Репликация ДНК имеет ряд
принципиальных особенностей.
а). Во-первых, субстратами, из которых
синтезируются новые цепи ДНК,
являются дезоксинуклеозидтрифосфаты
(дНТФ), а не
дезоксинуклеозидмонофосфаты
(дНМФ), входящие в состав ДНК.
Поэтому в ходе включения в цепь ДНК
от каждого нуклеотида отщепляются 2
фосфатных остатка. Использование
именно дНТФ, а не дНМФ, объясняется
энергетическими причинами:
образование межнуклеотидной связи
требует энергии; источником ее и служит
разрыв межфосфатной связи.
Основные принципы
б). Во-вторых, репликация ДНК —
матричный процесс: каждая
синтезируемая (дочерняя) цепь ДНК
строится, используя в качестве матрицы
одну из цепей исходной (родительской)
ДНК.
Основой при этом является принцип
комплементарности: из четырех
возможных нуклеотидов (дАТФ, дГТФ,
дЦТФ,дТТФ) в состав растущей цепи
включается в данный момент тот,
который комплементарен нуклеотиду в
соответствующем положении
родительской цепи.
Основные принципы
в). В-третьих, процесс можно назвать
полуконсервативным: по завершении
процесса исходные молекулы ДНК
оказываются наполовину
обновленными. В каждой из дочерних
молекул одна цепь родительская, а
вторая — новосинтезированная.
г). Удлинение цепи ДНК (или отдельного
ее фрагмента) всегда происходит в
направлении от 5‘-конца к 3‘-концу. Это
означает, что очередной новый
нуклеотид присоединяется к 3‘-концу
растущей цепи. Кроме того, поскольку в
любой молекуле ДНК комплементарные
цепи антипараллельны, то и растущая
цепь антипараллельна матричной цепи.
Следовательно, последняя, матричная
цепь, считывается в направлении 3' →
5'.
Особенности механизма репликации
а) Процесс репликации осуществляется сложным ферментным
комплексом (насчитывающим до 15-20 различных белков).
При репликации ДНК у эукариот на каждой хромосоме работает не
один, а сразу большое количество таких комплексов. Иными словами,
на хромосоме имеется много точек начала репликации ДНК. И
удвоение ДНК совершается не последовательно от одного конца до
другого, а одновременно во многих местах сразу. Это значительно
сокращает продолжительность процесса.
Так, в сперматогониях на одной хромосоме — в среднем около 40
точек начала репликации, и S-фаза составляет 15 ч.
Особенности механизма репликации
б) В каждой указанной точке начинают
работать два ферментных комплекса:
один перемещается по молекуле ДНК
в одну сторону, второй — в
противоположную. При этом каждый
комплекс реплицирует не только одну
цепь ДНК, но и другую. Самый
сложный вопрос: как при этом удается
для обеих родительских цепей
(несмотря на их антипараллельность)
соблюдать принцип считывания в
направлении 3' → 5'?
Один из возможных механизмов мы
кратко обсудим ниже. Но каков бы ни
был механизм, репликация
распространяется в обе стороны от
каждой точки начала репликации.
Говорят, что при этом образуются две
репликативные вилки, движущиеся в
противоположных направлениях.
Особенности механизма репликации
в). Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух
синтезируемых им цепей растет с некоторым опережением по
сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется
лидирующей, а вторая — запаздывающей.
Важнейшее обстоятельство состоит в том, что лидирующая цепь
образуется ферментным комплексом в виде непрерывного очень
длинного фрагмента.
Особенности механизма репликации
Запаздывающая же цепь образуется в виде серии относительно
коротких фрагментов — примерно по 1500 нуклеотидов. Это т. н.
фрагменты Оказаки.
г). Образованию каждого фрагмента ДНК (как длинного, таки любого
из фрагментов Оказаки) предшествует синтез короткой
последовательности (из 10-15 нуклеотидов) РНК-затравки. Дело в том,
что ДНК-полимераза, не может начинать процесс «с нуля», т. е. в
отсутствие олигонуклеотидной последовательности.
Особенности механизма репликации
В противоположность этому, фермент синтеза РНК – праймаза такой
способностью обладает. Потому-то данному ферменту и
«приходится» начинать образование каждого нового фрагмента ДНК.
