Раздел 7. Нестационарная кинетика ферментативных реакций.

CH3
N
Физическая химия биополимеров
Лаврик О.И.
НГУ-2012
O
7. Нестационарная кинетика
ферментативных реакций
Предстационар – переходная фаза реакции,
предшествующая стационарной
• Нестационарная кинетика
позволяет достаточно детально
проанализировать стадийность
реакции.
• Поскольку нужно следить за одним
оборотом реакции, следовательно,
нужно использовать высокие
концентрации фермента.
Нестационарная кинетика
Время измерений
от 10-7 до 1 с
Аппаратура для
быстрого смешивания и последующего
наблюдения за ферментом и
субстратом
Кинетика данной реакции описывается
системой уравнений:
d[X]
= k1[E][S] + k-2[E][P] - (k2+k-1)[X]
dt
d[P]
= k2[X]-k-2[E][P]
dt
[E0] = [E] + [X]
[S0] = [S] + [X] + [P]
Условия:
 Большой избыток субстрата ([S0] >>[E0] и [S]≈[S0])
 Небольшая глубина реакции ([P] ≈ 0)
d[X]
= k1[E][S0] - (k2+k-1)[X]
dt
d[P] = k [X]
2
dt
[E0] = [E] + [X]
Исключение переменной [E]:
d[X]/dt + (k1[S0] + k-1 + k2)[X] = k1[E0][S0]
Решение этого неоднородного уравнения:
[X] = C`(t)exp[-(k1[S0] + k2 + k-1)t]
k 1[E 0 ][S 0 ]
[X] =
+ Ceхр(-( k1[S0] + k2 + k-1))t
k 1[S 0 ]  k 2  k -1
При [X](0)=0:
k 1[E 0 ][S 0 ]
C=k 1[S 0 ]  k 2  k -1
[X] = [E 0 ][S 0 ] (1-ехр(- k1([S0] + KM)t))
[S 0 ]  K M
Концентрация промежуточного соединения Х
возрастает во времени и стремится к пределу:
[E 0 ][S 0 ]
[X]lim= [X]стац=
[S 0 ]  K M
[E 0 ][S 0 ]
[X] =
(1-ехр(- k1([S0] + KM)t))
[S 0 ]  K M

При [S0] >> KM:
[X] = [E0](1- eхр(- k1[S0]t))

При [S0] << KM:
[X] = [E 0 ][S 0 ] (1- eхр(- k1KMt))
KM
Из кинетики накопления промежуточного
соединения Х может быть найдена константа
скорости k1 и сумма констант скоростей
k-1 + k2. Для этого введем функцию t :
t-1= k1[S0] + k2 + k-1
Поскольку:
[E 0 ][S 0 ]
[X] = [S ]  K (1-ехр(- k1([S0] + KM)t)) =
0
M
= [X]стац (1-ехр(- t /t))


[X
]
t


ln 1 

 [X ]

t
стац


Определение констант реакции из данных
по предстационарной кинетике


[X
]
t


ln 1 

 [X ]