Для синтеза РНК-затравки, праймера требуются
рибонуклеозидтрифосфаты (рНТФ), а их включение происходит тоже
по принципу комплементарности соответствующему участку ДНК.
Особенности механизма репликации
РНК-затравки после завершения синтеза фрагментов ДНК удаляются.
Вместо них происходит достраивание (путем удлинения предыдущего
фрагмента ДНК) образующихся «брешей». И все многочисленные
фрагменты ДНК, образованные на одной родительской цепи,
сшиваются в единые цепи.
Особенности механизма репликации
Фермент геликаза (от helix — спираль) обеспечивает расплетение в
районе репликативной вилки двойной спирали родительской ДНК:
последняя разъединяется на одноцепочечные участки. На это
затрачивается энергия гидролиза АТФ — по 2 молекулы АТФ на
разделение 1 пары нуклеотидов.
Особенности механизма репликации
Однако расплетение спирали на некотором участке создает
суперспирализацию перед этим участком. Дело в том, что каждая
молекула ДНК в целом ряде мест зафиксирована на ядерном
матриксе.
Проблема решается с помощью ферментов топоизомераз.
Топоизомераза разрывает одну из цепей ДНК. Это позволяет участку
ДНК (от места расплетения до места разрыва) вращаться вокруг
соответствующей связи целой цепи. Впоследствии концы разорванной
цепи вновь замыкаются.
Особенности механизма репликации
С каждой из двух нитей сразу связываются специальные SSB-белки
(от англ. Single Strand Binding Proteins). Последние обладают
повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и
стабилизируют их в таком состоянии.
Праймаза, используя в качестве матрицы соответствующий участок
одноцепочечной ДНК, синтезирует короткую РНК-затравку, или
праймер.
Особенности механизма репликации
Далее в дело вступают ДНК-полимеразы. У эукариот известно 5
разных ДНК-полимераз.
Из них β (бета)- и ε (эпсилон)-полимеразы участвуют в репарации
ДНК;
γ (гамма)-полимераза — в репликации митохондриальной ДНК;
α (альфа)-, δ (дельта)- и ε (эпсилон)-полимеразы участвуют в
репликации ядерной ДНК.
Особенности механизма репликации
Cкорость работы комплекса у эукариот около 50 нуклеотидов в
секунду. В комплексе, осуществляющем репликацию лидирующей
цепи, ДНК-полимераза α (альфа)- связана с ДНК-полимеразой δ
(дельта), в комплексе, осуществляющем репликацию отстающей цепи
ДНК-полимераза α (альфа) связана с ДНК-полимеразой ε (эпсилон).
Оба комплекса связаны друг с другом и праймазой, синтезирующей
праймеры.
Особенности механизма репликации
По одной из версий, на запаздывающей цепи в процессе репликации
формируется петля. Поэтому направление образования фрагмента
Оказаки на внутреннем участке петли начинает совпадать с
направлением движения полимеразного комплекса. Тогда последний
может практически одновременно образовывать сразу обе цепи ДНК
— и лидирующую, и запаздывающую.
Особенности механизма репликации
«Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой. Как и
ДНК-полимеразы, этот фермент образует межнуклеотидную
(фосфодиэфирную) связь.
Особенности механизма репликации
Эукариотические хромосомы содержат большое число репликонов.
Репликационная вилка начинается с образования особой структуры репликационного глаза.. Участок, в котором образуется
репликационный глаз, называют точкой начала репликации (около 300
нуклеотидов).
Повторение:
1. Что является субстратом для синтеза новых цепей ДНК?
2. Почему процесс репликации называют полуконсервативным?
3. В каком направлении движется фермент ДНК-полимераза?
4. В каком направлении происходит образование дочерней
полинуклеотидной цепочки ДНК?
5. Сколько ферментных комплексов начинают работать в точке
инициации репликации?
6. Какая цепь называется лидирующей, какая – запаздывающей?
7. Что такое фрагменты Оказаки?
8. Каковы функции праймазы?
9. Каковы функции геликазы?
10.Каково значение топоизомераз?
11.Каково значение SSB-белков?
Повторение:
1. Какие полимеразы участвуют в репликации ядерной ДНК?
2. Какие функции в репликации выполняют лигазы?
3. Что такое репликационный глаз?