t
стац 

По тангенсу угла наклона прямой (ln(1-[X]/[X]стац), t) найдем t-1.
Проведя эксперименты при различных начальных концентрациях
субстрата, можно построить график зависимости t-1([S0]) и найти
k1 и k-1+ k2. Константу k2 находят из стационарной скорости
реакции, тогда k-1 можно определить из суммы k-1+ k2.
Реакция превращения субстрата в продукт с
участием произвольного числа n
промежуточных соединений
При S0 >> E0, k1ES
k1ES0.
d[X1]/dt = k1[E][S0] + k-2[X2] - (k2+k-1)[X1]
d[Xi]/dt = ki[Xi-1] + k-(i+1)[Xi+1] - (ki+1+k-i)[Xi]
d[Xn]/dt = kn[Xn-1] - (kn+1+k-n)[Xn]
[E0] = [E] + ∑[Xi]
Линейным дифференциальным уравнением с постоянными
коэффициентами этой системы будет уравнение:
dnXn/dtn + a1dn-1Xn-1/dtn-1 + … + anXn = b
Реакция превращения субстрата в продукт с
участием произвольного числа n
промежуточных соединений
Решение этого неоднородного уравнения:
Xn(t) = Σ Aiexp(λit) + b/an,
где λi - корни характеристического уравнения
λn + a1λn-1 + … + an = 0.
Корни этого уравнения имеют размерность обратного
времени t-1 = -1/λi. После их подстановки в линейное
дифференциальное уравнение и интегрирования
получаем:
Pn(t) = Σ kn+1Ai/λi (exp(λit) – 1)+ kn+1bt/an
Реакция превращения субстрата в продукт с
участием произвольного числа n
промежуточных соединений
Особенности изменения во времени концентрации продукта реакции
1. После протекания реакции в предстационарном режиме
по истечении времени t >> ti, i = 1, …, n, реакция переходит
в стационарный режим, характеризуемый стационарной
скоростью vст = kn+1b/an, где величины an и b являются
функциями элементарных констант и начальных скоростей
фермента и субстрата и в каждом конкретном случае
определяются как коэффициенты линейного
дифференциального уравнения.
2. Зависимость концентрации конечного промежуточного
соединения описывается суммой экспоненциальных
членов, а концентрация конечного продукта – суммой
экспонент и линейным членом, причем число экспонент
соответствует числу промежуточных соединений в
механизме реакции.
Экспериментальные методы
исследования нестационарных
процессов
«Струевые» методы
позволяют смешать
два раствора за
доли миллисекунды
Кинетика ферментативных реакций
в предстационарном режиме
Методы релаксационной
кинетики
Нет проблемы мертвого времени,
связанного со смешиванием реагентов,
благодаря использованию предварительно
смешанных растворов
"Струевые" методы
• Хартридж и Роутон, 1923 г. – реакция инициируется
быстрым смешиванием реагентов в проточных
условиях.
метод непрерывной струи
метод ускоренной струи
метод остановленной струи
1. Метод непрерывной струи
Два раствора реагирующих
веществ вводят в
смесительную камеру,
и раствор после смешивания
поступает в трубку для
наблюдения.
а – растворы реагирующих
веществ; б – смесительная
камера; в – трубка для
наблюдений.
u – постоянная скорость потока, l – расстояние от смесительной
камеры: t = l/u.
Например, если скорость струи равна 10 м/с, то на расстоянии 1 см от
смесителя "возраст" раствора будет равен 1 мс, на расстоянии 10 см 10 мс. Меняя расстояние от точки смешения до места измерения,
можно получить данные для построения кинетической кривой.
Смешение достигается за 1-2 мс. Скорость потока по трубке
диаметром 1-2 мм обычно порядка м/с. Это позволяет изучать
кинетику реакций с временем полупревращения, равным нескольким
мс.
2. Метод ускоренной струи
Растворы реагирующих веществ помещают в
шприцы, поршни которых приводят в движение
резким толчком в течение ~0,1 с. Наблюдение
проводят в фиксированной точке вблизи
смесительной камеры.
Скорость течения жидкости (и, следовательно,
время протекания реакции) постоянно меняется.
Методика ускоренной струи позволяет использовать
весьма малые объемы реагирующих веществ (до 0,1
мл), что является важным преимуществом при
исследовании ферментативных реакций.
Минимальное время полупревращения реагента,
доступное измерению, составляет 1 мс; диапазон
измеряемых констант скорости составляет 102-107
л·моль-1·с-1.
3. Метод остановленной струи
Для остановки струи используют поршень, помещенный в конце
трубки для наблюдений, который позволяет остановить поток
за 1-2 мс. Реакционная смесь толкает этот поршень, и он резко
останавливается, дойдя до внешних ограничителей.
а – растворы реагирующих веществ; б –
смесительная камера; в – точка наблюдения;
г – останавливающий поршень; д – ограничитель.
Метод импульсного фотолиза (флеш-метод)
Метод применяется для реакций, которые инициируются действием
света за счет протекающих в системе фотохимических реакций.
В отличие от "струевых" методов метод импульсного фотолиза не
требует быстрого смешивания реагентов.
• а – источник света; б - кювета с исследуемым раствором; в импульсная лампа; г – высоковольтный конденсатор; д монохроматор; е - фотоумножитель; ж – осциллограф.
• "Мертвое" время метода определяется: 1) временем
импульсной вспышки и 2) временем фотохимического
образования соответствующего компонента ферментативной
реакции. Ксеноновая импульсная техника позволяет получить
мощные импульсы света продолжительностью 10-100 мксек.
Релаксационные методы
Система выведена
из равновесия
релаксация
Равновесие 1
Равновесие 2
Метод температурного скачка
• Используется аппаратура, позволяющая осуществить
изменение температуры за несколько микросекунд. Метод
позволяет работать с небольшим объемом исследуемого
раствора (до 0,1 мл).
• Раствор инкубируют в кювете спектрофотометра или
флуориметра, а затем менее чем за 1 мкс повышают
температуру на 5-10ºC c помощью разряда конденсатора (или
за 10-100 нс с помощью инфракрасного лазера). Если при этом
изменяется энтальпия системы, то смещается и положение
равновесия.
Внешнее влияние, возмущающее систему, может иметь
разную физическую природу. В общем случае константа
равновесия является функцией не только температуры, но
и давления, электрического поля. Поэтому, помимо
рассмотренного метода (температурного скачка), внешнее
воздействие на систему можно осуществить, изменяя
давление (скачок давления, поглощение ультразвука) или
электрическое поле (метод электрического импульса).
Разрешающая способность
релаксационных методов
Метод
Разрешающая
способность, с
Поглощение ультразвука
10-6 - 10-10
Температурный скачок
10-4 - 10-6
Метод электрического
импульса
10-4 - 10-6
Скачок давления
10-2
Релаксационная кинетика
Начальное состояние системы – равновесие: равновесные
концентрации [Е], [А], [ЕА] и константа равновесия
K=
[ E ][ A ]
[EA]
Изменение температуры системы (Т → ΔТ)
K
H
  ln K 
T
2
K
RT
(К → ΔК):
Новое равновесие характеризуется константой К+ΔК
d[EA]/dt = k1[E][A] - k-1[EA]
где текущие концентрации связаны с равновесными:
[EA] = [EA] + Δ[EA]; [E] = [E] + Δ[E]; [A] = [A] + Δ[A]
Анализ кинетики упрощается, если отклонение от равновесия,
вызываемое внешним фактором, невелико, т.е. [E]>>Δ[E],
[A]>>Δ[A]. В этом случае можно пренебречь Δ[E]Δ[A].
Поскольку (из материального баланса): Δ[A]=Δ[E]=-Δ[EA]
d(Δ[EA])/ dt + [k1([E] + [A]) k-1]Δ[EA] = k1[E][A]- k-1[EA]
Релаксационная кинетика
d(Δ[EA])/dt + [k1([E] + [A]) k-1]Δ[EA] = k1[E][A]- k-1[EA]
Решение представляет собой экспоненциальную
функцию Δ[EA] от времени, в которой показатель
экспоненты связан с элементарными константами
скорости реакции уравнением:
t -1=k1([E]+ [A]) + k-1
Величина t называется временем релаксации. При
анализе зависимости времени релаксации от
равновесных концентраций фермента [E] и лиганда
[A] могут быть найдены элементарные константы
скорости реакции.